Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

الفئران التنظير ل Published: August 26, 2014 doi: 10.3791/51875
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 2, 1
1Department of Medicine B, University Hospital Münster, 2Department of Pediatric Rheumatology and Immunology, University Children's Hospital Münster
* These authors contributed equally

Summary

تقنيات التصوير الحيوانات الصغيرة تسمح الفحوص التشخيصية التسلسلية والتدخلات العلاجية في الجسم الحي. في الآونة الأخيرة، ونطاق التطبيقات اتسعت بشكل كبير ويشمل حاليا تقييم للتنمية ورم القولون، التئام الجروح ورصد الالتهابات. يوضح هذا البروتوكول هذه التطبيقات المحتملة متنوعة من التنظير الفئران.

Abstract

وتستخدم على نطاق واسع نماذج الماوس لدراسة المرضية للأمراض البشرية وتقييم الإجراءات التشخيصية وكذلك التدخلات العلاجية preclinically. ومع ذلك، وتقييم صحيح من التغيرات المرضية غالبا ما يتطلب التحليل النسيجي، وعندما يؤديها خارج الحي، يتطلب موت الحيوان. لذا في إعدادات التجريبية التقليدية، والامتحانات المتابعة داخل الفردية نادرا ما تكون ممكنة. وهكذا، وتطوير التنظير الفئران في الفئران الحية تمكن المحققون للمرة الأولى إلى كل من تصور مباشرة الغشاء المخاطي الهضمي وأيضا تكرار الإجراء لمراقبة التغيرات. تطبيقات عديدة لفي الجسم الحي الفئران التنظير موجودة، بما في ذلك دراسة التهاب الأمعاء أو التئام الجروح، والحصول على خزعات المخاطية مرارا وتكرارا، وإدارة محليا وكلاء التشخيصية أو العلاجية باستخدام القسطرة حقن مصغرة. وفي الآونة الأخيرة، وسعت التصوير الجزيئي مو التصوير التشخيصيdalities السماح كشف محدد من الجزيئات المستهدفة متميزة باستخدام photoprobes محددة. في الختام، برزت التنظير الفئران والتكنولوجيا المتطورة لرواية تجريبية التشخيص في الجسم الحي والتصوير قد تؤثر بشكل كبير على البحوث قبل السريرية في مختلف المجالات.

Introduction

والنماذج الحيوانية أثرى إلى حد كبير فهمنا للعديد من الأمراض المعوية. وقد برز الماوس مختبر (المصحف العضلة) كنموذج حيواني رئيس في البحوث الطبية الحيوية بسبب معلوماتها الوراثية والجينومية وفيرة ومتاحة بسهولة في المعدلة وراثيا وخروج المغلوب السلالات. بالإضافة إلى تعزيز التفاهم المرضية المرض، كما تستخدم نماذج حيوانية الأهم لاختبار المرشحين المخدرات فضلا عن التدخلات التشخيصية أو العلاجية قبل السريرية. ومع ذلك، على الرغم من مجموعة متنوعة من نماذج الماوس محاكاة الأمراض التي تصيب البشر، العديد من الخيارات التشخيصية والتداخلية التي تستخدم بشكل روتيني في رعاية المرضى غير متوفرة بالنسبة للفئران. وفقا لذلك، واستراتيجيات المراقبة لمراقبة مسار المرض الفئران أو تأثير التدخلات العلاجية وغالبا ما تقتصر على الملاحظات غير المباشرة أو نشر تحليلات الوفاة. بينما توجد إجراءات غير الغازية للفئران مراقبة المؤشرات الحيوية مثل نشاط المرض، تشوantification من فقدان الوزن أو كسب، الدم، البول والبراز يحلل، وهذه هي المؤشرات غير المباشرة فقط ومنحازة بواسطة التباين بين الأفراد. بالإضافة إلى ذلك، بعد الوفاة يحلل منع الملاحظات طولية في نقاط زمنية متكررة. تقنيات التصوير المتطورة لرصد نشاط المرض في الفئران ومؤخرا فقط تم عرضه 1،2. ورغم أن هذه تقنيات التصوير تسمح التحليلات المتكررة، إلا أنها توفر رؤية وصفي وغالبا غير دقيق في الأمعاء، عدم تمكين التصور المخاطية المباشر أو السماح تدخلات تشخيصية أو علاجية مثل اكتساب خزعة أو التطبيق الموضعي داخل المخاطية والمرشحين المخدرات.

في الآونة الأخيرة، وأنظمة بالمنظار عالية الدقة لاستخدامها في الفئران الحية وضعت 3،4. لأول مرة هذه التقنيات بالمنظار تتيح رؤية مباشرة من endoluminal الأمراض مرض القولون مثل التئام الجروح أو التهاب الأمعاء توفير الكائناتوضع ECTIVE، في الوقت الحقيقي مما يسمح الدراسات الطولية في نفس الحيوان في نقاط زمنية متكررة. جانبا من السماح الخزعات المتكررة في الماوس الفردية، ويمكن أيضا أن تستخدم أنظمة بالمنظار للتأثير علاجي وجود ورم أو التهاب موضعي واضح من خلال السماح التطبيق المباشر من مادة إلى مجال الاهتمام. وعلاوة على ذلك، والمواد العلاجية والسيطرة يمكن تسليمها مباشرة إلى مجال الاهتمام، وهذا لا يمكن أن يؤديها في نفس الماوس، باستثناء التباين بين الأفراد. وقد تم حتى الآن توظيف هذه النظم لتقييم التهاب القولون، التئام الجروح، خزعات الكبد بالمنظار والحث مثلي أورام الكبد 8 والتنمية الورم باستخدام أنظمة التهديف مختلفة مثل مؤشر بالمنظار الفئران من شدة التهاب القولون (MEICS) 5-7. يتكون من خمسة MEICS المعلمات لتقييم التهاب: سماكة جدار القولون، والتغيرات في نمط الأوعية الدموية، ووجود الليفين، تحبب من mucosآل السطح، والبراز الاتساق.

في هذا البروتوكول وصفنا استخدام التنظير جامدة في نماذج الفئران من الأمعاء التئام الجروح، والتهاب وسرطان القولون. أولا، علينا أن نظهر تقييم بالمنظار من التئام الجروح والتهاب القولون وكذلك تقييم الطولي النشاط التهاب القولون ودراسة cancerogenesis في القولون الفئران. ما وراء استخدام وصفي من التنظير الفئران، ونحن نقدم تعليمات مفصلة حول استخدام الأجهزة بالمنظار الحصول على الخزعات، وتطبيق موضعي وداخل المخاطية للمكونات المختلفة للاهتمام (مثل المرشحين المخدرات أو الخلايا السرطانية). وأخيرا، فإننا شرح استخدام التنظير مضان الفئران، التي توظف تقنيات التصوير الجزيئي المتطورة، في تحديد أورام القولون والمستقيم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

تمت الموافقة على جميع التجارب على الحيوانات من قبل Landesamt FÜR الناطور، UMWELT UND Verbraucherschutz (LANUV) وفقا لقانون حماية الحيوان الألمانية.

1. المواد وإعداد التجريبي

  1. رعاية الحيوان
    1. استخدام الإناث أو ذكور الفئران من سلالة أي وزنها من 20 إلى 25 غرام وإيوائهم وفقا للتشريع الرعاية الحيوانية المحلية.
    2. إطعام الفئران مع طعام خاص للقوارض وتطبيق خالية من البرسيم طعام ثلاثة أيام على الأقل قبل مضان الامتحانات لتقليل endoluminal السيارات مضان.
    3. توفير تعقيمها شرب المياه الإعلانية libitum.
  2. تحريض الحاد الناجم عن التهاب القولون مفاجآت صيف دبي
    1. إعداد 3٪ (ث / ت) ديكستران سلفات الصوديوم (DSS، الوزن الجزيئي: 36،000-50،000 دا) حل عن طريق إذابة 3 غرام من مفاجآت صيف دبي في 100 مل ماء مشبع. يقدم هذا الحل ومياه الشرب الحصري لبالمال وبالشهرة أيضا الإعلان الفئران وحساب 5 مل من DSS-حل في الماوس / يوم. تغذية تابعرول الفئران تعقيمها بالماء دون مفاجآت صيف دبي libitum الإعلانية 9.
  3. تحريض سرطان القولون والمستقيم
    1. حل azoxymethane مطفرة (أوم) (تنبيه! قد يسبب السرطان وضرر وراثي!) في المياه المالحة متساوي التوتر العقيمة للحصول على تركيز النهائي من 1 ملغ / مل. تطبيق جرعة واحدة من 10 ملغ لكل كيلوغرام من وزن الجسم AOM داخل peritoneally باستخدام حقنة 1 مل (30 G) 10.
    2. الفئران التحدي (باستثناء السيطرة على الفئران) مع دورات متكررة من 3٪ (ث / ت) مفاجآت صيف دبي من يوم 0-7، يوم 14 إلى 21، يوم 28-35 واليوم من 42 إلى 49 للحث التهابات مدفوعة cancerogenesis القولون والمستقيم. إطعام الفئران تعقيمها بالماء فقط بين هذه التحديات (انظر الشكل 4A لجدول زمني مفصل الوقت). إطعام الفئران التحكم مع الماء تعقيمها في كافة مراحل التجربة.
  4. إعداد مضان التنظير (FE)
    1. استخدام فلوريسئين-Isothiocyanat (FITC) - ديكستران (الوزن الجزيئي 70،000 دا، FITC: جلوكوز = 1: 250) لDETEction الورم الحميد القولون عن طريق تعزيز البصرية من النمو الشاذ المرتبطة نمط الأوعية الدموية.
    2. إدارة 60 ملغ FITC مترافق ديكستران مخففة في 100 ميكرولتر PBS عن طريق الوريد 5 دقائق قبل الفحص بالمنظار مضان.
  5. التخدير
    1. توفير إمدادات الأيزوفلورين المستمر للتخدير (1.5 LO 2 / دقيقة، المجلد 1.5-2٪ الأيزوفلورين [2 كلورو-2- (difluoromethoxy) -1،1،1-trifluoro-الإيثان]). استخدام معدات خاصة لتخدير البيطرية مع قناع على السيطرة بإحكام التخدير.
  6. إعداد حقنة شرجية
    1. غرس حقنة شرجية 2 مل من السوائل (المحتويات: hydrogenphosphate الصوديوم 1.5٪ (ث / ت) والصوديوم dihydrogenphosphate 11٪ (ث / ت)) في القولون إذا اشتبه تحميل البراز الكبير الذي قد يحجب الرؤية.

2. المعدات التقنية

  1. استخدام محطة عمل بالمنظار البيطرية التي تم تطويرها واعتمادها لاستخدام التنظير الحيوانات الصغيرة. ربط التعليم الجامعيrkstation إلى وحدة الكاميرا، مصدر الضوء زينون، مضخة الهواء وإلى جهاز الكمبيوتر التقليدي للضوء التنظير الأبيض. ثم توصيل الكاميرا والمنظار جامدة مصغر (1.9 مم القطر الخارجي 10 سم طول، الشكل 5).
  2. استخدام المنظار غمد مع قناة العمل (الشكل 5D) لتطبيق ملقط الخزعة أو أنبوب حقن. استخدام غمد بدون قناة تعمل لتنظير القولون التشخيص.
  3. تكوين إعدادات مصدر الضوء لمضان التنظير لإثارة استشفاف المستخدمة (على سبيل المثال، 490 نانومتر لديكستران FITC مترافق). بالإضافة إلى ذلك، دمج عامل تصفية ممر الموجة المناسب بين التلسكوب والكاميرا (على سبيل المثال، 525 نانومتر لديكستران FITC مترافق).
  4. إدراج ملقط الخزعة مرنة (3 Charr.، 28 سم) من خلال قناة عمل المنظار الحصول على الخزعات.
  5. إدخال أنبوب مرن حقن (0.96 ملم) من خلال قناة تعمل لموضعي، داخل المخاطية أو endoluminal لنواقص الإدارة وكلاء التشخيصية أو العلاجية.
  6. استخدام جدول الفحص heatable مع درجة حرارة 42 درجة مئوية. هذا يمنع الفئران تصبح منخفض الحرارة أثناء الفحص.

3. التخدير للحيوانات

  1. ضع الماوس في مربع صغير ولكن مانعة للتسرب وإدارة الأيزوفلورين (100٪ (V / V)، المجلد 5٪ و 3 لتر / دقيقة). الانتظار حتى يفقد وعيه الماوس.
  2. نقل الماوس على طاولة الفحص عن التنظير. مواصلة الأيزوفلورين استنشاق عبر قناع الوجه مع جرعة 100٪ V / V، 1.5 المجلد٪، 1.5 لتر / دقيقة. دائما تطبيق مرهم العين لمنع جفاف العين في حين تحت التخدير.
  3. تقييم فعالية التخدير عن طريق التحقق من ردود الفعل. راجع مجموعة وبدوره حول المنعكس ': إذا مخدرة بما فيه الكفاية، يجب وضع الفأرة على ظهرها لا يستدير. تحقق من "أصابع المنعكس ': عندما التخدير كافية، معسر لينة بين أصابع الحيوان لا ينبغي أن تؤدي إلى انسحاب الساق (مرحلةالتسامح الجراحي).

4. تنظير القولون

  1. وضع الماوس تخدير عرضة / على ظهره على طاولة الفحص.
  2. إدارة 2 مل من حقنة شرجية عبر قنية زرر في القولون إذا اشتبه تحميل البراز الكبير الذي قد يحجب الرؤية. تنتظر الفئران في التبرز بعد إدارة حقنة شرجية. ادخال المنظار بعناية فائقة لتجنب ثقب.
  3. فتح كل صمامات من غمد مع واحد منهم أن يكون متصلا مضخة الهواء. ختم صمام الآخر مع السبابة الاستغناء الهواء. تضخم القولون مع الهواء، وببطء وبعناية، وخاصة في حالة خزعة أو الحقن.
  4. دفع المنظار فقط بقدر ما الثنية القولونية اليمنى لتجنب ثقب (4-5 سم من فتحة الشرج).
  5. تنظير القولون التشخيصي
    1. فحص الغشاء المخاطي للتعديلات التهابات أو الخبيثة في حين يتراجع المنظار. التراجع ببطء لتقييم محيط كامل من الامعاء. تقييم سنويا داخل اللمعةthologies باستخدام أنظمة التسجيل أنشئت المناسبة كما هو مطلوب.
    2. لتبرير موقف بالمنظار متطابقة لالتقاط صور خلال تصورات المتكررة للمناطق الجرح، لاحظ المسافة بين فتحة الشرج والفئران الآفة المخاطية. وعلاوة على ذلك، استخدم غيض من ملقط الخزعة كفاصل لتحقيق مسافة متطابقة بين المنظار ومنطقة الجرح خلال الحصول على الصور. ويرتبط حجم الجرح لحجم غمد المنظار، والتي تضم 3 مم.
      ملاحظة: ضع المنظار في موقف مماثل من خلال المقارنة البصرية مع صورة وثائق الامتحانات السابقة. آفات الإجراء في نفس الزاوية والمسافة في كل متابعة الفحص بالمنظار.
  6. إجراء خزعة
    1. أخذ خزعات بمساعدة اثنين من المحققين. إدخال ملقط الخزعة بعناية من خلال القناة تعمل حتى غيض من ملقط مرئيا على الشاشة إلى المحقق الثاني. ملقط فتح وإغلاق بعناية لثقب باطلة.
    2. الانتقال ملقط لموقع علم الأمراض.
  7. إجراء الحقن
    1. أداء إجراء الحقن بمساعدة اثنين من المحققين. قبل حقن ملء أنبوب مرن (0.96 ملم) تماما مع الوكيل إلى أن تدار. دفع أنبوب من خلال القناة تعمل حتى قنية (30 G) مرئيا على الشاشة إلى المحقق الثاني. تحضير حقنة غرامة وإدارة بلطف المبلغ المطلوب من وكيل التشخيصية أو العلاجية. يجب أن تكون أحجام حقن أقصى 50 ميكرولتر.
    2. ادخال الإبرة في submocosa في زاوية من 15-30 درجة. يواجه شطبة في اتجاه الغشاء المخاطي. يظهر الغشاء المخاطي علامة مميزة بعد رفع حقن ناجحة.
  8. مضان التنظير (FE)
    1. إدارة 60 ملغ FITC مترافق ديكستران مخففة في 100 ميكرولتر PBS عن طريق الوريد قبل مضان فحص بالمنظار.
    2. تحقق من نقطة زمنية المثلى بين حقنلديك فلوري المسمى التتبع وإجراءات التصوير التي تعتمد على التتبع الصيدلة. تكوين إعدادات نظام ممر الموجة مرشح وفقا لالإثارة وانبعاث الطول الموجي للالتتبع المستخدمة. إجراء التنظير مضان لاستشفاف غير محددة حجم الدم (على سبيل المثال، FITC) مباشرة بعد الحقن في الوريد من صبغة الفلورسنت لتقييم نمط الأوعية الدموية من سطح المخاطية.
    3. تنظر التصوير عدة ساعات بعد تطبيق التتبع في حالة استشفاف المستهدفة أو "تحقيقات الذكية" لتوفير أفضل هدف لخلفية النسبة.
    4. أداء تحميل الصور والفيديو والوثائق للنتائج.

5. بعد تنظير القولون

  1. فصل الماوس في قفص شاغرة وضعه على منشفة ورقية لحماية الماوس من الشفط القمامة. تدفئة الماوس مع مصباح REDLIGHT لمنع انخفاض حرارة الجسم. مراقبة الماوس ولا تترك دون حراسة حتى استعاد ذلك كافياالوعي للحفاظ على الاستلقاء القصية. مرة واحدة واعية تماما، ضع الماوس العودة إلى قفصه المعنيين.
  2. في نهاية التجربة، مكان الماوس في مربع صغير ولكن مانعة للتسرب وإدارة CO 2 (100٪ (V / V)، المجلد 100٪ و 3 لتر / دقيقة). الانتظار حتى يفقد وعيه الكامل الماوس ويتوقف التنفس. إرسال الماوس عن طريق كسر الرقبة. أداء البطن البطن وازدراع القولون. فتح القولون طوليا، وأغسلها لمزيد من التقييم النسيجي أو الجزيئي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

في رصد الجسم الحي من الأمعاء التئام الجروح
خلال التنظير الروتيني، والجروح التي يسببها المخاطية ميكانيكيا بواسطة ملقط الخزعة المصغرة التي يبلغ قطرها 3 الفرنسية (يساوي 1 مم؛ الشكل 1A). بعد ذلك، تم رصد التئام الجروح عن طريق الامتحانات بالمنظار اليومية وكميا عن طريق قياس منطقة الجرح المتبقية باستخدام برامج تحرير الصور، مثل يماغيج (الشكل 1B). يتم التعبير عن إغلاق الجرح الفردية مع مرور الوقت من قبل القسمة من منطقة الجرح الفعلية / منطقة الجرح الأولية. على سبيل المثال، في يوم 3 بعد جيل الجرح، تم انتشال 41٪ ± 4.1٪ من مساحة الجرح، بينما في يوم 7 كان الجرح عادة ما تلتئم تماما (الشكل 1C). بالإضافة إلى ذلك، في نهاية التجربة، والجروح يمكن مقطوعة لتقييم النسيجي خارج الحي. يصور عبارة عن صور تمثيلية من الهيماتوكسيلين ويوزين (H & E) -stained سرير الجرح في داذ 0 و 5 يوم (الشكل 1D).

العلاج بالحقن داخل المخاطية الموجهة التنظير
لتطبيقها داخل المخاطية من وكلاء الدوائية، تم إدخال أنبوب مرن (قطره 0.96 ملم) مع قنية ثابتة إلى النهاية (30 G) إلى القناة عمل المنظار (الشكل 2A). بعد التنسيب داخل المخاطية من الإبرة، وتم ضخ بعناية بحد أقصى 50 ميكرولتر. يدل على تطبيق ناجح داخل المخاطية، رفع الغشاء المخاطي للقولون يمكن ملاحظتها بسهولة ظاهريا (الشكل 2B، C).

في تقييم فيفو التهاب القولون التجريبي
بعد تحريض التهاب القولون، وأظهرت الفئران فقدان الوزن من يوم 3 مع فقدان الحد الأقصى لوزن الجسم من 19٪ التي تحدث في يوم 7 (الشكل 3A). بالإضافة إلى قياس وزن الجسم يوميا، تم رصد نشاط المرض بواسطة التنظير المتكررة والعيانية الكمي للالتهاب تلاه مؤشر بالمنظار الفئران من شدة التهاب القولون (MEICS). وفقا لفقدان وزن الجسم، وزيادة MEICS النتيجة في يوم 7 بعد بداية مفاجآت صيف دبي مما يدل على الضرر الهائل للالتهابات الغشاء المخاطي للقولون، الذي تحسينها في يوم 13 (الشكل 3B). لفيفو السابقين ارتباط الضرر النسيجي، تم كميا التعديلات التهابات القولون من أقسام الملون E-H وفقا لDieleman النتيجة 11. في يوم 7 بعد بداية مفاجآت صيف دبي، كان الضرر النسيجي أعلى بشكل ملحوظ في الفئران المعالجة مفاجآت صيف دبي مقارنة مع الضوابط كما يتضح من تعرية الظهارية، التقرحات المخاطية وكذلك زيادة تسلل العدلات وتحسن كبير في يوم 13 (الشكل 3C، E). بالإضافة إلى ذلك، تقييم الخزعات النسيجية المخاطية، التي تم الحصول عليها بشكل روتيني بالمنظار أثناء الامتحانات، أيد مرحلة متقدمة من التهاب القولون في يوم 7 (الشكل 3F-H).

محتوى "> الإسفار التنظير أورام القولون والمستقيم
بعد ما يقرب من 80 يوما تحريض الورم عن طريق AOM وثلاث دورات من مفاجآت صيف دبي (الشكل 4A)، وأورام القولون متعددة (الشكل 4C)، وكذلك علامات العيانية من التهاب مزمن مثل حبيبات الغشاء المخاطي (الشكل 4B) 10 وحظت بالتنظير. تقييم النسيجي للأورام القولون والمستقيم بواسطة H & E تلطيخ كشف أورام مع وبدون عالية الجودة [إينتربيثليل. ولذلك، فإن AOM-DSS-نموذج يشبه نموذج مثالي لدراسة العمليات الجزيئية التسرطن 12، وكذلك لتقييم الأجهزة التشخيصية جديدة 13. التصوير مضان استهداف جزيئات محددة يسمح في الجسم الحي التصوير الجزيئي مع "أساليب التصوير" 14،15. لإثبات جدوى FE، كنا FITC، وتألقي المستخدمة على نطاق واسع. للكشف FITC معين، نظام ممر الموجة مرشح مجتمعة مع لتر مصدر آيت المقدمة الطول الموجي الإثارة المحددة المطلوبة (490 نانومتر؛ الشكل 4D). لكشف دقيق من الطول الموجي الانبعاثات FITC محددة (525 نانومتر)، وموسط ممر الموجة مرشح الثاني بين رئيس الكاميرا والمنظار (الشكل 4E). لم FE دون تطبيق التتبع لا يكشف عن أي إشارة محددة ولا التفاعل مع أنسجة القولون أو البراز تألق ذاتي (الشكل 4F، G). في المقابل، مباشرة بعد تطبيق الوريد من FITC-ديكستران، يمكن ملاحظة أن تألقي في الغشاء المخاطي للقولون، ويمكن استخدامه لتقييم زيادة الأوعية الدموية في مناطق التهاب مزمن (الشكل 4H)، وكذلك الغشاء المخاطي الخبيث (الشكل 4I). وفقا لذلك، وتحديد حجم كثافة مضان من قبل برامج تحرير الصور أظهرت زيادة كبيرة في امتصاص تألقي داخل الأنسجة الخبيثة بالمقارنة مع الغشاء المخاطي للقولون غير المصاب (الشكل 4K).

"jove_content" FO: المحافظة على together.within الصفحات = "دائما"> الشكل 1
الرقم 1. مراقبة بالمنظار من الظهارية التئام الجروح في الجسم الحي، فضلا عن التقييم الكمي والنسيجي لالتئام الجروح، وبعد جيل من الجروح القولون، الحدود الجروح وإغلاق الجرح يمكن الكشف بسهولة. يتم تقييم منطقة الجرح (السهام البيضاء) يوميا خلال التنظير المتابعة لمتابعة كميا الظهارية التئام الجروح (A - C) خارج الحي، ومقطوعة الجروح وملطخة E-H & للتحليل النسيجي لالتئام الجروح (D). يتم تحديد المقاييس التي صورت شريط النطاق. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

إعادة 2 "FO: محتوى العرض =" 5in "SRC =" / الملفات / ftp_upload / 51875 / 51875fig2highres.jpg "العرض =" 500 "/>
الشكل 2. التنظير الموجهة داخل المخاطية العلاج بالحقن تحت المراقبة البصرية، ورأس الإبرة (A) يتم وضع بهدوء في الغشاء المخاطي للقولون و 50 ميكرولتر من المواد الذائبة يتم حقن (B). وفي وقت لاحق، شهد رفع المخاطية يمكن الاعتراف (النجمة) دون أي علامات النزيف الحاد (C). يتم تحديد المقاييس التي صورت شريط النطاق. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 3
وكان بالطبع من التهاب القولون بالمنظار الرقم 3. تقييم الدورة من مفاجآت صيف دبي التهاب القولون تقييم تجريبيد تغيرات في وزن الجسم، والامتحانات بالمنظار وكذلك التحليل النسيجي للأقسام القولون ملتهبة والخزعات بالمنظار. تماشيا مع خسائر كبيرة في وزن الجسم والضرر النسيجي المتقدم في يوم 7 (A، C، E، التكبير 10X)، والامتحانات والتقييم النسيجي بالمنظار من الخزعات التي تم الحصول عليها يصور علامات الالتهاب الحاد (B، D، G، H، التكبير 5X و10X) بينما في اليوم 13 بعد بدء مفاجآت صيف دبي والتعديلات التهابات تحسينها بشكل كبير. يتم تحديد المقاييس التي صورت شريط النطاق. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 4
فايجوري 4. FE أورام القولون والمستقيم. بعد تحريض cancerogenesis القولون والمستقيم بواسطة AOM والإدارة DSS دوري لمدة 11 أسبوعا (A)، وعلى ضوء التنظير الأبيض الكشف عن الغشاء المخاطي حبيبات تدل على التهاب القولون المزمن (B) والعديد من الآفات endoluminal (C) والتي تم تشخيصها على أنها أورام مع الدرجة العالية داخل الظهارة الأورام التي كتبها H & E تلطيخ فيفو السابقين (G). بينما كان التصور من التهاب مزمن (H) والأورام (I) من الممكن بسهولة باستخدام المستهدفة FE FITC، FE دون تطبيق التتبع لم تسمح نهائي الكشف عن الورم (F، G). وفقا لذلك، تمت زيادة الكمي لكثافة مضان بشكل ملحوظ داخل الأنسجة الخبيثة بالمقارنة مع الغشاء المخاطي للقولون غير المتضررين، يتضح من ملامح مقياس الرمادية (E، F). للتبديل إلى وضع مضان خلال colonoscop الضوء الأبيضذ، يتم توصيل ممر الموجة مرشح معين بالإضافة إلى مصدر الضوء البارد لتوفير الطول الموجي الإثارة محددة (على سبيل المثال، 490 نانومتر لFITC؛ D). هذا الفلتر يسهل التحول (السهم الأبيض) بين الضوء وسائط مضان البيضاء (D). لالتقاط الانبعاثات الطول الموجي محددة (على سبيل المثال، 525 نانومتر لFITC)، وموسط ممر الموجة مرشح الثاني بين المنظار ورئيس الكاميرا باستخدام مفصل حربة (E). يتم تحديد المقاييس التي صورت شريط النطاق. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 5
الشكل 5. التجريبي انشاء محطة عمل بالمنظار. محطة العمل بالمنظار ( B)، غمد المنظار (9 Charr) دون (C) والعمل مع قناة (D)، وكاميرا (. E) وملقط الخزعة (F). الرجاء النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

الظهارية التئام الجروح هو عملية مستمرة. يحدث تقشير المستمر الفسيولوجية للخلايا السطح داخل الغشاء المخاطي الهضمي تتطلب التجديد المتكرر للخلايا الظهارية 16. بالتالي، ضعف التئام الجروح له تأثير كبير على العديد من الأمراض بما في ذلك قرحة المعدة والأمعاء وتسرب توصيلي 17 18. تقييم الخلفية الجزيئية وكذلك المرشحين المحتملين المخدرات لتحفيز الشفاء الظهارية لا يجوز أداؤها غير كامل في أنظمة زراعة الخلايا في المختبر 19،20. وبالتالي، هناك حاجة الاجهزة التجريبية أكثر تطورا مثل تنظير القولون الفئران مع جيل من الجروح المخاطية التي يحددها ملقط الخزعة لتمكين موثوق التقييم في الجسم الحي من الهضمي التئام الجروح وتقييم التفاعلات المحتملة بين التهاب الأمعاء وعمليات التئام الجروح.

وبالإضافة إلى ذلك، يمكن استخدام إبرة الحقن للترocal الإدارة داخل المخاطية الأصباغ التشخيص أو المرشحين المحتملين المخدرات. ويمكن تحقيق ذلك باستخدام أنبوب مرن (قطره 0.96 ملم) مع إبرة مثبتة في النهاية يمكن إدخالها من خلال القناة العاملة. وبالنظر إلى أن وكيل الاختبار وكذلك السيطرة وهمي قد يتم تسليمها في الآفات الالتهابية أو الورمية منفصلة داخل نفس الحيوان، ويوفر هذا النهج ميزة في موثوقية مقارنة إعدادات التجريبية التقليدية. تطبيق مزيد من الحقن المحلية هو زرع الخلايا السرطانية الإنسان أو الفئران لتوليد مثلي الأورام في القولون الفئران 21.

وهناك حاجة إلى نماذج الفئران من التهاب القولون لتوضيح الفيزيولوجيا المرضية وكذلك لتقييم وكلاء العلاجية المحتملة preclinically. ولذلك، رصد دقيق لمسار المرض أمر في غاية الأهمية. تقليديا، يتم تقييم شدة المرض عادة من قبل المعلمات غير المباشرة مثل وزن الجسم، واختبار haemoccult فضلا عن تحليلمن الدم والبراز. في المقابل، تقرير مباشر من شدة التهاب القولون غالبا ما تقتصر على التحليل النسيجي بعد الوفاة، الأمر الذي يتطلب موت الحيوان. ومع ذلك، قولون الفئران يوفر رؤية مباشرة من الغشاء المخاطي القولون من الفئران الحية. وعلاوة على ذلك، والرصد المباشر والمتكرر لميزات التهاب القولون هو ممكن، وهي المطلوبة في نماذج تجريبية مع بداية ظهور أعراض المرض غير متجانسة، على سبيل المثال، IL-10 الفئران ناقصة أو في نموذج transfercolitis في الفئران التي تعاني من نقص الفريق الاستشاري. ونتيجة لذلك، تم إنشاء مؤشر الفئران التهاب القولون بالمنظار 6 الذي يسمح الكمي الموضوعي للالتهاب الغشاء المخاطي وفحوصات متابعة المسلسل الى نفس الحيوان.

في سياق التسرطن القولون والمستقيم، تنظير القولون يوفر الفرص المفيدة المختلفة. على سبيل المثال، على النقيض من طرق غير الغازية، التنظير هو النهج الأول للسماح في تقرير الجسم الحي من حجم الورموأرقام الورم. وعلاوة على ذلك، فإن استخدام photoprobes الفلورسنت استهداف جزيئات محددة يمكن التصور النوعي والكمي لعمليات الجزيئية. في دراسة متعدية يؤديها Foersch وآخرون. وقد أظهرت استهداف معين من التعبير VEGF داخل الغشاء المخاطي للقولون الخبيث ليكون ممكنا، ويمكن استخدامه لتوصيف الآفة والتنبؤ الاستجابة للعلاج في المرضى من البشر المصابين بسرطان القولون والمستقيم 22. وعلاوة على ذلك، المعلومات الناتجة عن هذا النهج التصوير الجزيئي قد تكون قادرة على أن تترجم للاستخدام في المرضى من البشر. وسيتيح هذا التوصيف حية من الآفات المشتبه بها أثناء التنظير. أخيرا، ما يسمى "تحقيقات الذكية" زيادة خصوصية هذه استشفاف بواسطة تفعيل fluorophores من العمليات الأنزيمية على جانب الآفة المستهدفة 23.

عند إجراء التنظير الفئران، خطوات معينة للبروتوكول معين حاسمة بشكل خاص. على سبيل المثال، مو مختلفةاستخدام سلالات تختلف في قابليتها للتخدير وتركيزات مفاجآت صيف دبي. ولهذا البروتوكول قد تكون هناك حاجة لأن تتكيف مع الأوضاع المحلية. وعلاوة على ذلك، مطلوب خبرة في أداء امتحانات بالمنظار والمعرفة الدقيقة لتشريح الفئران لإجراء التنظير الأمثل الفئران التي هي آمنة وموجهة نحو الهدف. فيما يتعلق القيود المحتملة لهذه التقنية، نؤكد على أن النظام المستخدم هو المنظار جامدة، وبالتالي الحد من الإجراء لالقولون بقدر ما الثنية الصحيحة. وعلاوة على ذلك، فإن معظم fluorochromes ينطبق على FE يجري حاليا تقييم بشأن سلامتهم الشخصية، وبالتالي حين متاحة للدراسات الفئران، لا يتم الموافقة عليها بعد لاستخدامها في المرضى من البشر.

وفيما يلي الخطوات الحاسمة بشأن العملية الإجراء: (1) منذ التعرض لمفاجآت صيف دبي التي يسببها التهاب القولون قد تختلف بين سلالات مختلفة، وتحريض التهاب القولون الحاد مفاجآت صيف دبي قد خطر الموت من الحيوانات إذا كان هناك أدفanced شدة من التهاب القولون. لذلك، والنظر في تقييم تركيزات عدة مفاجآت صيف دبي لتحديد الأنسب لسلالة الفردي والدفعة DSS المحددة المستخدمة. الفحص بالمنظار قد يكون صعبا في وجود جماهير كبيرة البراز intracolonic. حمل حركة الامعاء قبل الإجراء باستخدام تطبيق المستقيم من 2 مل من السوائل عن طريق حقنة شرجية قنية زرر من شأنها تحسين الرؤية إذا اشتبه تحميل البراز الكبير الذي قد يحجب الرؤية. في حالة حدوث ثقب معدلات عالية خلال خزعة، وانخفاض العرض الجوي في القولون قبل الحصول على خزعات المخاطية ويقلل من ضغط ملقط الخزعة على سطح الغشاء المخاطي قبل إغلاق الفروع.

أخذت معا، على عكس الطرق التقليدية لتقييم نشاط المرض من التهاب القولون التجريبي أو cancerogenesis من قبل المعلمات غير المباشرة مثل وزن الجسم، وحدوث الدم البراز، وتحليل الدم المحيطي أو التحليل النسيجي بعد الوفاة، نهايةتقنيات القائم على oscopy تمكن الرصد المباشر لمسار المرض فرصة لأداء الخزعات تحت المراقبة البصرية. بالإضافة إلى ذلك، التئام الجروح وتأثير علاجي من المرشحين المخدرات يطبق موضعيا يمكن تقييمها في الجسم الحي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

Acknowledgments

نشكر سونيا Dufentester وإلكه يبر للمساعدة التقنية الخبراء. نشكر Faekah جوهر لتصحيح التجارب المطبعية المخطوطة وستيفان بروكنر لدعم المعلوماتية الطبية. وأيد هذا العمل من خلال منحة من التخصصات عدا-كرونة-فريزنيوس شتيفتونغ (2012_A94). وأيد D. Bettenworth بواسطة زمالة أبحاث من كلية الطب، Westfälische فيلهلم-UNIVERSITÄT مونستر. وأيد محمد بروكنر من قبل "Gerok" موقف التناوب للجمعية الألمانية للبحوث (DFG SFB1009B8). نشكر هايكه بلوم للتوضيح من الكرتون الماوس.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
Alfalfa-free diet Harlan Laboritories, Madison, USA 2014
Azoxymethane (AOM) Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Germany A5486
Bepanthen eye ointment Bayer, Leverkusen, Germany 80469764
Dextran sulphate sodium (DSS) TdB Consulatancy, Uppsala, Sweden DB001
Eosin Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Germany E 4382
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Germany E 9884
Falcon Tube 50 ml BD Biosciences, Erembodegem, Belgium 352070
Florene 100 V/V Abbott, Wiesbaden, Germany B506
Haematoxylin Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Germany HHS32-1L
Isopentane (2-Methylbutane) Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Germany M32631-1L
Methylene blue Merck, Darmstadt, Germany 1159430025
O.C.T. Tissue Tek compound                                  Sakura, Zoeterwonde, Netherlands 4583
Omnican F - canula Braun, Melsungen, Germany 9161502
Phosphate buffered saline, PBS Lonza, Verviers, Belgium 4629
Sodium Chloride 0.9% Braun, Melsungen, Germany 5/12211095/0411
Standard diet Altromin, Lage, Germany 1320
Tissue-Tek Cryomold Sakura, Leiden, Netherlands 4566
Vitro – Clud                                                                R. Langenbrinck, Teningen, Germany 04-0002 
Equipment
AIDA Control Karl Storz - Endoskope, Tuttlingen, Germany 20 096020
Bandpass filter Semrock, Rochester, USA HC 716/40
Bandpass filter Semrock, Rochester, USA HC 809/81
Biopsy Forceps, 3 Fr., 28 cm Karl Storz - Endoskope, Tuttlingen, Germany 61071ZJ
Dell Monitor Dell, Frankfurt am Main, Germany U2412Mb
Examination Sheath, 9 Fr. Karl Storz - Endoskope, Tuttlingen, Germany 61029D
Examination Sheath, 9 Fr. Karl Storz - Endoskope, Tuttlingen, Germany 61029C
Fiber Optic Light Cable, 3.5 mm Karl Storz - Endoskope, Tuttlingen, Germany 69495NL
Fluorescein Blue Filter System Karl Storz - Endoskope, Tuttlingen, Germany 20100032
Fluorescein Barrier Filter Karl Storz - Endoskope, Tuttlingen, Germany 20100033
Foot switch Karl Storz - Endoskope, Tuttlingen, Germany 20010430
HOPKINS Telescope, 1.9 mm, Length 10 cm Karl Storz - Endoskope, Tuttlingen, Germany 1830231
SCB D-light P  Karl Storz - Endoskope, Tuttlingen, Germany 20 133720
SCB tricam SL II Karl Storz - Endoskope, Tuttlingen, Germany 20 2230 20
Tubing set instruments VETPUMP II Karl Storz - Endoskope, Tuttlingen, Germany 69811
Tricam PDD PAL Karl Storz - Endoskope, Tuttlingen, Germany 20221037
UniVet Porta Groppler Medizintechnik, Deggendorf, Germany BKGM 0451
Vetpump 2 Karl Storz - Endoskope, Tuttlingen, Germany 69321620

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bettenworth, D., et al. Translational 18F-FDG PET/CT imaging to monitor lesion activity in intestinal inflammation. Journal of nuclear medicine : official publication, Society of Nuclear Medicine. 54, 748-755 (2013).
  2. Lewis, J. S., Achilefu, S., Garbow, J. R., Laforest, R., Welch, M. J. Small animal imaging. current technology and perspectives for oncological imaging. European journal of cancer. 38, 2173-2188 (2002).
  3. Huang, E. H., et al. Colonoscopy in mice. Surgical endoscopy. 16, 22-24 (2002).
  4. Becker, C., et al. In vivo imaging of colitis and colon cancer development in mice using high resolution chromoendoscopy. Gut. 54, 950-954 (2005).
  5. Becker, C., Fantini, M. C., Neurath, M. F. High resolution colonoscopy in live mice. Nature protocols. 1, 2900-2904 (2006).
  6. Neurath, M. F., et al. Assessment of tumor development and wound healing using endoscopic techniques in mice. Gastroenterology. 139, 1837-1843 (2010).
  7. Pickert, G., et al. STAT3 links IL-22 signaling in intestinal epithelial cells to mucosal wound healing. The Journal of experimental medicine. 206, 1465-1472 (2009).
  8. Shapira, Y., et al. Utilization of murine laparoscopy for continuous in-vivo assessment of the liver in multiple disease models. Plos one. 4, e4776 (2009).
  9. Wirtz, S., Neufert, C., Weigmann, B., Neurath, M. F. Chemically induced mouse models of intestinal inflammation. Nature protocols. 2, 541-546 (2007).
  10. Neufert, C., Becker, C., Neurath, M. F. An inducible mouse model of colon carcinogenesis for the analysis of sporadic and inflammation-driven tumor progression. Nature protocols. 2, 1998-2004 (2007).
  11. Dieleman, L. A., et al. Chronic experimental colitis induced by dextran sulphate sodium (DSS) is characterized by Th1 and Th2 cytokines. Clinical and experimental immunology. 114, 385-391 (1998).
  12. Gao, Y., et al. Colitis-accelerated colorectal cancer and metabolic dysregulation in a mouse model. Carcinogenesis. 34, 1861-1869 (2013).
  13. Foersch, S., Neufert, C., Neurath, M. F., Waldner, M. J. Endomicroscopic Imaging of COX-2 Activity in Murine Sporadic and Colitis-Associated Colorectal Cancer. Diagnostic and therapeutic endoscopy. 2013, 250641 (2013).
  14. Bremer, C., Ntziachristos, V., Weissleder, R. Optical-based molecular imaging: contrast agents and potential medical applications. European radiology. 13, 231-243 (2003).
  15. Keller, R., Winde, G., Terpe, H. J., Foerster, E. C., Domschke, W. Fluorescence endoscopy using a fluorescein-labeled monoclonal antibody against carcinoembryonic antigen in patients with colorectal carcinoma and adenoma. Endoscopy. 34, 801-807 (2002).
  16. Jones, M. K., Tomikawa, M., Mohajer, B., Tarnawski, A. S. Gastrointestinal mucosal regeneration: role of growth factors. Frontiers in bioscience : a journal and virtual library. 4, 303-309 (1999).
  17. Mertz, H. R., Walsh, J. H. Peptic ulcer pathophysiology. The Medical clinics of North America. 75, 799-814 (1991).
  18. Pantelis, D., et al. The effect of sealing with a fixed combination of collagen matrix-bound coagulation factors on the healing of colonic anastomoses in experimental high-risk mice models. Langenbeck's archives of surgery / Deutsche Gesellschaft fur Chirurgie. 395, 1039-1048 (2010).
  19. Burk, R. R. A factor from a transformed cell line that affects cell migration. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 70, 369-372 (1973).
  20. Msaki, A., et al. The role of RelA (p65) threonine 505 phosphorylation in the regulation of cell growth, survival, and migration. Molecular biology of the cell. 22, 3032-3040 (2011).
  21. Zigmond, E., et al. Utilization of murine colonoscopy for orthotopic implantation of colorectal cancer. PloS one. 6, e28858 (2011).
  22. Foersch, S., et al. Molecular imaging of VEGF in gastrointestinal cancer in vivo using confocal laser endomicroscopy. Gut. 59, 1046-1055 (2010).
  23. Mitsunaga, M., et al. Fluorescence endoscopic detection of murine colitis-associated colon cancer by topically applied enzymatically rapid-activatable probe. Gut. 62, 1179-1186 (2013).

Tags

الطب، العدد 90، أمراض الجهاز الهضمي،
الفئران التنظير ل<em&gt; في فيفو</em&gt; شفاء المتعدد الوسائط التصوير من التسرطن وتقييم المعوية والتهاب الجرح
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Brückner, M., Lenz, P.,… More

Brückner, M., Lenz, P., Nowacki, T. M., Pott, F., Foell, D., Bettenworth, D. Murine Endoscopy for In Vivo Multimodal Imaging of Carcinogenesis and Assessment of Intestinal Wound Healing and Inflammation. J. Vis. Exp. (90), e51875, doi:10.3791/51875 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter