Summary
נתאר כאן שיטה פשוטה ומהירה בידודו של סלמונלה typhimurium-המכילה phagosomes של מקרופאגים על-ידי ציפוי החיידקים עם ביוטין ו streptavidin.
Abstract
סלמונלה typhimurium הוא חיידק תאיים עיצוב גבות הגורמת דלקת הקבה והמעים בבני אדם. לאחר הפלישה פרופריה. מוסקולריס, S. חיידקים typhimurium במהירות זוהה, phagocytized על ידי מקרופאגים, הכלול שלפוחית המכונה phagosomes על מנת להיות מושפל. בידוד של ס typhimurium-phagosomes המכיל היה בשימוש נרחב כדי ללמוד איך ס זיהום typhimurium משנה את תהליך ההבשלה phagosome כדי למנוע השפלה חיידקי. באופן קלאסי, בידודו של המכילים חיידקים phagosomes בוצעה על ידי צנטריפוגה הדרגתיות סוכרוז. עם זאת, תהליך זה זמן רב, דורש מידה מסוימת של מיומנות וציוד מיוחדים. המתוארים כאן היא שיטה פשוטה ומהירה על בידודו של ס typhimurium-המכילה phagosomes של מקרופאגים על-ידי ציפוי החיידקים עם ביוטין-streptavidin-מצומדת beads מגנטי. יכול להיות מושעים phagosomes המתקבלות בשיטה זו כל מאגר של בחירה, המאפשר הניצול של phagosomes מבודדים למגוון רחב של מבחני, כגון חלבון, מטבוליט ו ליפיד לניתוח. לסיכום, שיטה זו עבור בידודו של ס typhimurium-המכיל phagosomes ספציפיים, יעיל, מהיר, דורש ציוד מינימלי, תכליתי יותר מאשר השיטה הקלאסית של בידוד מאת סוכרוז הדרגתי-ultracentrifugation.
Introduction
המקרופאגים הם מסתובבים תאים phagocytic מיוחדים לזהות, לבלוע, לבזות את כל החלקיקים הזרים נוכח ברקמות היקפיים, החל מוות תאים כדי מיקרואורגניזמים כגון חיידקים פולשים. על פני השטח קולטן בתיווך זיהוי של סמנים הפתוגן הספציפי הנוכחי בדרך כלל על פני השטח של מיקרואורגניזמים (המכונה פתוגן-הקשורים לתבניות מולקולרי או PAMPs), מקרופאגים ליזום ומורכב של הממברנה התאית ב סדר כדי להקיף את הפתוגן1phagocytize.
הפתוגן אפף נכלל אז על ידי מקרופאג ב שלפוחית תאיים המכונה phagosome. דרך סדרה של פיוז'ן ואירועים ביקוע עם שלפוחית אחרים כגון endosomes ו- lysosomes, phagosome פתוגן המכיל רוכש ערכה של חלבונים הדרושים עבור חיסול של התוכן phagosomal. לכן, ההרכב אנזימטי של phagosome זה משתנה מאוד במהלך תהליך זה, המכונה ההבשלה phagosome2.
זמן קצר לאחר phagocytosis, multimeric ATPase vacuolar מורכבים (v-ATPase) הוא שולב קרום phagosome על ידי היתוך עם endosomes3. מתחם זה מנצל ATP כדי משאבת הפרוטונים מ ציטוזול כדי לומן של phagosome4. לחומצי phagosome חיוני עבור האירועים פיוז'ן עם אחרים שלפוחית5 , הפעלת מספר רב של אנזימים degradative תלויי-pH6. עוד מתחם אנזימטי multimeric במהירות שמתארגנת על קרום phagosome הוא המתחם nadph לאוקסידאז (NOX). NOX מורכבים מתחמצן nadph על מנת לייצר מינים חמצן תגובתי (ROS) זה מופרשים לתוך לומן phagosome ואשר תורמות באופן משמעותי הריגתו של מיקרואורגניזמים אפף7.
במהלך השלבים הראשונים של התבגרות, phagosomes להציג סמני בדרך כלל כגון Rab5 ו- Rab7 של endosomes מוקדמות ומאוחרות בהתאמה יחד עם יחידת משנה0 V של v-ATPase8. פיוז'ן של phagosomes עם lysosomes ו- endosomes מאוחר תוצאות חשיפת המחלה phagocytized למגוון רחב של אנזימים hydrolytic כגון cathepsin פרוטאזות, lipases וβ-galactosidase9. לחומצי לומן נדרש גם ההפעלה של אנזימים אלה. לדוגמה, המחשוף של cathepsin D כדי לייצר טופס קצר פעיל הוא תלוי-pH10. אנזימים אלה לבזות את הפתוגן ולסיים את הייצור של פפטידים קצרים, נגזר הפתוגן מוצגים על ידי מקרופאג histocompatibility הגדולות מורכבות (MHC) class II מולקולות בתאי T כדי לעורר תגובה חיסונית אדפטיבית11.
לפיכך, phagosome ההבשלה הוא קריטי עבור התגובה החיסונית מולדת וקישורים הזרועות מולדת, גמישים של המערכת החיסונית. . זה לא מפתיע כי פתוגנים התפתחו אסטרטגיות כדי להתגבר על חיסול על ידי מקרופאגים לאורך התהליך המתואר לעיל של התבגרות phagosome... לדוגמה, החיידק תאיים שחפת Mycobacterium , הלגיונלה pneumophila למנוע ההבשלה phagosome על ידי מעכבים v-ATPase הרכבה ו לומן הסוגר acidification12,13 . חיידקים אחרים, כגון ליסטריה או שיגלה flexneri זירוז היווצרות נקבובית ממברנה phagosome להימלט אל ציטוזול ה-14,15. לעומת זאת, serovar enterica סלמונלה typhimurium (S. typhimurium) הוא מסוגל לשנות את המאפיינים של phagosome בתוך חלולית להפכו במיקום מתאים עבור שכפול שלו16. יכולת זו גורם S. typhimurium מודל מאוד מעניין ללמוד בתיווך הפתוגן הפרעה של התבגרות phagosome.
ס typhimurium הוא חיידק תאיים עיצוב גבות הגורמת דלקת הקבה והמעים בבני אדם. לאחר הפלישה פרופריה. מוסקולריס, ס חיידקים Typhimurium במהירות זוהה, phagocytized על ידי מקרופאגים, הנכלל phagosomes17. כמה דיווחים בעבר תיארו את ס typhimurium-phagosomes המכיל להציג למקבלי הן endosomes והן lysosomes18, מחקרים אחרים מצאו ליזוזום phagosome פיוז'ן מנעה על ס זיהום Typhimurium19.
בתחילה, phagosome ההבשלה על ס זיהום typhimurium נחקר על ידי מיקרוסקופ immunofluorescence. התפתחות טכניקות בידודו של המכילים חיידקים phagosomes התומך מחקר מדויק יותר של התוכן phagosome במונחים של סמנים אנדוזום, ליזוזום. נכון להיום, שיטת העיקרי המשמש את ניתוקה של המכילים חיידקים phagosomes הוא fractionation subcellular18,מעברי צבע של סוכרוז שלב20. עם זאת, שיטה זו דורשת מספר השלבים צנטריפוגה זה יכול לגרום לנזק מכני phagosomes, יכול להשפיע על היציבות של רכיבים phagosomal (חלבונים ושומנים), הוא זמן רב. יתר על כן, זה דורש את השימוש ultracentrifuge: פיסת ציוד מיוחד שאינו נגיש עבור כל מעבדה.
לאחרונה הוחל גישה חדשה את בידודה של בקטריאלי המכיל phagosomes, שבו פתוגנים חיידקיים מסומנות עם biotinylated lipopetide (Lipobiotin) ומאוחר יותר חילוץ באמצעות streptavidin מצומדת beads מגנטי21 . אנו מציעים שיטה משלימה חלופית על-ידי תיוג חיידקי משטח המכיל amine מקרומולקולות עם NHS-ביוטין ואחריו streptavidin מצומדת beads מגנטי. Phagosomes המתקבלות בשיטה זו מאוד מועשרים בסמני אנדוזום, ליזוזום והוא יכול לשמש למגוון רחב של מבחני, מניתוח חלבון טכנולוגיות לניתוח. בנוסף, זה אינו מצריך ציוד מיוחד כגון ultracentrifuges. יתר על כן, על ידי ביטול השלבים צנטריפוגה, הנזק מכני phagosomes והן את כמות הזמן המועסקים הם מופחת במידה ניכרת. בשיטה זו ניתן להתאים בקלות בידוד של phagosomes המכילה חיידקים אחרים, כגון גראם חיוביים Staphylococcus aureus, כללה גם כתב יד זה. לסיכום, שיטה זו עבור בידודו של ס typhimurium-המכיל phagosomes הוא משחק פשוט, חסכוני, חינוך, פחות זמן רב יותר הבידוד קלאסית מאת סוכרוז הדרגתי-ultracentrifugation, עיבוד מאוד המכיל חיידקים phagosomes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל השלבים הכרוכות של פתוגניים ס typhimurium צריך להתבצע BSL-2 או גבוה יותר מתקן רמת אבטחה ביולוגי. התרבות ואת ציפוי של ס Typhimurium, כמו גם את הזיהום של מקרופאגים הנגזרות מח העצם (BMDMs) חייב להתבצע תחת תא למינארי למניעת זיהום. בידודו של ס typhimurium-המכיל phagosomes יכול להתבצע על כל ספסל מעבדה BSL-2-
החילוץ של מח העצם של עכברים עבור בידול שלה לתוך מקרופאגים שבוצעה בהתאם המוסדיים הנחיות על רווחת בעלי החיים ואושרו על-ידי הסוכנות מדינת נורדריין-ווסטפהאליאניות טבע, איכות הסביבה, הגנת הצרכן [Landesamt לדנציג נטור, Umwelt ו- Verbraucherschutz (LANUV) Nordrhein-Westfalen; קובץ לא: 84-02.05.40.14.082 ו- 84-02.04.2015.A443], באוניברסיטת קולון.
1. Culturing typhimurium ס
- Inoculate ס typhimurium (זן SL1344) של מושבת חיידקים יחיד לתוך מ ל מרק אינפוזיה (BHI) הלב של המוח באמצעות לולאה חיידקי.
- דגירה ההשעיה חיידקי באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה ברעידות.
- למחרת, להעביר 1 מ"ל של ההשעיה חיידקיים לתוך 19 מ ל מרק BHI בבקבוקון חרוט, דגירה ב 37 מעלות צלזיוס בתוך אינקובטור ברעידות.
- לפקח על ס typhimurium הצמיחה על ידי מדידת צפיפות אופטית (OD)-600 nm (OD 600) עם ספקטרופוטומטרים. מדידות להתחשב בערך כל 30 דקות
- OD כאשר 600 מגיע ל- 1.0, להסיר השעיית חיידקי חממה, העברת לתוך שפופרת 50 מ. צנטריפוגה חיידקים ב g x 5,400 למשך 15 דקות ב-4 מעלות צלזיוס
- להסיר את תגובת שיקוע, resuspend ב- 10 מ ל תמיסת סטרילית באגירה פוספט (PBS).
- צנטריפוגה ב g x 5,400 למשך 15 דקות ב 4 º C.
- להסיר את תגובת שיקוע, resuspend החיידק ב mL 4.9 ל- PBS סטרילי.
2. ציפוי של ס' typhimurium עם NHS-ביוטין/Streptavidin-מצומדת Beads מגנטי
- µL להוסיף 100 של 10 מ"ג/מ"ל ביוטין קישור פתרון (NHS-ביוטין מומס דימתיל סולפוקסיד, דימתיל סולפוקסיד) וטרי, כדי ההשעיה חיידקי מוכן בשלב הקודם. לדוגמה, לדלל 5 מ"ג של NHS-ביוטין לתוך 0.5 מ של דימתיל סולפוקסיד סטרילי. מיקס כראוי על-ידי pipetting למעלה ולמטה כמה פעמים.
- לפצל את התערובת לתוך חמישה צינורות 1.5 mL-
- Incubate כבר שעתיים בטמפרטורת החדר (RT) ב- thermoblock עם טלטול מתמיד ב- 350 סל"ד.
- צנטריפוגה צינורות ב 15,000 g x 10 דקות ב RT ולמחוק את תגובת שיקוע.
- Resuspend ב 1 מ"ל של PBS סטרילי, צנטריפוגה ב 15,000 x g 10 דקות ב RT ולמחוק את תגובת שיקוע.
- חזור על שלב 2.5 פעמיים נוספות כדי להסיר לחלוטין את ביוטין עודף קישור פתרון.
- לאחר השטיפה האחרונה resuspend בגדר ב 1 מ"ל של PBS סטרילי.
- העברת 100 µL של 10 מ"ג/מ"ל פתרון streptavidin מצומדת beads מגנטי לתוך צינור 1.5 מ ל ולהשאיר את זה על המדף מגנטי עבור 5 דק.
- להסיר הממס עם פיפטה לקחת את streptavidin-מצומדת beads מגנטי הפתרון מהמדף מגנטי, resuspend זה עם 1 מ"ל של הבולם מצופה-בקטריאלי ביוטין מוכן בשלב 2.7.
- Incubate עבור h 1 ב RT ב thermoblock עם טלטול מתמיד ב- 350 סל"ד.
- למקם את הפתרון על מתלה מגנטי; לחכות 5 דקות ולאחר מכן להסיר עם פיפטה חיידקים לא מקפידים על גבי הקיר (לשמור את זה בצינור כאנטי " החיידקים שאינם מצופים "). השבר הקפדה על הקיר של הצינור בקשר עם המגנט נמצא החיידק ביוטין/streptavidin-מצופה.
- להסיר את הצינור המכיל חיידקים שכותרתו מהמדף מגנטי, resuspend ב 1 מ"ל של PBS סטרילי.
- למקם אותו שוב על מתלה מגנטי, להמתין 5 דקות ולהשתמש פיפטה כדי להסיר את PBS.
- חזור על שלבים 2.13 ו 2.14 עוד פעמיים כדי להסיר את כל החיידקים הם לא מצופים beads מגנטי מצומדת streptavidin.
- לאחר השטיפה האחרונה resuspend החיידק מצופה ב- 500 µL ל- PBS סטרילי, שלוף את הצינור כמו " מצופה חיידקים ".
- נחשב המושבה יוצרי יחידות (cfu) של שני " החיידקים שאינם מצופים ", " מצופה חיידקים " פתרונות על ידי ציפוי דילולים טורית על פלטות אגר BHI. כ 2 x 10 8 cfu/mL של חיידקים מצופה התקבלו 20 מ"ל של השעיה חיידקי ראשוני עם יתר 600 של 1.0. לשמור על התליה מצופה-בקטריאלי ב 4 ° C כדי לשמש ביום שלמחרת, להדביק מקרופאגים.
3. זיהום של BDMDs
- באותו יום כאשר החיידקים הם מצופים ביוטין ו streptavidin מצומדת beads מגנטי, צלחת מלאה BMDMs 22 הבדיל במנות 6 ס מ על צפיפות של תאים 6 5 x 10 לכל תבשיל.
- ביום הבא, centrifuge התליה מצופה-בקטריאלי ב 15,000 g x עבור 5 דקות ב-4 מעלות צלזיוס
- להסיר את תגובת שיקוע, resuspend במדיום המכון ממוריאל פארק רוזוול (RPMI), בתוספת 10% סרום שור עוברית (FBS)-ריכוז של 10 x 10 6 cfu/mL-
- להדביק מקרופאגים-ריבוי של זיהום (MOI) של 10, המדיום להסיר BMDMs ומוסיפים 5 מ של הבולם מצופה-בקטריאלי מוכן. MOI אופטימליים עשויים להידרש, עבור כל סוג התא או ניסיוני מטרת phagosomes מבודדים.
- Incubate-RT 10 דקות לסינכרון phagocytosis.
- Incubate-37 מעלות צלזיוס חממה 2 CO 5% למשך 30 דקות ליזום phagocytosis. סוגי תאים אחרים עשויים לדרוש פעמים הדגירה שונים כדי להבטיח הפנמה של החיידקים-
- להסיר המדיום המכיל חיידקים הכלים ולשטוף את התאים עם RPMI שלוש פעמים כדי להסיר חיידקים שאינם הפנימו.
- ולבסוף להוסיף 10 מ של RPMI המכיל 10% FBS ו µg 50/mL gentamycin להרוג את כל החיידקים הלא-phagocytized.
- דגירה של BMDMs נגוע ב 37 ° C עם 5% CO 2 עד נקודת הזמן המבוקש. נקודת הזמן הרצויים להיקבע השפעול לפי החיידקים ואת סוג התא המשמש את המטרה של ניתוח. לצורך המחקר האירועים פיוז'ן phagosome-אנדוזום מוקדם ס BMDMs נגועה Typhimurium, דגירה 30 דקות מומלץ. לניתוח של אירועים מאוחרים יותר, ניתן לחלץ phagosomes לאחר 2 h או 4 שעות של דגירה. דגירה ממושך של מקרופאגים עם ס Typhimurium מעבר 24 h תוצאות מות המקרופאגים. מורחב זיהום תאיים לפני החילוץ phagosome כנראה יכול להוביל השפלה של ביוטין מולקולות. עם זאת, לא נתבונן אובדן של ביוטין על חיידקים מצופה עד ה 24
4. בידוד של ס typhimurium-המכיל Phagosomes
- להכין עוצמת הקול של phagosome נדרש בידוד מאגר (50 מ מ צינורות, pH.7, 50 מ מ MgCl 2, 5 מ מ EGTA) על-ידי הוספת dithiothreitol (DTT) ריכוז סופי של 1 מ מ, Cytochalasin B להגמר ריכוז של מעכבי מיקרומטר, ואת פרוטאז פוספטאז 10 המומלצים ע י היצרן.
הערה: DTT ו- Cytochalasin B יש להוסיף למאגר בידוד phagosome A תמיד מיד לפני השימוש. Cytochalasin B משבשת את שלד התא, הקלת העלתה של קרום התא. - בזמן הרצוי הצבע, להסיר את המדיום את התאים הנגועים, לשטוף עם PBS סטרילי חימם את RT.
- 750 להוסיף µL של phagosomבידוד e מאגר A לכל תבשיל, דגירה 20 דקות על קרח. בעת שימוש מספרי הטלפון הנייד שונים, הנפח של בידוד מאגר A צריך להיות מותאם באופן פרופורציונלי.
- µL 250 להוסיף מאגר בידוד phagosome B (50 מ מ, pH.7, 50 מ מ MgCl 2, 5 מ מ EGTA, 220 מ"מ מניטול, וצינורות סוכרוז 68 מ מ). סלע הצלחת על מנת להבטיח כי המאגר מגיע לפני השטח המלא של המנה. בעת שימוש מספרי הטלפון הנייד שונים, הנפח של בידוד מאגר B צריך להיות מותאם באופן פרופורציונלי.
- להסיר התאים המנה על ידי גירוד בעדינות באמצעות שוטר גומי ומעבירים אותם אל צינור mL 1.5 טרום מקורר.
- עוברים התליה תא 26 גרם מחט באמצעות מזרק 1 מ"ל לפחות 15 פעמים (שאיפה אחת ועוד אחת הוצאה של הסעיפים התליה תא כמו פעם אחת). . זה מספיק כדי לשחרר את התוכן cytosolic של BMDMs. מספר עובר דרך המחט חייב להיות אופטימיזציה עבור כל סוג התא.
- מקום התליה תא על מתלה מגנטי ולא לחכות 5 דקות. החלקיקים קשור המגנט הן phagosomes המכיל מצופה - ס Typhimurium. ההשעיה מכיל את שאר מרכיבי התא.
- להעביר את המתלים לתוך צינור 1.5 mL כאנטי " ציטוזול ".
- להסיר את הצינור עם phagosomes מבודדים המדף מגנטי, resuspend אותם ב 1 מ"ל של PBS סטרילי.
- למקם את המתלים phagosome על מתלה מגנטי, לחכות 5 דקות והסר את PBS. חזור על שלבים 4.9 ו- 4.10 לשטוף את מבודדת ס
- typhimurium-המכיל phagosomes.
- לבסוף להסיר את PBS, resuspend את phagosomes במאגר הדרושים; לדוגמה, במאגר assay (ריפה) radioimmunoprecipitation לניתוח חלבון. כ- 50-200 µg החלבון מתקבל לדגימה בעקבות פרוטוקול זה, בהתאם הסכום הראשוני של תאים למשרד הפנים של זיהום.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
בידוד של המכילים חיידקים phagosomes על ידי פרוטוקול זה מחייב את biotinylation של החיידקים כצעד ראשון. אנחנו ולכן העריך את האפקטיביות של ס typhimurium biotinylation על ידי ניתוח מיקרוסקופיה קונפוקלית BMDMs נגוע biotinylated mCherry -S. typhimurium המסומנת Cy5-Streptavidin. בקצרה, BMDMs נדבקו כפי שמתואר פרוטוקול זה עם mCherry -S. typhimurium בעבר biotinylated אבל לא מתפשט עם streptavidin מצומדת beads מגנטי. לאחר דגירה 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס, התאים היו נשטפים עם PBS חמים, קבוע עם 4% פורמלדהיד במשך 20 דקות על קיבוע RT. הופסק על ידי שטיפה נרחב עם PBS. התאים היו אז permeabilized עם 3% Triton ב- PBS למשך 5 דקות ב RT. נגוע BMDMs היו אז מודגרות עם Cy5-Streptavidin עבור 20 דקות ב 4 º C. לאחר חפיפה מקיפה הדגימות הוכנו לניתוח על ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית (איור 1). לא biotinylated mCherry -S. Typhimurium שימש שליטה שלילי. פלורסנט האיתות Cy5-Streptavidin נצפתה באופן בלעדי biotinylated mCherry -S. typhimurium, המאשרת את biotinylation של החיידק היה מוצלח. ניתוח microscopical בוצע על מיקרוסקופ קונפוקלי באמצעות "60 X O2 NA: 1.40" המטרה. אורכי גל עירור עבור fluorochromes היו 405 ננומטר (דאפי), 559 nm (mCherry), 635 nm (Cy5), ואת PMT מתח נקבע ב- 574v, 565v ו- 443v, בהתאמה.
מאז התגובה החיסונית מופעלות ב מקרופאגים על ידי S. typhimurium תלויה במידה רבה הפעלת קולטן משטח מקרופאג על ידי ליגנדים חיידקי, הבאה בדקנו אם הציפוי של S. typhimurium ביוטין, streptavidin מצומדת beads מגנטי יכול לשנות את התגובה החיסונית מולדת הנגוע BMDMs. אנחנו העריכו קודם אם ציפוי של S. typhimurium יכול לשנות את יכולת phagocytic של BMDMs על ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית. BMDMs נדבקו כפי שמתואר פרוטוקול זה עם mCherry -S. Typhimurium מצופה עם ביוטין ו streptavidin מצומדת beads מגנטי או ללא ציפוי mCherry -S. typhimurium. לאחר דגירה 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס, התאים היו נשטפים עם PBS חמים, קבוע עם 4% פורמלדהיד במשך 20 דקות ב- RT. לאחר הרחצה נרחב עם PBS, הדגימות הוכנו לניתוח על ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית. כפי שמוצג באיור2, מקרופאגים phagocytized mCherry נייר עם ציפוי וללא -S. typhimurium באותה מידה.
בשלב הבא, ניתחנו את התגובה דלקתית מופעלות על ידי S. typhimurium מצופה ביוטין ו streptavidin מצומדת beads מגנטי (איור 3). Supernatants מ BMDMs נגוע נייר עם ציפוי וללא ס typhimurium נאספו לאחר 24 שעות של הזיהום על מקושרים-אנזים immunosorbent assay (אליסה) המופרש אינטרלוקין-6 (IL-6). הציפוי של S. typhimurium ביוטין, streptavidin מצומדת beads מגנטי משנה באופן משמעותי את התגובה דלקתית של מקרופאגים.
כדי להעריך את טוהר phagosomes המכילים חיידקים מתקבל על ידי העסקת פרוטוקול זה ניתחנו מבודד mCherry -S. typhimurium-המכילה phagosomes על-ידי immunoblotting. בעזרת נוגדנים ספציפיים נגד התג mCherry, מצאנו העשרה משמעותית של ביטוי-mCherry S. typhimurium ב phagosomes מבודדים בהשוואה השבר cytosolic המתקבל באותה דגימת זרע (איור 4). Phagosomes מבודד המכיל mCherry - S. typhimurium זה לא היה מצופה בעבר עם ביוטין שימשו כפקד שלילי. תוצאות אלו מדגימים כי פרוטוקול זה מאפשר ולטיהור phagosomes כי הם מאוד מועשרים בחיידקים.
הבא ביצענו ניתוח immunoblot של סמני אנדוזום, ליזוזום phagosomes מבודד המכיל S. typhimurium (איור 5). רוב הסימנים אנדוזום, ליזוזום נצפו בבירור ב phagosomes מבודדים-4 שעות לאחר הפגיעה לעומת 30 דקות. את העשרת סמנים endosomal Rab5 Rab7, כמו גם ליזוזום סמני v-ATPase (V0 וגם V1 subunits) ואת cathepsin D, נצפו. מעניין, נצפתה רק בדמות cleaved cathepsin D ב- phagosomes מבודדים-4 שעות לאחר הפגיעה. המחשוף של פרו-cathepsin D (kDa 48) כדי לייצר הטופס הפעיל קצר (33 kDa) מתרחשת רק את phagosomes אך לא ציטוזול, הוכחת יחודיות של פרוטוקול זה בידוד phagosome.
מאז סמנים של organelles כגון המיטוכונדריה או (ER) רשתית תוך-פלזמית מאותרים לעתים קרובות בהכנות של המכילים חיידקים phagosomes מבודדים, ה- S. typhimurium-phagosomes מבודד המכיל היו שנבדק עם נוגדנים ספציפיים נגד המשגר מיטוכונדריאלי Tomm20 את חדר המיון חלבון calnexin (איור 6). בדקנו אותם גם עם נוגדן כנגד האנזים גליקוליזה GAPDH כדי להעריך cytosolic מזהמים phagosomes מבודדים. מצאנו המיטוכונדריה וסמנים ER ב- S. typhimurium-מבודד phagosomes אבל ללא זיהום cytosolic.
ללמוד צדדיות של הפרוטוקול עבור בידוד של phagosomes המכילים חיידקים, ביוטין streptavidin מצומדת beads מגנטי ציפוי הליך הוחל על חיידק גראם חיוביים S. aureus. על ידי העסקת את אותו קיבעון, צביעת פרוטוקול כמתואר עבור mCherry -S. typhimurium (איור 1) לנו אישר biotinylation מוצלחת של חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) לביטוי -S. aureus (איור 7). יתר על כן, הבחנו העשרה של דה מרקר אנדוזום Rab7, את ליזוזום סמני v-ATPase (יחידת משנה של0 V) והיא cathepsin D על ידי ניתוח immunoblot מבודדת GFP -S. aureus-המכילים phagosomes (איור 8). המחשוף של cathepsin D לצורתו בוגר היה רק לזיהוי אחרי 4 שעות של זיהום הדגימות phagosome בודדים אך לא של שברים cytosolic. מבודדים S. aureus-phagosomes המכיל היו חופשיים של זיהום cytosolic כפי שהראה את immunodetection של GAPDH.
לסיכום, הראו כי פרוטוקול הבידוד שלנו phagosome מאפשר את ניתוקה של מועשר המכילים חיידקים phagosomes, ללא זיהום cytosolic. ההכנות phagosome מבודדים יכול לשמש לניתוח של סמנים אנדוזום, ליזוזום ללמוד פהgosome ההבשלה. יתר על כן, זה הוצג פרוטוקול זה, יכול לשמש עבור חיידקים גראם שליליים וגם גראם חיובי, כי ההליך תיוג לא לשנות את התגובה החיסונית של מקרופאגים.
איור 1: זריחה מיקרוסקופ ניתוח של biotinylated ס typhimurium באמצעות Cy5-Streptavidin. BMDMs נדבקו למשך 30 דקות עם mCherry -S. typhimurium שהיה biotinylated ("Biotinylated S. ט"), כפי שמתואר פרוטוקול זה. לא biotinylated mCherry -S. typhimurium ("לא biotinylated S. ט") שימש פקד שלילי. לאחר קיבוע permeabilization של התאים, הדגימות היו מודגרות עם Cy5-Streptavidin עבור 20 דקות ב 4 º C. קרינה פלואורסצנטית אות מהגרעין (דאפי), mCherry -ס typhimurium, Cy5-Streptavidin נותחו באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית. האיתות Cy5-Streptavidin יכול להתגלות רק בתוך החיידק בעבר המסומנת ביוטין, וכך לאשר biotinylation יעיל. סרגל קנה מידה = 10 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2: ניתוח Microscopical של BMDMs נגוע mCherry -S. typhimurium מצופה ביוטין וחרוזים מגנטי מצומדת streptavidin. BMDMs היו נגועים mCherry -S.typhimurium המסומנת ביוטין ו streptavidin מצומדת beads מגנטי כפי שמתואר פרוטוקול זה. לאחר מתן אפשרות של המקרופאגים phagocytize את החיידקים למשך 30 דקות, התאים היו קבוע עם 4% פורמלדהיד במשך 20 דקות ב- RT. החיידק מצופה phagocytized על ידי מקרופאגים היו אז נותחו על ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית. ניתוח הראו כי צריכת חיידקים מצופים ("מצופה S. טי") להשוות הצריכה של חיידקים mCherry ללא תווית ("לא מצופה S. טי"), הממחיש את תיוג עם ביוטין, streptavidin מצומדת beads מגנטי אינו משנה phagocytosis של S. typhimurium על ידי מקרופאגים. הגרעינים היו מוכתמים דאפי להמחשת מיקרוסקופ. הנתונים מוצגים אומר ± S.E.M. ומחושב מובהקות סטטיסטית באמצעות התלמיד t-מבחן מיוצג כ * = p < 0.05; * * = p < 0.01; = p < 0.001. סרגל קנה מידה = 40 µm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3: הפרשת IL-6 על-ידי BMDMs נגוע beads מגנטי ביוטין-ו-streptavidin-מצומדת, שכותרתו S. typhimurium בהשוואה ללא תווית S. typhimurium . BMDMs נדבקו בנגיף ס typhimurium מצופה ביוטין ו streptavidin מצומדת beads מגנטי כפי שמתואר פרוטוקול זה. לאחר 24 שעות של זיהום, supernatants נאספו לצורך ניתוח נוסף של IL-6 הפרשת מאת אליסה. Supernatants בצורת BMDMs נגוע ללא ציפוי S. typhimurium שימשו פקד. אינדוקציה של IL-6 הפרשת מאת מצופה S. typhimurium לא היתה שונה באופן משמעותי בהשוואה לזו של ללא ציפוי S. typhimurium. הנתונים מוצגים אומר ± S.E.M., מובהקות סטטיסטית מחושב באמצעות מבחן t סטודנט מיוצג כ * = p < 0.05; * * = p < 0.01; = p < 0.001. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4: העשרה חיידקי ב מבודד phagosomes. העשרת מתויג mCherry ס typhimurium ב phagosomes מבודדים שנאספו לאחר 30 דקות ו- h 4 של זיהום הושווה השבר cytosolic. Β-אקטין שימש פקד הטעינה. הפקד שלילי מתייחס phagosomes מבודדים באמצעות ללא ציפוי S. typhimurium ב 30 דקות לאחר הפגיעה. כמו שציפיתי, הפלט הסופי של בידוד phagosome באמצעות תווית ס typhimurium אינו מציג כמות משמעותית של mCherry או β-אקטין, הוכחת יחודיות של הפרוטוקול. 20 µg של חלבון נטען לדגימה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 5: ניתוח של סמני אנדוזום, ליזוזום מבודד S. typhimurium-המכילים phagosomes. העשרת את סמני אנדוזום Rab5, Rab7, ואת ליזוזום סמני v-ATPase (V0 ו- V1 subunits) cathepsin D נותחו ב מבודד S. typhimurium-המכיל phagosomes שחולצו לאחר 30 דקות ו- h 4 של זיהום. Β-אקטין שימש פקד הטעינה. 20 µg של חלבון נטען לדגימה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 6: ניתוח של המיטוכונדריה, ER וסמני cytosolic מבודדים S. typhimurium-המכילים phagosomes. דה מרקר cytosolic GAPDH, calnexin סמן את חדר המיון, ו- the marker מיטוכונדריאלי Tomm20 ב s phagosomes typhimurium מבודד-30 min ו- 4 שעות לאחר הפגיעה היו נותחו על ידי immunoblotting, לעומת שברים cytosolic המתאימים. 20 µg של חלבון היו טעונים לדגימה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 7: ניתוח Microscopical של GFP -S. aureus נגוע מקרופאגים. BMDMs נדבקו בנגיף זה. aureus ביטוי חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) שכותרתו אינטרנטביוטין th כפי שמתואר מתודולוגיה של תיוג ס typhimurium. לאחר מתן אפשרות מקרופאגים phagocytize את החיידקים למשך 30 דקות, התאים היו קבועים. ללא ציפוי S. aureus ("לא biotinylated S. א") שימשו השליטה שלילי. לאחר קיבוע permeabilization של התאים, הדגימות היו מודגרות עם Cy5-Streptavidin עבור 20 דקות ב 4 º C. האות פלורסנט מהגרעין (דאפי), ה-GFP -S. ואת Cy5-Streptavidinנותחו על ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית. רק אפשר היה לראות את האות מ- Cy5-Streptavidin החיידק בעבר המסומנת ביוטין, המאשר biotinylation יעיל. גודל ברים = 10 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 8: ניתוח של סמני אנדוזום, ליזוזום מבודד S. aureus-המכיל phagosomes. S. aureus-המכיל phagosomes מבודדים-30 דקות, 2 h ו- 4 שעות לאחר הפגיעה, נותחו על ידי immunoblotting עבור סמנים phagosomal Rab5, Rab7 ו- v-ATPase לעומת שברים cytosolic המתאימים. 20 µg של חלבון היו טעונים לדגימה. דוגמאות נבדקו גם עם נוגדנים ספציפיים נגד GAPDH, הוכחת את זה מבודד S. aureus-phagosomes המכיל חופשיים של זיהום cytosolic. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
שיטה חדשה עבור בידודו של ס typhimurium-המכילה phagosomes על-ידי ציפוי החיידק ביוטין, streptavidin מצומדת beads מגנטי מתואר כאן. לאחר הפרעה עדין של קרום התא, phagosomes המכיל חיידקים ניתן בקלות לחלץ באמצעות מתלה מגנטי. אנו מראים כי תיוג של החיידקים המשמרת את הקיבולת של המחלה כדי לגרום לדלקת, אינה משנה את המאפיין phagocytic של התא המארח. חשוב לציין, phagosomes המתקבלות בשיטה זו הם מועשרים ב חיידקים וב אנדוזום/ליזוזום סמני ונטול זיהום cytosolic.
שיטה זו מציגה מספר יתרונות בהשוואה לשיטת הבידוד phagosome מסורתיים מעסיקה ההפרדה הדרגתיות סוכרוז. זה מבטל זמן רב מספר השלבים צנטריפוגה, ומאפשר החוקר להתמודד עם דוגמאות נוספות בפחות זמן ולקבל מזוכך דגימות phagosome על-ידי הגדלת מספר שוטף צעדים בקלות. השימוש בפרוטוקול זה מבטל את הצורך עבור ציוד מיוחד ורגיש, כגון ultracentrifugation. צנטריפוגה מהירות גבוהה יכול לשנות את המאפיינים של שלפוחית ולהפחית את התשואה הסופית22, אשר הוא נמנע בדרך פרוטוקול זה. גם הראו כי הציפוי של ס typhimurium ביוטין, streptavidin מצומדת beads מגנטי אינו משנה את יכולת phagocytic של מקרופאגים. יתר על כן, אינדוקציה של IL-6 על ידי מקרופאגים נגוע התווית ' S. typhimurium היה שהודעה לעומת מקרופאגים נגוע החיידקים ללא תווית. לכן, ציפוי של ס Typhimurium לא לגרום שינויים משמעותיים ב פתוגניות שלהם. לידע שלנו, ציפוי של ס typhimurium אינו מייצג מכשול עבור השימוש phagosomes מבודדים לכל אחת הטכניקות הנפוצות של ניתוח מעבדה.
ס typhimurium-המכיל phagosomes מבודדים בשיטה זו הם מועשרים חיידקים, נוכח endosomal טיפוסי, סמנים lysosomal, כמו את subunits V v-ATPase0 ו V1 את פרוטאז בוגרת cleaved cathepsin D, אשר יכולים להתגלות רק בחלקים phagosome מבודדים. בנוסף, מצאנו המיטוכונדריה וסמנים אר ב מבודד ס typhimurium-המכיל phagosomes. האינטראקציה של phagosomes עם המיון נחקרה נרחב למרות כמות חלבונים מחדר המיון נוכח פתוגן המכיל phagosomes עשויים להשתנות עם המחלה למד וסוג התא. לדוגמה, phagosomes המכיל Brucella abortus מבודד למעצבי phagocytes הם עשירים ER סמני23 , אבל לא את אלו מבודד מקרופאגים24. Calnexin זוהתה קודם לכן ב- S. Phagosomes המכילים Typhimurium מבודדת על ידי סוכרוז הדרגתיות18. אינטרקציה קרובה של phagosomes המכילים חרוז אינרטי, המיטוכונדריה היה גם שדווחה בעבר25, המסביר את הנוכחות של Tomm20 ב phagosomes מבודדים. חלבונים מיטוכונדריאלי נמצאו phagosomes מבודד המכיל pneumophila ל'26 או Mycobacterium27. עם זאת, זיהוי רכיבים המיטוכונדריה בהכנות של מבודדים פתוגן המכיל phagosomes באמצעות שיטת צנטריפוגה הדרגתיות סוכרוז יש לעיתים קרובות האמינו עקב צפיפות דומה של אברון זה ו פתוגן המכיל phagosome ולכן לא ספציפי28. השיטה שלנו מונע כזה. נושא זיהום ומספק מידע אמין יותר מרמז כי ממברנות מיטוכונדריאלי יכול להתערבב עם קרום phagosomal. לסיכום, זה יהיה קשה להימנע ER וסמני מיטוכונדריאלי פתוגן המכיל מבודד הכנות phagosomes, בהתאם לסוג התא המארח את הפתוגן. השיטה המומלצת עבור האימות של טוהר phagosomes מבודדים היא להשתמש מתויג-חיידקים, נוגדנים ספציפיים תגית זיהוי חיידקים על ידי המערב כתם. אנו גם מראים כי שיטה זו בידוד ניתן להתאים עבור מיקרואורגניזמים אחרים עם קבוצות זמין אמין משטח זה יכול להיות biotinylated. כדוגמה, אנחנו יישמו בהצלחה פרוטוקול שלנו כדי לבודד S. aureus-המכיל phagosomes. Phagosomes המכיל S. aureus מבודדים באמצעות פרוטוקול זה מועשר בסמני ליזוזום ו אנדוזום כגון v-ATPase (יחידת משנה של0 V) ו- Rab7, בהתאמה, אך לא מציגות את סמנים cytosolic כגון GAPDH.
שלפוחית Endosomal/phagosomal מספק סביבות ייחודיות עבור ההשפלה של פתוגנים, אך לשמר את האנטיגנים עבור מערכת אזעקה מערכת החיסון מסתגלת. למרות זאת, phagosomes ואת תהליך ההבשלה נחקרו בהרחבה, microenvironment, phagosome על אירוח פתוגנים שונים נשאר חמקמק. גם לא ברור כיצד שינויים מטבוליים בתאים לשנות phagosome ההבשלה ואת התוכן שלה. לכן, פרוטוקול מפורט כאן מעניק יותר הזדמנויות ללמוד phagosome להן ותפקודו בהקשר של פתולוגיות שונות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
מחקר במעבדה של רובינסון הוא נתמך על ידי מימון מהאשכול מצוינות קלן על תגובות הלחץ הסלולר במחלות Aging-Associated, אוניברסיטת קלן, גרמניה (CECAD; במימון של DFG בתוך יוזמה מצוינות של הפדרלי הגרמני, המדינה ממשלות) ומענקים פתוח (SFB 670), הון קלן, מריה-Pesch יסודות אוניברסיטת קלן, גרמניה.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| EZ-Link NHS Biotin | Thermo Fisher Scientific | 20217 | |
| FluidMag Streptavidin | Chemicell | 4205 | |
| PIPES | Carl Roth | 9156.2 | |
| MgCl2 | Carl Roth | A537.4 | |
| EGTA | Carl Roth | 3054.3 | |
| Sucrose | Carl Roth | 4621.1 | |
| Mannitol | Carl Roth | 4175.1 | |
| DTT | Sigma | 43816 | |
| Halt Protease and Phosphatase inhibitor cocktail | Thermo Fisher Scientific | 1861280 | |
| Cytochalasin B | Sigma | C6762 | |
| DYNAL or DynaMag Magnet | Thermo Fisher Scientific | 12321D | |
| SmartSpec 3000 Spectrophotometer | Bio-Rad | 170-2501 | |
| Bacterial loop (10µl) | Sarstedt | 86.1562.010 | |
| Salmonella enterica serovar Typhimurium SL1344 | Leibniz Institute DSMZ-German collection of Microorganisms and Cell Cultures | ||
| RPMI | Biochrom | FG1415 | |
| PBS | Biochrom | L1825 | |
| Cy5-streptavidin | Invitrogen | SA1011 | |
| anti-beta-actin antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-47778 | |
| anti-mCherry antibody | Thermo Fisher Scientific | PA5-34974 | |
| anti-Rab5 antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-46692 | |
| anti-Rab7 antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-10764 | |
| anti-v-ATPase (V0) antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-28801 | |
| anti-v-ATPase (V1) antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-20943 | |
| anti-cathepsin D antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-6486 | |
| anti-Tomm20 antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-17764 | |
| anti-calnexin antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-46669 | |
| anti-GAPDH antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-20357 |
References
- Freeman, S. A., Grinstein, S. Phagocytosis: receptors, signal integration, and the cytoskeleton. Immunol Rev. 262 (1), 193-215 (2014).
- Kinchen, J. M., Ravichandran, K. S. Phagosome maturation: going through the acid test. Nat Rev Mol Cell Bio. 9 (10), 781-795 (2008).
- Lafourcade, C., Sobo, K., Kieffer-Jaquinod, S., Garin, J., van der Goot, F. G. Regulation of the V-ATPase along the Endocytic Pathway Occurs through Reversible Subunit Association and Membrane Localization. Plos One. 3 (7), e2758 (2008).
- Forgac, M. Vacuolar ATPases: rotary proton pumps in physiology and pathophysiology. Nat Rev Mol Cell Bio. 8 (11), 917-929 (2007).
- Marshansky, V., Futai, M. The V-type H+-ATPase in vesicular trafficking: targeting, regulation and function. Curr Opin Cell Biol. 20 (4), 415-426 (2008).
- Ullrich, H. J., Beatty, W. L., Russell, D. G. Direct delivery of procathepsin D to phagosomes: Implications for phagosome biogenesis and parasitism by Mycobacterium. Eur J Cell Biol. 78 (10), 739-748 (1999).
- Bedard, K., Krause, K. H. The NOX family of ROS-generating NADPH oxidases: Physiology and pathophysiology. Physiol Rev. 87 (1), 245-313 (2007).
- Haas, A. The phagosome: Compartment with a license to kill. Traffic. 8 (4), 311-330 (2007).
- Scott, C. C., Botelho, R. J., Grinstein, S. Phagosome maturation: A few bugs in the system. J Membrane Biol. 193 (3), 137-152 (2003).
- Turk, V., et al. Cysteine cathepsins: From structure, function and regulation to new frontiers. Bba-Proteins Proteom. 1824 (1), 68-88 (2012).
- Ramachandra, L., Song, R., Harding, C. V. Class II MHC molecules and peptide complexes appear in phagosomes during phagocytic antigen processing. Faseb J. 12 (4), A589-A589 (1998).
- Robinson, N., et al. Mycobacterial Phenolic Glycolipid Inhibits Phagosome Maturation and Subverts the Pro-inflammatory Cytokine Response. Traffic. 9 (11), 1936-1947 (2008).
- Clemens, D. L., Lee, B. Y., Horwitz, M. A. Mycobacterium tuberculosis and Legionella pneumophila phagosomes exhibit arrested maturation despite acquisition of Rab7. Infect Immun. 68 (9), 5154-5166 (2000).
- Smith, G. A., et al. The two distinct phospholipases C of Listeria monocytogenes have overlapping roles in escape from a vacuole and cell-to-cell spread. Infect Immun. 63 (11), 4231-4237 (1995).
- Woolard, M. D., Frelinger, J. A. Outsmarting the host: bacteria modulating the immune response. Immunol Res. 41 (3), 188-202 (2008).
- Gallois, A., Klein, J. R., Allen, L. A. H., Jones, B. D., Nauseef, W. M. Salmonella pathogenicity island 2-encoded type III secretion system mediates exclusion of NADPH oxidase assembly from the phagosomal membrane. J Immunol. 166 (9), 5741-5748 (2001).
- Ohl, M. E., Miller, S. I. Salmonella: A model for bacterial pathogenesis. Annu Rev Med. 52, 259-274 (2001).
- Mills, S. D., Finlay, B. B. Isolation and characterization of Salmonella typhimurium and Yersinia pseudotuberculosis-containing phagosomes from infected mouse macrophages: Y-pseudotuberculosis traffics to terminal lysosomes where they are degraded. Eur J Cell Biol. 77 (1), 35-47 (1998).
- Buchmeier, N. A., Heffron, F. Inhibition of Macrophage Phagosome-Lysosome Fusion by Salmonella-Typhimurium. Infect Immun. 59 (7), 2232-2238 (1991).
- Luhrmann, A., Haas, A. A method to purify bacteria-containing phagosomes from infected macrophages. Methods Cell Sci. 22 (4), 329-341 (2000).
- Steinhauser, C., et al. Lipid-labeling facilitates a novel magnetic isolation procedure to characterize pathogen-containing phagosomes. Traffic. 14 (3), 321-336 (2013).
- Weischenfeldt, J., Porse, B. Bone Marrow-Derived Macrophages (BMM): Isolation and Applications. CSH Protoc. 2008, (2008).
- Detilleux, P. G., Deyoe, B. L., Cheville, N. F. Entry and intracellular localization of Brucella spp. in Vero cells: fluorescence and electron microscopy. Vet Pathol. 27 (5), 317-328 (1990).
- Arenas, G. N., Staskevich, A. S., Aballay, A., Mayorga, L. S. Intracellular trafficking of Brucella abortus in J774 macrophages. Infect Immun. 68 (7), 4255-4263 (2000).
- West, A. P., et al. TLR signalling augments macrophage bactericidal activity through mitochondrial ROS. Nature. 472 (7344), 476-480 (2011).
- Li, Q., Jagannath, C., Rao, P. K., Singh, C. R., Lostumbo, G. Analysis of phagosomal proteomes: from latex-bead to bacterial phagosomes. Proteomics. 10 (22), 4098-4116 (2010).
- Rao, P. K., Singh, C. R., Jagannath, C., Li, Q. A systems biology approach to study the phagosomal proteome modulated by mycobacterial infections. Int J Clin Exp Med. 2 (3), 233-247 (2009).
- Rogers, L. D., Foster, L. J. The dynamic phagosomal proteome and the contribution of the endoplasmic reticulum. P Natl Acad Sci USA. 104 (47), 18520-18525 (2007).
