Summary
Phospholipid fedtsyrer giver oplysninger om strukturen af jordens mikrobielle samfund. Vi præsenterer fremgangsmåder til ekstraktion fra jordprøver med en enfaset chloroform-blanding, fraktionering af ekstraherede lipider ved anvendelse af fastfase ekstraktionskolonner, og methanolyse for at fremstille fedtsyremethylestere, som analyseres ved kapillær gaschromatografi.
Abstract
Phospholipid fedtsyrer (PLFAs) er centrale elementer i mikrobielle cellemembraner. Analysen af PLFAs udvundet jord kan give oplysninger om den overordnede struktur af terrestriske mikrobielle samfund. PLFA profilering har været flittigt brugt i en række økosystemer som biologisk indeks af jord overordnede kvalitet, og som en kvantitativ indikator for jordens reaktion på arealforvaltning og andre miljømæssige stressfaktorer.
Den standard metode præsenteres her skitserer fire centrale trin: 1. lipid ekstraktion fra jordprøver med en chloroform blanding enfaset, 2. fraktionering hjælp fastfase ekstraktion kolonner til at isolere phospholipider fra andre udtrukne lipider, 3. methanolyse af phospholipider til at producere fedtsyre methylestere (fames) og 4. FAME analyse ved kapillær gaschromatografi under anvendelse af en flammeionisationsdetektor (GC-FID). To normer, anvendes, herunder 1,2-dinonadecanoyl--sn-glycero-3-phosphocholin (PC (19:0/19: 0)) at vurdere den samlede inddrivelse af udvinding metode, og methyl decanoate (MeC10: 0) som en intern standard (ISTD) til GC-analyse.
Introduction
Phospholipid fedtsyrer (PLFAs) er en del af mikrobielle cellemembraner fra domænerne Bakterier og Eukarya. Mikroorganismer producerer PLFAs med forskellige kædelængder og sammensætning som et middel til at opretholde celle-membran integritet og cellulær funktion som svar på deres umiddelbare miljøforhold; hvorfor det kan hævdes, at mikrobielle samfund, der er geografisk adskilte, men er udsat for lignende jordbundsforhold vil udtrykke lignende PLFAs. Jord- PLFAs med en kædelængde mellem 14 og 20 C-atomer er typisk anses for at være af overvejende bakteriel og fungal oprindelse 1. I blandede kulturer, kan PLFA analyse ikke anvendes til at identificere individuelle mikrobielle arter, men det kan give et samlet fingeraftryk af de mikrobielle samfund der findes i jord. Eftersom PLFAs hurtigt nedbrydes ved celledød, kan de anses for at være repræsentative for den levedygtige jordmikrobiel samfund 2. Denne technique har været flittigt brugt til at karakterisere den strukturelle sammensætning af mikrobielle samfund findes i en lang række miljøer, der spænder fra skove 3-4 til prærier 5-6 og marker 7. Det har været anvendt med succes i karakterisere jord reaktion at lande ledelsesændringer, herunder skov klar-skæring 8, kalkning 9, regenerering 10-12, samt forstyrrelser såsom brand 13, forurening med metaller 14 og kulbrinter 15, og insekt udbrud 16 .
Den moderne PLFA analysemetode udviklet i løbet af de sidste seks årtier gennem flere centrale fremskridt ved en række forskningsgrupper. I 1958 opstod en signifikant forbedring at tilpasse chloroform: methanol: vand-forhold i ekstraktionsopløsningen at flytte blandingen fra en enfaset til et tofaset system, 17. Denne optimerede lipid ekstraktion og den reviderede isolation proprotokol blev kendt som Bligh og Dyer metode. Protokollen blev vedtaget af mange laboratorier i de kommende årtier, og i løbet af denne tid, Hvid og kolleger bidrog betydelige fremskridt af metoden; for eksempel, de forbedret ekstraktionstrinet ved at udveksle en fosfatbuffer for vand, og de optimerede analyse ved gaskromatografi (GC) gennem øget peak identifikation og kvantificering. Måske mere relevante for jord videnskab, besluttede de i 1979 at de ekstraherede lipider kunne bruges som et indeks for mikrobiel struktur, når de undersøgte den mikrobielle biomasse af marine sedimenter 18.
Yderligere udvikling fandt sted i 1980'erne, da den metode blev mere almindeligt brugt i jord videnskab, specielt i relation til rhizosfæren 19. På det tidspunkt, hvor fremgangsmåden inkluderet methyl nonadecanoate (MeC19: 0) som intern standard 19 og anvendelse af en kiselsyre kolonnen for lipid fraktionering 21 </ Sup>. Efter sit arbejde med White 19,21, Tunlid tilbage til Sverige og begyndte forskningssamarbejde med Baath-partiet og Frostegård. Ved at undersøge effektiviteten af forskellige udvinding buffere til en suite af jord varierende indhold af organisk stof, viste den gruppe, den citratbuffer øget mængden af lipid fosfat udvundet sammenlignet med fosfatbuffer 22. Endvidere deres 1993 publikation 23 på indflydelsen af kalkning på jordmikrobiel samfund gik på at blive en citation klassiker i Soil Biologi & Biokemi 24. Forskerne udnyttede principal komponent analyse i deres databehandling. PLFA analyse, som den metode nu kaldes, genererer store datasæt og brug af multivariate statistiske procedurer til at behandle disse data var meget nyskabende for den tid og inspirerende for mange. Samtidig med det arbejde, der gøres i Sverige, blev ændringer af PLFA procedure undersøges iTyskland ved Zelles og kolleger 25-26. Deres version af proceduren var kendt for sin brug af en fast-fase ekstraktion (SPE) søjle i stedet for den kiselsyre kolonnen, men samlet set var mere laboratorium intensivt.
Frostegård papir 23, sammen med den detaljerede metodologi ved White & Ringelberg 27, forudsat fundamentet for en eksplosion i brugen af PLFA teknik til at undersøge grundlæggende spørgsmål i jord videnskab. Siden da har yderligere forbedringer af den metode, Firestone og kolleger inkluderet tilføje en intern GC standard (C10: 0) og C19: 0 som et surrogat standard for at forbedre kvantificering 28, og erstatte brugen af skilletragte til runde bund hætteglas at forenkle ekstraktion 29. For nylig, Chowdhury og Dick 30 undersøgte trin methylering og rapporterede, at de to methylering procedurer, der anvendes i jorden videnskab litteratur KOH / MeOH metode identceret et større udvalg af fedtsyrer.
I denne procedure er i vid udstrækning baseret på den oprindelige metode udviklet af Bligh og Dyer, og inkorporerer de ovennævnte modifikationer, såsom brugen af methanolisk KOH for methylering trin. To standarder anvendes til hver prøve: en surrogat standard af 1,2-dinonadecanoyl--sn-glycero-3-phosphocholin (PC (19: 0/19: 0)), der tilsættes til jordprøven inden den første ekstraktion at vurdere effektiviteten og genopretning af hele protokol, og et instrument standard af methyl decanoate (MeC10: 0), som er tilsat før identifikation og kvantificering ved GC.
Vi anerkender, at PLFA metode er almindeligt brugt af mange mikrobielle økologi laboratorier verden over, og er blevet dokumenteret mange gange, herunder af International Organization for Standardization 2. Formålet med denne artikel er at præsentere en let at følge og robust protokol, der kan være nyttige for jordforskere, der forsøger at lære PLFA teknikken.
Protocol
BEMÆRK: Sørg altid at ordentlig personlige værnemidler (PPE) er slidt hele protokollen. Glas må ikke berøres med de bare hænder. Lipider fra fingre, hår, fedt, olier og kulbrinter er alle potentielle kontaminanter. Brug altid nitrilhandsker og skyl handsker med 70% alkohol ved håndtering rene glasvarer.
1. Fremstilling af Glas til Analyse
- Engangs glasvarer (f.eks centrifugeglas)
- Wrap i aluminiumsfolie og varme i muffelovnen for fire og en halv time ved 450 ºC.
- Polytetrafluorethylen (PTFE) -lined hætter
- Soak hætter i en time i fosfat vaskemiddel, og vask derefter med skurebørste i varmt vand og fosfat rengøringsmiddel. Skylle sæbe med postevand.
- Sted i syrebad (5% HCI) i en time kun (ikke forlader længere som foringerne kan falde ud af hætterne, hvis de er gennemvædet i for lang tid. Skyl tre gangei ledningsvand. Skyl tre gange i destilleret vand. Tør i ovnen ved 40 ºC.
- Genanvendelig glasvarer (fx 10 ml, 15 ml, 45 ml hætteglas / krukker)
- Vask med skurebørste i varmt vand og fosfat rengøringsmiddel. Skyl sæbe med vand fra hanen og sted i syrebad (5% HCI) natten over. Skyl tre gange i ledningsvand, derefter skylles tre gange i destilleret vand og derefter tørre i ovnen ved 40 ºC.
- Wrap i ren aluminiumsfolie (50 ml krukker er pakket enkeltvis og andre glasvarer er pakket ind i prøvebatcher, fx 20) og varme i muffelovnen for fire og en halv time ved 450 ºC.
- Volumetrisk glasvarer (f.eks målekolbe)
- Vask med skurebørste i varmt vand og fosfat rengøringsmiddel. Skyl sæbe med vand fra hanen og sted i syrebad (5% HCI) natten over. Skyl tre gange i postevand, skylles tre gange i destilleret vand, og derefter tørres i ovn ved 40 &# 186; C.
- Før brug skylles 3 gange med en lille mængde opløsningsmiddel (f.eks methanol) - ikke sætte volumetrisk glasudstyr i muffelovnen.
2. Indsamling og behandling af jordprøver Før PLFA Analyse
- Saml jordprøver i sterile poser, og medmindre disse kan analyseres med det samme, fryse dem så hurtigt som muligt. Opbevar prøver i fryser (-80 ºC), indtil klar til at fortsætte med frysetørring af prøver. Frys tørre partier af prøver efter de anvisninger fryse tørretumbler.
- Overfør hver frysetørret prøve til ny-mærket steril pose. Afvej prøve fra frysetørret materiale i posen i præ-mærkede dæmpet centrifugerør for PLFA udvinding.
BEMÆRK: En generel retningslinje er at bruge 0,5 g for organiske materialer (kulstofindhold> 17% wt) og op til 3,0 g for prøver mineralsk jord. Optag prøvevægt for hver prøve. - For hver 10 prøver, også afvejes enyderligere to eksemplarer til analyse, og for hver 20 prøver indbefatter en tom (dvs. et centrifugerør, der ikke har nogen prøve i det - anvendt som en kontrol for at identificere enhver potentiel kontaminering under PLFA ekstraktionsprocessen). Proces partier af prøveglas på samme tid.
BEMÆRK: Et sæt på 20 prøver vil svare til en batch af 23 prøveglas (prøve 1 til 10, en kopi af prøve 10, prøver 12 til 22, en kopi af prøve 22, og en blank = batch af 23 prøverør).
BEMÆRK: Udfør udvinding, så adskillelse, så methylering i partier af prøver før forberede dem til GC-analyse og køre dem alle sammen. Dette medvirker til at identificere, hvor fejl være sket, hvis noget går galt, og kan medvirke til at sænke antallet af nødvendige gentagne ekstraktioner.
3. PLFA Teknik (trin er til individuel prøve, men komplet én hele partiet ad gangen)
BEMÆRK: Alle trin i PLFA teknik er beskrevet i trin1-3 nedenfor bør udføres i et stinkskab ved hjælp passende værnemidler og efter lab sikkerhedsretningslinjer.
- Ekstraktion (trin 1):
- Forbered 5,0 M KOH ved opløsning 14 g KOH i 50 ml destilleret, deioniseret vand (dH 2 O).
- Forbered 0,15 M citratbuffer ved at opløse 31,52 g citronsyre monohydrat i 400 ml dH 2 O. Juster til pH 4,00 ± 0,02 ved at tilføje 5,0 M KOH; ca 45-50 ml 5,0 M KOH vil være forpligtet til at justere pH til 4,00. Når pH er justeret, fortyndes citratpuffer til 1.000 ml ved anvendelse af en målekolbe. Opbevar citratbuffer i køleskabet, når den ikke er i brug (i op til en måned).
- Forbered dagligt pc'en (19: 0/19: 0) nonadecanoate surrogat standard ved fortynding 250 pi af stamopløsningen (10 mg / ml) i 25 ml chloroform (dette giver nok surrogat standard for et parti 23 prøver). Tilsæt 0,5 ml PC (19: 0/19: 0) surrogat standardopløsning til prøven centrifugerør.
- ENdd Bligh og Dyer ekstraktionsmiddel til jordprøven i følgende rækkefølge: i) 2,0 ml citratbuffer, ii) 2,5 ml chloroform, og iii) 5,0 ml methanol. Cap prøve med en PTFE-foret hætte og vortex i 30 sek; placere i ende-over-ende rysteapparat i 2 timer.
- Centrifuger ved 226 xg i 15 min med låg på. Tegn supernatanten med en Pasteur-pipette og overføres til et mærket 45 ml hætteglas.
- Tilføj en anden runde af Bligh og Dyer ekstraktionsmiddel til hver prøve, og gentage trin 4 og 5 ovenfor. Tegn supernatanten med en Pasteur-pipette og overføres til den samme mærkede 45 ml hætteglas.
- Tilføj til mærket 45 ml hætteglas indeholdende supernatant: i) 5,0 ml chloroform, og ii) 5,0 ml citratbuffer. Cap med hvid PTFE-foret hætte og vortex hætteglas i 30 sek. Lad det sidde natten over ved stuetemperatur i mørke (for at undgå oxidation).
- Forsigtigt vakuum ned fra den øvre vandige fase af 45 ml hætteglas (hvis intet vakuum er til rådighed, skal pipetten sænkes gennem aqueskellige fase meget omhyggeligt for ikke at indsamle i pipetten når pipettering den organiske fase). Pipette lavere organiske fase i mærket 15 ml hætteglas.
- Sted parti på 15 ml hætteglas under komprimeret N2 (for at undgå oxidering) ved stuetemperatur. Fordampe chloroform langsomt, indstilling af N2-strøm til pjuske overfladen af væsken i hætteglasset, men ikke klatre siderne af hætteglasset.
- Skru PTFE-foret cap og gemme prøver i fryseren ved -20 ºC indpakket i aluminiumsfolie (wrap i partier frem for individuelt), indtil klar til at fortsætte med trin 2.
- Lipid fraktionering (trin 2)
- Placer SPE-søjle holder med tappe på glasset tank. Indsætte nye SPE-søjlerne (silica, 500 mg, 6 ml) i tappe. Label kolonner som nødvendigt (anbefales at undgå at blande op prøver).
- Konditioneres hver kolonne ved at tilføje 5 ml acetone og lade det dræne igennem, og derefter tilføje to tilføjelser af 5 ml chloroform (totalvolumen = 10 ml). Tillad sekunder chloroform vask til at flyde ud indtil ~ 1 mm over fritten og derefter lukke studs.
- Re-opløse prøve (opbevaret i 15 ml hætteglas ved afslutningen af trin 1) ved tilsætning af 0,5 ml chloroform til glas og vortex forsigtigt. Overførsel genopløst prøven til SPE-søjle under anvendelse af en Pasteur-pipette; gentag for i alt 2 overførsler (samlet overførsel volumen på 1 ml chloroform pr prøve).
- Lay lipid prøve direkte ind i centrum af kolonnen, og lad opløsningsmidlet løbe helt ind tank.
- Eluer neutrale lipider ved tilsætning af 5 ml chloroform til hver kolonne. Tillad opløsningsmiddel løbe helt ind tank.
- Eluer glycolipider ved tilsætning af 5 ml acetone til hver kolonne. Tillad opløsningsmiddel løbe helt ind i opsamlingstanken.
- Fjern kolonne stå fra tank og afløb tank med vakuum apparat. Indsæt rack med rene og mærkede centrifugerør ind i tanken. Udskift kolonne stå på tanken; mærket kolonne ovenstående bør linje med mærket centrifuge rør nedenfor.
- Eluer phospholipider til centrifugerør ved tilsætning af 5 ml methanol til hver kolonne. Vent SPE kolonner til at tørre ud i stinkskab før bortskaffelse af dem. Tørre ned phospholipidfraktioner ved stuetemperatur under komprimeret N2.
- Purge rør med N 2. Skru PTFE-foret cap og gemme prøver i fryseren ved -20 ºC indpakket i aluminiumsfolie (wrap i partier frem for individuelt) indtil den er klar til at gå videre til Trin 3.
- Lipid methylering (trin 3).
- Tænd for varmt vandbad indstillet til 37 ºC. Forbered 1M eddikesyre (hvis det ikke allerede gjort) ved at opløse 57,1 ml iseddike i 1000 ml dH 2 O ved hjælp af en 1000 ml målekolbe. Denne opløsning kan opbevares ved stuetemperatur i op til tre måneder. .
- Forbered batch af methanolisk KOH. Forbered 0,2 M KOH-opløsning ved at opløse 0,45 g KOH i 40 ml methanol. Juster volumen KOH og methanol i overensstemmelse med ennticipated batch størrelse i trin 3. Forbered denne løsning dagligt; må ikke opbevares i længere perioder.
- Fjern prøverne (i centrifugerør lagret efter trin 2) fra fryseren og tillade prøver at komme til stuetemperatur. Tilsæt 0,5 ml chloroform og 0,5 ml methanol til hver prøve, efterfulgt af 1,0 ml methanolisk KOH. Cap rør stramt med PTFE-foret hætte. Swirl at blande.
- Anbring forseglede prøver i 37 ºC bad i 30 minutter. Sikre, at vandniveauet er et minimum på 1-2 mm over niveauet af prøvevæsken. Fjern og tillade prøver at afkøle. Mens prøverne er i vandbad, mærke små hætteglas med prøve-id'er (10 ml hætteglas med PTFE-foret hætte).
- Tilføj 2,0 ml hexan til hver prøve og hvirvel. Derpå tilsættes 0,2 ml 1,0 M eddikesyre til hver prøve og hvirvel at blande igen; faseseparation bør blive synlig.
- Tilsættes 2,0 ml dH2O til hver prøve til at bryde fase. Vortex prøver til 30 sek. Centrifugeres prøverne ved 226 xg i 2 min.
- Ved brug afkort Pasteur pipette den øverste fase at rengøre mærket 10 ml hætteglas. Pas på ikke at overføre nogen af de lavere (vandige) fase.
- Tilsæt 2,0 ml hexan til hver prøve centrifugerør og hvirvel. Vortex prøver til 30 sek. Centrifugeres prøverne ved 226 xg i 2 min.
- Brug af korte Pasteur pipette, igen tilføje den øverste fase til den mærkede 10 ml hætteglas.
- Fordampe opløsningsmiddel i mærket-10 ml hætteglas ved stuetemperatur under N2. Skru PTFE-foret cap og gemme prøver i fryseren ved -20 ºC indpakket i aluminiumsfolie (wrap i partier frem for individuelt), indtil klar til at fortsætte med GC-analyse. Vær sikker på at mærke alle prøver.
- Gaskromatograf (GC) analyse
BEMÆRK: Identifikation og kvantificering af de enkelte PLFAs opnås ved anvendelse af en GC forbundet til enten en FID eller en MS-detektor. Mens vejledningen nedenfor er for GC-FID, ville prøveforberedelse gyldigt i GC-MS som well. Et eksempel set-up for et GC-FID-systemet vil omfatte en 25 m × 0,2 mm × 0,33 um (5% phenyl) -methylpolysiloxane kolonne med følgende temperatur protokol: indledende temperatur 190 ºC, rampe 10 ºC / min til 285 ºC , hold 9,5 min, rampe 60 ºC / min til 310 ºC, hold 0,42 min 31.- Forbered GC interne standard (ISTD) ved at tilføje en dråbe MeC10: 0 (methyl decanoate) til 100 ml hexan (rekord tilføjet vægt til 0,1 mg). Tænd gasser til GC og tænd derefter GC. Kontroller, at H2, N2 og luftcylindre er åbne og at der er tilstrækkelig gas til at køre analysen (H2 bør aldrig komme under 500 psi).
- Kontroller at betingelserne for en god kalibrering er opfyldt ved at køre kalibreringsstandarder indeholder en blanding af fedtsyrer, efterfulgt af en hexan tom. Identitet af individuelle fedtsyrer kan tildeles manuelt baseret på sammenligninger med retentionstider opnået for standarder, eller det kan være Automatically tildelt anvendelse af kommercielt tilgængelige software 31. I alle tilfælde kan utvetydig identifikation opnås ved anvendelse af en MS-detektor 2.
BEMÆRK: Yderligere tegn på en god kalibrering omfatter fladskærms baseline og ingen forurening i hexan skyl. - hver PLFA prøve rest (indeholdt i 10 ml hætteglas fra lipid methylering trin 3) i 150 pi af ISTD Opløs og overføres til GC hætteglas (alternativt bruge 50 til 75 pi, hvis prøven reaktion forventes at være svag, såsom i meget sandjord).
- Indstil prøven injektionsvolumen til 2 pi. Indstil FID temperaturen til 300 ºC. Kør prøver under anvendelse af en indgangstemperatur på 250 ° C, med H2 som bæregas (flowhastighed 1,3 ml / min) og en split forhold på 30: 1.
Representative Results
Fedtsyrer er angivet som X: YωZ, hvor X betegner antallet af carbonatomer, Y betegner antallet af dobbeltbindinger, og Z angiver positionen af den første dobbeltbinding fra alifatiske (ω) ende af molekylet. De suffikser »c« og »t« angiver cis og trans geometriske isomerer. Den præfikser og suffikser »a« og »i« refererer til anteiso og iso forgrening og Mig og OH angive methylgrupper og hydroxylgrupper, hhv.
Post-GC løb, kontrollere, at prøverne har modtaget tilstrækkelig ISTD ved at kigge på 10: 0 højdepunkt. Kontroller også svaret fra GC standarder, dvs. de hætteglas, der indeholder hexan tilsat ISTD opløsning; disse bør ikke have andre toppe. Intern standard svar bør være ens i hele alle kørsler.
Figur 1 viser en reprætive prøve løb. Den store hexan peak opløsningsmiddel vises karakteristisk ved en retentionstid (RT) omkring 1,8 min. Den ISTD standard top (C10: 0) vises en RT på 3,4 min, mens C19: 0 har en RT på 16,2 min. GC-analyse adskiller PLFAs baseret på deres kædelængde, med længere kæder eluering langsommere; for eksempel, C18: 0 eluerer ved 14,4 minutter, medens C16: 0 eluerer ved 10,8 min. Desuden kan denne analytiske protokol adskille PLFAs baseret på deres grad af umættethed og placeringen af deres dobbeltbinding; for eksempel, C18: 0 eluerer ved 14,4 min, mens C18: 1 9c, og C18: 1 7c eluerer ved 14,0 og 14,1 min, (figur 1). Endelig kan adskilles PLFAs af tilsvarende kædelængde og mætning men forskellig forgrening konfiguration (anteiso versus iso); for eksempel C15: 0I og C15: 0a eluerer ved 8,6 og 8,7 min, (figur 1).
De områder af de forskellige GC toppe kan være importeret i et regneark for yderligere at behandle gaskromatogrammet oplysninger. Hver identificeret PLFA er kvantificeret (nmol g -1 af tør jord) ved følgende ligning:
hvor F er en justeringsfaktor, der tager hensyn FID selektivitet og molariteten forskelle mellem fedtsyrer 32, areaPLFA er toparealet for hver identificeret PLFA, areaC10: 0 er toparealet for ISTD (MeC10: 0), C10: 0 std tilføjet er mængden af ISTD (nmol) tilsat til hver prøve før GC løb, forholdet (C19: 0 std tilføjede / C19: 0 prøve) svarer til genopretning af PC (C19: 0 / C19: O) surrogat standard, og prøvens vægt er mængden af ovntørret jord (g) tilsat til den oprindelige prøve centrifugeglas, og anvendes til at ekstrahere PLFAs.
BEMÆRK: områder under Forskelnt toppe udtrykkes som peak områder, respons eller% respons afhængigt af GC-systemet. Inden for området relevante for jord PLFA karakterisering, kan områder antages at være lineært proportional med vægten af fedtsyrer; alternativt kan små korrektionsfaktorer anvendes til at redegøre for FID selektivitet 32. Hertil kommer, fordi resultaterne indledningsvist udtrykkes på vægtprocentbasis, de skal blive normaliseret til opnåelse molære mængder. Justeret for molær forskelle opnås ved at tage hensyn molekylvægtene af de enkelte fedtsyrer; offentliggjort tabel 32 og kommerciel software 31 er også tilgængelige til at hjælpe, når normalisere for molaritet.
Mængden af ISTD (nmol) tilsat til hver prøve kan yderligere beregnes som:
C10: 0std tilsat = [ISTD] × V (STD tilsat)
[ISTD] er koncentrationen (nmol l -1) i MeC10: 0 (methyl decanoate) opløst i hexan (se trin 3.4.1), og V (STD tilsat) er rumfanget (L) af tilberedte ISTD-opløsning sat til hver prøve forud for GC spil (dvs. 150 pi ifølge trin 3.4.4).
Mængden af C19: 0 (nmol) til stede i hver prøve under GC-analyse svarer til:
hvor areaC19: 0 er arealerne for C19: O, mens den tilsvarende mængde af C19: 0 (nmol) tilsættes til hver prøve ved begyndelsen af den PLFA udvinding metode (jf Trin 3.1.3) er:
hvor [19: 0] Std (mg L -1 (19: 0 std tilsat) er rumfanget af tilberedt surrogat standard sat til hver prøve ved begyndelsen af den PLFA ekstraktion fremgangsmåde (jf Trin 3.1.3), M 19: 0 er molekylvægten af 1,2-dinonadecanoyl--sn-glycero-3-phosphocholin (PC (19: 0/19: 0)).
BEMÆRK: Et mol C19: 0 nonadecanoate surrogat standard udbytter to mol C19: 0 efter methylering trin, mens C10: tilføjes 0 standard efter methylering.
Følgende PLFAs typisk udelukket fra analysen af jord mikrobielle samfund: i) PLFAs der er <14 C og> 20 C i længden, og ii) PLFAs med mindre end 0,5% af det samlede i peak område. Når disse PLFAs er blevet udelukket, kan svarene fra alle de resterende PLFAs summeres for at opnå den samlede PLFA biomass (nmol g -1 af tør jord). Univariate analyse af PLFA data (f.eks ANOVA, følgende data transformation som egnet til at opfylde forudsætningerne for testen, der skal udføres) kan bruges til at sammenligne total PLFA biomasse og / eller PLFA biomasse af udvalgte grupper blandt prøve grupper / behandlinger. For eksempel, figur 2 ses resultater for den relative fordeling af forskellige PLFA grupper, såsom ligekædet mættede PLFAs, mættede PLFAs med enten mid-kæde (10-methyl) eller terminal forgrening, og mono- eller polyumættede PLFAs samt summen af de samlede PLFAs (nmol g -1 af tør jord). I dette særlige eksempel alder træer (som aftager fra site 1 til Site 3) ses at påvirke både samlede PLFAs og den relative fordeling af de forskellige PLFA grupper.
For at vurdere de overordnede mønstre i PLFA sammensætning blandt prøver, kan multivariat analyse af alle PLFAs være conduCTED 33. De PLFA data skal omdannes efter behov forud for den valgte flerdimensional analyse til at opfylde forudsætningerne for den statistiske test og forskningsspørgsmålet der behandles, fx er en Hellinger transformation ofte bruges til at relativere dataene. Figur 3 viser resultaterne fra en ikke -metric multidimensional skalering (NMDS) ordination af samme data, der blev anvendt i figur 2; NMDS er en ikke-parametrisk, multivariat teknik, der producerer 2- eller 3-dimensionelle placering af datapunkter baseret på ligheden mellem ranking scorer mellem prøverne.
Figur 1. Repræsentative GC-FID kromatogram. En prøve opnået fra en dyrket Brown Chernozemic jord blev anvendt til denne analyse. Retentionstider og tilsvarende PLFAs (i parentes) og deres højdepunkt område (pA) are angivet på figuren for repræsentative toppe. For overskuelighedens skyld, er ikke alle toppe angivet på figuren, selv om dette bestemt prøve gav 33 identificerede PLFAs. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. relative forekomst af seks forskellige klasser af PLFAs (% af totale PLFAs), og total PLFA biomasse (nmol g -1 af tør jord). Prøver fra skovklædte Luvisolic jord blev anvendt til denne analyse. Resultaterne indikerer større samlede PLFAs til jorden i stedet en, som er placeret under ældre træer (> 50 år), efterfulgt af de mellemliggende-alderen (25 år) træer (site 2), og endelig de yngste (10 år) træer ( Webstedet 3). Relativt mere mættede PLFAs er til stede på de yngstesite, mens flere umættede PLFAs er til stede ved den ældste site. Fejl søjler repræsenterer standardafvigelser. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Ikke-metrisk multidimensionel skalering (NMDS) ordination af PLFAs (ved hjælp af% af de samlede PLFAs data) akserne 2 og 3 i en 3-dimensionel løsning. Denne ordination blev beregnet ved hjælp af de samme data som dem, der anvendes til figur 2. Den yngste websted (site 3) adskiller meget tydeligt fra de ældre to steder (steder 2 og 3), som viser overlap i deres PLFA mikrobielle samfund sammensætning. Mængden af variation i PLFA samfund data forklares ved hver akse er inkluderet i parentes; 72,5% af variationen kan forklares ved disse to akser for en 3-dimensionesionelle NMDS løsning. Klik her for at se en større version af dette tal.
Discussion
For at minimere og undgå fejlfortolkninger af PLFA data, skal omhyggelig screening data gøres, fordi nogle PLFAs, der findes i jorden mikrobielle samfund er også til stede i enkelt- og flercellede eukaryote organismer, såsom planterødder, alger og jord dyr. Hertil kommer, at Archaea ikke indeholder PLFAs; stedet, er arke membraner består af phospholipid-etherlipider (PLELs). Følgelig kan PLFA protokollen ikke anvendes til at karakterisere arke samfund i jord.
Tilknytning individuelle PLFAs til specifikke mikrobielle grupper bør udøves med forsigtighed (se 2011 offentliggørelse af Frostegård og kolleger 34 for en fremragende diskussion af nogle af de begrænsninger af PLFA metoden). I stedet kan det være mere hensigtsmæssigt, som det blev gjort i figur 2, at gruppere PLFAs baseret på deres kemiske struktur, f.eks, i) ligekædede mættede PLFAs, ii) mættede PLFAs med mid-chain (10-methyl) forgreningsmidler, iii) terminalt forgrenede mættede fedtsyrer, iv) monoumættede PLFAs, V) polyumættede PLFAs og vi) hydroxy fedtsyrer.
Prøve vægt kan være nødvendigt at justere baseret på mængden af ekstraherbare PLFAs indeholdt i en given jordprøve. Ved ikke at justere mængden af jord udvundet i mindre mikrobielt aktive jord, brugerne er i risiko for ikke at opnå et tilstrækkeligt antal PLFA reaktioner (toppe) til præcist at repræsentere den samlede mikrobielle samfund. I højt mikrobielt aktive jord med høje koncentrationer af PLFAs, brugere er i risiko for overbelastning af GC-kolonne, hvilket forhindrer nøjagtig kvantificering af PLFAs. I begge tilfælde, jordprøver skal re-analyseres for PLFAs. Et godt udgangspunkt er at tilføje 0,5 g for organiske jordprøver (såsom skov gulve), og ca. 3 g for mineralske jordprøver. Da mængden af ekstraherbare PLFAs typisk er korreleret til mængden af organisk kulstof i en jord, prøve viight kan justeres på grundlag af jordens kulstofindhold, fx kan en g mineralsk jordprøve være tilstrækkelig til at opnå en god PLFA kvantificering når kulstofindhold er 10-15%, mens> 5 g kan være nødvendig, hvis kulstofindholdet er ≤ 0,5 %. Det er altid en god ide at gøre en prøvekørsel med et par prøver at optimere prøve vægt før hele sættet køres.
Fælles strategier fejlfinding for PLFA protokollen og GC-analyse er som følger. Hvis GC kromatogram baseline er for høj, bør H2-gas cylinder ændres. Hvis opløsningsmidlet eller ISTD toppe mangler fra kromatogrammet, kan der være et problem med prøve injektion (f.eks sluttet sprøjte, problem med autosampler, tom eller mangler hætteglas, fejl med hætteglas positionering). Hvis der detekteres mere end tre toppe i fremgangsmåden / prøve blank, er der forurening af emnet, og der er en høj sandsynlighed for, at samme forurenende stof (er) vil være til stede i prøven GC chromatograms. Find forureningskilden (normalt vandige medier), eller i det mindste sikre, at toppene for det forurenende fjernes fra prøven kromatogrammer, og at disse toppe er ikke inkluderet i nogen statistisk analyse af PLFA data. Det er også en god ide at køre hexan skylninger mellem prøverne, når der er mistanke om fremførsel. Yderligere toppe i hexan skylning vil indikere fremførsel (dvs. tungere komponenter eluerer fra tidligere løb).
Lipider er særligt modtagelige for oxidation, og særlig pleje skal udøves i hele protokollen for at beskytte prøver fra eksponering luft og lys, såsom lagre dem i mørke og holde dem under nitrogen. Alle prøver og blanke skal have tilstrækkelig C19: 0 surrogat standard. En manglende C19: 0 peak, i enten prøver eller emner, indikerer en dårlig nyttiggørelse eller et fuldstændigt tab af analytter. Respons på C19: 0 i prøverne, der er betydeligt lavere end den metode / prøve blanks indikerer et tab af analytter på et tidspunkt i PLFA metoden. Når man står med dårlig C19: 0 opsving, alle aspekter af proceduren skal nøje overvejes og undersøges, herunder den indledende ekstraktion alle faser af prøve overførsel, SPE udvinding, fedtsyre methylering, tørring, opbevaring og prøve manipulation for at isolere fase eller faser, hvor analytter går tabt. På den anden side kan det være, at udvindingen af nogle jordprøver kan give C19: 0, i hvilket tilfælde genvinding af surrogat standard kan være overvurderet. Mens du bruger to standarder ((PC (19: 0/19: 0) og MeC10: 0) er ikke et absolut krav, vi har fundet dette at være meget nyttigt når behøver at foretage fejlfinding Så længe MeC10:. 0 svar er tilstrækkelig , fejlfinding kan fokusere på de skridt før GC-analyse.
Som tidligere nævnt skal der udvises forsigtighed, når de fortolker økologisk betydning og økosystem relationer udelukkende er baseret på biomarkører udleded fra PLFA data, fordi rene kultur undersøgelser viser, at isolerede bakteriestammer vil indeholde forskellige kategorier af PLFAs. I stedet bør biomarkør PLFAs ses som et nyttigt supplement i en suite af beviser, når de foretager bredere økologiske slutninger. I litteraturen har de enkelte PLFAs blevet foreslået og anvendt som biomarkører for forskellige mikrobielle grupper. Mættede PLFAs anvendes typisk til at repræsentere grampositive bakterier og monoumættede PLFA anvendes til gramnegative bakterier. Anerkendte biomarkører for gramnegative bakterier indbefatter monoumættede fedtsyrer med umættetheden i ω5 eller ω7 position, såsom C16: 1ω7, C18: 1ω7, og C18: 1ω5. Desuden kan cyclopropyl fedtsyrer også være repræsentative for gramnegative bakterier 35. Derfor kan PLFAs fra gram-negative bakterier beregnes som svarer til summen af A: 1ω5 + A: 1ω7 + A: 0cyclo. Anerkendte biomarkører for grampositive bakterier er terminalt forgrenede saumættede fedtsyrer, iso-forgrenede såsom C15: 0I, C16: 0I, C17: 0I; eller anteiso-forgrenet, såsom C15: 0a og C17: 0a. Mættet PLFAs med mid-kæde (10-methyl) forgrening, såsom 10Me16: 0 og 10Me18: 0 er karakteristisk stede i actinomycetes 36. Således kan PLFAs fra grampositive bakterier beregnes som svarer til summen af A: 0 (ISO, anteiso, 10-methyl).
Mange biomarkører forbundet med svampe PLFA ofte flerumættede, men nogle svampe-biomarkører er enkeltumættet. For eksempel i form af fungale monoumættede biomarkører, C16: 1ω5 er blevet identificeret som en indikator for arbuskulære mycorrhiza svampe (AMF) 37, C18: 1ω9 er almindelig i saprofytiske svampe, og ectomycorrhizae indeholder typisk C16: 1ω9. Tilstedeværelsen af di-umættede C18: 2ω6,9 forekommer ofte i forbindelse med C18: 1ω9 og også korrelerer godt med svampens sterol ergosterol, hvilket indikerer, at C18: 2ω6,9 kan tilstrækkeligt repræsentere ectomycorrhizae og saprofytiske svampe 38. Tri-umættede C18: 3ω 6,9,12 er også blevet anvendt som biomarkør for svampe 10; dog C18: kan 3ω6c findes i andre eukaryote organismer, herunder planter og alger, selvom det typisk er ikke fundet i bakterier. På sigt af jord protister, C20: har 4ω6c blevet anerkendt som en protist biomarkør 39, selv om andet arbejde ikke har kunnet påvise C20: 4ω6c selv når levedygtige protist populationer blev bekræftet visuelt ved hjælp af lys mikroskopi 40.
Mange undersøgelser behandle økologiske spørgsmål i forbindelse med den overordnede jordmikrobiel samfund ved at udnytte flerdimensionale ordinations teknikker som en PLFA dataanalyse værktøj. Når du bruger denne fremgangsmåde, har nogle forfattere valgt at udelukke sjældne PLFAs fra datasættet ved at fjerne PLFAs der er til stede i mindre end 5% af prøverne 4. De normale mættede fedtsyrer C16: 0 og C18: 0 er rigelige i alle jordens mikroorganismer, herunder prokaryoter og eukaryotes. Derfor nogle forskere vælger at fjerne disse PLFAs forud for statistisk analyse på det grundlag, at de ikke kan være følsomme indikatorer for sammensætningen af jorden mikrobielle samfund - selvom C16: 0 og C18: 0 stadig skal medtages, når summen alle PLFAs for et indeks for mikrobiel biomasse. På sigt af statistiske analyser, mange forskere vælger at gennemføre en ikke-metrisk multidimensionel skalering (NMDS) ordination, da denne teknik er velegnet til data, der kan ikke være normalfordelt 33. Yderligere analyser relateret til kategoriske variable kan indeholde indikatorarter analyse, som kan relatere forekomsten af specifikke PLFAs til kategoriske grupperinger og multi respons permutation procedurer (MRPP), som kan hjælpe bestemme ligheder eller forskelle blandt mikrobielle samfund tildelt kategoriske grupper. Derudover kan multivariate regression træer (MRT) være særlig nyttig, når indflydelsen af flere eksperimentelle variabler ellerbehandlinger skal vurderes som potentielle forklarende variable 5 (f.eks jordtekstur, fugt, regenerering alder).
Når de er etableret, at PLFA protokollen er en forholdsvis simpel analysemetode, der kan være meget nyttigt, når kvantificere jordmikrobiel reaktion på miljøforandringer og menneskeskabte forstyrrelser. Mens molekylære teknikker såsom genetisk fingeraftryk er bedre egnet til den detaljerede karakterisering af mikrobielle samfund, den PLFA metoden har den fordel, at give kvantitative oplysninger om den samlede mikrobielle biomasse 34. I vores forskningslaboratorium, kan én person komfortabelt behandle et sæt af 20 prøver over 4 dage, og vi har fundet den protokol, præsenteres her for at være en robust og reproducerbar teknik til at vurdere jordens biologiske kvalitet.
Den effekt af PLFA metode kan kraftigt udvidet ved at koble den til en stabil isotop analyse 41, 42. Konkret tilføjelse of 13 C-mærkede substrater til jord giver mulighed for kvantificering af substrat inkorporering i jordens mikroorganismer selv isotopanalysen af individuelle PLFAs 41. Desuden er denne metode synes at være en meget lovende værktøj til at belyse trofiske forbindelser i jord fødekæder 42.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pierce Reacti-Vap III-evaporator gassing manifold with 27 ports | Used in Steps 1-3 | ||
| Compressed Nitrogen | Praxair | Ni-T | Dangerous: Use only after training and minimize contact and use; Used in Steps 1-3 |
| Disposable centrifuge tube and Teflon-lined cap | Fisher Scientific | 05-569-3 | Used for Step 1 (1 per sample) and Step 2 (1 per sample) |
| Disposable glass long-necked Pasteur pipettes | Fisher Scientific | 13-678-20D | Used for Step 1 (2 per sample) |
| Disposable glass short-necked Pasteur pipettes | Fisher Scientific | 13-678-4 | Used for Step 2 (1 per sample), Step 3 (1 per sample), GC analysis (1 per sample), and one for each type of solution dispensed during PLFA methods (~10 per batch of samples) |
| Elastic band | Grand & Toy | 42199 | 1 per sample for freeze drying |
| Freeze Dryer-Labconco 7806002 and 7753000 | Used for preparing samples for PLFA analysis - use whatever model your lab has | ||
| Freezer (-20 °C, -80 °C) | Revco | ULT2586-5-A36 | Minus 80 °C is used for freezing freshly collected soil samples, -20 °C is used for storing samples at end of each of 3 steps of PLFA analysis |
| Gas chromatograph - Agilent 6890 Series capillary gas chromatograph (GC; Wilmington, DE) equipped with a 50 m Ultra 2 (5%-phenyl)-methylpolysiloxane column | Agilent Technologies | Used for GC analysis, other models of GC could also be used (1 needed) | |
| Analytical column | Agilent Technologies | 19091B-105 | |
| Gas chromatograph insert | Agilent Technologies | 5183-4692 | Used for GC analysis (1 per sample) |
| Gas chromatograph vial and lid | Agilent Technologies | 5188-6592 | Used for GC analysis (1 per sample) |
| Hexanes | Fisher Scientific | H292-4 | Hazardous: use only in fume hood, Read MSDS, minimize use and wear appropriate PPE; Total volume per sample = 4 ml (2.0 ml + 2.0 ml (step 3)) |
| Hot water bath -Isotemp 220 | Fisher Scientific | Used for Step 3 (1 per batch of samples) | |
| Kimwipe | Fisher Scientific | 06-666-2 | Used for freeze drying samples |
| KOH, ACS grade | Fisher Scientific | P250-500 | Hazardous: Use only in fume hood, Read MSDS, minimize use and wear appropriate PPE; Used for making citrate buffer (used in Step 1) and methanolic KOH (step 3) |
| Lab quake end-over-end shaker for centrifuge tubes | Barnstead/Thermolyne | 3,625,485 | Used for Step 1 (1 per batch of samples of appropriate holding capacity) |
| MeC10:0 methyl decanoate internal standard | Sigma-Aldrich | 299030-2.5G | Used for GC analysis |
| Methanol | Fisher Scientific | A454-4 | Hazardous: Use only in fume hood, Read MSDS, minimize use and wear appropriate PPE; Total volume per sample = 15.5 ml (5 ml + 5 ml (step 1) + 5 ml (step 2) + 0.5 ml (step 3)) |
| MIDI Peak Identification Software | MIDI, Inc., Newark, DE | Used for interpreting GC analysis output | |
| MIDI Calibration Standard Mix for Microbial Identification System | Lab Sphere Inc | 1200-A | Used as a Calibration mix for TSBA 40 |
| Nitrile gloves | Fisher Scientific | 27-058-52 | Used always when conducting PLFA lab work |
| pH Meter - Accumet XL200 | Fisher Scientific | Used for making citrate buffer | |
| Pipette (0.2 - 2 ml) - Socorex - Calibra Digital 832 Macropipette | Socorex | 832.02 | Used throughout Steps (1 per sample) |
| 250 µl gastight syringe | Hamilton | 1725 | Used for GC analysis (1 per sample) |
| silver shield gloves | Sigma-Aldrich | Z529575 | For use when handling chloroform |
| solid phase extraction (SPE) column | Agilent Technologies | 5982-2265 | Used for Step 2 (1 per sample) |
| SPE glass column holder with spigots and vacuum apparatus attached | Sigma-Aldrich | Used for Step 2 (1 per batch of samples) | |
| Vortex - Barnstead International Maxi Mix II- M37615 | Barnstead International | M37615 | Used in Steps 1-3 |
| Water - ultra-pure and Chromosolv HPLC grade | Sigma-Aldrich | 270733-4L | Used throughout analysis |
| Whirl-Pak® bags | Fisher Scientific | 01-812-120 | Used in sample collection - 2 bags required per sample collected |
References
- Zelles, L. Fatty acid patterns of phospholipids and lipopolysaccharides in the characterisation of microbial communities in soil: a review. Biol. Fert. Soils. 29, 111-129 (1999).
- ISO/TS 29843-1: 2010-Soil quality-determination of soil microbial diversity. , ISO/TC. Geneva, Switzerland. Available from: http://www.iso.org/iso/home.htm (2010).
- Swallow, M. J. B., Quideau, S. A. Moisture effects on microbial communities in boreal forest floors are stand-dependent. Appl. Soil Ecol. 63, 120-126 (2012).
- McIntosh, A. C. S., Macdonald, S. E., Quideau, S. A. Linkages between the forest floor microbial community and resource heterogeneity within mature lodgepole pine forests. Soil Biol. Biochem. 63, 61-72 (2013).
- Card, S. M., Quideau, S. A. Microbial community structure in restored riparian soils of the Canadian prairie pothole region. Soil Biol. Biochem. 42, 1463-1471 (2010).
- McKinley, V. L., Peacock, A. D., White, D. C. Microbial community PLFA and PHB responses to ecosystem restoration in tallgrass prairie soils. Soil Biol. Biochem. 37, 1946-1958 (2005).
- Bossio, D. A., Scow, K. M., Gunapala, N., Graham, K. J. Determinants of soil microbial communities: effects of agricultural management, season, and soil type on phospholipid fatty acid profiles. Microbial Ecol. 36, 1-12 (1998).
- Hannam, K. D., Quideau, S. A., Kishchuk, B. E. Forest floor microbial communities in relation to stand composition and timber harvesting in northern Alberta. Soil Biol. Biochem. 38, 2565-2575 (2006).
- Pettersson, M., Bååth, E. The rate of change of a soil bacterial community after liming as a function of temperature. Microbial Ecol. 46, 177-186 (2003).
- Degrood, S. H., Claassen, V. P., Scow, K. M. Microbial community composition on native and drastically disturbed serpentine soils. Soil Bio.l Biochem. 37, 1427-1435 (2005).
- Quideau, S. A., Swallow, M. J. B., Prescott, C. E., Grayston, S. J., Oh, S. -W. Comparing soil biogeochemical processes in novel and natural boreal forest ecosystems. Biogeosciences. 10, 5651-5661 (2013).
- Hahn, A. S., Quideau, S. A. Long-term effects of organic amendments on the recovery of plant and soil microbial communities following disturbance in the Canadian boreal forest. Plant Soil. 363, 331-334 (2013).
- Swallow, M., Quideau, S. A., MacKenzie, M. D., Kishchuk, B. E. Microbial community structure and function: The effect of silvicultural burning and topographic variability in northern Alberta. Soil Biol. Biochem. 41, 770-777 (2009).
- Pennanen, T. Microbial communities in boreal coniferous forest humus exposed to heavy metals and changes in soil pH-a summary of the use of phospholipid fatty acids. Biolog (R) and H-3-thymidine incorporation methods in field studies. Geoderma. 100, 91-126 (2001).
- Margasin, R., Hämmerle, M., Tscherko, D. Microbial activity and community composition during bioremediation of diesel-oil-contaminated soil: effects of hydrocarbon concentration, fertilizers, and incubation time. Microbial Ecol. 53, 259-269 (2007).
- Štursová, M., Šnajdr, J., Cajthaml, T., Bárta, J., Šantrůčková, H., Baldrian, P. When the forest dies: the response of forest soil fungi to a bark beetle-induced tree dieback. ISME J. 8, 1920-1931 (2014).
- Bligh, E. G., Dyer, W. J. A rapid method of total lipid extraction. Can. J. Biochem. Phys. 37, 911-917 (1959).
- White, D. C., Davis, W. M., Nickels, J. S., King, J. D., Bobbie, R. J. Determination of the sedimentary microbial biomass by extractible lipid phosphate. Oecologia. 40, 51-62 (1979).
- Tunlid, A., Hoitink, H. A. J., Low, C., White, D. C. Characterization of bacteria that suppress Rhizoctonia damping-off in bark compost media by analysis of fatty acid biomarkers. Appl. Environ. Microb. 55, 1368-1374 (1989).
- Bobbier, J., White, D. C. Characterization of benthic microbial community structure by high resolution gas chromatography of fatty acid methyl esters. Appl. Environ. Microb. 39, 1212-1222 (1980).
- Tunlid, A., et al. Determination of phospholipid ester-linked fatty acids and poly P-hydroxybutyrate for the estimation of bacterial biomass and activity in the rhizosphere of the rape plant Brassica napus (L.). Can. J. Microbiol. 31, 1113-1119 (1985).
- Frostegård, A., Tunlid, A., Bååth, E. Microbial biomass measured as total lipid phosphate in soils of different organic content. J. Microbiol. Meth. 14, 151-163 (1991).
- Frostegård, Å, Bååth, E., Tunlid, A. Shifts in the structure of soil microbial communities in limed forests as revealed by phospholipid fatty acid analysis. Soil Biol. Biochem. 25, 723-730 (1993).
- Burns, R. G. Soil Biology and Biology Citation Classic X. Soil Biol. Biochem. 43, 1619-1620 (2011).
- Zelles, L., Bai, Q. Y., Beck, T., Beese, F. Signature fatty acids in phospholipid and lipopolysaccharides as indicators of microbial biomass and community structure in agricultural soils. Soil Biol. Biochem. 24, 317-323 (1992).
- Zelles, L., Bai, Q. Y. Fractionation of fatty acids derived from soil lipids by solid phase extraction and their quantitative analysis by GC-MS. Soil Biol. Biochem. 25, 495-507 (1993).
- White, D. C., Ringelberg, D. B. Signature lipid biomarker analysis. Techniques in Microbial Ecology. Burlage, R. S., Atlas, R., Stahl, D., Geesey, G., Sayler, G. , Oxford University Press. New York. 255-272 (1998).
- Bird, J. A., Herman, D. J., Firestone, M. K. Rhizosphere priming of soil organic matter by bacterial groups in a grassland soil. Soil Biol. Biochem. 43, 718-725 (2011).
- Waldrop, M. P., Firestone, M. K. Microbial community utilization of recalcitrant and simple carbon compounds: impact of oak-woodland plant communities. Oecologia. 138, 275-284 (2004).
- Chowdhury, T. R., Dick, R. P. Standardizing methylation method during phospholipid fatty acid analysis to profile soil microbial communities. J. Microbiol. Meth. 88, 285-291 (2012).
- Buyer, J. S., Sasser, M. High throughput phospholipid fatty acid analysis of soils. Appl. Soil Ecol. 61, 127-130 (2012).
- Christie, W. W., Han, X. Gas chromatographic analysis of fatty acid derivatives. Lipid analysis, isolation, separation, identification, and lipidomic analysis. , Woodhead Publishing Ltd. Cambridge, UK. 159-180 (2010).
- McCune, B., Grace, J. B. Analysis of ecological communities. , MjM Software Design. Oregon. 300 (2002).
- Frostegård, A., Tunlid, A., Bååth, E. Use and misuse of PLFA measurements in soils. Soil Biol. Biochem. 43, 1621-1625 (2011).
- Högberg, M. N., Högberg, P., Myrold, D. D. Is microbial community composition in boreal forest soils determined by pH, C-to-N ratio, the trees, or all three. Oecologia. 150, 590-601 (2007).
- Brennan, P. Mycobacterium and other actinomycetes. Microbial Lipids. Ratledge, C., Wilkinson, S. , Academic Press. London. 203-298 (1988).
- Olsson, P. A. Signature fatty acids provide tools for determination of the distribution and interactions of mycorrhizal fungi in soil. FEMS Microbiol. Ecol. 29, 303-310 (1999).
- Frostegård, Å, Bååth, E. The use of phospholipid fatty acid analysis to estimate bacterial and fungal biomass in soil. Biol. Fert. Soils. 22, 59-65 (1996).
- Myers, R. T., Zak, D. R., White, D. C., Peacock, A. Landscape-level patterns of microbial community composition and substrate use in upland forest ecosystems. Soil Sci. Soc. Am. J. 65, 359-367 (2001).
- Swallow, M. J. B., Quideau, S. A., Norris, C. E. Ciliate dependent production of microbial anthranilic acid occurring within aspen litter. Soil Biol. Biochem. 60, 113-121 (2013).
- Norris, C. E., Quideau, S. A., Macey, D. E. Processing of 13C glucose in mineral soil from aspen, spruce, and novel ecosystems in the Athabasca Oil Sands Region. Appl. Soil Ecol. 71, 24-32 (2013).
- Ruess, L., Chamberlain, P. M. The fat that matters: Soil food web analysis using fatty acids and their carbon stable isotope signature. Soil Biol. Biochem. 42, 1898-1910 (2010).
