Summary
הסינתזה של חומרים פעילי שטח פפטיד מבוססי פוליאמין (PPAs) הוא אתגר משמעותי בשל נוכחותם של nitrogens אמין מרובים, אשר דורשת שימוש מושכל של הגנה על קבוצות כדי להסוות את תגובתי פונקציות אלה. בנייר זה, אנו מתארים שיטה נתיישב עבור הכנת אלה סוג חדש של מולקולות וההספק עצמית.
Abstract
פוליאמין מבוססי חומרים פעילי פפטיד שטח (PPAs) הם סוג חדש של עצמי וההספק amphiphilic biomaterials קשורים חומרים פעילי שטח פפטיד (PAs). PAs מסורתיים בעלי חומצות אמינו טעונות כמו solubilizing קבוצות (ליזין, ארגינין), אשר מחובר ישירות ל קטע השומנים או יכול להכיל אזור מקשר גרם של חומצות אמינו נייטרלי. כוונון פפטיד רצף PAs יכולות להניב מורפולוגיות מגוונות. באופן דומה, PPAs בעלי מקטע הידרופובי וחומצות אמינו נייטרלי, אבל גם מכילים מולקולות פוליאמין כמים solubilizing קבוצות (הידרופילית). כמו במקרה עם PAs, PPAs יכול גם להתחבר בעצמם לתוך מורפולוגיות מגוונים, כולל מוטות קטנים, מעוות ננו-סרטים של מאוחה ננו-גליונות, כאשר מומס במים. עם זאת, הנוכחות של ראשי ומשני אמינים על מולקולה בודדת פוליאמין מציב אתגר משמעותי כאשר סינתזה PPAs. בנייר זה, אנו מראים פרוטוקול פשוט, מבוסס על תקדימים ספרות, כדי להשיג נתיישב סינתזה של PPAs באמצעות סינתזה פפטיד מעבדתי (SPPS). פרוטוקול זה ניתן להרחיב את הסינתזה של PAs ומערכות דומות אחרות. אנחנו גם ממחישים את השלבים הנדרשים עבור ביקוע חלבונים מן שרף, זיהוי, טיהור.
Introduction
פפטיד עצמית וההספק חומרים פעילי שטח (PAs) הם סוג של biomaterials מורכבת בדרך כלל המקטעים הבאים: בראש הידרופיליות (א), (ב) מקשר אזור, וזנב הידרופובי (ג). רוב PAs המתוארים בספרות בעלי ראש הידרופילית המורכבת של חומצת אמינו טעונות או קוטבי משקעים1,2,3,4. PAs מצאו מגוון רחב של יישומים של וההתערבות כולל משלוח סמים, אבחון מחלות, רפואה רגנרטיבית ועוד5. מבוסס על רצף חומצות אמיניות שלהם, PAs יכולים ליצור מגוון רחב של nanostructures כולל הקזאין כדורית, ננו-חוטים. לאחרונה דיווחנו מחלקה של היברידית פפטיד מבוססי פוליאמין חומרים פעילי שטח, כינה PPAs6. מורפולוגיות, קינטיקה וההספק עצמית, והשפלה מטבולית, של אלה biomaterials, נמצאו להיות קשורה קבוצת ראש solubilizing שלהם. יתר על כן, nanostructures PPA לא הראה רעילות לכיוון בתרבית של תאים (קווים MiaPaCa2 ותא הלה) בריכוזים שנבדקו. Nanocarriers מבוסס-PPA הם סמים אטרקטיבי-מסירה רכב כי: (1) פוליאמין ספיגת ואת חילוף החומרים הוכח להיות מוגברת של תאים סרטניים, nanostructures (2) cationic יכול להשיג endosomal לברוח7,8, מה שמוביל גבוה במחזור ומגורים בתוך תא, ו- (3) הם צריכים לקבל פרופיל מטבולי ייחודי בהשוואה הרשות הפלסטינית; לדוגמה, הם יהיו יציבים יותר לכיוון פרוטאזות נמצא בגוף האדם (למרות שהם רגישים אולי אנזימים אחרים, כגון amine oxidases)9,10. כמו כן, PPAs נמצאו מורפולוגיות מגוונים, מאפיינים physicochemical, ננו-חלקיק נוקשות, ואת מכלול קינטיקה בהתאם לאורך ואת תשלום של PPA בודדים מולקולה6. במסמך זה, אנו מתארים את פרוטוקול מפורט עבור סינתזה, זיהוי, טיהור של PPAs כי ניתן להחיל גם על הכנת PAs או מולקולות דומות של פפטיד היברידית.
כיוון polyamines כלל אינם זמינים מסחרית בצורות שלהם מוגן, וכיוון הגנה אמינים הראשיים והמשניים של polyamines הוא בעל חשיבות עליונה עבור conjugating אותם עם חומצות אמינו ומולקולות אחרות, אנחנו המחולקות שלבים סינתטיים כדי להשיג את ההגנה שלהם. המטרה הכוללת של פרוטוקול זה נועד לספק שיטה פשוטה עבור conjugating polyamines כדי חומצות אמינו. Polyamines חוסר קבוצה קרבוקסילית; לפיכך, הם לא מצמידים רינק אמיד או שרפים וואנג. במקום זאת, שרפים כגון 2-chlorotrityl כלוריד מומלצים עבור פרוטוקול סינתטי. האתגר העיקרי לטיפוסי PPA סינתזה היא הנוכחות של קבוצות פונקציונליות אמין יסודי ותיכון. למטרות שלנו, הגנו כל אמינים משניים ב פוליאמין תוך שמירה על קבוצה אמינו העיקרי על פוליאמין בחינם לאפשר צימוד הריאקציה. התגובה נעשה על תמיכה מלאה בעקבות עקרונות מעבדתי פפטיד סינתזה (SPPS) כדי להקל את העבודה לאחר כל שלב צימוד ו- deprotection. הפרוטוקול הבא מיועד הן ידניים ואוטומטיים הסינתזה של PPAs (למרות שאימות כמה צעדים יתחרו בבמערכת אוטומטית). הסינתזה של מולקולות אלה ניתן גם לבצע בחוץ של סינתיסייזר אוטומטיות או בסיועם של כור מיקרוגל (אוטומטית או חצי אוטומטית). יש כבר סיכם את ערכת התגובה באיור1.
איור 1: (א) A סכימת התגובה הכללית לסינתזה של PPAs. Polyamines נציג (B) שניתן להתרגל מסונתז PPAs המתוארים כאן. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. כללי הפרוטוקול של סינתזה של PPAs
- לחשב את היקף סינתזה (בדרך כלל mmol). מדד זה מבוסס על המסה של הסכום PPA היעד. זכור כי יעילות התגובה SPPS בהדרגה יורדת עם עלייה של רצף חומצות אמיניות. לכן, יעילות התגובה היא קשה לחשב.
- לחשב את המשקל של שרף כדי לשמש על פי ההעמסה של השרף. הטעינה נמצא על המכולה או בפרוטוקול ניתוח של השרף, שבאה לידי ביטוי mmol/g. ניתן להשתמש בנוסחה הבאה לחישוב המשקל של השרף:
- לשקול בזהירות את 2-chlorotrityl כלוריד שרף (במקרה שלנו ההעמסה הוא ~0.85 mmol)
- הכנס השרף כלי סינתזה fritted עם המפרט הבא: קיבולת – 50 מל ', Fritted דיסק – 25 מ מ, נקבוביות – בינוני.
- להוסיף 15 מ"ל של דיכלורומתאן (DCM) השרף.
- מוספית כלי סינתזה כדי מהירות משתנה מטרף מכני (שייקר את הבקבוק/קדירות) והפעל את כלי בזווית של 45° (או אופקית) כדי למקסם את עצבנות.
- לאפשר את החרוזים שרף להתנפח במשך 15 דקות נפיחות משפר את התשואה של התגובה כי הוא מקל פעפוע של האתר הפעיל, וייעול צימוד.
- הוסף 8 מקבילות (2 mmol עבור קנה מידה mmol 0.25) פוליאמין הרצוי (Spermine, Spermidine, Diethyelenetriamine, 1, 3-diaminopropane, וכו ') שרף, לאפשר לו להגיב במשך 5 שעות.
הערה: תקופה התגובה פחותה יפחית התשואה. - קייזר בדיקה (ראה טבלה של חומרים) כדי לאשר זיווג מוצלח פוליאמין שרף. זיווג מוצלח אמינים הראשי התשואות בצבע סגול/כחול, המתאים אמין ללא תשלום.
- להגן על הקבוצה amine הראשי באמצעות 4 מקבילות מומס מתנול נטול מים (15 מ ל), 1-(4,4-dimethyl-2,6-dioxocyclohex-1-ylidene)ethyl (Dde), ע י ניעור לילה תערובת11את התגובה.
הערה: זמן תגובה פחותה מפחיתה את התשואה. - לבצע מבחן קייזר. היעדרות של צבע כחול של החרוז שרף מאשר הגנה מוצלחת... במקרה של הגנה לא מוצלח של אמין ראשי, חזור על השלב הקודם.
- לרוקן את DCM ולשטוף שרפים פעמיים עם תערובת של DCM DMF (2:1, 15 מ"ל).
- לפזר 20 מקבילות (5 mmol) di-טרט בוטיל di-פחמתי (מפחיד) ב- DCM (20 מ ל) ולאפשר את התגובה להמשיך במשך 3 שעות.
- לעשות chloranil של מבחן (ראה טבלה של חומרים) כדי לוודא הגנה מלאה של אמין משני. תוצאה חיובית (הגנה) מניב צבע צהוב בהיר או חסר צבע. אמינים משניים חינם לתת צבע ירוק/כחול כהה, בעוד אמינים העיקרית לתת צבע אדום.
- מסננים את התערובת הממס, לשטוף פעמיים עם תערובת של DCM DMF (2:1, 15 מ"ל).
- מוסיפים פתרון 2% של הידרזין DMF (10 מ"ל), לנער 1 h.
- קייזר מבחן לאשר deprotection מוצלחת של אמין ראשי.
-
הוסף את חומצות אמינו הרצוי ברצף הפוכה שבה אתה כתיבה/לצייר אותם. פפטידים טרמיני N נמשכים טרמיני C אבל הם מסונתז בכיוון ההפוך, C כדי ש לדוגמה, עבור PPA המחייב את פפטיד הבאים ליבה - GLFD-, להוסיף חומצה אספרטית (D), ואחריו פנילאלנין (נ), לאוצין (L), ולבסוף גליצין (G).
הערה: עבור רוב חומצות אמינו, קוקטייל צימוד הבאות מתאימה עבור הקובץ המצורף שרפים פוליאמין טעון.- מערבבים 4 מקבילות (1 mmol) חומצת אמינו ביותר המוגן על-ידי Fmoc, 3.95 במקבילות של 2-(1H-benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium hexafluorophosphate (HBTU) ו- 15 במקבילות של אמין diisopropylethyl (DIPEA).
- לפזר אותם בתערובת של DCM ו DMF (1:1, 15 מ"ל), sonicate את הקוקטייל למשך 2 דקות (עד התפרקות מוחלטת).
- המתן של מינימום 3-5 נוספים כדי להבטיח הפעלה של חומצה קרבוקסילית על חומצת אמינו ביותר.
- להוסיף את תערובת התגובה לכלי השיט. לבצע את התגובה עבור 2-4 שעות בטמפרטורת החדר.
הערה: מצאנו הבאות בתור חלופה יעילה HBTU (בדרך כלל נדרש כמויות נמוכות של חומצות האמינו את והסוכנת צימוד): COMU, PyBOP, HATU, DIC/Oxima. - קייזר מבחן כדי לאשר זיווג מוצלח.
- בטל את הבחירה להגן על Fmoc-הקבוצה של חומצת אמינו ביותר על-ידי הוספת פתרון 20% של 4-methyl פיפרידין (10 מ"ל) ב- DMF. לעשות את זה פעמיים, כל פעם לנער את התערובת התגובה למשך 15 דקות.
הערה: חלופה יעילה להסרת Fmoc היא piperazine/DBU12.- לבצע שטיפה DCM (15 מ ל) בין תוספות.
- קייזר מבחן לאשר דה-הגנה מוצלח של החומצה אמינית.
- לשטוף את השרף ביסודיות כדי להסיר כל עקבות של 4-מתיל. לשטוף את השרף פעמיים עם DMF (10 מ"ל), כל כביסה שנמשך 5 דקות, ולבסוף עם DCM (10 מ"ל) למשך 10 דקות.
- להוסיף את כל חומצות האמינו הנותרים את במרוכז חוזרת של צימוד והגנה דה-שלבים.
-
לבסוף, לאחר צימוד כל חומצות אמינו הנדרשים, נזווג את הזנב הידרופובי לחומצה אמינית האחרון של הבונה פוליאמין-פפטיד:
- להוסיף 10 מקבילות הפונקציונליות של חומצה קרבוקסילית הרצוי כדי מקבילות 9.5 HBTU ושווי 12 של DIPEA מומס תערובת DCM DMF (1:1, 20 מ"ל).
הערה: יש לזכור להצמיד להם אולי צריכים שיעור שונה של הממס (בדרך כלל מדובר % גדול יותר של DCM) או התוספת או ממיס אחר כגון N-methylpyrrolidone (NMP). - Sonicate את הקוקטייל למשך 5-10 דקות עד התפרקות (ראינו זה לוקח יותר זמן על הזנב להתמוסס לחלוטין) ולהוסיף כלי הקיבול.
הערה: עבור זנבות המכיל מספר אתרי תגובתי, הם יצטרכו להיות מוגן לפני צימוד אותם. - לבצע את התגובה הזו (צימוד הזנב הידרופובי) לפחות 5 שעות, למרות זה רצוי לבצע אותה ללילה עבור התשואה הגבוהה ביותר.
- להוסיף 10 מקבילות הפונקציונליות של חומצה קרבוקסילית הרצוי כדי מקבילות 9.5 HBTU ושווי 12 של DIPEA מומס תערובת DCM DMF (1:1, 20 מ"ל).
2. PPA המחשוף מתמיכה מוצק
מטרת שלב זה היא המחשוף של PPA השרף, וכדי להסיר את קבוצות מגן מפחיד חומצות אמינו ו פוליאמין משקעים.
- לשטוף את השרף DMF (8 מ ל למשך 2 דקות), פעמיים עם DCM (8 מ"ל, בכל פעם במשך 5 דקות). לפני כל הוספה, לנקז הממס מכלי הקיבול. ברגע בכביסה האחרונה מבוצע, יבש השרף תחת ואקום למשך 15 דקות.
- להכין את הפתרון המחשוף באמצעות יחס התערובת הבאה: 28:1:1 trifluoroacetic חומצה (TFA): H2O: Triisopropyl silane (טיפים). כדי להפוך את 15 מ"ל של המחשוף קוקטייל מ 14 ל TFA, להוסיף 0.5 mL של H2O ו- 0.5 מ של טיפים.
- להוסיף פתרון המחשוף זה שרף ומנערים עבור 2-4 שעות בטמפרטורת החדר.
- לאסוף את הפתרון ב 25 או 50 מ ל עגולה בתחתית הבקבוק.
- לרכז את TFA באופן vacuo 1-2 מ ל באמצעות המאדה בלחץ מופחת תוך חימום התערובת ב 40 מעלות צלזיוס (לא לעלות על 55 ° C כדי למנוע פירוק של PPA).
- לאחר אידוי, להוסיף את הפתרון שהושג TFA (dropwise) בקבוקון התחתון עגול המכיל אתר נטול מים קרים (15 מ"ל). זה מיד לזרז את PPA.
- בנוסף, הוסף אתר נטול מים קרים (5 מ"ל) הבקבוק המקורי שבו TFA היה מרוכז.
- Sonicate את הבקבוק הזה. כדי לשחזר מוצקים נוספים ולשלב עם הפתרון אתר מהשלב 2.6.
הערה: פיפטה המעביר יכולים להישטף עם נפח קטן של DCM. הימנע היכרות עם DMF במהלך התהליך כי זה נוטה ליצור חומר דמוי ג'ל. - מקם את הבקבוק (מכוסה) בתוך המקרר ולתת לו לעמוד לילה כדי למקסם את כמות המשקעים.
- לאסוף את החומר precipitated על ידי סינון ואקום באמצעות משפך מסנן sintered דיסק. גודל הנקבוביות אידיאלי הן בסדר או בינונית.
- לשטוף את התמיסה פעמיים עם אתר קר (5 – 10 מ"ל) כדי להסיר את כל אורגניקס שיורית.
3. זיהוי של המוצר הגולמי בשיטת ושחרור מיובשים MALDI
-
מטריקס הכנה לניתוח במצב חיובי:
- כדי להפעיל ניתוח משקל מולקולרי באמצעות ספקטרומטר מסה מטריקס בסיוע לייזר Desorption/יינון (MALDI), להוסיף 10 עד 20 מ ג של חומצה α-cyano-4-hydroxycinnamic צינור microcentrifuge.
- להוסיף פתרון של מים/acetonitrile (1:1, 1.0 מ"ל) עם 0.1% חומצה Trifluoroacetic (TFA). לערבב ביסודיות על ידי vortexing.
הערה: מטריצה זו צריכה לשמש עבור פפטידים הטעון חיובית. מצב שלילי MALDI דומה אך דורש מטריצה המכילה 9-aminoacridine עם אמוניה 0.1% בתור ממיס מוספים. - להוסיף 1-2 µL של המדגם לצלחת היעד נירוסטה עבור MALDI ויבש המדגם באוויר. להוסיף 1-2 µL של המטריקס, לייבש אותו שוב.
הערה: הלוחות יש gridded לאורך הלוח היעד על מנת לאתר את הנקודה המסוימת מעגלית סימונים.
- לנתח את הדגימות בייצור מכשירים MALDI כדי לוודא את הזהות שלהם. יינון ספקטרומטריית Electrospray (ESI) היא אלטרנטיבה חוקית לאשר את זהותו של PPAs.
4. טיהור של PPAs באמצעות מפוח הפוכה-פאזי ביצועים גבוהים כרומטוגרפיה נוזלית (HPLC) טיהור
-
להמיס את התמיסה PPA בכמות מינימום של acetonitrile ומים.
- כלל אצבע, להמיס 100 מ ג של יובש PPA גולמי ב פחות מ 5 מ של acetonitrile ומים. יותר הידרופוביות PPAs עשויים לדרוש אחוז גדול יותר של acetonitrile כדי להמיס, אולי גם דורשת נפח גדול יותר של הממס באופן כללי, בהתאם המטען נטו של PPAs (טבלה 1).
- אם פירוק השלם לא יעשה, להוסיף 1% TFA (לחצן מצוקה או H2O). זה גם אפשרי להוסיף כמויות קטנות של אחרים ממיסים תואם כולל dimethylsulfoxide, מתנול או אלכוהול איזופרופיל (להגביל את התוכן שלהם על 5%).
| תמיסה # הממס | PPAs הטעון חיובית | אניון PPAs | ||
| 0.1% TFA במים | 0.1 מלון NH %3 במים | |||
| 0.1% TFA בלחצן מצוקה | 0.1 מלון NH %3 ' לחצן מצוקה | |||
טבלה 1: מערכות הממס. הצעת מערכת ממס באופן חיובי ולא שלילי טעונה PPAs.
- Sonicate את PPA באמצעות sonicator קרן עבור 20 דקות ב 10 פעימות s עם Amp1 של 48% או 2-3 h באמבט אולטראסוני.
-
לאחר מכן, לסנן באמצעות מסנן מזרק 0.45 μm ואחריו סינון באמצעות מסנן מזרק 0.20 μm טפלון (PTFE). הפתרון PPA צריך להיות נקי וללא כל החומרים חלקיקים.
- אם סינון קשה מדי, sonicate לתקופה ממושכת של זמן. מאוד מומלץ כי הפתרון PPA הוא מטוהרים מיד לאחר סינון מזרק, כמו אחסון ממושך עלול לגרום לו צבירה או gelate, אשר מחייבים sonication מחדש ו, אולי, סינון מחדש.
- במהלך ואחרי טיהור, להשתמש HPLC כיתה ממיסים או כאלה מסוננים דרך 0.25 μm מזרק מסנן/קרום.
הערה: התנאים הממס הנפוץ ביותר לטיהור PPAs מורכבות במעבר הדרגתי של H2O ולחצן מצוקה. - השתמש מכשיר HPLC הפוכה-פאזי סטנדרטי עבור פרוטוקול זה. זה צריך לכלול מתכנת הדרגתי של • תנאי, מערכת הממס בינארי, גלאי UV מסוגלת לאתר ב 220 ו- 254 ננומטר, ואני אספן שבר לתכנות. קצב זרימת המקסימום צריך להיות 50 mL/min.
- שימוש C-18 להפוך עמודה שלב להפרדה. עמודות של הממדים הבאים יכולים לשמש בהתאם המסה של מוצק הטיהור ולחייב הרשת של PPA (טבלה 2).
| תשלום PPA | גודל החלקיקים | גודל עמודה | המסה של PPA גולמי |
| + ve טעונים | 5 μm | 150 x 30 מ מ | 170 מ ג |
| -ve טעונים | 5 μm | 150 x 30 מ מ | 170 מ ג |
| + ve טעונים | 5 μm | 150 x 21.2 מ מ | 90 מ"ג |
| -ve טעונים | 5 μm | 150 x 21.2 מ מ | 90 מ"ג |
בטבלה 2: הציע עמודות: מידות טור, גודל החלקיקים, את קיבולת המטען המרבי לכל זריקה עבור סי18 הפוך עמודות HPLC שלב
- מזריקים PPA נקבע על ידי שני הקיבולת של העמודה ועל ידי הנפח של הלולאה הזרקה של HPLC אמצעי אחסון. הפעל את השיטה מעבר צבע HPLC בהתאם להגדרות ראו טבלה 3 (זמן • תנאי של 40 דקות).
| זמן | הממס (Acetonitrile) | B הממס (מים) | קצב הזרימה (mL/min) |
| 0 | 5% | 95% | קצב הזרימה תלויה על אריזת העמודה ואת גודלו. |
| 2 | 5% | 95% | |
| 35 | 95% | 5% | |
| 38 | 100% | 0% | |
| 40 | 5% | 95% |
טבלה 3: ההדרגתי המוצע: הציע שלב הפוך מעבר צבע מציג את ההרכב היחסי של המים vs acetonitrile על פני תקופה של זמן. קצב הזרימה יהיה תלוי במפרט עמודה.
-
לנתח את השברים שנאסף על המבחנות השונות באמצעות MALDI, לקבוע איזה צינור (או צינורות) מכיל את PPA. זה מוערך על ידי לימוד משקל מולקולרי נמצאו כל שפופרת.
- בדוק את הטוהר של השברים ב- HPLC אנליטי. השתמש מערכת HPLC-הדרגה מצויד עם גלאי UV שוכן בגובה 220 ננומטר.
- אם ישנם זיהומים, לעשות של מחזור נוסף של טיהור באמצעות HPLC. המילוי ההדרגתי לעיל המשמש לבדיקות מפוח וניתן לשנותם לשימוש עם HPLC אנליטי באמצעות התוכנה המקוונת של ממיר עמודה. כל שבר להיות הרבה ≥95% טהור אפיון פיסי או הערכה ביולוגי.
- לאסוף את השברים גדול עגול עם תחתית הבקבוק או אידוי הבקבוק ולהסיר את כל acetonitrile ואת רוב המים. הפתרון PPA הסופי צריך להיות לא יותר מ 10 מ"ל.
- העברה זו תתרכז שפופרת צנטרפוגה 50 מ. שימו לב כי PPAs הם חומרים דמויי-חומרי ניקוי; לפיכך, בועות ייווצר במהלך אידוי של הממס. מצאנו כי תוספת של אתיל אלכוהול מפחיתה היווצרות בועה.
- ואקום להתרכז להתרכז. במהלך אידוי ואקום, כמות גדולה של PPA עלול לדבוק בקירות המכולה. שחזור זה בשטיפת שוב ושוב על הקיר את הבקבוק עם מים HPLC. היקף משולב של PPA מרוכז, את rinsate צריך להיות לא יותר מ- 30 מ.
- המקום תמיסה מימית בתוך שפופרת 50 מ.
-
פלאש להקפיא את הפתרון PPA בחנקן נוזלי:
הערה: פלאש תוצאות קפוא בקרח-גבישים קטנים יותר אשר הנשגב מהר יותר ב- איזה שהוא לופילייזר. יתר על כן, הקפאה איטית יותר עשוי לאפשר היווצרות מבנים סופרא מולקולרית שהורכב עצמית. אלטרנטיבה אחרת (אבל רצוי פחות) הוא בהדרגה להקפיא במקפיא-80 ° C או להקפיא את השימוש של קרח יבש + תערובת אצטון- לפני הנחת הצינור צנטריפוגה איזה שהוא לופילייזר, לנקב או לשחרר את הפקק של הצינור כדי לאפשר לחות לברוח המדגם ולהשיג שליקט יחידת הקירור. הגדר את יחידת lyophilization להגדיר את הערך-54 ° C ו 0.016 mbar.
הערה: אפשרות נוספת היא להסיר את הכובע ולמקם מחיקה (עם גומייה) מעל הפתח. כמו כן, מצאנו כי הקפאת דגימות בזווית או לשבור את הקרח לחלקים קטנים מאפשר lyophilization מהיר וטוב יותר מגידול שטח. - אם המוצק מתחילה להימס, זה עשוי להצביע על עקבות הממס האורגני (בדרך כלל acetonitrile) קיימים. חזור על השלב קופא, להעריך את המצב של lyophilization.
- אם כור ההיתוך נמשכת, קיימים שני פתרונות פוטנציאליים:
- פיצול הדגימה בשני חלקים (ניתן להניח צינורות), לדלל עם מים, ולא לקפוא שוב. אין להשתמש פתרון זה לעיתים קרובות בגלל כמויות גדולות של ממיסים אורגניים עלולים לגרום נזק לציוד.
- לחלופין, למקם את הדגימה בבקבוקון, בהמשך להתאדות הממס האורגני תחת ואקום. Lyophilizing מדגם זה בצורתו הנוזלית בדרך כלל מוביל מתנגשות ואובדן של המתחם PPA.
- לפני הנחת הצינור צנטריפוגה איזה שהוא לופילייזר, לנקב או לשחרר את הפקק של הצינור כדי לאפשר לחות לברוח המדגם ולהשיג שליקט יחידת הקירור. הגדר את יחידת lyophilization להגדיר את הערך-54 ° C ו 0.016 mbar.
5. אחסון של PPAs
- החנות PPAs ב-20 ° C עם הפקקים התהדקה ואטום עם מצלמות-מיקרוסקופים על צינור עם תווית נכונה.
- לפני השימוש, להחזיר את PPA טמפרטורת הסביבה בתוך תא ואקום כדי למנוע עיבוי של אדי מים על PPAs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
לאחר הסינתזה של טיהור ולפני הערכה physicochemical או ביולוגי, מומלץ PPAs ההמונים בדק מחדש, הטוהר לקביעה באמצעות HPLC אנליטי. אפיון חומרים או הערכה ביולוגי, PPAs צריך להיות של טוהר > 95%. איור 2 מציג את HPLC מעקב (למעלה) ואת MALDI ספקטרה (למטה) המאשרים את נוכחותם של המוצר. מערכות אנליטיות HPLC ישתלבו השטח מתחת לעקומה (AUC) ולא של חאן אל > 95% יכול להיות קשור המוצר טוהר. במערכות מבוססות-UV HPLC, לצפות לשיא יחיד, חדה. ספקטרה MALDI צריכה להתאים את זה של המשקל המולקולרית מחושב PPA בתוך ±1 Da (בהתאם למצב של ניתוח על-ידי MALDI).
הרכבה עצמית של PPAs להיות visualized וניתח בטכניקות הרבות, כולל שידור מיקרוסקופ אלקטרונים (TEM) (איור 3 א, ב'), האטום כוח מיקרוסקופ (AFM) (איור 3C, D), רנטגן זווית קטנה פיזור (SAXS), סריקה מיקרוסקופ אלקטרונים (SEM), ודינמי פיזור אור (DLS). מוצלחת הרכבה עצמית תגרום nanostructures מוגדרים היטב AFM והן TEM. כשל בעצמם יביאו להצגת להיווצרות של אגרגטים חריג כי הם מאות ננומטרים בגודלם.
איור 2: נציג האנליטי HPLC chromatogram (למעלה), MALDI ספקטרום (התחתון) של PPA C16V22Spermine. דמות זו שונתה סמד ואח 20176; לעשות שימוש חוזר עם אישור של ג'ון וויילי ובניו, 2018. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3: שידור נציג מיקרוסקופ אלקטרונים (TEM) micrograph. (א) TEM תמונת מראה היווצרות של nanofiber ו- nanosheets מאוחה, שיבוץ Magnified (B) מציג את היווצרות מצורפות ננו-גליונות, אטומית (C) כוח מיקרוסקופ (AFM) micrograph, (ד) גובה מפה נגזר micrograph ג16V22KDiethyelenetriamine. הצירים X ו- Y של (D) מייצג ננו-גיליון רוחב וגובה ננו-גיליון בהתאמה. דמות זו שונתה סמד ואח 20176; לעשות שימוש חוזר עם אישור של ג'ון וויילי ובניו, 2018. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הפרוטוקולים המתוארים כאן ניתן לסנתז PPAs כמו בארות כמו PAs, הקשורות מבוססת על פפטיד מולקולות (כמו היברידי PA-peptoids). למרות הסינתזה של פפטידים באמצעות SPPS היא תהליך פשוט, הסינתזה של פפטידים המכילים מולקולות ביולוגיות ביות יכולה להיות מאתגרת במיוחד. Polyamines כמו spermine, spermidine, diethyelenetriamine, וכו, יכול לשמש מולקולות ביות הכוונת תאי סרטן13. PPAs עצמי יכולים להרכיב לתוך nanostructures עם מורפולוגיות מגוונות6. מטען חיובי שלהם יכול גם לסייע עם זמן מחזור יותר (בגלל הבריחה endosomal), פרופיל מטבולי שונה (בהשוואה המסורתית). עם זאת, סינתזה PPAs ו שלהם מקבילים יכול להיות אתגר מסוים עקב נוכחות אמינים ראשיים ומשניים. האסטרטגיה סינתטי הציג מתגבר על האתגר הזה על ידי שימוש הגיוני אורתוגונלית קבוצה מגן. מולקולת Dde עובר באופן סלקטיבי התגובה רק עם ראשי אמינים11. מפחיד, מצד שני, מגיב ללא הבחנה עם ראשי ומשני אמינים, לכן, ניתן להוסיף רק אחרי amine הראשי מוגנת. ברצוננו לציין כי קבוצות אחרות מגן יכול לשמש במקום מפחיד. לדוגמה, התגובה עם אנהידריד אצטי לצמיתות acetylate את אמינים משניים (קבוצה זו לא יוסרו במהלך המחשוף). באופן דומה, השימוש אנהידריד trifluoacetic תספק הגנה בסיס רגיש בזמן benzylcarbamate. אתן קבוצה אשר ניתן להסיר באמצעות H2/Ni14. ברגע polyamines מוגנות לפי הצורך, הסינתזה של PPA ניתן להמשיך באמצעות תקן SPPS. צימוד הזנב הידרופובי לשאר הבונה פוליאמין-פפטיד לא רק לוקח פרק זמן ארוך יותר של זמן זוג, אבל גם דורש כמות כפולה טוחנת של חומצות אמינו. חלק הידרופובי זנבות אולי אינם מתמוססים היטב בטמפרטורת החדר קצת ממיסים מסורתי או עלול לזרז גם לאחר פירוק ראשוני. תגובות אלו בצורה הטובה ביותר מתבצעת תחת חימום מתון (40 ° C) על ידי העברת כל שני המגיבים כדי לעגל את הבקבוק התחתון. לחלופין, קיבול סינתיסייזר המעטפת עשויה לשמש כדי לחמם שני המגיבים לאורך התגובה. אם הוא זמין, סינתיסייזר מיקרוגל עשויים לסייע עם מצמד ה-15.
למרות צורות רבות של לספקטרומטרית זמינים לקבוע את ההמונים של PPAs, השתמשנו ספקטרוסקופיה MALDI לצורך הזיהוי שלנו. אנו מוצאים MALDI להיות יותר יעיל בהפקת הפסגות יון מולקולרית, מזעור פיצול, adduct גיבוש. MALDI צריך להיות מתוכנת ליצירת יון שמתאים למצב יינון סביר של PPA. מלבד תכנות כלי לייצר יון של מטען מסוים, אנו זקוקים גם לשלב את הדגימות עם המטריצה המתאימה מתאים מצב שאנו נשתמש.
PAs לעיתים קרובות יש נטייה טופס מלח adducts בצלחת MALDI. בעיה זו נתפסת לעתים קרובות יותר עם מולקולות טעונים שלילית. מלחים נפוצים ביותר הם אלה של נתרן (Na+ = 23 Da), אשלגן (K+ = 39 Da). אלה adducts מאי להיחסם על-ידי הוספת 1 – 2 µL של חומצה אצטית. PPAs מספקים בדרך כלל ה+ adduct. מומלץ לשימוש רק nanopore ומים או HPLC המים לאורך סינתטיים תהליך החיטוי כדי למנוע חדירת יונים נוספים. מיכלי זכוכית בורוסיליקט וכלי התגובה עשויים להכיל כמויות ניכר של נתרן יונים אשר ליץ לתוך המוצר הסופי. לשטוף את כלי הזכוכית בזהירות באמצעות nanopurewater בשביל הכביסה האחרון.
זיהוי הפסגות יון מולקולרית גם הופך להיות קשה אם הפתרון מטריצה לא מלא רווי המטריקס מוצק. כדי להבטיח רוויה, צריך תמיד להיות כמות קטנה של המטריקס מוצק זה לא solubilized.
בתור הערה סופית, אנא שקול כי כמה PPAs או PAs אולי לא טופס כלשהו התמיסה על תוספת של האתר. זה נצפתה בעיקר ב PPAs יותר הידרופילית. באירועים כאלה, אנחנו קודם מתאדים כל אתר, לנטרל TFA עודף עם NH4או ולהוסיף מים, Acetonitrile (עם 0.1% TFA או NH4OH) באופן מלא solubilize זה ולאחר מכן המשך לטהר כרגיל.
הפרוטוקול המתואר כאן ניתן לסנתז טהור מאוד וריאציות של הרכבה עצמית פוליאמין המבוסס על פפטיד חומרים פעילי שטח (PPAs) וגם PAs. השלבים הגנה אורתוגונלית/deprotection יכול לשמש במצבים אחרים הדורשים מיסוך סלקטיבי של קבוצות אמין יסודי ותיכון.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים יש אין ניגוד אינטרסים להכריז
Acknowledgments
הפרויקט מומן על ידי והמרכז הרפואי של אוניברסיטת נברסקה (סטארט-אפ קרנות, MC-S); NIH COBRE, 5P20GM103480 (Bronich ט) של האגודה האמריקנית לכימיה, PRF # 57434-DNI7(MC-S).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Chlorotrityl chloride resin | AappTec | RTZ001 | |
| SynthwareTM synthesis vessel | Aldrich | SYNP120050M | |
| Dichloromethane | Acros | AC406920250 | Fisher Sci. Catalogue # |
| Wrist Shaker | Boekel Scientific | 401000-2 | |
| Kaiser test kit | Sigma-Aldrich | 60017 | |
| 2-[(4,4-dimethyl-2,6-dioxocyclohex-1-ylidene)ethyl-amino]-ethanol | Sigma-Aldrich | CDS004772 | |
| Anhydrous Methanol | Acros | AC610981000 | Fisher Sci. Catalogue # |
| Chloranil test kit | TCI | TCC1771-KIT | VWR Catalogue # |
| Di-tert butyl di-carbonate | Acros | AC194670250 | Fisher Sci. Catalogue # |
| Dimethylformamide | Fisher Scientific | BP1160-4 | |
| Hydrazine | Acros | AC296815000 | FIsher Sci. Catalogue # |
| (2-(1H-benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium hexafluorophosphate) | p3biosystems | 31001 | |
| 4-methyl piperidine | Acros | AC127515000 | FIsher Sci. Catalogue # |
| Trifluoroacetic Acid | AappTec | CXZ035 | |
| Triisopropyl Silane | Sigma-Aldrich | 233781 | |
| Ether | Fisher Scientific | E138-1 | |
| α-Cyano-4-hydroxycinnamic acid | Sigma-Aldrich | C8982 | |
| 9-Aminoacridine | Sigma-Aldrich | 92817 | |
| Fisherbrand Syringe Filters: PTFE Membrane | Fisher Scientific | 09-730-21 |
References
- Cui, H., Pashuck, E. T., Velichko, Y. S., Weigand, S. J., Cheetham, A. G., Newcomb, C. J., Stupp, S. I. Spontaneous and x-ray-triggered crystallization at long range in self-assembling filament networks. Science. 327, 555-559 (2010).
- Pashuck, E. T., Cui, H., Stupp, S. I. Tuning supramolecular rigidity of peptide fibers through molecular structure. Journal of the American Chemical Society. 132, 6041-6046 (2010).
- Stupp, S. I., Zha, R. H., Palmer, L. C., Cui, H., Bitton, R.
- Conda-Sheridan, M., Lee, S. S., Preslar, A. T., Stupp, S. I. Esterase-activated release of naproxen from supramolecular nanofibres. Chemical Communications. 50, 13757-13760 (2014).
- Mata, A., Palmer, L., Tejeda-Montes, E., Stupp, S. I. Design of biomolecules for nanoengineered biomaterials for regenerative medicine. Nanotechnology in Regenerative Medicine. , Springer. 39-49 (2012).
- Samad, M. B., Chhonker, Y. S., Contreras, J. I., McCarthy, A., McClanahan, M. M., Murry, D. J., Conda-Sheridan, M. Developing Polyamine-Based Peptide Amphiphiles with Tunable Morphology and Physicochemical Properties. Macromolecular bioscience. 17, (2017).
- Nel, A. E., Mädler, L., Velegol, D., Xia, T., Hoek, E. M., Somasundaran, P., Klaessig, F., Castranova, V., Thompson, M. Understanding biophysicochemical interactions at the nano-bio interface. Nature Materials. 8, 543 (2009).
- Gujrati, M., Malamas, A., Shin, T., Jin, E., Sun, Y., Lu, Z. -R. Multifunctional cationic lipid-based nanoparticles facilitate endosomal escape and reduction-triggered cytosolic siRNA release. Molecular Pharmaceutics. 11, 2734-2744 (2014).
- Zhu, Y., Li, J., Kanvinde, S., Lin, Z., Hazeldine, S., Singh, R. K., Oupický, D. Self-immolative polycations as gene delivery vectors and prodrugs targeting polyamine metabolism in cancer. Molecular Pharmaceutics. 12, 332-341 (2014).
- Planas-Portell, J., Gallart, M., Tiburcio, A. F., Altabella, T. Copper-containing amine oxidases contribute to terminal polyamine oxidation in peroxisomes and apoplast of Arabidopsis thaliana. BMC Plant Biology. 13, 109 (2013).
- Nash, I. A., Bycroft, B. W., Chan, W. C. Dde - A selective primary amine protecting group: A facile solid phase synthetic approach to polyamine conjugates. Tetrahedron Letters. 37, 2625-2628 (1996).
- Ralhan, K., KrishnaKumar, V. G., Gupta, S. Piperazine and DBU: a safer alternative for rapid and efficient Fmoc deprotection in solid phase peptide synthesis. RSC Advances. 5, 104417-104425 (2015).
- Casero, R. A. Jr, Marton, L. J. Targeting polyamine metabolism and function in cancer and other hyperproliferative diseases. Nature Reviews Drug Discovery. 6, 373 (2007).
- Wuts, P. G. M., Greene, T. W. Protection for the Amino Group. In Greene's Protective Groups in Organic Synthesis. , John Wiley &, Sons, Inc. 696-926 (2006).
- Palasek, S. A., Cox, Z. J., Collins, J. M. Limiting racemization and aspartimide formation in microwave-enhanced Fmoc solid phase peptide synthesis. Journal of Peptide Science. 13, 143-148 (2007).
