Summary
Denne protokollen beskriver en fremgangsmåte for ekstraksjon av små RNA fra humant serum. Vi har brukt denne metoden for å isolere microRNAs fra kreft serum til bruk i DNA-arrays og også singleplex kvantitativ PCR. Protokollen benytter fenol og guanidiniumtiocyanat reagenser med modifikasjoner å vike høy kvalitet RNA.
Abstract
Analyse av RNA og dets ekspresjon er et vanlig trekk i mange laboratorier. Av betydning er fremveksten av små RNA som microRNAs, som finnes i pattedyrceller. Disse små RNA er potente genet regulatorer styrer vitale trasé som vekst, utvikling og død, og mye interesse har vært rettet mot deres uttrykk i kroppsvæsker. Dette er på grunn av deres feilregulering i humane sykdommer så som kreft, og deres potensielle anvendelse som serum biomarkører. Imidlertid kan analysen av miRNA ekspresjon i serum være problematisk. I de fleste tilfeller er mengden av serum er begrensende og serum inneholder lave mengder av total RNA, hvorav små RNA utgjør bare 0,4 til 0,5% 1. Således isolering av tilstrekkelige mengder av kvalitet RNA fra serum er en stor utfordring for forskere i dag. I dette teknisk papir, vi demonstrere en metode som bruker bare 400 mL av humant serum for å innhente tilstrekkelig RNA for enten DNA-matriser eller qPCR analyser. Den endvantages ved denne metoden er dens enkelhet og evne til å gi høy kvalitet RNA. Det krever ingen spesielle kolonner for rensing av små RNA og benytter generelle reagenser og maskinvare som finnes i vanlige laboratorier. Vår metode anvender en faselåst gel for å fjerne fenol forurensning mens den på samme tid gir høy kvalitet RNA. Vi introduserer også et ekstra trinn for ytterligere å fjerne alle forurensninger under isolasjonstrinnet. Denne protokollen er svært effektiv i å isolere utbytter av totale RNA på opptil 100 ng / mL av serum, men kan også tilpasses for andre biologiske vev.
Introduction
I de senere årene har det vært en økende trykk for å oppdage nye biomarkører for tidlig deteksjon av menneskelige sykdommer. Mye oppmerksomhet har vært fokusert på å bruke små RNA som microRNAs 2 (mirnas eller Mirs) som potensielle markører. Disse små RNA er funnet i kroppsvæsker som serum, og studier har vist at de er motstandsdyktige mot nedbrytning, og er stabile over et område av varierende miljøforhold 3. Gitt disse funksjonene, serum eller sirkulerende mirnas er den ideelle biomarkør fire, fem. Foreløpig er det to hovedtilnærminger for isolering av små RNA fra biologiske væsker. Den første metode anvender en kolonne basert teknologi for å binde og eluere de små RNA 6, mens den andre fremgangsmåten anvender den langvarige protokoll med fenol-og guanidinium thiocyanate reagenser 7. Vi har utviklet en enkel, effektiv, kolonne frie protokollen til å isolere små RNA fra humant serum. Den isolerte RNA er umiddelbart brukbare i nedstrøms applikasjoner, inkludert DNA oligonukleotid arrays og RNA sekvensering.
Denne protokollen ble utviklet fordi vi ble konfrontert med flere problemer ved bruk av fenol-baserte metoder for å isolere RNA fra serum. Den tradisjonelle Chomczynski tilnærmingen er hyppig brukt i de fleste laboratorier med et utvalg av reagenser tilgjengelige fra de fleste kommersielle leverandørene. Men vurderer sin utbredt bruk, strenge retningslinjer har ikke blitt utviklet for å produsere konsekvent høy kvalitet RNA fra kroppsvæsker, spesielt blod eller serum.
Vanlige problemer forbundet med å isolere RNA fra serum inkluderer lav RNA avkastning og forurensning med reagenser brukt under isolasjon, spesielt fenol. Vår tilnærming eliminerer disse fenol forurensninger for å gi høy kvalitet RNA for nedstrøms analyse som kvantitativ PCR (qPCR) og RNA sekvensering. Vi har videre testet dette RNA på miRNA arrays.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Merk: Human serumprøver fra friske pasienter eller pasienter med kreft ble oppnådd med informert samtykke under godkjente menneskelige etiske protokoller fra Royal Prince Alfred Hospital Sydney (Protokoll nummer X10-0016 og HREC/10/RPAH/24) og University of Technology, Sydney. Serumprøver ble samlet fra pasienter før kirurgi fra forskjellige Sydney sykehus og plassert i lagring ved -80 ° C.
1.. Small RNA Isolation from Serum
Total RNA ble fremstilt fra humant serum ved å bruke en modifisert versjon av Tri-Reagent RT LS-protokollen.
- Tine frosne serumprøve på is, og deretter overføre 400 ul av den ferske tint serumet til en merket mikrosentrifugerør.
- Fortynn serum med 100 ul RNase-fritt H2O og tilsett proteinase K ved en konsentrasjon på 1 mg / ml.
- Inkuber ved 37 ° C i 20 minutter for å tillate protein fordøyelse med proteinase K.
- To sikre fullstendig solubilisering, tilsett 1,5 ganger dens volum av Tri-Reagent RT LS og 100 ul av 4-bromanisol.
- Kort invertere homogenate, utføre repetitive pipettering for 5 sek og overføre til en merket 2 ml Heavy Phase Lock tube.
- Spin homogenatet ved 12.000 x g i 20 min ved 4 ° C.
- Nøye dekanter minst 1 ml av den resulterende vandige oppløsning i en frisk DNA LoBind røret. Den organiske og interfase bør fanget under den hvite gel av fase-lås-røret.
- Til 5,0 mL av glykogen (5 mg / ml) og 500 ul av 100% isopropanol til den vandige oppløsning, blandes ved inversjon, og inkuber O / N ved -20 ° C.
- Etter O / N inkubasjon sentrifuge prøven i 20 min ved 12.000 x g i 4 ° C sentrifuge.
- Kast den klare supernatant og utføre en "flash" spin i 2 min ved 16.000 x g i 4 ° C sentrifuge.
- Fjern forsiktig den klare solution rundt pellet ved hjelp av en pipette.
- Vask pelleten med 1 ml 70% etanol og sentrifuger ved 10 000 x g i 10 min. Dekanter vaske-løsning og gjenta vasketrinnet.
2. RNA resuspensjon inn Solution
- Resuspender pelleten i 10 pl RNase-fritt H2O, noe som sikrer at pelleten fullstendig oppløst. For å sikre at RNA er fullstendig solubilisert prøven kan varmes opp til 55 ° C i 5 min. I løpet av denne tiden, blande prøven med gjentatt pipettering. For en høyere total RNA yield, basseng to RNA preparater fra samme pasient.
- Kvantifisere resuspendert RNA ved hjelp av en UV-Vis-spektrofotometer og vurdere RNA kvalitet ved hjelp av en 2100 Bioanalyzer. Oppbevar oppsamlede RNA prøver ved -80 ° C for bruk i nedstrøms applikasjoner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Fig. 1 representerer en typisk UV / Vis spekteret av RNA isolert fra serum. Fra denne profilen vi bemerket protein forurensning på 280 nm med fenol og organiske miljøgifter både på 270 nm og 230 nm, henholdsvis. Rester guanidiniumtiocyanat ble også bemerket ved 260 nm. For å redusere forurensninger, ble en serie av optimaliseringsfremgangsmåten vises til standard Tri-Reagent RT-LS prosedyre. Vi tilsatt 5 mg / ml glykogen å øke både den totale RNA-utbyttet og redusere forurensning (sort linje, Figur 1A).
Videre ble det observert at etter fjerning av isopropanol var omtrent 100 til 300 pl vaskebuffer som omgir RNA pelleten. En ytterligere sentrifuge spin ble tilsatt til protokollen, og residuet vaske-oppløsningen ble forsiktig fjernet. Dette resulterte i en profil skift fra 270 nm til 280 nm (rød spor, Figur 1B). Vi utledet at denne "flash" spin hadde redusert fenol forurensningved 270 nm, og konkluderte med at 280 nm topp sannsynligvis representerte proteinforurensning.
For ytterligere å øke RNA yield og redusere protein bære gjennom vi lagt en fase Lock Gel trinn. Dette trinnet er tillatt for den fullstendige overføring av den vandige fase uten organiske forurensninger (figur 1B). Som serum inneholder en stor mengde av protein, evaluerte vi dersom fortynning av det opprinnelige serumvolum ville ha noen virkning (figur 1C). I et total-ekstrakt volum på 500 pl, vi blandet 400, og 250 pl av serum med dH 2 O. Jo større volum utbyttet nesten fordoblet mengden av total RNA når sammenlignet med bruk av 250 pl av serum. Det var også en reduksjon i miljøgifter når redusere startvolum (Merk: Som den eneste variabelen i denne optimalisering skritt var volumet av serum, er det 230 nm peak direkte forbundet med serumvolum og ikke en gjenstand fra Tri-Reagens isolasjon) . Den lille RNA innhold av disse preparatene ble så vurdert ved hjelp av Bioanalyzer i kombinasjon med små RNA Kit. Fra Bioanalyzer spor, er det en tydelig topp på ca 20 nts som representerer mikroRNA befolkningen (Figur 2A). Ved hjelp av denne protokollen, representerte dette microRNA komponenten 93% av det totale RNA liten populasjon. Dette er en høy grad av renhet, og det totale RNA kan nå brukes for varierende molekylære assays slik som matriser og qPCR reaksjoner. En oppsummering av arbeidsflyten er presentert i figur 2B.
Vi så målt mikroRNA uttrykk i fire forskjellige biologiske prøver ved hjelp av enten en oligonukleotid matrise eller qPCR. Figur 3A representerer en mikroRNA varmekart over disse fire prøvene. Som i vår forrige undersøkelse, ble hierarkisk clustering brukes til å analysere uttrykket data og gruppeprøver basert på deres mikroRNA uttrykk profil åtte. KvantitativPCR (qPCR) ble også brukt for å vurdere mikroRNA nivåer i disse forberedelsene. Ved hjelp av de samme fire prøvene, utførte vi singleplex TaqMan qPCR reaksjoner å oppdage Mir-21-5p, Mir-486-5p, Mir-15b-5p, Mir-16-5p og la-7a. Som vist på forsterknings plott (figurene 3B og 3C) alle miRNAs var vellykket detektert.
Figur 1 Spektrofotometrisk profil av RNA fra humant serum.. A. En typisk UV-profilen av RNA isolert fra humant serum (blå linje). Forskjellige optimaliseringsfremgangsmåten ble testet for å redusere forurensninger, og øker total RNA utbytte. B. Sammen bruk av en fase-lås gel til en normal isolasjon. C. Profil av to målinger med forskjellige startvolumer av serum. Økende volum h Annonsen merket innvirkning på RNA avkastning. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. A. representant Bioanalyzer spor som viser en enkelt pigg på ca 21 nukleotider (x-aksen). Dette pigg representerer miRNA brøkdel i den lille RNA befolkningen fra serum. B. Oppsummering av arbeidsflyt for å isolere total RNA fra serum. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
hres.jpg "src =" / files/ftp_upload/51443/51443fig3.jpg "/>
Figur 3. Den microRNAs isolert ved hjelp av denne metoden ble benyttet for utvalg profilering og qPCR analyser. A. Tre hode og nakke kreft og en normal sera ble isolert for total RNA (inkludert microRNAs) og utsatt for matrise profilering ved hjelp av 8 X 60K miRNA chip. Dette ble gjentatt i teknisk replikat. Etter rådata Kvalitetskontroll (QC) foredling, ble uttrykket av disse microRNAs analysert ved hjelp av hierarkiske Clustering (HCL) og presentert som et varmekart. Red indikerer opp regulering og blått angir nedregulering av de microRNAs. B. Representative qPCR forsterkningskurver for påvisning av Mir-21, Mir-486, Mir-15, Mir-16 og la-7a i fire humane sera. C. Alt fem mirnas ble oppdaget og rå Ct-verdier ble deretter plottet for normal serum. Dette mønsteret for deteksjon var lik for de tre andre prøver (data ikke vist)..jove.com/files/ftp_upload/51443/51443fig3highres.jpg "target =" _blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Populasjonen av microRNAs utgjør omtrent 0,4 til 0,5% av det totale RNA som finnes i serum. Videre er det også et høyt proteininnhold som finnes i humant serum. For å forbedre RNA og redusere både protein-og fenol forurenser vi har modifisert den tradisjonelle Chomczynski tilnærmingen 9 med tillegg av flere trinn.
Total RNA ble isolert fra serum ved hjelp av standard Tri-Reagent RT-LS (Molecular Research Centre) men når utført i vårt laboratorium, denne metoden ga RNA i små mengder med forskjellige forurensninger.
Figur 1 viser en UV spektrofotometrisk RNA profil med tegn på proteinforurensning ved 280 nm, fenol forurensning ved 270 nm, og andre organiske forurensninger ved 230 nm. Reagenset, guanidiniumtiocyanat, ble også detektert ved 260 nm.
For å løse problemene med lave serum RNA avlinger og redusere forurensning, en serie av optimization trinn ble tilsatt til den standard Tri-Reagent RT-LS prosedyre. For det første fant vi at fortynne serum en i fem redusert protein forurensning. Dette trinnet har blitt anbefalt av andre undersøkelser 10 og er vist å redusere proteinforurensning. Videre har vi brukt 1 mg / ml konsentrasjon av proteinase K. Vi har testet et område av konsentrasjoner fra 100, 500 og 1000 mikrogram. Det var ingen forskjell mellom konsentrasjonene dermed vi benyttes høyere konsentrasjoner og kortere inkuberingsperioder.
Den andre modifikasjon var å innføre anvendelse av 2,0 ml faselåst rør. Den tunge fase-lås Gel fanger størstedelen av forurensninger slik som fenol, og proteinene i den organiske fase. Det gir en tetthetsbarriere for maksimal overføring av den vandige fase uten risiko for kontaminasjon. Anvendelsen av Phase Lock Gel som en vandig / organisk fase barrierematerialet kan redusere behandlingstiden og ytterligere forbedre DNA gjeneri med så mye som 30%, mens den på samme tid eliminerer brukeren mot å utsettes for skadelige flyktige organiske 11. Den tredje modifikasjon førte til en betydelig forbedring i RNA kvalitet. Innføringen av en "flash" sentrifuge spinn ved 12000 × g var viktig i å fjerne eventuelle gjenværende forurensning fra RNA pellet før etanol vasker.
Når man sammenligner vår tilnærming til andre publiserte metoder 6, 12, 13, har vi innført ved bruk av en fase-lås Gel for å maksimere utvinningen av små noncoding RNAer fra den vandige fase. En av begrensningene i vår protokoll og andre er at replikere isoleringer kan være nødvendig for å få nok RNA for uttrykk analyse. Fra våre erfaringer, vi foretrekker de Trizol baserte metoder enn kolonnebaserte kits og en rekke studier de har sammenlignet fordelene ved begge systemene 6, 14-16. Av særlig interessevar en fersk undersøkelse som konkluderte med at miRNAs med lav GC innhold, for eksempel Mir-141, Mir-29b, Mir-21, Mir-106b, Mir-15a, og Mir-34a, er selektivt tapt under prøveopparbeidelse bruker Trizol metoden 17. Dette problemet ble løst ved tilsetning av magnesium under prøve isolasjon.
I sammendraget, bruker vår protokoll de tradisjonelle metoder for å isolere små RNA fra serum. Disse serum miRNAs kan være avledet fra mikropartikler, exosomes eller døende celler. Denne protokollen vil isolere alle disse miRNAs for å produsere høykvalitets-RNA, som kan brukes for ulike molekylære nedstrøms applikasjoner. Denne utvinningsmetoden er ganske grei, er avhengig av felles maskinvare som finnes i de fleste laboratorier, og er enkel nok for de fleste nybegynnere er interessert i å måle mirnas uttrykk i menneskelig serum.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Det er ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Samantha Khoury og Pamela Ajuyah støttes av den australske Graduate Award. Vi ønsker også å erkjenne Translasjons Cancer Research Network, Lowy Cancer Research Centre, University of New South Wales og Nord-translasjonell kreftforskning Enhet for deres ekstra støtte av Samantha Khoury.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tri-Reagent RT LS | Molecular Research Center, USA | TR 118 | |
| RNase free H2O | GIBCO Invitrogen | 10977-023 | |
| Proteinase K | Finnzymes, Finland | EO0491 | |
| Heavy Phase Lock tube | 5PRIME | 2302830 | 2 ml capacity |
| DNA Lobind tube | Eppendorf | 0030 108.078 | 1.5 ml capacity |
| Glycogen | Invitrogen, USA | 10814-010 | 5 mg/ml |
| RNA grade isopropanol | Sigma Aldrich, USA | I9516 | 100% |
| Refrigerated centrifuge | John Morris | ||
| Nanodrop UV-Vis spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific, USA | ||
| RNA grade ethanol | Sigma Aldrich, USA | E7023 | 70% |
| Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent, USA |
References
- Babu, S. Monitoring extraction efficiency of small RNAs with the Agilent 2100 Bioanalyzer and the Small RNA Kit. Agilent Application Note. , (2010).
- Tran, N., Hutvagner, G. Biogenesis and the regulation of the maturation of miRNAs. Essays Biochem. 54, 17-28 (2013).
- Chim, S. S., et al. Detection and characterization of placental microRNAs in maternal plasma. Clin. Chem. 54, 482-490 (2008).
- Lodes, M. J., et al. Detection of cancer with serum miRNAs on an oligonucleotide microarray. PLoS One. 4, (2009).
- Chen, X., et al. Characterization of microRNAs in serum: a novel class of biomarkers for diagnosis of cancer and other diseases. Cell Res. 18, 997-1006 (2008).
- Burgos, K. L., et al. Identification of extracellular miRNA in human cerebrospinal fluid by next-generation sequencing. RNA. 19, 712-722 (2013).
- Chomczynski, P., Sacchi, N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Anal. Biochem. 162, 156-159 (1987).
- Zhang, X., et al. Alterations in miRNA processing and expression in pleomorphic adenomas of the salivary gland. Int. J. Cancer. 124, 2855-2863 (2009).
- Chomczynski, P., Sacchi, N. The single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction: twenty-something years on. Nat. Protoc. 1, 581-585 (2006).
- Kirschner, M. B., et al. Haemolysis during sample preparation alters microRNA content of plasma. PLoS One. 6, (2011).
- Murphy, N. R., Hellwig, R. J. Improved nucleic acid organic extraction through use of a unique gel barrier material. Biotechniques. 21, 934-936 (1996).
- Taylor, C. J., Satoor, S. N., Ranjan, A. K., Pereira e Cotta, M. V., Joglekar, M. V. A protocol for measurement of noncoding RNA in human serum. Experimental Diabetes Research. 2012, (2012).
- Ichikawa, M., Akiyama, H. A Combination of Extraction Reagent and DNA Microarray That Allows for the Detection of Global MiRNA Profiles from Serum/Plasma. Methods Mol. Biol. 1024, 247-253 (2013).
- Fromm, B., Harris, P. D., Bachmann, L. MicroRNA preparations from individual monogenean Gyrodactylus salaris-a comparison of six commercially available totalRNA extraction kits. BMC Res. Notes. 4, 217 (2011).
- Li, Y., Kowdley, K. V. Method for microRNA isolation from clinical serum samples. Anal. Biochem. 431, 69-75 (2012).
- McAlexander, M. A., Phillips, M. J., Witwer, K. W. Comparison of Methods for miRNA Extraction from Plasma and Quantitative Recovery of RNA from Cerebrospinal Fluid. Frontiers in Genetics. 4, 83 (2013).
- Kim, Y. K., Yeo, J., Kim, B., Ha, M., Kim, V. N. Short structured RNAs with low GC content are selectively lost during extraction from a small number of cells. Mol. Cell. 46, 893-895 (2012).
