Summary
כאן, אנו מציגים טכניקה חדשנית שנועדה להקליט electroencephalography (EEG) בחופשיות נעורים אפילפטיים נעורים באופן חופשי ולתאר את הנהלים שלה, תכונות, ויישומים. שיטה זו מאפשרת אחד להקליט EEG במשך יותר מ 1 בשבוע.
Abstract
EEG היא שיטה שימושית לזיהוי פעילות חשמלית במוח. יתר על כן, זהו כלי אבחון בשימוש נרחב עבור תנאים נוירולוגיים שונים, כגון אפילפסיה והפרעות נוירודגנרטיבית. עם זאת, זה קשה מבחינה טכנית להשיג הקלטות EEG ב יילודים כפי שהוא דורש טיפול מיוחד טיפול רב. כאן, אנו מציגים שיטה חדש לרשום EEG ב גורים עכברוש ילודים (P8-P15). עיצבנו אלקטרודה פשוטה ואמינה באמצעות לוקוסים של המחשב; זה יכול להיות מושתל בקלות לתוך הגולגולת של גור עכברוש להקליט אותות EEG באיכות גבוהה במוח נורמלי אפילפטי. Pups קיבלו הזרקת intraperitoneal (IP) של חומצה kainic neurotoxin (KA) כדי לגרום התקפים אפילפטיים. השתלה כירורגית שבוצעה בהליך זה הוא זול יותר מאשר נהלים אחרים EEG עבור יילודים. שיטה זו מאפשרת להקליט אותות EEG באיכות גבוהה ויציבה במשך יותר משבוע אחד. יתר על כן, הליך זה יכול להיות מיושם גם על ra הבוגרתTs ועכברים כדי ללמוד אפילפסיה או הפרעות נוירולוגיות אחרות.
Introduction
ידוע היטב כי תקשורת מתמשכת בין נוירונים נדרשת כדי להשיג תפקוד תקין של המוח. תקשורת interneuronal מתרחשת בעיקר בסינפסות, שבו מידע נוירון אחד מועבר נוירון השני. שידור סינפטי זה מתווכת על ידי שני סוגים של הסדרים מבניים ייעודיים: סינפסות חשמליות או כימיות 1 . Electrophysiology הוא השדה אשר לוכד את הפוטנציאל החשמלי המיוצר במהלך תקשורת interneuronal כי השליטה על פונקציות הגוף הכולל והתנהגות 2 . EEG היא השיטה הנפוצה ביותר בין טכניקות אלקטרו רבות.
EEG היא טכניקה המשמשת לזהות שינויים אותות חשמליים המיוצרים על ידי גירויים פנימיים או חיצוניים. יתר על כן, זהו מבחן חיוני לאבחון קליני ולניבוי תוצאות של תנאים נוירולוגיים שונים כגון אפילפסיה, מחלת פרקינסון ואלצהיימרE, כמו גם ההשפעות של סוכני פרמקולוגיים וטוקסיקולוגיים 3 . בדרך כלל, חולה אפילפטי מראה היפראקסיסטיות וליקוי קישוריות תפקודית בתוך המוח; אלה מסוכמים כמו הפרשות epileptiform interictal (IEDs) והוא יכול להיות מוקלט על ידי EEG בצורה של קוצים חדים, חולף; גלים חדים; מתחמי גל ספייק; או polyspikes 4 . המאפיין העיקרי של המוח האפילפטי הוא ההתרחשות הספונטנית של התקפים אפילפטיים, אשר ניתן להקליט או מהקרקפת או מתוך פרנכימה במוח על מנת לאתר את אזור המוח האחראי על ההתקפים 5 . יתר על כן, EEG יש גם השלכות חשובות מאוד הפרעות ניווניות כמו מחלת אלצהיימר (AD). מחקרים מראים כי שינויי EEG השתנו ורשתות נכות נפגעות בחולי AD הם נפוצים. עם זאת, הידע שלנו על פתופיזיולוגיה של תנודות הרשת במחלות neurodegenerative iS מפתיע חלקית ואת צריכה להיות נוספת לחקור 6 .
בפרוטוקול זה, עיצבנו אלקטרודה פשוטה שבה ניתן להקליט EEG כדי להבין את התקשורת החשמלית הן במוח הנורמלי הפתולוגי. השתלה כירורגית בשיטה זו הוא זול יותר מאשר נהלים אחרים זמינים 7 . יתר על כן, שיטה זו יכולה לשמש כדי להקליט באיכות גבוהה ויציבה אותות EEG עבור timeframes יותר ( כלומר, 2-4 שעות בכל יום במשך שבוע 1). בנוסף, השתמשנו אלקטרודות מצית (במשקל של כ 26 מ"ג) המאפשרים לבעלי החיים להתנהג באופן טבעי יותר 8 . שיטה זו מיושמת באופן נרחב על המחקר של EEG ב גורים עכברוש ילודים הדורש את המגבר ואת digitizer, נפוץ במעבדה electrophysiology ואינו דורש שום התקנים נוספים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
טיפול בבעלי חיים, הליך כירורגי, ונהלי הקלטה היו בהתאם להנחיות עבור דרום סין רגיל אוניברסיטת בעלי חיים טיפול ועדת שימוש.
1. הכנת אלקטרודה (איור 1A-C)
הערה: מחשב סיכת loci הוא פשוט קשר בעל שיניים כחלק ממשק האות בהתקני תקשורת. הוא מורכב ממחבר זכר המתחבר למחבר הנשי.
- בזהירות להפריד את סיכות זכר ונקבה מהסיכה המחשב לוקוסים ( איור 1 א ) בעזרת המלקחיים. חבר את הפינים זכר ונקבה יחד כדי ליצור אלקטרודה וליישם cyanoacrylate ליצור קשר דבק חזק ( איור 1 ג ).
- שים את האלקטרודות לתוך כוס מלאה מים מזוקקים עבור ומניחים אותו לניקוי קולי במשך 10 דקות. להעביר אותם לתנור ייבוש על 45 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. לעקר את האלקטרודות באמצעות אור UV למשך 30 דקות.
2. הליך כירורגי (איור 1D-F)
- הכן את כלי ניתוח מעוקרים ומנגנון stereotaxic. להרדים את הגורדה עכברוש ילוד באמצעות הרדמה isoflurane (2.5%) עם האוויר. כאשר הגור הוא הרדים עמוקים, להתאים את המינון של isoflurane ל 1.0%. בצע זנב או קמצוץ הבוהן לפני הניתוח כדי להבטיח את העומק הנכון של הרדמה.
- לתקן את הראש של הגור במנגנון stereotaxic על ידי הנחת פסי האוזן לתוך תעלות האוזן מעט הידוק אותם.
הערה: אין להדק יתר על המידה את פסי האוזן, שכן הגולגולת הניאונטלית רכה מאוד. - לשמור על שדה כירורגית סטרילית על ידי ריסוס כל הציוד עם אתנול 70%. לעשות חתך 15 מ"מ על הראש באמצעות אזמל. בעזרת מלקחיים, בעדינות למשוך את הקרקפת הרחק קו האמצע בארבע הפינות. שים קצת מלוחים ספוג מים מתחת לעור כדי לשמור את החתך פתוח לרווחה ( איור 1D ).
- מצא את נקודות ברגמה ולבדה על הגולגולתולסמן אותם בעיפרון. השתמש מחט מזרק (26 G) לעשות שני חורים בר לתוך קליפת המוח הקדמי (PFC) והיפוקמפוס.
הערה: PFC ממוקם ב 1 מ"מ מ"מ האחורי כדי bregma ו -0.5 מ"מ לרוחב לקו האמצע, בעוד ההיפוקמפוס ממוקם ב -2.0 מ"מ הקדמי כדי ברגמה ± 0.5 מ"מ לרוחב לקו האמצע ( איור 1D ו- E ). עומק האלקטרודה לא צריך להיות יותר מ 2 מ"מ מתחת משטח קליפת המוח כדי למזער נזק מוחי. - השתמש במלקחיים להחזיק את האלקטרודות ולהכניס את הפניה אלקטרודות ההקלטה לתוך PFC ו היפוקמפוס, בהתאמה. החל משחה erythromycin סביב האלקטרודה, כדי למנוע זיהום אפשרי. תקן את האלקטרודה באמצעות cyanoacrylate.
- הכן מלט אקרילי שיניים כך יש עקביות דביק צמיג. החל את מלט שיניים לכסות את האלקטרודות ואת שאר הגולגולת.
הערה: יש לייבש את הגולגולת ביסודיות לפני החלת מלט השיניים. החל 5% חומצה picric על האלקטרודות כדי להגן עליהם.
הערה: ההליך כולו צריך להיעשות מכסה המנוע biosafety לשמור על תנאים סטריליים. - הסר את החיה מן המסגרת stereotaxic להזריק 300 μL של 10% גלוקוז תת עורית. מניחים אותו על שמיכה מחומם להתאוששות. ודא כי החיה היא חמה (37 מעלות צלזיוס) ו אמבולטורי ( כלומר, התאושש לחלוטין). ניהול buprenorphine intraperitoneally (0.05 מ"ג / ק"ג) עבור כאבים שלאחר ניתוח.
הערה: אל תעזוב בעל חיים ללא השגחה עד שהוא יחזור להכרה מספקת (כלומר, התנהגות רגילה ותנועה). - להחזיר את הגור לכלוב הביתה עם הסכר שלהם לאחר שהוא חוזר להכרה. המתן יומיים עד שהחיה תושלם במלואה.
3. הקלטה EEG
- לאחר החלמה מלאה, לחבר את האלקטרודות מושתל על הגולגולת של הגור אל המגבר בכלוב שלה. חבר את המגבר לכדי אנלוגי לדיגיטליעל ממיר ולהצמיד את הממיר למחשב; את הקווים המחוברים צריך לטפל בזהירות, כך שהם לא מקבלים מסובך.
- בחר לפחות 10,000 דגימה קצב הדגימה על יחידת רכישת נתונים להקלטת (רוחב הפס של המשדר הוא 1-100 הרץ). ודא שהנתונים נדגמו כראוי.
- לאחר קבלת הקלטה בסיסית, להזריק את הגור intraperitoneally עם חומצה kainic (KA) (2 מ"ג / ק"ג) כדי לגרום התקפים אפילפטיים. 15 דקות לאחר הזרקת KA לצפות ולתעד את הפרשות אפילפטי. התפיסה לייצר דרך KA הם בדרך כלל פיזית.
הערה: משך ה- iictal-tonic הוא בערך 15.2 ± 0.9 s, משך ההתקפים הוא בערך 62 ± 5 שניות. ניתן למנוע התקפים בחולדה הניאונטלית על ידי מתן הזרקה IP של הידרל כלורל (400 מ"ג / ק"ג). - שמור את הנתונים דיגיטליים ולנתח אותו באמצעות חבילות עיבוד אותות, כגון spike2. לחשוף את רמת הכוח של רכיבי תדר שונים האות neagatal EEG ידי perfאו ניתוח של ספקטרום הספק. לחשב את הכוח של מסגרת זמן 1 דקות על ידי מציאת משרעת ממוצע מרובע שורש מ 1 עד 100 הרץ (הלהקה EEG) 9 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
אם ההליכים כירורגית לעיל מתבצע כראוי, ערוץ אחד העכברוש ילוד הגור EEG ההקלטה תבוצע בהצלחה. 10 דקות לאחר הזרקת KA, דפוס קבוע של סימנים התנהגותיים הופיעו בצורה של תנועות לא סדירות גירוד, רעידות, אובדן של איזון. איור 2 מציג את עקבות נציג EEG עקבות ו interictal, ictal-tonic, ו ictal-clonic מורחבת עקבות. דפוסים חוזרים ונשנים של אי-פריטי EEG ו- interctal ו- EECTAL החלו 15-60 דקות (30 ± 5.2 דקות, ממוצע ± SEM) לאחר הזרקת KA ( איור 2 א ו -2 ב ). איור 2 ד ו- 2E מייצג את ההתקפים הטוניים-קלוניים שהם הסוג הנפוץ ביותר. משך ה- iictal-tonic נמשך 15.2 ± 0.9 s ( איור 2 ד ). התוצאות המייצגות הראו כי פריקות טוניק היו ואחריו פרץ clonic ( איור 2 ב, 2D, ו 2 E ).
E_content "fo: keep-together.within-page =" 1 ">
איור 1: איור של פרוטוקול ההשתלה כירורגית. ( א ) סיכות מחשב זעירות. ( ב ) סיכה נקבה (משמאל) ואת זכר זכר (מימין). סרגל סולם משמש למדוד את אורך סיכת הנקבה. ( ג ) סיכת נקבה זכר זכר. ( ד ) גולגולת חשופה. מס '1 מציג את אתר ההתייחסות, מס' 2 מציג את Bregma, No. 3 ו- 4 אתרי ההקלטה הקיימים, ומספר 5 מציג את Lambda. ( E ) השתלת אלקטרודה. מס '1 מציג את האלקטרודה התייחסות, מס' 3 ו 4 להציג את האלקטרודה הקלטה. ( F ) גולם עכברוש משוחזר (P9). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
D / 55489 / 55489fig2.jpg "/>
איור 2: KA- המושרה Neonatal התקף. ( A ) עקבות נציג EEG מ חולדה P10 שהוזרק עם KA (2 מ"ג / ק"ג, IP) הראו התפרצויות פרץ אפילפטי חוזרים. ( ב ) תצוגה מורחבת של פריקות אפילפטיות דמויי אשכול בודדים מהקופסה ב- A. ( C , D ו- E ) עקבות טיפוסיים אופייניים, אקטליים-טוניקיים ו-אקטליים-קלוניים הורחבו מהקופסה ב- B. ( F ) את הכוח הממוצע EEG (1 דקות חלון זמן) לפני ואחרי הזרקת KA (ממוצע ± SEM). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3: הגדרת הקלטה של EEG. הקלטת מעקב נציג הוא shoWn ב נע בחופשיות נעל חולדה נעורים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
כאן, אנו מדווחים על ניתוח והליכי ההקלטה לרכישת EEG בחופשיות העברת גורים עכברוש ילודים על ידי שיטת חוטית ( איור 3 ). זה כבר הציע כי גורד עכברוש P7-P12 הוא בגיל ההתפתחות המתאים לטווח קצר של היילוד האנושי 10 , 11 . זה קשה מבחינה טכנית להשיג איכות גבוהה EEG נתוני ההקלטה בעת עבודה עם גורים עכברוש בקבוצת גיל זו. בנוסף, זה דורש טיפול מיוחד טיפול גדול 8 .
מחקרים קודמים בבדיקת vivo הקלטות EEG ב חולדות הלידה נערכו באמצעות הקלטת פתרונות הקלטה ב P12 או בעלי חיים ישנים יותר 12 , אבל גישות אלה יקרים מאוד. על ידי הסתמכות על אלקטרודות פשוטות, הצלחנו לייצר אלקטרודה ( איור 1 ) המפחיתה את עלות הניסוי ל קטנה כמו 1 $ תוך מתן EEG בצפיפות גבוהההקלטות. השתלת כירורגי בשיטה זו יכולה לקחת קצת כמו 10 דקות, בהתאם למורכבות של הניתוח.
השלבים הקריטיים בפרוטוקול זה הוא ההשתלה של אלקטרודות. זה צריך להיעשות בזהירות. כדי לשמור על קשר מתמיד של האלקטרודה עם הגולגולת, השלבים הבאים חשובים לשקול. ראשית, להסיר את פסולת רקמות על הגולגולת בעזרת מקלון כותנה מעוקר כי זה עשוי להגדיר את האלקטרודה מן הגולגולת. שנית, להשתמש cyanoacrylate כראוי כדי לצרף את האלקטרודה עם הגולגולת. שלישית, לשמור על צמיגות נאותה של מלט שיניים. עדיף ליישם מלט שיניים בשתי שכבות; השכבה הראשונה צריכה להיות צפופה מעט כדי לכסות את הגולגולת בעוד השכבה השנייה צריכה להיות קצת נזלת כדי לכסות את הפינות של השכבה הראשונה. הקש על מלט דנטלי בעדינות עם קצה פיפטה ליישב אותו כדי להפוך את הקשר חזק דבק. אם זה מימי מדי הוא עשוי לבנות שכבת בידוד תחת electrאודה, ואם זה צפוף מדי, מלט שיניים בקלות ליפול מן הגולגולת בשל המשקל שלה. כמו כן חשוב לשמור על טמפרטורת הגוף של הגוף ב 37 מעלות צלזיוס במשך כל הניתוח להישרדות.
היישום של הליך זה מוגבל לרישום EEG ב גורים עכברוש ילודים בין הגילאים P8 ו P15 כי הגורים גדל עלול להסיר את המלט שיניים אלקטרודה מן הגולגולת שלהם. במונחים של יישומים נוספים, שיטה זו יכולה לשמש גם כדי להקליט את הפעילות החשמלית של עכברים בוגרים ועכברים לאחר שינוי קל. יתר על כן, שיטה זו משאיל את עצמו היטב להשתמש בניסויים התנהגותיים שונים, כגון מבוך מוגבה פלוס.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אינם מכריזים על ניגוד עניינים.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי הקרן למדעי הטבע של סין (31171355) ואת הקרן למדעי הטבע של גואנגדונג (S2011010003403, 2014A030313440).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Computer pin | |||
| Pincer | DELI Group Co., Ltd. | ||
| 502 super glue | DELI Group Co., Ltd. | 7144 | |
| Drying oven | Boxun | GZX-9140MBE | |
| Isofluorane | RWD Life Science | 902-0000-522 | |
| Stereotaxic apparatus | RWD Life Science | 900-0068-507 | |
| Anesthesia apparatus | RWD Life Science | 902-0000-510 | |
| Homeothermic Heating Device | Harvard Apparatus | K 024509 | |
| Amplifier Model 3000 | A-M Systems | 61558 | |
| Micro1401 Analog Digital converter | Cambridge Electronic Design Ltd. | 4383 | Data acquisition unit |
| Spike2 | Cambridge Electronic Design Ltd. |
References
- Pereda, A. E. Electrical synapses and their functional interactions with chemical synapses. Nat Rev Neurosci. 15 (4), 250-263 (2014).
- Chorev, E., Epsztein, J., Houweling, A. R., Lee, A. K., Brecht, M. Electrophysiological recordings from behaving animals--going beyond spikes. Curr Opin Neurobiol. 19 (5), 513-519 (2009).
- Freeborn, D. L., McDaniel, K. L., Moser, V. C., Herr, D. W. Use of electroencephalography (EEG) to assess CNS changes produced by pesticides with different modes of action: effects of permethrin, deltamethrin, fipronil, imidacloprid, carbaryl, and triadimefon. Toxicol Appl Pharmacol. 282 (2), 184-194 (2015).
- Werhahn, K. J., Hartl, E., Hamann, K., Breimhorst, M., Noachtar, S. Latency of interictal epileptiform discharges in long-term EEG recordings in epilepsy patients. Seizure. 29, 20-25 (2015).
- Staba, R. J., Stead, M., Worrell, G. A.
- Nimmrich, V., Draguhn, A., Axmacher, N. Neuronal Network Oscillations in Neurodegenerative Diseases. Neuromolecular Med. 17 (3), 270-284 (2015).
- Zayachkivsky, A., Lehmkuhle, M. J., Dudek, F. E. Long-term Continuous EEG Monitoring in Small Rodent Models of Human Disease Using the Epoch Wireless Transmitter System. J Vis Exp. (101), e52554 (2015).
- Zayachkivsky, A., Lehmkuhle, M. J., Fisher, J. H., Ekstrand, J. J., Dudek, F. E. Recording EEG in immature rats with a novel miniature telemetry system. J Neurophysiol. 109 (3), 900-911 (2013).
- Dzhala, V. I., et al. NKCC1 transporter facilitates seizures in the developing brain. Nat Med. 11 (11), 1205-1213 (2005).
- Tucker, A. M., Aquilina, K., Chakkarapani, E., Hobbs, C. E., Thoresen, M. Development of amplitude-integrated electroencephalography and interburst interval in the rat. Pediatr Res. 65 (1), 62-66 (2009).
- Savard, A., et al. Involvement of neuronal IL-1beta in acquired brain lesions in a rat model of neonatal encephalopathy. J Neuroinflammation. 10, 110 (2013).
- Cuaycong, M., et al. A novel approach to the study of hypoxia-ischemia-induced clinical and subclinical seizures in the neonatal rat. Dev Neurosci. 33 (3-4), 241-250 (2011).
