Summary
Ce protocole décrit une technique de dosage personnalisable évolutive dans Drosophila qui produit des données robustes et quantitatives pour mesurer le comportement de toilettage. La méthode est basée sur la comparaison de la différence dans l'accumulation de colorant sur les corps des animaux non-soignés par rapport aux animaux soignés sur une période de temps déterminée.
Abstract
Le comportement de toilettage de Drosophila est un programme complexe de locomoteurs à plusieurs étapes qui nécessite un mouvement coordonné des membres antérieurs et des pattes arrière. Nous présentons ici un protocole d'analyse de toilettage et un nouveau design de chambre qui est rentable et évolutif pour les études à petite ou grande échelle de toilettage de Drosophila . Les mouches sont répandues dans leur corps avec un colorant Jaune Brillant et ont le temps de retirer le colorant de leur corps dans la chambre. Les mouches sont ensuite déposées dans un volume déterminé d'éthanol pour solubiliser le colorant. L'absorbance spectrale relative des échantillons de colorant-éthanol pour les animaux soignés contre les non-tissés est mesurée et enregistrée. Le protocole fournit des données quantitatives sur l'accumulation de colorant pour les mouches individuelles, qui peuvent être facilement calculées en moyenne et comparées entre les échantillons. Cela permet aux conceptions expérimentales d'évaluer facilement la capacité de toilettage pour les études sur les animaux mutants ou les manipulations de circuits. Cette procédure efficace est à la fois polyvalente et évolutive. Nous montrons wFlux ork du protocole et données comparatives entre des animaux WT et des animaux mutants pour le récepteur Dopamine Drosophila de type I ( DopR ).
Introduction
Toilettage dans Drosophila melanogaster ( D. melanogaster ) est un comportement inné robuste qui implique la coordination de multiples programmes moteurs indépendants 1 . Les mouches des fruits nettoient leurs corps de poussière, microbes et autres agents pathogènes qui pourraient entraver une fonction physiologique normale telle que la vision et le vol, ou conduisent à des défis immunitaires importants. En détectant et en réponse à la fois mécanique 2 et l'activation immunitaire 3 , les mouches se frottent de façon répétitive les jambes ensemble ou sur une région ciblée du corps jusqu'à ce qu'il soit suffisamment propre et que le soin de toilette progresse dans une autre partie du corps. Les mouches effectuent des mouvements de toilettage dans des épisodes distincts qui se produisent principalement dans des motifs stéréotypés 1 , 4 . Une hiérarchie comportementale devient évidente lorsque les signaux de toilettage sont priorisés. Les circuits et les modèles d'activité ont été identifiés en appui oFa modèle que les programmes de toilettage en haut de la hiérarchie se produisent d'abord et supprime les signaux parallèles provenant des zones du corps qui sont préparées par la suite 5 . La plus haute priorité est donnée à la tête, puis à l'abdomen, aux ailes et enfin au thorax 5 .
Le programme de toilettage de D. melanogaster est un système idéal pour l'étude des circuits neuronaux, des signaux moléculaires modulateurs et des neurotransmetteurs. Par exemple, le compromis de la fonction 6 de la neurofibromine, la perte de la protéine de retardement 10 fragile X de Drosophila ( dfmr1 ) 7 et l'exposition au bisphénol A (BPA) 8 provoquent tous des traitements généraux excessifs et d'autres comportements analogues aux symptômes humains discrets de neurofibromatose, fragiles X Le syndrome et les aspects des troubles du spectre autistique et du trouble déficitaire de l'attention avec hyperactivité (TDAH), respectivement. Le comportement de toilettage peut aussi être habituéDérivé de façon différentielle à travers les souches mutantes 2 , prêtant ce programme moteur à des études de plasticité comportementale. L'ampleur des phénomènes neurologiques qui peuvent être modélisés par Drosophila exige une nouvelle approche comparative pour mesurer la capacité des mouches de se toiletter.
L'action combinée des transporteurs de monoamine vésiculaire et l'abondance relative de la dopamine et d'autres amines biogènes dans le corps ont montré que la médiation du comportement de toilettage des mouches des fruits 9 , 10 . L'octopamine et la dopamine stimulent l'activité comparable de toilettage des jambes postérieures dans les mouches décapitées, tandis que la tyramine, le précurseur de l'octopamine, déclenche également un soin moindre 7 . Quatre récepteurs de dopamine ont été identifiés dans D. melanogaster 11 , 12 , 13 , 14 DopR, dDA1, stupide ) dans le comportement de toilettage des lèvres 15 .
Le soin de toilette peut être quantifié indirectement en examinant l'étendue de la propreté par laquelle un animal peut se toiletter complètement après avoir dépoussiéré le corps entier avec un colorant marqueur ou une poussière fluorescente 5 , 16 . Le reste de la poussière laissée sur le corps peut être utilisé comme marqueur relatif pour le comportement global. Les mouches en poudre après avoir eu suffisamment de temps pour se marier peuvent manifester un déficit spécifique dans le comportement de toilettage. Au fur et à mesure que les enquêtes de toilettage sont devenues plus étendues, les protocoles ont incorporé des pratiques telles que la décapitation pour ajouter des traitements pharmacologiques sur les nerfs conjonctifs du cou 10 , la stimulation tactile des poils pour susciter la réponse au groom 2 ,Et enregistrement vidéo de comportement 15 . L'observation directe du toilettage peut être facilement étudiée en utilisant l'observation visuelle et l'enregistrement manuel de la fréquence et de la durée des événements de toilettage spécifiques 4 .
Nous avons conçu une chambre de toilettage de quinze puits qui peut être construite avec une imprimante 3D ou un coupe-laser, et les modèles de modèles sont disponibles pour la reproduction 15 . La conception utilise deux plaques centrales jointes avec des ouvertures assorties et séparées par un maillage et deux plaques supérieures et inférieures, à partir desquelles les mouches et / ou le colorant sont chargés, respectivement. Après avoir autorisé le temps de mouches à épiler, nous les déposons dans de l'éthanol pour solubiliser le colorant et mesurer l'absorbance de cette solution à la longueur d'onde du colorant. Un lecteur de plaques peut être utilisé pour de multiples échantillons parallèles ou un spectrophotomètre à lecture unique peut être utilisé pour des échantillons individuels. Cette méthode minimise l'erreur induite par la manipulation et alDes tests de toilettage permettant d'exécuter une échelle plus petite et moins coûteuse. Cette méthode est dérivée et modifiée à partir des méthodes mises au point par Julie Simpson et Andrew Seeds, qui utilisent des chambres de toilettage plus grandes avec des éléments chauffants pour des manipulations de circuits sensibles à la température 5 . Le protocole suivant montre la quantification du soin du corps entier ainsi que des méthodes alternatives pour quantifier l'accumulation de colorant sur les parties du corps individuelles. Nous présentons également des exemples de données de comparaison entre les mutants WT et DopR , ainsi que des méthodes pour calculer un indice de performance simple pour le comportement de toilettage.
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Protocol
1. Préparation
- Préparez un aspirateur pour déplacer la Drosophile en direct d'un flacon de culture vers la chambre de toilettage. Les aspirateurs permettent le transfert d'animaux conscients aux chambres de comportement afin de s'assurer que l'anesthésie n'affecte pas l'observation comportementale ultérieure.
- À l'aide de ciseaux, coupez 1,5 pieds de l'ID du tube tygon ⅛ ", OD ¼". Coupez au moins 1 pouce de la pointe d'une pointe de micropipette jetable de 1 mL. Tenir un morceau de maille carré de 1 cm (ouverture 0,196 pouce) sur le bout coupé.
REMARQUE: la plupart des conseils 1mL ont une ligne de gradation où la pointe se trouve dans la boîte de colis, généralement coupée sur cette ligne. - Placer délicatement une pointe de micropipette de 1 ml sur la pointe de la maille / coupe. Observez le maillage comme une barrière étroite entre les deux pointes. L'intérieur de la nouvelle pointe crée une chambre de maintien pour les mouches.
- Couper le bout extrême de la nouvelle pointe de micropipette pour élargir l'ouverture suffisamment pour permettre le passage d'une seule mouche. The holE correspondra à peu près à l'ouverture de la chambre de toilettage (environ 1,5-2 mm de diamètre).
- Ajustez parfaitement les pointes imbriquées sur la fin du tube tygon. Poussez les pointes dans le tube pour assurer un ajustement serré pour permettre une pression de vide.
- À l'autre extrémité du tube, couper l'extrémité d'une pointe de micropipette de 200 μL et ajuster l'extrémité de coupe étroite dans le tube. C'est le côté "bouche" de l'aspirateur.
- À l'aide de ciseaux, coupez 1,5 pieds de l'ID du tube tygon ⅛ ", OD ¼". Coupez au moins 1 pouce de la pointe d'une pointe de micropipette jetable de 1 mL. Tenir un morceau de maille carré de 1 cm (ouverture 0,196 pouce) sur le bout coupé.
- Préparer des tubes aliquotes à poussière. Peser environ 5 mg de colorant Jaune Brillant sur du papier de pesée taré. Versez la poussière dans un tube de microcentrifugeuse de 0,6 mL et fermez fermement le capuchon.
REMARQUE: Nous conseillons l'utilisation de gants nitrile lors de la préparation d'une aliquote, car certains gants en latex sont perméables au colorant. - Répétez l'étape 1.2) pour tous les échantillons de l'expérience (un pour chaque mouche dans chaque chambre).
- Préparer des tubes d'éthanol (EtOH): Pipeter 1 mL d'EtOH 100% dans des tubes de microcentrifugeuse de 1,5 mL. Tubes d'étiquettes pour génotypes ou conditions. </ Li>
- Répétez l'étape 1.4) pour tous les échantillons de l'expérience (un pour chaque mouche dans chaque chambre). Capter et sauvegarder les tubes EtOH pour l'achèvement du dosage de toilettage. Incluez également au moins un échantillon "vierge" qui ne sera que de 1 mL d'EtOH sans mouche pour les témoins négatifs.
- Assemblez chaque chambre de toilettage en vissant la plaque supérieure coulissante (avec les plus petits trous), mais en laissant la plaque inférieure (avec les plus gros trous) enlever de la poussière.
- Placez chaque chambre de toilettage nécessaire à plat sur une table avec le haut face vers le bas. L'entrée de la mouche est orientée vers le bas.
- Chargez 5 mg d'une aliquote de colorant jaune brillant dans chaque chambre en tapotant le tube contre la surface de la chambre au-dessus du puits désiré. Appuyez sur la chambre contre la table pour vous assurer que toute la poussière tombe à travers le maillage sur la plaque supérieure.
- Vissez la plaque inférieure sur chaque chambre de sorte que les extrémités plus larges des ouvertures coniques soient vers l'extérieur et que les trous ne reposent pas sur les puits. Sécuriser le botTom plaque fermement afin qu'il ne glisse pas et ne libère pas de colorant.
- Retournez la chambre et la frappez à plat contre une table à plusieurs reprises afin que la poussière tombe dans le filet pour reposer sur la plaque inférieure.
- Faites glisser la plaque supérieure de la chambre dans la "position ouverte" afin que les petits trous s'alignent avec les quinze puits, ce qui permet l'introduction de mouches dans des puits individuels.
2. Mouillage et toilettage
- Chargez une volée dans l'aspirateur de la bouche en aspirant doucement à travers une extrémité de l'aspirateur comme s'il s'agissait d'une paille. Déposez les mouches en soufflant légèrement et en dirigeant l'ouverture vers la cible.
- Aspirez une volée dans chaque puits utilisé pour l'expérience. Après avoir chargé un puits, faites glisser la plaque supérieure afin que la mouche soit piégée dans la chambre et placez le ruban adhésif sur l'ouverture de ce puits pendant le chargement de la chambre entière afin d'éviter que la mouche n'échappe pendant le chargement d'autres puits. Si de multiples mouches sont aspirées en un seulEh bien, laissez cette ouverture découverte jusqu'à ce qu'une seule mouche reste.
- Après que tous les puits nécessaires sont remplis de mouches, basculer la chambre de façon à ce que la plaque inférieure soit vers le haut afin que la poussière puisse revêtir les mouches en tombant à travers le maillage.
- Fixez fermement les plaques supérieure et inférieure en serrant les vis et tourbillissez la chambre pour pousser les mouches pendant 4 s.
- Frappez la chambre (plaque supérieure vers le bas) contre une table deux fois pour que le colorant tombe sur l'autre côté. Ensuite, retournez la chambre (plaque supérieure face recto) et frappez la chambre deux fois pour s'assurer que le colorant se dépose sur le sol de la chambre inférieure à l'écart de la mouche dans la chambre supérieure.
- Pour contrôler les mouches qui ne sont pas autorisées à se marcher, passez immédiatement à l'étape 3 du protocole. Pour les mouches qui complètent l'analyse, passez à l'étape 2.7.
- Reposez la chambre à plat sur une table ou un comptoir avec la plaque supérieure vers le haut pendant trente minutes pour permettre aux mouches de se marier. Placez le chambDans un espace sans bruit et sans vibrations pour maintenir votre environnement constant pour toutes les expériences de toilettage (niveaux d'éclairage, humidité et température). Un incubateur de table à la RT ou à 25 ° C avec des contrôles d'humidité est idéal.
3. Préparation des échantillons et analyse de l'absorbance
- Garder le niveau de la chambre avec la plaque supérieure vers le haut, dévisser doucement la plaque inférieure et l'enlever de la chambre en prenant soin de ne pas perdre de colorant.
- Placez la chambre sur un tampon Fly CO 2 avec un faible débit d'air jusqu'à ce que les mouches soient anesthésiées.
- Dévissez la plaque supérieure de la chambre. Utilisez soigneusement une pince pour attraper une jambe et déplacer une mouche saupoudrée de chaque chambre et déposez-la dans un tube de microcentrifugeuse de 1,5 mL contenant de l'EtOH. Le temps de transfert pour 15 chambres contenant chacune une mouche est d'environ 3-5 minutes. Les expérimentateurs devraient tenir compte des temps de transfert si / lors d'expériences échelonnées avec de multiples chambres pour assurer une mise en scène efficace des expériences. Une fois que chaque tube de microcentrifugeuse contient 1 mouche, fermez le capuchon et inversez le tube trois fois pour agiter et mélanger la solution de colorant et d'éthanol.
- Incuber les tubes contenant de l'éthanol et les mouches pendant 5 h à la température ambiante pour assurer une élimination complète du colorant de la mouche en solution. Après les 5 h, tournez brièvement chaque tube (2 s) pour assurer le dégagement du colorant des mouches.
- Aliquote 50 μL du tube expérimental de 1,5 mL dans un puit d'une plaque à 96 puits si disponible, en prenant note de l'emplacement de chaque échantillon sur la plaque. Ajouter 200 μL d'EtOH pour diluer l'échantillon 5x. La dilution évite les effets de plafond des mouches fortement épissées ou de grands défauts de toilettage.
- Utilisez un lecteur de plaques pour analyser chaque échantillon à 397 nm. Alternativement, mesurer l'absorbance pour les échantillons individuels et les ébauches sur un spectrophotomètre standard dans le spectre visible si un lecteur de plaque n'est pas disponible.
- Lisez et enregistrez l'échantillon à travers le lecteur de plaques et enregistrez la feuille de calcul avec le recordeD échantillons sur la plaque.
4. Quantification des résultats
- Compilez les résultats pour tous les échantillons et mesurez la variance pour chaque génotype ou état.
NOTE: L'accumulation de teinture au moment 0 min et au moment de 30 min sont considérées comme des conditions distinctes en utilisant une analyse statistique par une correction ANOVA et Bonferroni unidirectionnelle ou d'autres corrections pour de multiples comparaisons parallèles. - Calculer la différence de pourcentage de toilettage pour chaque génotype / état en utilisant l'équation suivante: [(valeur moyenne d'accumulation de colorant au temps 0 '- valeur moyenne d'accumulation de colorant au temps 30') / valeur moyenne d'accumulation de colorant au temps 0] x 100.
- Exprimez le pourcentage pour chaque génotype et condition dans les diagrammes à barres et comparez les génotypes et les conditions.
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Representative Results
Le test de toilettage produit des données quantitatives pour évaluer la performance comportementale en fonction du reste relatif de colorant accumulé laissé sur les corps des mouches après un temps de mesure pour le toilettage (30 min). Des exemples d'images de la conception de la chambre de toilettage coulissante et des étapes principales de l'analyse sont mis en évidence à la figure 1 . Les mouches agrégent une quantité significative de colorant provenant du dépoussiérage immédiat en vortex en présence de colorant ( figure 2d, 2e ). Les mouches dépoussiérées peuvent conserver une gamme de post-dosage après accumulation de colorant ( figure 2f, 2g ). Par conséquent, l'accumulation de colorant solubilisant dans l'EtOH et la mesure de l'absorbance des échantillons individuels fournissent une évaluation reproductible et hautement quantitative de la capacité de toilettage.
Dans cette étude de DopR dans la régulation du toilettage des jambes arrière, nous avons comparé les performances de toilettage d'un hypomorphisme fort (
Pour enquêter sur les différences,Entre les capacités de toilettage des programmes de toilette avant et arrière, nous avons évalué directement l'accumulation de colorant sur les parties du corps séparables pendant le toilettage ( Figure 4 ). En disséquant les têtes, les ailes ou le "corps" (abdomen / thorax / jambes) des mouches individuelles après l'analyse, nous avons pu quantifier de manière fiable les différences et les similitudes entre les génotypes. Les résultats ont soutenu une interprétation selon laquelle aucune différence n'était présente pour les programmes de toilettage avant, car aucune différence significative n'a été observée pour les têtes de WT Vs. DopR mutants. Cependant, des différences importantes ont été observées pour les mesures des ailes et du corps entre les génotypes. Cette technique complémentaire pour effectuer le dosage primaire sur les parties du corps au lieu des mouches entières permet une méthode simple pour distinguer les programmes de toilette avant et arrière. Ces résultats ont été étendus et soutenus par des observations comportementales précises et l'enregistrement vidéo ou le suivi des composants individuels de la jambe antérieure ou hIndègement des comportements. Tous les résultats des figures 2-4 sont reproduits avec la permission de Genes, Brain et Behavior 15 .
Figure 1: Drosophila Grooming Assay Workflow. Ce diagramme simplifié décrit les grandes étapes du protocole de toilettage, mettant en évidence certains des matériaux et équipements nécessaires. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2: Quantification du grooming basé sur l'accumulation de colorant. (A) chambre de toilettage. Les mouches individuelles et le colorant Jaune Brillant sont placés dans des puits individuels (1 mouche: 1 puits). DimensionsEt des plans pour la production dans des données supplémentaires. ( B, d, f ) WT adulte mâle Drosophila (+ / +). ( C, e, g ) DopR f02676 / DopR f02676 mâle adulte Drosophila. ( B, c ) Vole avant la poussière. ( D, e ) Moule immédiatement après la poussière par chambre de vortex, avant le soin (temps: 0 min). ( F, g ) Mouches après toilettage (temps: 30 min). Barre d'échelle = 400 μm. Réimprimé avec la permission de Genes, Brain et Behavior 15 . Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3: Le récepteur de la dopamine ( DopR / dDA1 / dumb ) est requis pour la modulation du comportement de toilettage. (A , c, e ) GroominG de wildtype (bleu) et de mouches mutantes (rouge / orange) mesurées à 0 min ou 30 minutes après la poussière. La SEM est mesurée pour chaque génotype et état. (A , b ) n = 43 mouches par génotype et état. (A) WT et DopR f02676 mouches à la fois présentent un comportement de toilettage (+ / + 30' par rapport à + / + 0' = valeur p <0,0001, DopR f02676 30' par rapport à DopR f02676 0' = valeur p <0,0001). Les mouches DopR ne parviennent pas à se marcher aussi bien que les animaux WT ( DopR f02676 30 'par rapport à + / + 30' = valeur p <0,001). Le dépoussiérage aigu de chaque génotype à 0 'entraîne une accumulation de poussière équivalente (ns = non significative). ( B, d, f ) La différence de pourcentage de toilettage est calculée pour chaque génotype (colorant accum. À 0 '- colorant accum. À 30' / tume accum. 0 'x 100) fournissant une valeur relative pour comparer les comportements de toilettage. ( C ) DopR attp / DopR
G4.jpg "/>
Figure 4: Fonction de récepteur de la dopamine Potentiates Hindleg Grooming. (A) Grooming des régions individuelles de WT (bleu) et DopR f02676 / DopR f02676 (rouge) mesurée à 30 min après la formation de poussière et dissection ultérieure. Valeur p pour le toilettage des ailes = 0,0204. Valeur p pour le corps = 0,0302. N = 33-35 mouches pour toutes les conditions. La SEM est mesurée pour chaque génotype et état. Analyse statistique par One Way ANOVA et Bonferonni Correction. Réimprimé avec la permission de Genes, Brain et Behavior 15 . Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure supplémentaire: Méthode alternative pour la quantification visuelle du comportement de toilettage en utilisant NIH Image J Pixel Intensity Software. ( A ) Visualisation de wilDtype Drosophila sous la dissection du champ d'application. Oval définit l'abdomen dorsal comme région d'analyse pour l'intensité des pixels. ( B ) Visualisation de l'abdomen dorsal après dépoussiérage avec un pigment de peinture fluorescente Ultra Green V10. Le filtre standard pour la fluorescence verte capture le pigment bleu-vert. ( C ) Animal WT après revêtement avec du pigment UGV10 (pré-toilettage). ( E ) WT animal après revêtement avec du pigment UGV10 (postgroom). ( D ) DopRf02676 mutant homozygote après revêtement avec du pigment UGV10 (pré-toilettage). ( F ) DopRf02676 mutant homozygote après revêtement avec du pigment UGV10 (post-toilettage). ( G ) Quantification de l'intensité des pixels pour toutes les conditions. N = 15 mouches pour chaque génotype ou état. Analyses statistiques par One Way ANOVA et Bonferonni Correction. Ns = différence non significative. *** représente ap <0,001. PLCliquez ici pour télécharger ce fichier.
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Discussion
Le test de toilettage est relativement simple, mais nous recommandons aux expérimentateurs d'accorder une attention particulière aux problèmes suivants. Le maintien d'un joint étanche en serrant les vis sur les plaques supérieure et inférieure après l'introduction des mouches et du colorant est essentiel pour des résultats reproductibles. Le colorant Jaune Brilliant est très fin et les joints lâches permettront des pertes de teinture des bords de la chambre. L'irrégularité de la teneur en teinture pour chaque puits pourrait facilement éliminer la quantification de toilettage car une poussière non uniforme augmentera les écarts et les faux positifs pour les événements de toilettage. En outre, nous encourageons les expérimentateurs à prendre conscience de l'environnement dans lequel ils choisissent de tenir la chambre de toilettage pendant la période de toilettage de 30 min. La constance environnementale pour la température, l'éclairage, l'heure et l'humidité sont essentielles pour une performance constante pour les tests de comportement de Drosophila . Tenir les chambres de toilettage dans un petit incubateur pour minimiser les distractions oLes environnements de laboratoire variables sont idéaux pour une reproductibilité maximale des résultats, mais d'autres arrangements spatiaux peuvent également être couronnés de succès.
En ce qui concerne les mesures d'accumulation de colorant, nous avons observé que le colorant est perméable aux gants latex, de sorte que les gants nitrile sont préférables pour la manipulation et la pesée des poussières. Veillez à ne pas répandre largement la poussière dans les surfaces de laboratoire, car elle peut facilement tacher les vêtements et contaminer les surfaces ou les équipements. L'isolement d'une zone et d'un poste de mouche / CO 2 pour les expériences est préférable pour contenir l'exposition au colorant. Nous encourageons également les expérimentateurs à utiliser des plaques à 96 puits transparentes aux UV. Le pic d'absorbance de 397nm pour le colorant Jaune Brilliant est proche du spectre UV, et les plaques standard à 96 puits peuvent donner des mesures faibles ou imprécises pour les dilutions de teintures. Le colorant est également soluble dans l'eau en alternative à l'EtOH. Cependant, Drosophila ne se lave pas facilement dans l'eau sans vortex significatif et de petites bulles d'air aloLe corps des animaux teints montre une consistance plus faible et une solubilité du colorant. L'éthanol présente de meilleurs résultats et une variance plus faible dans les comparaisons directes.
Notre dosage peut être facilement modifié pour des techniques supplémentaires et des études plus raffinées, telles que la dissection du post-dosage du corps de mouche ( Figure 4 ). De tels suppléments peuvent être nécessaires pour comprendre quelles mesures de toilettage sont affectées, car l'accumulation de colorant n'indique généralement que des changements de comportement sans aborder directement la cause fondamentale biologique ou neuronale. Une fois que les différences sont observées, des expériences parallèles utilisant des méthodes d'enregistrement vidéo ou d'observation directe sont essentielles pour comprendre la racine comportementale de toute différence d'efficacité de toilettage. Ceci peut être étudié plus en détail par quantification visuelle de l'accumulation de particules de poussière sur des parties spécifiques du corps en utilisant des mesures d'intensité de pixels grâce au logiciel NIJ ImageJ, ainsi que le suivi direct de la patte arrière et de la patte arrièreComportement en marquant des séquences vidéo. En ce qui concerne les méthodes alternatives pour la quantification visuelle de la poussière fluorescente, les premières expériences dans le laboratoire ont utilisé un pigment de peinture fluorescent dérivé d'Alkaline Rare Earth Metal Silicate-Aluminate Oxide Europium. Après dépoussiérer les mouches avec le pigment de peinture fluorescent et anesthésier ou décapiter les animaux après le toilettage, les corps peuvent être enregistrés et analysés par microscopie numérique à l'aide d'un filtre fluorescent standard pour GFP sur une portée de dissection ( Données Supplémentaires ). Alors que cette méthode permet une quantification précise de l'intensité des pixels qui correspond aux résultats observés à l'aide du colorant Jaune Brillant, nous avons constaté que le débit de cette méthode est relativement lent et que les particules de pigment varient légèrement et sont moins uniformes que le revêtement observé pour Brilliant Colorant jaune. Cependant, pour certaines applications expérimentales, cette méthode alternative est appropriée, et il existe une grande variété de fluo disponibleDes couleurs conscentrées qui pourraient être utiles pour les applications de la drosophile et de la nondrosophila ou des expériences itératives de dépoussiérage où la quantification des événements séparés est essentielle. Il convient de noter que le pigment de peinture lui-même est soluble dans l'eau mais perd rapidement sa fluorescence dans l'eau, ce qui nuit gravement à l'utilité de ce pigment pour des mesures d'absorbance standard.
Ces types de méthodes ciblant des événements spécifiques de la jambe antérieure ou des genoux postérieurs sont essentiels pour comprendre la nature précise d'un phénotype et peuvent mettre en évidence des circuits neuronaux potentiels ou des programmes locomoteurs pour enquêter davantage. De plus, pour des expériences de contrôle parallèles, il est essentiel d'exclure des raisons comportementales potentielles non spécifiques que le toilettage pourrait être affecté. Si les animaux présentent de larges déficits moteurs ou des anomalies, il est possible que les déficits de toilettage soient secondaires aux grands phénotypes locomoteurs. Suivi vidéo simple des animaux WT par rapport au mutant ou au cirLes conditions manipulées par cuit peuvent facilement discriminer entre de grands changements de vitesse ou la distance totale parcourue, indépendamment des déficits de toilettage.
Le dosage de toilettage est une méthode polyvalente adaptée à la fois aux études à petite et à grande échelle de ce programme complexe de locomoteurs à plusieurs étapes; Les dessins sont facilement modifiés pour augmenter la dimension de la chambre ou le numéro 15 . La méthode fournit des données quantitatives robustes qui sont idéales pour l'évaluation comparative de la capacité de toilettage des mouches. La production des chambres est rentable et peut être réalisée à l'aide de nombreuses machines différentes (imprimantes 3D, coupe-laser, usines CNC) selon les ressources disponibles. La technique permet le débit intermédiaire d'échantillons individuels qui pourraient être facilement développés pour les écrans génétiques et les études de cartographie fonctionnelle.
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Disclosures
Les auteurs ne déclarent aucun conflit d'intérêts.
Acknowledgments
Nous souhaitons remercier Brian Shepherd, Tat Udomritthiruj, Aaron Willey, Ruby Froom, Elise Pitmon et Rose Hedreen pour les premiers travaux de test et d'établissement de cette méthodologie et des conceptions de chambre. Nous remercions Kelly Tellez et Graham Buchan pour la lecture et l'édition du manuscrit. Nous remercions Andrew Seeds et Julie Simpson pour leur travail pionnier et leurs conseils et leur soutien en suggérant l'utilisation de Brilliant Yellow Dye (Sigma). Ce travail est soutenu en partie par le Fonds de bienfaisance en recherche et en éducation médicale et chirurgicale Mary E. Groff, le Bronfman Science Centre et le Hellman Fellows Program.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| High-Flex Tygon PVC Clear Tubing | McMaster-Carr | 5229K54 | ID 1/8", OD 1/4", used with micropipettor tips and mesh to construct mouth aspirators |
| Micropipette tips (1 mL and 200 μL) | Genesee Scientific | 24-165, 24-150R | |
| Nylon Mesh Screen, 2 x 2.6" | McMaster-Carr | 9318T44 | Used to construct grooming chamber and mouth aspirators |
| Dumont #5 Forceps | Roboz Surgical Instrument | RS-5050 | |
| Brilliant Yellow Dye | Sigma-Aldrich | 201375-25G | we recommend use of nitrile gloves while handling this product |
| Vortexer | Fisher Scientific | 12-812 | set to "touch" |
| Ethanol | Carolina Biological Supply | 86-1282 | |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | VWR International | 10025-726 | |
| 0.65 mL microcentrifuge tubes | VWR International | 20170-293 | tubes can be reused with successive assays |
| UV 96-well plate | Corning | 26014017 | |
| BioTek Synergy HTX Platereader | BioTek | need to download catalog to access product number | http://www.biotek.com/products/microplate_detection/synergy_htx_multimode_microplate_reader.html?tab=overview |
| Gen5 Microplate Reader and Imager Software | BioTek | ||
| Microsoft Excel | Microsoft | https://www.microsoftstore.com/store/msusa/en_US/pdp/Excel-2016/productID.323021400?tduid=(65d098c0e83b86c952bdff5b0719c83f)(256380)(2459594)(SRi0yYDlqd0-LI..ql4M2LoZBEhcBljvIA)() | |
| Drosophila Incubator | Tritech | DT2-CIRC-TK | |
| 1/4" acrylic plastic | McMaster-Carr | 8473K341 | |
| 8 - 32 nuts | McMaster-Carr | 90257A009 | |
| 8 - 32 x 1" hex cap screws | McMaster-Carr | 92185A199 | the bottom plate needs to be tapped for this size screw |
| 8 - 32 x 1/2" hex cap screws | McMaster-Carr | 92185A194 | the second plate from the top needs to be tapped |
| 2 - 56 3/8" flat head phillips machine screws | McMaster-Carr | 91500A088 | these hold the two middle plates together |
| 0.175" ID, 1/4" OD, 0.34" aluminum pipe | McMaster-Carr | 92510A044 | Manufactured in-house; product listed is approximately the same dimensions and should work for size 8 screws. These act as sheaths for the 1" screws and set the hex cap up slightly from the surface of the top plate |
References
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- Corfas, G., Dudai, Y. Habituation and dishabituation of a cleaning reflex in normal and mutant Drosophila. J Neurosci. 9 (1), 56-62 (1989).
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- Dawkins, R., Dawkins, M. Hierarchical Organization and Postural Facilitation - Rules for Grooming in Flies. Animal Behaviour. 24 (Nov), 739-755 (1976).
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