Summary
Синтез amphiphiles на основе амидов кислых пептида (ППД) является важной задачей благодаря наличию нескольких Амин nitrogens, который требует разумного использования защиты групп, чтобы замаскировать этим реактивного функций. В настоящем документе мы описываем снисходительный метод для подготовки этих новых класса самостоятельной сборки молекул.
Abstract
На основе амидов кислых пептидные Amphiphiles (ППД) являются новый класс самостоятельной сборки амфифильных биоматериалов, относящиеся к amphiphiles пептид (ССА). Традиционные PAs обладают заряженные аминокислоты как растворяющие групп (лизин, аргинин), которые подключены непосредственно к сегменту липидов или может содержать область компоновщик из нейтральных аминокислот. Тюнинг пептид последовательность PAs может принести различные морфологии. Аналогично ППД обладают сегмент гидрофобных и нейтральных аминокислот, но также содержат полиаминовых молекулы воды, растворяющие (гидрофильных) групп. Как и в случае с PAs, ППД могут также самостоятельно собрать в разнообразных морфологии, в том числе малые стержни, витой нано ленты и плавленого нано листы, при растворении в воде. Однако наличие первичных и вторичных аминов на молекуле одного полиаминовых представляет значительную проблему при синтезировать ППД. В этой статье мы покажем простой протокол, основанный на прецеденты литературы, для достижения снисходительный синтез энергомощностей с использованием твердой фазы пептидного синтеза (ППУ). Этот протокол может быть продлен для синтеза PAs и других подобных систем. Мы также иллюстрируют шаги, которые необходимы для расщепления от смолы, идентификации и очистки.
Introduction
Самостоятельной сборки пептидные amphiphiles (ССА) являются класс биоматериалов, обычно состоит из следующих сегментов: () гидрофильные голова, (b) компоновщика региона и (c) гидрофобная хвост. Большинство описанных в литературе PAs обладают гидрофильные голова состоит из заряженных или полярных аминокислотных остатков1,2,3,4. ССА нашли широкий спектр приложений в биомедицине, в том числе Доставка лекарств, диагностики заболеваний, восстановительной медицины, и т.д.5. На основе их аминокислотных последовательностей, ПА может сформировать широкий спектр наноструктур, включая сферических мицелл и нано волокна. Недавно мы сообщили класс гибрид на основе амидов кислых пептидные amphiphiles, называют ППД6. Морфологии, самостоятельной сборки кинетики и метаболических деградации, эти биоматериалов, были найдены быть связано с их solubilizing начальник группы. Кроме того PPA наноструктур не показывают токсичности к mammalian клеток (линии MiaPaCa2 и клеток HeLa) в концентрациях, протестированных. PPA-основанные nanocarriers являются привлекательными наркотиков-доставки, потому что: (1) полиаминовых поглощение и метаболизм было показано увеличение раковых клеток, (2) Катионный наноструктур можно добиться от англ побег7,8, что приводит к более циркуляции и жительства в пределах ячейки и (3), они должны иметь собственный метаболизм профиль, когда по сравнению с ПА; Например, они будут более стабильными направлении протеаз, найти в человеческом теле (хотя они может быть чувствительным к другие ферменты, такие как Амин оксидазы)9,10. Кроме того иметь разнообразные морфологии, физико-химических свойств, наночастиц жесткость и Ассамблея кинетики в зависимости от длины и заряд отдельных PPA молекулы6были найдены ППД. Здесь мы описываем подробный протокол для синтеза, идентификации и очистки ППД, которые также могут быть применены к подготовке Пас или аналогичных гибридные пептидных молекул.
Потому что Полиамины обыкновенно не коммерчески доступных в их защищенных форм, и потому, что защита первичные и вторичные амины Полиамины имеет первостепенное значение для спрягать их с аминокислот и других молекул, мы наметили синтетические шаги для обеспечения их защиты. Общая цель настоящего Протокола заключается в обеспечивают простой метод для спрягать полиаминов в аминокислоты. Полиамины отсутствие карбоксильные группы; Таким образом они не могут сочетаться каток амидной или Ван смол. Вместо этого смолы, например 2-chlorotrityl хлорид рекомендуются для синтетических протокола. Основной задачей для синтеза PPA является наличие первичных и вторичных аминов функциональных групп. Для наших целей мы защитили все вторичные амины в полиаминовых сохраняя основной амино-группы на полиаминовых свободной соединительной реакции. Реакция была сделана на прочную поддержку принципам твердой фазы пептидного синтеза (ППУ) для облегчения работы вверх после каждого шага муфтой и deprotection. Следующий протокол предназначен для ручного и автоматизированного синтеза ПРП (хотя проверка некоторых шагов будет сложным в автоматизированной системе). Синтез этих молекул может также осуществляться на автоматизированных синтезатор или с помощью микроволновой реактора (автоматические или полуавтоматические). Схему реакции подведены на рисунке 1.
Рисунок 1: (A) A общей реакции схема для синтеза ППД. (B) представитель Полиамины, которые могут быть использованы для синтезированных ППД, описанных здесь. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. общий протокол для синтеза ППД
- Рассчитайте шкалу синтеза (обычно ммоль). Эта шкала основана на массы целевой суммы PPA. Имейте в виду, что эффективность реакции ППУ постепенно уменьшается с увеличением аминокислотной последовательности. Таким образом эффективность точное реакции трудно вычислить.
- Рассчитайте вес использоваться согласно загрузки смолы смолы. Загрузка на контейнере или протокол анализа смолы и выражена в ммоль/г. Следующая формула может использоваться для расчета веса смолы:
- Тщательно взвесить, 2-chlorotrityl хлорид смолы (в нашем случае загрузка является ~0.85 ммоль)
- Место смолы в фриттированных синтез сосуд со следующими характеристиками: мощность – 50 мл, фриттированных диск – 25 мм, пористость – средний.
- Добавьте 15 мл Дихлорметан (DCM) смолы.
- Аффикс синтеза судна в шейкере механические переменной скорости (фляга шейкер/мешалкой) и поверните судов под углом в 45° (или горизонтально) максимизировать агитации.
- Разрешить бусины смола пухнуть 15 мин отек повышает доходность реакции потому, что она облегчает молекулярной диффузии и доступность для активного узла, повышения эффективности сцепления.
- Добавить 8 эквиваленты (2 ммоль 0,25 шкалы ммоль) желаемого полиаминовых (Спермин, спермидина, Diethyelenetriamine, 1,3-diaminopropane и т.д.) в смоле и позволить ему реагировать на 5 ч.
Примечание: Меньший период реакции приведет к сокращению урожайности. - Сделать Кайзер тест (см. Таблицу материалы) для подтверждения успешного сопряжения полиаминовых смолы. Успешное сцепления первичных аминов дает фиолетовый/синий цвет, который соответствует бесплатно аминов.
- Защите группе Первичные амины, с использованием 4 эквиваленты 1-(4,4-dimethyl-2,6-dioxocyclohex-1-ylidene)ethyl (Dde), растворенного в безводный метанола (15 мл), встряхнув реакции смесь ночи11.
Примечание: Меньшее время реакции снижает урожайность. - Выполните тест Кайзер. Отсутствие синего цвета из бисера смолы подтверждает успешной защиты. В случае неудачной защиты Первичные амины повторите предыдущий шаг.
- Слейте DCM и мыть смолы дважды смесью DCM и DMF (2:1, 15 мл).
- Растворяют 20 эквиваленты (5 ммоль) ди трет бутил ди карбонат (БПЦ) в DCM (20 мл) и позволяют реакции перейти на 3 часа.
- Делать хлоранила тест (см. Таблицу материалы), чтобы подтвердить полную защиту вторичных аминов. Положительный тест (защита) дает бесцветный или светло-желтого цвета. Бесплатные вторичные амины придают темный зеленый/синий цвет, а первичных аминов красный цвет.
- Слейте жидкостной смеси и мыть дважды смесью DCM и DMF (2:1, 15 мл).
- Добавить 2% раствор Гидразин в DMF (10 мл) и трясти за 1 час.
- Сделать Кайзер тест для подтверждения успешного deprotection Первичные амины.
-
Добавьте требуемый аминокислоты в обратной последовательности, в которой вы бы записывают/рисуют их. Пептиды взяты из N Термини до Термини C но синтезируются в противоположном направлении, C до н. Например, для PPA, требующие следующих пептид ядра - GLFD-, добавьте аспарагиновой кислоты (D), а затем фенилаланин (F), лейцин (L) и наконец глицин (G).
Примечание: Для большинства аминокислоты, следующие коктейль муфта подходит для привязанность к полиаминовых загружен смолы.- Смешайте 4 эквиваленты (1 ммоль) аминокислоты Fmoc защищенный, 3,95 эквиваленты 2-(1H-benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium hexafluorophosphate (HBTU) и 15 эквиваленты diisopropylethyl Амин (DIPEA).
- Растворить их в смесь DCM и DMF (1:1, 15 мл) и sonicate коктейль для 2 мин (до полного растворения).
- Ждать еще 3-5 мин для обеспечения активации карбоновые кислоты на аминокислоты.
- Добавьте смесь реакции судна. Осуществляют реакции для 2-4 ч при комнатной температуре.
Примечание: Мы нашли следующие эффективные альтернативы HBTU (обычно требующих нижнюю аминокислоты и агент муфты): COMU, PyBOP, HATU, DIC/Oxima. - Сделать Кайзер тест для подтверждения успешного соединения.
- Снятие защиты Fmoc группа из аминокислоты, добавив 20% раствором 4-метил пиперидина (10 мл) в DMF. Сделать это дважды, каждый раз, пожимая реакционную смесь 15 мин.
Примечание: Эффективной альтернативой для удаления Fmoc-пиперазина/дБу12.- Почистить DCM (15 мл) между дополнений.
- Сделать Кайзер тест для подтверждения успешного де защиты аминокислоты.
- Вымойте смолы тщательно, чтобы удалить все следы 4-метил. Вымойте смолы дважды с DMF (10 мл), каждый мыть, продолжительностью 5 мин и наконец с DCM (10 мл) за 10 мин.
- Добавить все оставшиеся аминокислоты повторяя последовательно сцепного устройства и снять защиту шаги.
-
Наконец после соединения все необходимые аминокислоты, конъюгат гидрофобные хвост к последней амино кислоты полиаминовых пептид конструкции:
- Добавьте 10 эквиваленты желаемого карбоновые кислоты функциональность 9,5 эквиваленты HBTU и 12 эквиваленты DIPEA растворяется в DCM и DMF смесь (1:1, 20 мл).
Примечание: Имейте в виду, чем некоторые хвосты может понадобиться различные пропорции растворителя (обычно больших % DCM) или того или другого растворителя как N-метилпирролидоном (NMP). - Sonicate коктейль для 5-10 мин до распада (мы видели, она занимает больше времени для хвост, чтобы полностью растворить) и добавить к судну.
Примечание: Для хвосты, содержащих несколько реактивных сайтов, они будут должны защищаться перед их сцепления. - Осуществляют эту реакцию (муфта гидрофобные хвост) для по крайней мере 5 h, хотя желательно проводить ночь за высокий урожай.
- Добавьте 10 эквиваленты желаемого карбоновые кислоты функциональность 9,5 эквиваленты HBTU и 12 эквиваленты DIPEA растворяется в DCM и DMF смесь (1:1, 20 мл).
2. PPA расщепления от твердой поддержки
Целью этого шага является расщепление PPA из смолы и для удаления защиты групп БПЦ из аминокислот и амидов кислых отходов.
- Вымойте смолы с DMF (8 мл в течение 2 мин) и дважды с DCM (8 мл, каждый раз в течение 5 мин). Перед каждой сложения стечь растворителя из судна. После того, как выполняется последний мыть, сухой смолой под вакуумом для 15 мин.
- Приготовляют раствор расщепления, используя следующие смеси: 28:1:1 trifluoroacetic кислоты (ТФК): H2O: Triisopropyl Силан (советы). Чтобы сделать 15 мл декольте коктейль добавить 14 мл TFA, 0,5 мл H2O и 0,5 мл советов.
- Добавьте это решение расщепления смолы и встряхнуть для 2-4 ч при комнатной температуре.
- Собирать решения в 25 или 50 мл раунд нижней колбе.
- Сосредоточиться ТФК в вакууме до 1 – 2 мл с помощью роторный испаритель при пониженном давлении при обогреве смеси при температуре 40 ° C (не превысит 55 ° C, чтобы избежать разложения PPA).
- После испарения добавьте полученное решение TFA (каплям) круглым дном флакон, содержащий безводный холодной эфира (15 мл). Это сразу же будет выпадать в осадок PPA.
- Кроме того добавьте оригинальный флакон, где TFA было сосредоточено безводный холодной эфира (5 мл).
- Sonicate Этот настой восстановить дополнительные твердые и объединить с эфира решения от шага 2.6.
Примечание: Перенос пипетку можно мыть с небольшой объем DCM. Избегайте введения ДМФ во время процесса, потому что она, как правило, образуют гель подобные вещества. - Место колбу (крытая) внутри холодильника и пусть он стоять на ночь, чтобы максимизировать осадков.
- Соберите осажденного материала вакуумной фильтрации с использованием спеченных диск фильтр воронку. Идеальный поры размеры штрафа или средний.
- Вымойте преципитат дважды с холодной эфира (5 – 10 мл), чтобы удалить любые остаточные органические.
3. Идентификация сырой продукт, с помощью метода сушеные drop MALDI
-
Подготовка матрицы для анализа в положительных режиме:
- Чтобы начать анализ молекулярного веса с помощью матрицы помогает лазерная десорбция/ионизации (MALDI) масс-спектрометрии, добавьте 10-20 мг α-циано-4-Гидроксикоричная кислоты в пробки microcentrifuge.
- Добавляют раствор (1:1, 1.0 мл) воды/ацетонитриле с 0,1% Trifluoroacetic кислоты (ТФК). Тщательно перемешать, vortexing.
Примечание: Эта матрица должна использоваться для положительно заряженных пептиды. MALDI негативные режим похож, но требует матрицы, содержащие 9-aminoacridine с 0.1% аммиака как растворителя добавки. - Добавить 1-2 мкл пример целевого пластиной из нержавеющей стали для MALDI и сухой образца в воздухе. Добавить 1-2 мкл матрицы и высушить его снова.
Примечание: Пластины имеют круговая маркировка сетке вдоль пластину цель помочь найти особое место.
- Анализируйте образцы в MALDI инструмент для проверки их личности. Электроспрей ионизации (ESI) является действенной альтернативой подтверждения личности ППД.
4. Очистка ППД, используя очистке препаративный реверс фаза высокопроизводительных жидкостной хроматографии (ВЭЖХ)
-
Растворяют осадок PPA в минимальное количество ацетонитриле и воды.
- Как правило растворяются 100 мг сухой сырой ФПА-менее чем в 5 мл ацетонитриле и воды. Более гидрофобных ППД может потребоваться больший процент Ацетонитрил распустить и возможно, также потребуется больший объем растворителя в целом, в зависимости от чистой заряд ПРП (Таблица 1).
- Если не произойдет полного растворения, добавить 1% TFA (АКС или H2O). Это также можно добавить следовых количеств других совместимых растворителей, включая диметилсульфоксид, метанол или изопропиловый спирт (ограничить их содержание до 5%).
| Растворитель | Положительно заряженные ППД | Отрицательно заряженные ППД | ||
| 0,1 TFA % в воде | 0,1% NH3 в воде | |||
| 0,1% TFA в АКС | 0,1% NH3 в АКС | |||
Таблица 1: растворителя систем. Предложил жидкостной системы, положительно и отрицательно заряженные ППД.
- Sonicate с помощью sonicator рога для 20 минут 10 s импульсов с Amp1, 48% или 2-3 ч в ультразвуковой ванне PPA.
-
Затем фильтр с помощью фильтра 0.45 мкм шприц после фильтрации с помощью фильтра шприц из политетрафторэтилена (ПТФЭ) 0,20 мкм. PPA решения должны быть четкими и свободным от всех твердых материалов.
- Если фильтрация является слишком сложным, sonicate для длительного периода времени. Настоятельно рекомендуется, что решение PPA является очищенный сразу после фильтрации шприц, как длительного хранения может привести совокупности или gelate, который потребует повторного sonication и, возможно, повторно фильтрации.
- Во время и после очистки использование ВЭЖХ класс растворители или те, которые фильтруются через 0,25 мкм шприц фильтр/мембраны.
Примечание: Наиболее распространенных растворителей условий для очистки ППД состоят в градиенте H2O и АКС. - Используйте стандартный инструмент ВЭЖХ реверс фаза для этого протокола. Она должна включать элюции градиента программист, двоичные жидкостной системы доставки, УФ детектор способен обнаруживать на 220 и 254 Нм и коллекционер программируемый дроби. Максимальную скорость потока должна быть 50 мл/мин.
- Использование C-18 обратная фаза столбец для разделения. Могут использоваться столбцы следующих размеров в зависимости от массы твердых очищенная и чистой заряд ФПА (Таблица 2).
| PPA заряд | Размер частиц | Размер столбца | Масса сырой PPA |
| + ve заряженных | 5 мкм | 150 x 30 мм | 170 мг |
| -ve заряженных | 5 мкм | 150 x 30 мм | 170 мг |
| + ve заряженных | 5 мкм | 150 x 21.2 мм | 90 мг |
| -ve заряженных | 5 мкм | 150 x 21.2 мм | 90 мг |
Таблица 2: предложил колонок: Размеры, размеры частиц и максимальная нагрузка на инъекцию для C18 обратный фазы ВЭЖХ столбцы
- Придать PPA с тома, определяется как способность столбца и объем впрыска цикла ВЭЖХ. Запустите метод ВЭЖХ градиента согласно настройкам, показано в таблице 3 (элюции время 40 мин).
| Время | Сольвент (ацетонитриле) | B растворителя (вода) | Скорость потока (мл/мин) |
| 0 | 5% | 95% | Скорость потока зависит от столбца упаковки и его размер. |
| 2 | 5% | 95% | |
| 35 | 95% | 5% | |
| 38 | 100% | 0% | |
| 40 | 5% | 95% |
Таблица 3: предлагаемые градиент: Предложил обратная фаза градиент показаны относительные состав воды против Ацетонитрил в течение времени. Скорость потока будет зависеть от характеристики столбца.
-
Проанализировать фракций, собранные на различных пробирки с использованием MALDI и определить, какие трубы (или трубки) содержит PPA. Это оценивается путем изучать молекулярный вес, найдены в каждой тюбике.
- Проверьте чистоту фракций на аналитической ВЭЖХ. Использовать систему ВЭЖХ градиент, оснащенных УФ детектор на 220 Нм.
- Если примесей, сделайте дополнительный цикл очистки, ВЭЖХ. Для использования с аналитической ВЭЖХ, используя онлайн конвертер столбца может быть уменьшен выше градиента, используемого для препаративных ВЭЖХ. Каждая фракция много быть ≥95% чистой для определения физических характеристик или биологической оценки.
- Сбор фракций в большой круглодонные колбу или испарения колбу и удалить все ацетонитриле и большая часть воды. Окончательное решение ППА должна быть не более 10 мл.
- Передача этого концентрата до 50 мл пластиковых пробирок. Быть сообщил, что ПРП моющее средство подобных веществ; Таким образом пузырьки будут создаваться во время испарения растворителя. Мы обнаружили, что добавление этилового спирта уменьшается формирования пузыря.
- Вакуумные концентрат концентрат. Во время вакуумного испарения большое количество PPA могут придерживаться стен контейнера. Восстановите это неоднократно промыв стены колбу водой ВЭЖХ. Общий объем концентрированной PPA и rinsate должно быть не более чем 30 мл.
- Место водный раствор внутрь 50 мл трубки.
-
Вспышки заморозить это решение PPA в жидком азоте:
Примечание: Flash замораживания результатов в небольшие кристаллы льда, которые будут быстрее возвышенное в лиофилизатор. Кроме того медленнее замораживания может позволить формирование собственн-собранные супрамолекулярных структур. Другой вариант (но менее желательным) является постепенно заморозить в морозильной камере-80 ° C или заморозить с помощью сухого льда + смесь ацетона- Перед установкой пластиковых пробирок в лиофилизатор, перфорации или ослабьте крышку трубки чтобы влага избежать образец и получить собранные в холодильной. Установите блок лиофилизации, набор до-54 ° C и 0,016 мбар.
Примечание: Еще один вариант заключается в снять крышку и место wipe (с резинкой) на верхней части открытия. Кроме того мы обнаружили, что замораживание образцов в угол или разорвать лед на небольшие порции позволяет быстрее и лучше лиофилизации за счет увеличения площади поверхности. - Если тело начинает таять, это может означать, что присутствуют следы органических растворителей (обычно ацетонитриле). Повторите шаг, замораживания и оценить состояние лиофилизация.
- Если таяние сохраняется, существует два возможных решения:
- Сплит образца в две части (чтобы быть помещены в трубках), разбавляют водой и заморозить снова. Не использовать это решение часто, потому что большое количество органических растворителей могут повредить оборудование.
- Кроме того Поместите образец в колбу и дальше испаряются органического растворителя под вакуумом. Лиофилизации образец, который находится в жидкой форме обычно приводит к натыкаясь и потеря соединения PPA.
- Перед установкой пластиковых пробирок в лиофилизатор, перфорации или ослабьте крышку трубки чтобы влага избежать образец и получить собранные в холодильной. Установите блок лиофилизации, набор до-54 ° C и 0,016 мбар.
5. хранение ППД
- Магазин ППД в-20 ° C с шапки затянуты и опечатаны с парафина на трубе с помощью правильной метки.
- Перед использованием вернуть PPA в температуре в вакуумной камере, чтобы избежать конденсации водяного пара по ППД.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
После очистки и синтеза и до оценки физико-химических или биологических рекомендуется массы ППД вновь зарегистрированного и чистоту установлено с помощью аналитических ВЭЖХ. Характеризация материалов или биологических оценки, ППД нужно иметь чистоты > 95%. Рисунок 2 показывает ВЭЖХ трассировки (вверху) и MALDI спектров (внизу) подтверждающий наличие продукта. ВЭЖХ аналитических систем будет интегрировать площадь под кривой (AUC)) и AUC > 95% может быть связано с чистоту продукта. В системах на основе УФ ВЭЖХ ожидаете, чтобы увидеть один, острый пик. MALDI спектров должен соответствовать что вычисляемый молекулярной массы PPA в пределах ±1 Да (в зависимости от режима анализа MALDI).
Самостоятельной сборки из ППД могут быть визуализированы и анализируются с помощью многочисленных методов, включая передачи электронной микроскопии (ТЕА) (рис. 3а, B), атомных сил микроскопии (АСМ) (рис. 3 c, D), небольшой угол рентгеновской Рассеяние (лучей), сканирование электронная микроскопия (SEM) и динамического рассеяния света (DLS). Успешные самостоятельной сборки приведет к четко определенной наноструктур в АСМ и ТЕА. Неспособность самостоятельно собрать либо приведет в формировании нерегулярных агрегатов, которые несколько сотен нанометров в размер.
Рисунок 2: Представитель аналитического HPLC Хроматограмма (вверху) и MALDI (внизу) спектр PPA C16V22Спермин. Эта цифра была изменена Самад et al. 20176; повторно с разрешения John Wiley & Sons, 2018. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: Микрофотография представитель передачи электронного микроскопа (TEM). (A) ТЕА изображением формирования нановолокно и плавленый nanosheets, (B) Magnified врезные показаны формирования нано пачках, (C) атомной силу Микрофотография микроскопии (АСМ), (D) и высота карта производным от Микрофотография C16V22KDiethyelenetriamine. Оси X и Y (D) представляет нано лист ширина и высота нано лист соответственно. Эта цифра была изменена Самад et al. 20176; повторно с разрешения John Wiley & Sons, 2018. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Протоколы, описанные здесь может использоваться для синтеза ППД скважин как PAs и связанных пептидной основе молекул (таких, как гибридные PA-peptoids). Хотя синтез пептидов, используя ППУ является простой процедурой, синтез пептидов, содержащие биологические молекулы самонаведения может быть особенно сложным. Полиамины как Спермин, спермидина, diethyelenetriamine, и т.д., может функционировать как самонаведения молекул для ориентации клетки рака13. ППАС могут самостоятельно собрать в наноструктур с разнообразными морфологии6. Их положительный заряд может также помочь с более длиннее время циркуляции (из-за побег от англ) и различные метаболические профиля (по сравнению с традиционными ПА). Однако обобщения ППД и их аналоги может быть конкретной задачей из-за присутствия первичные и вторичные амины. Представленные синтетических стратегия преодолевает этот вызов, рационального использования ортогональных защиты группы. Молекула Dde выборочно проходит реакция только с первичных аминов11. С другой стороны, BOC, неизбирательно реагирует с первичные и вторичные амины и, таким образом, могут быть добавлены только после того, как первичные амины защищен. Мы хотели бы отметить, что другие группы защиты могут использоваться вместо БПЦ. Например реакция с ангидрида уксусной кислоты будет постоянно acetylate вторичные амины (эта группа не будут удалены во время расщепление). Аналогично использование trifluoacetic ангидрид обеспечит база чувствительных защиту при benzylcarbamate даст группы, которые могут быть удалены путем H2/Ni14. После Полиамины защищены, при необходимости, синтез PPA можно переходить с помощью стандартных ППУ. Сцепное устройство гидрофобные хвост, чтобы остальная часть конструкции полиаминовых пептид не только занимает длительный период времени для пара, но также требует дважды молярный объем аминокислот. Некоторые из гидрофобных хвостов не может распустить хорошо при комнатной температуре в некоторых традиционных растворителях или может вызвать даже после первоначального распада. Лучше всего такие реакции проводятся под мягким Отопление (40 ° C) путем передачи всех реактивы для округления нижней колбе. Кроме того судно с рубашкой синтезатор может использоваться чтобы согреться реагентов на протяжении реакции. Если таковые имеются, синтезатор Микроволновая печь может помочь с муфта15.
Хотя многие виды масс-спектроскопии доступны для определения массы ППД, мы использовали MALDI спектроскопии для целей нашей идентификации. Мы нашли MALDI должна быть более эффективной в производстве пиков молекулярных ионов, сведение к минимуму фрагментации и аддукт формирования. MALDI должны быть запрограммированы сформировать ион, который соответствует наиболее вероятное состояние ионизации PPA. Помимо программирования инструмент производить Ион конкретного обвинения, нам также нужно объединить образцы с соответствующей матрицы, которая подходит для режима, который мы будем использовать.
ССА часто имеют тенденцию к форме соли аддукты на табличке MALDI. Эта проблема рассматривается чаще всего с отрицательно заряженные молекулы. Наиболее общие соли являются те натрия (Na+ = 23 да) и калия (K+ = 39 да). Эти аддукты май быть подавлены, добавив 1-2 мкл рабочего раствора уксусной кислоты. ПРП обычно обеспечивают аддукт H+ . Рекомендуется использовать только Нанопор воды или воды ВЭЖХ во всем синтетических и процесс очистки во избежание введения дополнительных ионов. Боросиликатное стекло контейнеров и реакции сосудов могут содержать значительное количество ионов натрия, которые будут выщелачиваться в конечный продукт. Промывайте тщательно с использованием nanopurewater для последнего мойки посуды.
Выявление пиков молекулярных ионов также становится трудной, если матрица раствор насыщен матрице твердого не полностью. Для обеспечения насыщенности, всегда должны быть небольшое количество твердых матрицы, что не солюбилизирован.
Как окончательное примечание Учтите, что некоторые ППД или PAs не могут образовывать любого осадка после добавления эфира. Главным образом это наблюдалось в более гидрофильные ППД. В таких мероприятиях мы сначала испаряются все эфира, нейтрализует превышение TFA с NH4OH и добавить воды и ацетонитриле (с 0.1% TFA или NH4OH) полностью солюбилизировать последнего его и затем очистить как обычно.
Протокол, описанные здесь может использоваться для синтеза высоко чистых вариантов самостоятельной сборки полиаминовых основе пептида amphiphiles (ППД), а также PAs. Ортогональные защиты/deprotection действия может использоваться в других ситуациях, которые требуют выборочного маскирования групп первичных и вторичных аминов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют никакого конфликта интересов объявить
Acknowledgments
Этот проект финансировался медицинский центр университета штата Небраска (Запуск средства, MC-S); НИЗ КОБРЕ, 5P20GM103480 (т. Бронич) и американского химического общества, PRF # 57434-DNI7(MC-S).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Chlorotrityl chloride resin | AappTec | RTZ001 | |
| SynthwareTM synthesis vessel | Aldrich | SYNP120050M | |
| Dichloromethane | Acros | AC406920250 | Fisher Sci. Catalogue # |
| Wrist Shaker | Boekel Scientific | 401000-2 | |
| Kaiser test kit | Sigma-Aldrich | 60017 | |
| 2-[(4,4-dimethyl-2,6-dioxocyclohex-1-ylidene)ethyl-amino]-ethanol | Sigma-Aldrich | CDS004772 | |
| Anhydrous Methanol | Acros | AC610981000 | Fisher Sci. Catalogue # |
| Chloranil test kit | TCI | TCC1771-KIT | VWR Catalogue # |
| Di-tert butyl di-carbonate | Acros | AC194670250 | Fisher Sci. Catalogue # |
| Dimethylformamide | Fisher Scientific | BP1160-4 | |
| Hydrazine | Acros | AC296815000 | FIsher Sci. Catalogue # |
| (2-(1H-benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium hexafluorophosphate) | p3biosystems | 31001 | |
| 4-methyl piperidine | Acros | AC127515000 | FIsher Sci. Catalogue # |
| Trifluoroacetic Acid | AappTec | CXZ035 | |
| Triisopropyl Silane | Sigma-Aldrich | 233781 | |
| Ether | Fisher Scientific | E138-1 | |
| α-Cyano-4-hydroxycinnamic acid | Sigma-Aldrich | C8982 | |
| 9-Aminoacridine | Sigma-Aldrich | 92817 | |
| Fisherbrand Syringe Filters: PTFE Membrane | Fisher Scientific | 09-730-21 |
References
- Cui, H., Pashuck, E. T., Velichko, Y. S., Weigand, S. J., Cheetham, A. G., Newcomb, C. J., Stupp, S. I. Spontaneous and x-ray-triggered crystallization at long range in self-assembling filament networks. Science. 327, 555-559 (2010).
- Pashuck, E. T., Cui, H., Stupp, S. I. Tuning supramolecular rigidity of peptide fibers through molecular structure. Journal of the American Chemical Society. 132, 6041-6046 (2010).
- Stupp, S. I., Zha, R. H., Palmer, L. C., Cui, H., Bitton, R.
- Conda-Sheridan, M., Lee, S. S., Preslar, A. T., Stupp, S. I. Esterase-activated release of naproxen from supramolecular nanofibres. Chemical Communications. 50, 13757-13760 (2014).
- Mata, A., Palmer, L., Tejeda-Montes, E., Stupp, S. I. Design of biomolecules for nanoengineered biomaterials for regenerative medicine. Nanotechnology in Regenerative Medicine. , Springer. 39-49 (2012).
- Samad, M. B., Chhonker, Y. S., Contreras, J. I., McCarthy, A., McClanahan, M. M., Murry, D. J., Conda-Sheridan, M. Developing Polyamine-Based Peptide Amphiphiles with Tunable Morphology and Physicochemical Properties. Macromolecular bioscience. 17, (2017).
- Nel, A. E., Mädler, L., Velegol, D., Xia, T., Hoek, E. M., Somasundaran, P., Klaessig, F., Castranova, V., Thompson, M. Understanding biophysicochemical interactions at the nano-bio interface. Nature Materials. 8, 543 (2009).
- Gujrati, M., Malamas, A., Shin, T., Jin, E., Sun, Y., Lu, Z. -R. Multifunctional cationic lipid-based nanoparticles facilitate endosomal escape and reduction-triggered cytosolic siRNA release. Molecular Pharmaceutics. 11, 2734-2744 (2014).
- Zhu, Y., Li, J., Kanvinde, S., Lin, Z., Hazeldine, S., Singh, R. K., Oupický, D. Self-immolative polycations as gene delivery vectors and prodrugs targeting polyamine metabolism in cancer. Molecular Pharmaceutics. 12, 332-341 (2014).
- Planas-Portell, J., Gallart, M., Tiburcio, A. F., Altabella, T. Copper-containing amine oxidases contribute to terminal polyamine oxidation in peroxisomes and apoplast of Arabidopsis thaliana. BMC Plant Biology. 13, 109 (2013).
- Nash, I. A., Bycroft, B. W., Chan, W. C. Dde - A selective primary amine protecting group: A facile solid phase synthetic approach to polyamine conjugates. Tetrahedron Letters. 37, 2625-2628 (1996).
- Ralhan, K., KrishnaKumar, V. G., Gupta, S. Piperazine and DBU: a safer alternative for rapid and efficient Fmoc deprotection in solid phase peptide synthesis. RSC Advances. 5, 104417-104425 (2015).
- Casero, R. A. Jr, Marton, L. J. Targeting polyamine metabolism and function in cancer and other hyperproliferative diseases. Nature Reviews Drug Discovery. 6, 373 (2007).
- Wuts, P. G. M., Greene, T. W. Protection for the Amino Group. In Greene's Protective Groups in Organic Synthesis. , John Wiley &, Sons, Inc. 696-926 (2006).
- Palasek, S. A., Cox, Z. J., Collins, J. M. Limiting racemization and aspartimide formation in microwave-enhanced Fmoc solid phase peptide synthesis. Journal of Peptide Science. 13, 143-148 (2007).
