Summary
Ein Protokoll für die Kanülierung der Maus Glandula Speicheldrüse über die Wharton-Gang beschrieben. Für dieses Experiment ist die Trypanblau-Lösung als Färber verwendet werden, um zu demonstrieren, wie diese Technik effektiv liefert Infusionen in die gezielte Drüse, und die Zuverlässigkeit dieses neuen Ansatzes als potenzielle klinische Arzneimittelentwicklung / Zelltherapie für die Regeneration der Speicheldrüsen vorschlagen.
Abstract
Schwere Speicheldrüse Unterfunktion ist häufig bei Patienten mit Sjögren-Syndrom und diejenigen, die therapeutischen Bestrahlung erhalten in ihrem Kopf und Hals Regionen zur Behandlung von Krebs gefunden. Beide Gruppen von Patienten Symptome wie Xerostomie (Mundtrockenheit), Dysphagie (Störungen der Kau-und Schluckstörungen), schwere Karies, verändertes Geschmacksempfinden, Mund-Rachen-Infektionen (Candida), Mukositis, Schmerzen und Beschwerden.
. Ein innovativer Ansatz der regenerativen Medizin für die Behandlung von Speicheldrüsen hypo-Funktion ist in RS Redman, E Mezey et al 2009 spekuliert: Stammzellen können direkt durch Kanülierung werden in der Drüse abgelagert als wirksame Methode bei der Wiederbelebung der Funktionen der gestörten Orgel. Vermutlich werden die migrierten ausländischen Stammzellen in Drüsenzellen, die als Teil der Host-Funktion der Speicheldrüsen unterscheiden. Auch dieses ist Kanülierung Technik eine sinnvolle und effektive Methode für die klinische Gentransfer-Anwendung.
Hier zeigen die Schritte bei der Durchführung der Kanülierung Verfahren auf der Maus Glandula Speicheldrüse über die Wharton-Gang (Abb. 1) beteiligt. C3H-Mäuse (Charles River, Montreal, QC, Canada) sind für dieses Experiment, das unter sauberen konventionellen Bedingungen wurden an der McGill University Tier Resource Center gehalten werden. Alle Experimente wurden von der Universität Animal Care Committee genehmigt worden und wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien des Canadian Council on Animal Care.
Für dieses Experiment ist eine Trypanblau-Lösung in die Drüse durch die Öffnung des Wharton-Gang mit einer Insulin-Spritze mit einer 29-Gauge-Nadel eingehüllt in einem Polyethylen-Schlauch infundiert. Anschließend wird die Maus seziert, um zu zeigen, dass die Infusionen in die Drüse erfolgreich migriert.
Protocol
1. Verfahrensbeschreibung
- Subkutan zu injizieren 1 ul / g Körpergewicht von 0,5 mg / ml Atropinsulfat-Monohydrat (Kat. Nr. 11330, Fluka, USA) in jede Maus an den Speicheldrüsen Sekret von der Störung der Bewegung der Infusionen zu verhindern.
- Anesthetize jeder Maus mit 1 ul / g Körpergewicht von 100 mg / ml Ketamin und 20 mg / ml Xylazin (Phoenix Scientific, AR, USA) injiziert intraperitoneale (IP)
- Legen Sie die Maus auf eine maßgeschneiderte Kunststoff-Plattform in der Bauchlage: Die oberen Schneidezähne sind auf einem Metalldraht gesperrt, und die unteren Schneidezähne sind auf einer elastischen Schnur eingehakt um in den Besitz der Mund offen.
- Verwenden Sie eine Insulin-Spritze mit einer 29-Gauge-Nadel (Cat # 600145, Tyco Healthcare, MA, USA) in einem 0,58 mm Durchmesser Polyethylen Rohr (Cat # 427410, Becton Dickinson, MD, USA; Abb. 2) platziert. Die Polyethylen-Rohr eingesetzt ist 5mm über der Spitze einer 29-Gauge-Nadel. Die Nadel ist wie ein starrer Leitfaden für die Polyethylen-Rohr in die Wharton-Gang bewegen verwendet. Die Polyethylen-Rohr wird 3-5 mm in den Kanal eingeschoben. Beachten Sie, dass nur die Polyethylen-Rohr der Speicheldrüse Kanal gelangt, während der Nadel bleibt außerhalb des Kanals. Inject 50ul der gefilterten 0,4% Trypanblau Färbelösung (Cat # 15250, Gibco, USA) in die submandibularis über die Wharton-Gang, der direkt unterhalb der Zunge liegt. Die Infusion wird ständig mit positiven Druck auf die Spritze Kolben geliefert, der Finger bleibt auf dem Kolben auch nach all der Infusion hat, um die Drüse geliefert worden, um einen Rückfluss der Infusion intraoral zu verhindern. Der Trypanblau-Lösung ist in dem Video als Farbstoff, um die Technik zu demonstrieren.
- N ach der Injektion der Trypanblau-Lösung wurde die Maus vor der Dissektion eingeschläfert. Die Speicheldrüse wird operativ in Ordnung ausgesetzt, um festzustellen, wie viel von der Infusionen tatsächlich in der Drüse blieb.
2. Repräsentative Ergebnisse:
Nach der Infusion injiziert wurden, war die Maus seziert, um operativ Setzen Sie das post-kanülierten Speicheldrüse. Wie auf Bild-2 gezeigt, stellt die dunkle Färbung der Wharton-Gang Beweise, dass die Trypanblau-Lösung wurde erfolgreich infundiert.
Abbildung 1. Kanülierung der Maus submandibularis.
Abbildung 2. Polyethylen Rohr ummantelt um die Spitze eines 29-Gauge-Nadel. Die Kanüle wird als starre Führung des Polyethylen-Rohr in die Wharton-Gang bewegen verwendet. Die Polyethylen-Rohr (kanülierten) 3-5 mm in den Kanal eingeschoben. Beachten Sie, dass nur die Polyethylen-Rohr der Speicheldrüse Kanal gelangt, während der Nadel bleibt außerhalb des Kanals.
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Discussion
Eine Schwierigkeit mit diesem Kanülierung Methode besteht darin, den Rückfluss der injizierten Lösung zu verhindern. Selbst wenn der Trypanblau-Lösung wurde vorübergehend in die Speicheldrüse erfolgreich migriert, kann der Speichel-Sekretion mit der Infusionen und verursachen Rückfluss der Trypanblau-Lösung aus der Drüse. Als Vorsichtsmaßnahme zusätzlich zur Verwendung Atropin zur Sekretion von Speichel hemmen, sollten die Polyethylenkanüle in die Wharton-Gang und der Kolben der Spritze für 60 Sekunden gehalten, nachdem die Infusionen hinterlegt haben schon bleiben. Damit können die meisten der infundierten Lösung innerhalb der Drüse bleiben.
Üblicherweise ist die systemische Anwendung, nämlich die intravenöse Injektion (IV) von Drogen / Zellen, als einen klinischen Ansatz für Speicheldrüse Regeneration eingesetzt. Intravenös injiziert Infusionen wird durch das gesamte Kreislaufsystem reisen, so dass nur ein Teil der Drogen / Zellen, in die gezielte Drüsen zu migrieren. Im Vergleich zu dieser traditionellen Methode kann die lokale Anwendung, dass die Injektion von Drogen / Zellen über die Kanülierung Verfahren ist, wie eine direkte und effektive Art und Weise in die Wiederbelebung der Funktionen der Parotis, submandibularis und sublingualen Speicheldrüsen wahrgenommen werden. Deshalb kann diese Kanülierung Technik als ein zuverlässiges Modell für die regenerative Medizin von Maus Speicheldrüse verwendet werden, und als eine Perspektive, dieses Verfahren kann eine sinnvolle Methode für die klinische Anwendung sein.
Es wäre eine große Freude, diese visuell-Artikel als ein effektives Werkzeug für Studenten und Forscher, die in weiteren Studien in der regenerativen Medizin der Speicheldrüse interessiert sind, verwendet werden.
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Disclosures
Alle Experimente wurden von der Universität Animal Care Committee genehmigt worden und wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien des Canadian Council on Animal Care.
Acknowledgments
Die Autoren bedanken sich bei Dr. Ana Cotrim für technische Beratung und Dr. Monzur für Geräte Murshed. Diese Arbeit wurde zum Teil durch die Canadian Institutes for Health Research finanziert.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Atropine | Drug | Fluka | 11330 | To inhibit saliva secretion |
| Ketamine | Drug | Phoenix Scientific | Sedation | |
| Xylazine | Drug | Phoenix Scientific | ||
| Polyethylene tubing (0.58 mm diameter) | Tube | Intramedic | 427410 | To insert over tip of needle to avoid tissue injury during insertion into Wharton’s duct. |
| Ultra Comfort Insulin syringe (with a 29G needle) | Syringe | Tyco Healthcare, Covidien | 600145 | |
| 4% trypan blue | Stain | GIBCO, by Life Technologies | 15250 |
References
- Fox, P. C. Acquired salivary dysfunction. Drugs and radiation. Ann N Y Acad Sci. 842, 132-137 (1998).
- Bhide, S. A., Miah, A. B., Harrington, K. J., Newbold, K. L., Nutting, C. M. Radiation-induced xerostomia: pathophysiology, prevention and treatment. Clin Oncol (R Coll Radiol). 21, 737-744 (2009).
- Redman, R. S., Ball, W. D., Mezey, E., Key, S. Dispersed donor salivary gland cells are widely distributed in the recipient gland when infused up the ductal tree. Biotech Histochem. 84, 253-260 (2009).
