بروتوكول سهلة لتركيب تجميع الذاتي القائم على بولياميني الببتيد أمفيفيليس (نظام) والحيوية ذات الصلة
Summary
تركيب الببتيد المستندة إلى بولياميني أمفيفيليس (نظام) يمثل تحديا كبيرا نظراً لوجود عدة أمين نيتروجينس، الأمر الذي يتطلب الاستخدام الحكيم لحماية المجموعات لإخفاء هذه الوظائف القائم على رد الفعل. في هذه الورقة، ويصف لنا طريقة سهلة للتحضير لهذه الفئة الجديدة من جزيئات تجميع ذاتي.
Abstract
على أساس بولياميني “أمفيفيليس الببتيد” (نظام) فئة جديدة من تجميع ذاتي amphiphilic المتصلة بالمواد الحيوية إلى أمفيفيليس الببتيد (PAs). نظام تقييم الأداء التقليدية تمتلك مشحونة بالأحماض الأمينية سولوبيليزينج المجموعات (يسين، ارجينين)، التي ترتبط مباشرة بقطعة دهن أو يمكن أن يحتوي على منطقة رابط مصنوعة من الأحماض الأمينية محايدة. ضبط تسلسل الببتيد من نظام تقييم الأداء يمكن أن تسفر عن مورفولوجيس المتنوعة. وبالمثل، وبالاخذ امتلاك قطعة مسعور والأحماض الأمينية محايدة، ولكن أيضا تحتوي على جزيئات بولياميني كالماء سولوبيليزينج المجموعات (ماء). كما الحال بالنسبة لنظام تقييم الأداء، كما يمكن تجميع وبالاخذ ذاتيا في مورفولوجيس المتنوعة، بما في ذلك قضبان صغيرة وشرائط نانو الملتوية، وتنصهر نانو-أوراق، عندما يذوب في الماء. ومع ذلك، وجود الأمينات الأولية والثانوية على حد سواء في جزيء بولياميني واحدة تمثل تحديا كبيرا عند توليف وبالاخذ. في هذه الورقة، ونظهر بروتوكول بسيط، استناداً إلى سوابق الأدب، تحقيق توليفة السطحية لنظام استخدام المرحلة الصلبة الببتيد التوليف (الكائنة). ويمكن تمديد هذا البروتوكول لتركيب نظام تقييم الأداء ونظم أخرى مماثلة. نحن أيضا لتوضيح الخطوات اللازمة للانقسام من الراتنج، وتحديد الهوية، وتنقية.
Introduction
تجميع ذاتي الببتيد أمفيفيليس (PAs) فئة من المواد الحيوية التي تتألف عادة من الأجزاء التالية: (أ) ماء الرأس والمنطقة (ب) رابط الذيل (ج) مسعور. تمتلك معظم PAs الموصوفة في الأدب رأسه ماء تتألف من الأحماض الأمينية مشحونة أو القطبية بقايا1،2،،من34. نظام تقييم الأداء قد وجدت مجموعة واسعة من التطبيقات في الطب الحيوي بما في ذلك تسليم المخدرات، وتشخيص المرض، والطب التجديدي، إلخ5. استناداً إلى تسلسل الأحماض الأمينية بها، نظام تقييم الأداء يمكن أن تشكل مجموعة متنوعة واسعة من النانو بما في ذلك المذيلات كروية، وخيوط نانو. ونحن قد أبلغت مؤخرا بفئة من الهجين على أساس بولياميني الببتيد أمفيفيليس، وصف وبالاخذ6. تم العثور على مورفولوجيس وحركية تجميع ذاتي، وتدهور ايضية، هذه الحيوية، تكون ذات صلة بجماعتهم الرأس سولوبيليزينج. وعلاوة على ذلك، لم تظهر النانو PPA سمية نحو خلايا الثدييات (خطوط MiaPaCa2 وخلية هيلا) بتركيزات تم اختبارها. نانوكاريرس المستندة إلى المؤسسة العامة للتقاعد وسائل إيصال المخدرات جذابة لأن: (1) بولياميني الامتصاص والايض قد ثبت أن زيادة في الخلايا السرطانية، يمكن تحقيق النانو (2) الموجبة اندوسومال الهروب7،8 الأمر الذي يؤدي إلى ارتفاع التداول والإقامة داخل خلية، و (3) يجب أن يكون ملف تعريف الأيض متميزة بالمقارنة مع السلطة الفلسطينية؛ على سبيل المثال، سوف تكون أكثر استقرارا نحو البروتياز التي وجدت في جسم الإنسان (على الرغم من أنهم ربما حساسة للإنزيمات الأخرى، مثل أمين oxidases)9،10. أيضا، تم العثور على وبالاخذ بالخصائص الفيزيائية وصلابة نانوحبيبات، مورفولوجيس متنوعة وحركية الجمعية تبعاً لطول والمسؤول عن كل جزيء PPA6. هنا، يمكننا وصف بروتوكول مفصل للتوليف وتحديد الهوية، وتنقية وبالاخذ التي يمكن تطبيقها أيضا على إعداد نظام تقييم الأداء أو جزيئات الببتيد الهجين مماثلة.
أن بوليامينيس ليست متاحة تجارياً في أشكالها المحمية عادة، ولأن حماية الأمينات الأولية والثانوية من بوليامينيس بأهمية قصوى للتصريف مع الأحماض الأمينية والجزيئات الأخرى، وقد أوضحنا الاصطناعية من الخطوات لتحقيق هذه الحماية. والهدف العام من هذا البروتوكول توفير طريقة بسيطة للتصريف بوليامينيس للأحماض الأمينية. بوليامينيس تفتقر إلى مجموعة كاربوكسيليك؛ وهكذا، لا يمكن أن يقترن إلى “حلبة أميد” أو راتنجات وانغ. بدلاً من ذلك، ينصح راتنجات مثل كلوريد 2-تشلوروتريتيل لبروتوكول الاصطناعية. ويتمثل التحدي الرئيسي لتوليف PPA وجود المجموعات الوظيفية أمين الابتدائية والثانوية. لأغراضنا، نحن حماية جميع الأمينات الثانوية في بولياميني مع إبقاء المجموعة الأمينية الأساسية على بولياميني الحرة للسماح برد فعل اقتران. حدث رد فعل على دعم متين بعد مبادئ المرحلة الصلبة الببتيد التوليف (الكائنة) لتسهيل العمل إلى أعلى بعد كل خطوة اقتران و deprotection. البروتوكول التالي لتوليف وبالاخذ اليدوي والآلي (على الرغم من أن التحقق من بعض الخطوات سوف تكون صعبة في نظام مؤتمت). يمكن أيضا أن يتم تجميع هذه الجزيئات خارجاً المزج الآلي أو مع المعونة من مفاعل يعمل بالموجات الدقيقة (الآلي أو شبه الآلية). وقد تم تلخيص رد فعل مخطط في الشكل 1.
رقم 1: (A) بنظام رد الفعل العام لتركيب نظام. بوليامينيس الممثل (ب) التي يمكن استخدامها لتوليف وبالاخذ الموصوفة هنا. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Protocol
Representative Results
Discussion
يمكن استخدام البروتوكولات المذكورة هنا توليف وبالاخذ الآبار كنظام تقييم الأداء، والمتعلقة بالجزيئات المستندة إلى الببتيد (مثل الهجين السلطة الفلسطينية-بيبتويدس). على الرغم من أن تركيب الببتيدات الكائنة باستخدام إجراءات واضحة، يمكن تركيب الببتيدات المحتوية على جزيئات بيولوجية صاروخ مو…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم تمويل هذا المشروع من المركز الطبي في جامعة نبراسكا (أموال بدء التشغيل، MC-S)؛ المعاهد الوطنية للصحة-نحاس، 5P20GM103480 (ت. برونيتش)، وجمعية الكيميائيين الأمريكية، PRF # 57434-DNI7(MC-S).
Materials
| 2-Chlorotrityl chloride resin | AappTec | RTZ001 | |
| SynthwareTM synthesis vessel | Aldrich | SYNP120050M | |
| Dichloromethane | Acros | AC406920250 | Fisher Sci. Catalogue # |
| Wrist Shaker | Boekel Scientific | 401000-2 | |
| Kaiser test kit | Sigma-Aldrich | 60017 | |
| 2-[(4,4-dimethyl-2,6-dioxocyclohex-1-ylidene)ethyl-amino]-ethanol | Sigma-Aldrich | CDS004772 | |
| Anhydrous Methanol | Acros | AC610981000 | Fisher Sci. Catalogue # |
| Chloranil test kit | TCI | TCC1771-KIT | VWR Catalogue # |
| Di-tert butyl di-carbonate | Acros | AC194670250 | Fisher Sci. Catalogue # |
| Dimethylformamide | Fisher Scientific | BP1160-4 | |
| Hydrazine | Acros | AC296815000 | FIsher Sci. Catalogue # |
| (2-(1H-benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium hexafluorophosphate) | p3biosystems | 31001 | |
| 4-methyl piperidine | Acros | AC127515000 | FIsher Sci. Catalogue # |
| Trifluoroacetic Acid | AappTec | CXZ035 | |
| Triisopropyl Silane | Sigma-Aldrich | 233781 | |
| Ether | Fisher Scientific | E138-1 | |
| α-Cyano-4-hydroxycinnamic acid | Sigma-Aldrich | C8982 | |
| 9-Aminoacridine | Sigma-Aldrich | 92817 | |
| Fisherbrand Syringe Filters: PTFE Membrane | Fisher Scientific | 09-730-21 |
References
- Cui, H., Pashuck, E. T., Velichko, Y. S., Weigand, S. J., Cheetham, A. G., Newcomb, C. J., Stupp, S. I. Spontaneous and x-ray-triggered crystallization at long range in self-assembling filament networks. Science. 327, 555-559 (2010).
- Pashuck, E. T., Cui, H., Stupp, S. I. Tuning supramolecular rigidity of peptide fibers through molecular structure. Journal of the American Chemical Society. 132, 6041-6046 (2010).
- Stupp, S. I., Zha, R. H., Palmer, L. C., Cui, H., Bitton, R. Self-assembly of biomolecular soft matter. Faraday Discussions. 166, 9-30 (2013).
- Conda-Sheridan, M., Lee, S. S., Preslar, A. T., Stupp, S. I. Esterase-activated release of naproxen from supramolecular nanofibres. Chemical Communications. 50, 13757-13760 (2014).
- Mata, A., Palmer, L., Tejeda-Montes, E., Stupp, S. I. Design of biomolecules for nanoengineered biomaterials for regenerative medicine. Nanotechnology in Regenerative Medicine. , 39-49 (2012).
- Samad, M. B., Chhonker, Y. S., Contreras, J. I., McCarthy, A., McClanahan, M. M., Murry, D. J., Conda-Sheridan, M. Developing Polyamine-Based Peptide Amphiphiles with Tunable Morphology and Physicochemical Properties. Macromolecular bioscience. 17, (2017).
- Nel, A. E., Mädler, L., Velegol, D., Xia, T., Hoek, E. M., Somasundaran, P., Klaessig, F., Castranova, V., Thompson, M. Understanding biophysicochemical interactions at the nano-bio interface. Nature Materials. 8, 543 (2009).
- Gujrati, M., Malamas, A., Shin, T., Jin, E., Sun, Y., Lu, Z. -. R. Multifunctional cationic lipid-based nanoparticles facilitate endosomal escape and reduction-triggered cytosolic siRNA release. Molecular Pharmaceutics. 11, 2734-2744 (2014).
- Zhu, Y., Li, J., Kanvinde, S., Lin, Z., Hazeldine, S., Singh, R. K., Oupický, D. Self-immolative polycations as gene delivery vectors and prodrugs targeting polyamine metabolism in cancer. Molecular Pharmaceutics. 12, 332-341 (2014).
- Planas-Portell, J., Gallart, M., Tiburcio, A. F., Altabella, T. Copper-containing amine oxidases contribute to terminal polyamine oxidation in peroxisomes and apoplast of Arabidopsis thaliana. BMC Plant Biology. 13, 109 (2013).
- Nash, I. A., Bycroft, B. W., Chan, W. C. Dde – A selective primary amine protecting group: A facile solid phase synthetic approach to polyamine conjugates. Tetrahedron Letters. 37, 2625-2628 (1996).
- Ralhan, K., KrishnaKumar, V. G., Gupta, S. Piperazine and DBU: a safer alternative for rapid and efficient Fmoc deprotection in solid phase peptide synthesis. RSC Advances. 5, 104417-104425 (2015).
- Casero, R. A., Marton, L. J. Targeting polyamine metabolism and function in cancer and other hyperproliferative diseases. Nature Reviews Drug Discovery. 6, 373 (2007).
- Wuts, P. G. M., Greene, T. W. . Protection for the Amino Group. In Greene’s Protective Groups in Organic Synthesis. , 696-926 (2006).
- Palasek, S. A., Cox, Z. J., Collins, J. M. Limiting racemization and aspartimide formation in microwave-enhanced Fmoc solid phase peptide synthesis. Journal of Peptide Science. 13, 143-148 (2007).
