Summary
Здесь мы представляем новую технику, предназначенную для записи электроэнцефалографии (ЭЭГ) в свободно движущихся неонатальных эпилептических детенышах, и описываем ее процедуры, особенности и применения. Этот метод позволяет регистрировать ЭЭГ более 1 недели.
Abstract
ЭЭГ - полезный метод для обнаружения электрической активности в мозге. Кроме того, это широко используемый диагностический инструмент для различных неврологических состояний, таких как эпилепсия и нейродегенеративные расстройства. Однако технически сложно получить записи ЭЭГ у новорожденных, поскольку для этого требуется специализированная обработка и тщательный уход. Здесь мы представляем новый метод регистрации ЭЭГ у новорожденных щенков крыс (P8-P15). Мы спроектировали простой и надежный электрод, используя лотки с компьютерными штифтами; Он может быть легко имплантирован в череп крысиного щенка для регистрации высококачественных сигналов ЭЭГ в нормальном и эпилептическом мозге. Щенкам вводили интраперитонеальную (внутрибрюшинную) инъекцию нейротоксин-каиновой кислоты (КА) для индукции эпилептических припадков. Хирургическая имплантация, выполняемая в этой процедуре, менее дорогостоящая, чем другие процедуры ЭЭГ для новорожденных. Этот метод позволяет регистрировать высококачественные и стабильные сигналы ЭЭГ более 1 недели. Кроме того, эта процедура может быть применена и к взрослому raTs и мышей для изучения эпилепсии или других неврологических расстройств.
Introduction
Хорошо известно, что для получения нормальной функции мозга требуется непрерывная связь между нейронами. Межнейронная связь в основном происходит в синапсах, где информация от одного нейрона передается второму нейрону. Эта синаптическая передача опосредуется двумя типами специальных структур: электрическими или химическими синапсами 1 . Электрофизиология - это область, которая фиксирует электрический потенциал, возникающий во время межнейронной коммуникации, который контролирует общие функции и поведение организма 2 . ЭЭГ является наиболее часто используемым методом среди многих электрофизиологических методов.
ЭЭГ - метод, используемый для обнаружения изменений электрических сигналов, создаваемых внутренними или внешними стимулами. Кроме того, это важный тест для клинической диагностики и прогноза исходов различных неврологических состояний, таких как эпилепсия, болезнь Паркинсона и болезнь АльцгеймераЕ, а также эффекты фармакологических и токсикологических агентов 3 . Как правило, эпилептический пациент проявляет гипервозбудимость и нарушение функциональной связности в головном мозге; Они суммируются как интериктальные эпилептиформные разряды (ИЭУ) и могут регистрироваться ЭЭГ в виде резких переходных скачков; Острые волны; Комплексы спайк-волн; Или полиспасты 4 . Главной особенностью эпилептического мозга является спонтанное возникновение эпилептических припадков, которые могут быть записаны либо с головы, либо из паренхимы головного мозга, чтобы определить местонахождение области мозга, ответственной за приступы 5 . Кроме того, ЭЭГ также имеет очень важные последствия в нейродегенеративных расстройствах, таких как болезнь Альцгеймера (AD). Исследования показывают, что измененные записи ЭЭГ и нарушения осцилляторных сетей у пациентов с АД являются общими. Однако наши знания о патофизиологии колебаний сети при нейродегенеративных заболеваниях iУдивительно неполной и нуждается в дальнейшем изучении 6 .
В этом протоколе мы разработали простой электрод, с помощью которого можно записывать ЭЭГ, чтобы понять электрическую связь как в нормальном, так и в патологическом мозге. Хирургическая имплантация в этом методе дешевле, чем другие доступные процедуры. 7 . Более того, этот метод может быть использован для записи высококачественных и стабильных сигналов ЭЭГ на более длительные временные рамки ( т.е. 2-4 часа в день в течение 1 недели). Кроме того, мы использовали более легкие электроды (весом около 26 мг), которые позволяют животным вести себя более естественно 8 . Этот метод широко применим для изучения ЭЭГ у новорожденных крысят новорожденных, для которых требуется усилитель и дигитайзер, обычно используемые в электрофизиологической лаборатории и не требующие дополнительных устройств.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Уход за животными, хирургические процедуры и процедуры регистрации соответствовали руководящим принципам Комитета по уходу и использованию животных Южно-Китайского педагогического университета.
1. Подготовка электродов (фигура 1A-C)
ПРИМЕЧАНИЕ. Локальные контакты на компьютере - это просто контактный контакт в качестве части интерфейса сигнала в устройствах связи. Он состоит из штекерного разъема, который вставляется в гнездовой разъем.
- Тщательно отделите штырьки мужского и женского пола от лоскутов пальцев компьютера ( рис. 1A ) с помощью клещей. Соедините штыри мужского и женского пола вместе, чтобы сформировать электрод, и нанесите цианоакрилат, чтобы создать прочную адгезионную связь ( рис. 1С ).
- Поместите электроды в стакан, наполненный дистиллированной водой, и поместите его в ультразвуковой очиститель на 10 мин. Переместите их в сушильную печь при 45 ° C в течение 30 минут. Стерилизовать электроды с помощью УФ-излучения в течение 30 мин.
2. Хирургическая процедура (рис. 1D-F)
- Подготовьте стерилизованные хирургические инструменты и стереотаксическую аппаратуру. Анестезируйте щенка новорожденных крыс, используя изофлуран анестезию (2,5%) с воздухом. Когда щенок подвергается глубокой анестезии, отрегулируйте дозу изофлурана до 1,0%. Выполняйте хвост или пальцы на ноге перед операцией, чтобы обеспечить надлежащую глубину анестезии.
- Закрепите головку щенка в стереотаксическом аппарате, поместив ушные штанги в ушные каналы и слегка затянув их.
ПРИМЕЧАНИЕ. Не чрезмерно затягивайте ушные штанги, так как череп новорожденного очень мягкий. - Поддерживайте стерильное хирургическое поле, распыляя все оборудование с 70% этанолом. Сделайте разрез 15 мм на голове с помощью скальпеля. Используя щипцы, аккуратно вытяните кожу головы от средней линии на четырех углах. Нанесите пропитанный физиологическим раствором хлопок под кожу, чтобы разрез был широко открыт ( рис. 1D ).
- Найдите точки брегмы и лямбды на черепеИ пометьте их карандашом. Используйте иглу шприца (26 G), чтобы сделать два отверстия заусенцев в префронтальной коре (PFC) и гиппокампе.
ПРИМЕЧАНИЕ. ПФУ располагается на расстоянии +1,8 мм сзади от брегмы и -0,5 мм в поперечном направлении от средней линии, в то время как гиппокамп расположен на -2,0 мм впереди брегмы и ± 0,5 мм в поперечном направлении от средней линии ( рис. 1D и E ). Глубина электрода должна быть не более чем на 2 мм ниже поверхности коры, чтобы минимизировать повреждение головного мозга. - Используйте щипцы для удержания электродов и вставьте контрольные и записывающие электроды в ПФУ и гиппокамп, соответственно. Применить эритромицин мазь вокруг электрода, чтобы избежать любой возможной инфекции. Закрепите электрод с помощью цианакрилата.
- Подготовьте зубной акриловый цемент так, чтобы он имел клеевую и вязкую консистенцию. Нанесите зубной цемент, чтобы покрыть электроды и остальную часть черепа.
ПРИМЕЧАНИЕ: Тщательно высушите череп перед нанесением зубного цемента. Нанесите 5% -ную пикриновую кислоту на электроды, чтобы защитить их.
ПРИМЕЧАНИЕ. Вся процедура должна проводиться в вытяжном шкафу для поддержания стерильности. - Удалите животное из стереотаксической рамки и введете 300 мкл 10% глюкозы подкожно. Поместите его на обогреваемое одеяло для восстановления. Убедитесь, что животное теплое (37 ° C) и амбулаторное ( т.е. полностью выздоровевшее). Администрирование бупренорфин внутрибрюшинно (0,05 мг / кг) для послеоперационной боли.
ПРИМЕЧАНИЕ. Не оставляйте животное без присмотра, пока оно не восстановит достаточное сознание (т.е. нормальное поведение и движение). - Верните щенка в его клетку с плотиной после того, как она вернется в сознание. Подождите два дня, пока животное не будет полностью выздоровело.
3. Запись ЭЭГ
- После полного восстановления подсоедините электроды, имплантированные на черепе щенка, к усилителю в его собственной клетке. Подключите усилитель к аналогово-цифровому вИнвертор и присоедините преобразователь к компьютеру; Соединительные линии должны быть тщательно обработаны, чтобы они не запутались.
- Выберите частоту дискретизации не менее 10000 Гц на блоке сбора данных для записи (полоса пропускания передатчика составляет 1-100 Гц). Убедитесь, что данные правильно взяты.
- После получения базовой записи, вводите щенка внутрибрюшинно с помощью каиновой кислоты (KA) (2 мг / кг), чтобы вызвать эпилептические приступы. Через 15 мин после инъекции KA наблюдают и записывают эпилептические разряды. Приступы выработки через КА обычно являются физическими.
ПРИМЕЧАНИЕ. Длительность иктально-тонического воздействия составляет около 15,2 ± 0,9 с, продолжительность схватывания составляет примерно 62 ± 5 с. Приступы могут быть предотвращены у новорожденных крыс, давая IP инъекцию хлоралгидрата (400 мг / кг). - Сохраните оцифрованные данные и проанализируйте их с помощью пакетов программ обработки сигналов, таких как spike2. Выявить уровень мощности различных частотных компонентов в сигнале ЭЭГ новорожденных путем перфорацииЧто позволяет проводить анализ спектра мощности. Вычислите мощность в 1-минутном таймфрейме, найдя среднеквадратичную амплитуду от 1 до 100 Гц (диапазон ЭЭГ) 9 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Если вышеуказанные хирургические процедуры будут проведены должным образом, будет выполнена успешная запись ЭЭГ на один канал крысы новорожденного крысы. Через 10 минут после инъекции KA в виде нерегулярных движений и царапин, тремора и потери равновесия появляется регулярная картина поведенческих признаков. На рисунке 2 показаны типичные следы ЭЭГ-сыворотки и интериктальные, иктально-тонические и иктально-клонические расширенные следы. Периодические межприступные и иктальные ЭЭГ разряды начинались через 15-60 мин (30 ± 5,2 мин, среднее ± SEM) после инъекции KA ( фиг. 2А и 2В ). Рисунок 2D и 2E представляют тонико-клонические припадки, которые являются наиболее распространенным типом. Продолжительность иктально-тонического воздействия составляла 15,2 ± 0,9 с ( рисунок 2D ). Репрезентативные результаты показали, что за тоническими разрядами следуют клонические всплески ( рис. 2B, 2D и 2E).
E_content "fo: keep-together.within-page =" 1 ">
Рисунок 1: Иллюстрация хирургического имплантационного протокола. ( A ) Крошечные контакты компьютера. ( B ) Женский штифт (левый) и штырьковый (правый). Шкала масштаба используется для измерения длины штифта. ( C ) Подсоединенный штырьковый и мужской штырь. ( D ) Открытые черепа. В № 1 представлен эталонный сайт, в № 2 представлены Брегма, № 3 и 4, где имеются записывающие сайты, а в № 5 представлен Лямбда. ( E ) Электродная имплантация. В № 1 представлен контрольный электрод, № 3 и 4 - регистрирующий электрод. ( F ) Восстановленный щенок крысы (P9). Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
D / 55489 / 55489fig2.jpg "/>
Рисунок 2: KA-индуцированный неонатальный припадок. ( A ) Репрезентативный ЭЭГ-след от крысы P10, которую инъецировали KA (2 мг / кг, внутрибрюшинно), показал рецидивные эпилептические всплески. ( B ) Расширенный вид единичных кластерных эпилептических разрядов из ящика в A. ( C , D и E ) Типичные интериктальные, иктально-тонические и иктально-клонические следы расширены из коробки в B. ( F ) Обобщенные данные, показывающие Средняя мощность ЭЭГ (1 мин. Окно времени) до и после инъекции КА (среднее ± SEM). Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Настройка записи ЭЭГ. Репрезентативная запись трассировкиWn в свободно перемещающемся щенке новорожденных крыс. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Здесь мы сообщаем о хирургических и регистрационных процедурах для получения ЭЭГ у свободно перемещающихся щенков новорожденных крыс методом проводных ( рис. 3 ). Было высказано предположение, что щенок крысы P7-P12 находится в возрасте развития, соответствующем полнородному новорожденному 10 , 11 . Технически трудно получить высококачественные данные записи ЭЭГ при работе с детенышами крыс в этой возрастной группе. Кроме того, это требует специализированной обработки и большой осторожности 8 .
Предыдущие исследования, изучающие записи ЭЭГ in vivo у новорожденных крыс, проводились с использованием проводных записывающих растворов у P12 или у более старых животных 12 , но эти подходы очень дорогостоящие. Опираясь на простые электроды, мы смогли создать электрод ( рис. 1 ), что позволило снизить стоимость эксперимента до всего лишь 1 долл., При этом все еще давая высокую плотность ЭЭГзаписи. Хирургическая имплантация в этот метод может занять всего 10 минут, в зависимости от сложности операции.
Критические шаги в этом протоколе - имплантация электродов. Это нужно делать аккуратно. Для поддержания постоянного контакта электрода с черепом важно учесть следующие этапы. Во-первых, удалите осколки ткани на черепе с помощью стерилизованного ватного тампона, поскольку он может отделить электрод от черепа. Во-вторых, используйте цианоакрилат должным образом, чтобы прикрепить электрод к черепу. В-третьих, поддерживайте адекватную вязкость зубного цемента. Зубной цемент лучше наносить в два слоя; Первый слой должен быть немного плотным, чтобы покрыть череп, в то время как второй слой должен быть немного жидким, чтобы покрыть углы первого слоя. Аккуратно постучите зубным цементом с наконечником пипетки, чтобы уладить его, чтобы получить прочное сцепление. Если он слишком водянистый, он может создать изолирующий слой под электрическимОда, и если он слишком плотный, зубной цемент легко отвалится от черепа из-за его собственного веса. Также важно поддерживать температуру тела щенка при 37 ° C на протяжении всей операции для выживания.
Применение этой процедуры ограничено записью ЭЭГ у новорожденных щенков крыс в возрасте от Р8 до Р15, поскольку растущие щенки могут удалять зубной цемент и электрод из их черепа. Что касается дальнейших применений, этот метод может также использоваться для регистрации электрической активности взрослых крыс и мышей после незначительной модификации. Более того, этот метод хорошо подходит для использования в различных поведенческих экспериментах, таких как приподнятый плюс лабиринт.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы объявили, что нет никаких конфликтов интересов.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана Фондом естественных наук Китая (31171355) и Фондом естественных наук провинции Гуандун (S2011010003403, 2014A030313440).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Computer pin | |||
| Pincer | DELI Group Co., Ltd. | ||
| 502 super glue | DELI Group Co., Ltd. | 7144 | |
| Drying oven | Boxun | GZX-9140MBE | |
| Isofluorane | RWD Life Science | 902-0000-522 | |
| Stereotaxic apparatus | RWD Life Science | 900-0068-507 | |
| Anesthesia apparatus | RWD Life Science | 902-0000-510 | |
| Homeothermic Heating Device | Harvard Apparatus | K 024509 | |
| Amplifier Model 3000 | A-M Systems | 61558 | |
| Micro1401 Analog Digital converter | Cambridge Electronic Design Ltd. | 4383 | Data acquisition unit |
| Spike2 | Cambridge Electronic Design Ltd. |
References
- Pereda, A. E. Electrical synapses and their functional interactions with chemical synapses. Nat Rev Neurosci. 15 (4), 250-263 (2014).
- Chorev, E., Epsztein, J., Houweling, A. R., Lee, A. K., Brecht, M. Electrophysiological recordings from behaving animals--going beyond spikes. Curr Opin Neurobiol. 19 (5), 513-519 (2009).
- Freeborn, D. L., McDaniel, K. L., Moser, V. C., Herr, D. W. Use of electroencephalography (EEG) to assess CNS changes produced by pesticides with different modes of action: effects of permethrin, deltamethrin, fipronil, imidacloprid, carbaryl, and triadimefon. Toxicol Appl Pharmacol. 282 (2), 184-194 (2015).
- Werhahn, K. J., Hartl, E., Hamann, K., Breimhorst, M., Noachtar, S. Latency of interictal epileptiform discharges in long-term EEG recordings in epilepsy patients. Seizure. 29, 20-25 (2015).
- Staba, R. J., Stead, M., Worrell, G. A.
- Nimmrich, V., Draguhn, A., Axmacher, N. Neuronal Network Oscillations in Neurodegenerative Diseases. Neuromolecular Med. 17 (3), 270-284 (2015).
- Zayachkivsky, A., Lehmkuhle, M. J., Dudek, F. E. Long-term Continuous EEG Monitoring in Small Rodent Models of Human Disease Using the Epoch Wireless Transmitter System. J Vis Exp. (101), e52554 (2015).
- Zayachkivsky, A., Lehmkuhle, M. J., Fisher, J. H., Ekstrand, J. J., Dudek, F. E. Recording EEG in immature rats with a novel miniature telemetry system. J Neurophysiol. 109 (3), 900-911 (2013).
- Dzhala, V. I., et al. NKCC1 transporter facilitates seizures in the developing brain. Nat Med. 11 (11), 1205-1213 (2005).
- Tucker, A. M., Aquilina, K., Chakkarapani, E., Hobbs, C. E., Thoresen, M. Development of amplitude-integrated electroencephalography and interburst interval in the rat. Pediatr Res. 65 (1), 62-66 (2009).
- Savard, A., et al. Involvement of neuronal IL-1beta in acquired brain lesions in a rat model of neonatal encephalopathy. J Neuroinflammation. 10, 110 (2013).
- Cuaycong, M., et al. A novel approach to the study of hypoxia-ischemia-induced clinical and subclinical seizures in the neonatal rat. Dev Neurosci. 33 (3-4), 241-250 (2011).
