Summary
Syntese av polyamin-baserte peptid amphiphiles (PPAs) er en betydelig utfordring av flere Amin nitrogens, som krever forstandig bruk av beskytte grupper for å maskere disse reaktive funksjonaliteten. I dette papir beskriver vi en lettvint metode for utarbeidelse av disse nye klassen selv av molekyler.
Abstract
Polyamin-baserte peptid Amphiphiles (PPAs) er en ny klasse av selv montasje amphiphilic biologisk materiale knyttet til peptid amphiphiles (PAs). Tradisjonelle PAs har ladet aminosyrer som solubilizing grupper (lysin, arginine) som kobles direkte til et lipid segment eller kan inneholde en koblingsfunksjonalitet region laget av nøytrale aminosyrer. Tuning peptid sekvensen av PAs kan gi ulike morphologies. Tilsvarende PPAs har et hydrofobe segment og nøytrale aminosyrer, men også inneholde polyamin molekyler som vann solubilizing (hydrofile) grupper. Som tilfellet er med PAs, kan også PPAs selv montere i forskjellige morphologies, inkludert liten stenger, vridd nano-bånd og smeltet nano-ark, oppløst i vann. Men utgjør tilstedeværelsen av både primære og sekundære aminer på et enkelt polyamin molekyl en betydelig utfordring når syntetisere PPAs. I dette papiret viser vi en enkel protokoll, basert på litteratur presedens, å oppnå en lettvinte syntese av PPAs med solid fase peptid syntese (SPPER). Denne protokollen kan utvides til syntesen av PAs og andre lignende systemer. Vi har også illustrere trinnene som er nødvendig for spalting fra harpiks, identifikasjon og rensing.
Introduction
Selv montasje peptid amphiphiles (PAs) er en klasse av biologisk materiale vanligvis består av virksomme: (a) hydrofile hodet, (b) koblingsfunksjonalitet region og (c) hydrofobe halen. De fleste PAs beskrevet i litteraturen har en hydrofile hode består av ladet eller polar aminosyre rester1,2,3,4. PAs har funnet en rekke programmer i biomedisin inkludert narkotika-leveranser, sykdom diagnose, regenerativ medisin, etc.5. Basert på deres aminosyresekvens, kan PAs danne en rekke nanostrukturer inkludert sfærisk micelles og nano-filamenter. Vi har nylig rapportert en klasse av hybrid polyamin-baserte peptid amphiphiles, kalt PPAs6. Den morphologies, selv montasje kinetics og metabolske nedbrytning av disse biologisk materiale, ble funnet å være relatert til solubilizing leder gruppen. Videre vise PPA nanostrukturer ikke toksisitet mot pattedyrceller (MiaPaCa2 og HeLa celle linjene) i de testet konsentrasjonene. PPA-baserte nanocarriers er attraktive narkotikarelaterte levering biler fordi: (1) polyamin opptak og metabolisme har vist seg å være økt hos kreftceller, (2) kationisk nanostrukturer kan oppnå endosomal rømme7,8, som fører til høyere sirkulasjon og bolig i cellen, og (3) bør ha en distinkt metabolske profil sammenlignet med PA; for eksempel, de blir mer stabil mot proteaser finnes i menneskekroppen (selv om de kanskje følsom for andre enzymer, for eksempel Amin oxidases)9,10. Også har PPAs blitt funnet for å ha forskjellige morphologies, mekanisk-egenskaper, hydrogenion stivhet og montering kinetics avhenger på lengden og ansvaret for individuelle PPA molekyl6. Her beskriver vi en detaljert protokoll for syntese, identifikasjon og rensing av PPAs som også kan brukes til utarbeidelse av PAs eller lignende hybrid peptid molekyler.
Fordi polyaminer ikke er vanligvis kommersielt tilgjengelige i skjemaene beskyttet, og fordi beskytte de primære og sekundære aminer av polyaminer er av største betydning for bøye dem med aminosyrer og andre molekyler, har vi skissert de syntetisk skritt for å oppnå deres beskyttelse. Det overordnede målet med denne protokollen er en enkel metode for bøye polyaminer å aminosyrer. Polyaminer mangler en karbonoxylsyre gruppe; Dermed kan de kobles til Rink amid eller Wang harpiks. I stedet anbefales harpiks som 2-chlorotrityl chloride syntetiske protokollen. Den største utfordringen for PPA syntese er de primære og sekundære Amin funksjonelle grupper. For vårt formål beskyttet vi alle sekundære aminer i polyamin samtidig amino primærgruppen på polyamin gratis å tillate kopling reaksjonen. Reaksjonen ble gjort på en solid støtte etter prinsippene i solid fase peptid syntese (SPPER) å lette den arbeidet opp etter hver kobling og deprotection trinn. Følgende protokollen er for både manuelle og automatiserte syntese av PPAs (selv om verifisering av noen trinn vil være utfordrende i et automatisert system). Syntese av disse molekylene også kan bæres ut en automatisert synthesizer eller ved hjelp av en mikrobølgeovn reaktor (automatisk eller halvautomatisk). Reaksjon ordningen summert i figur 1.
Figur 1: (A) A generelle reaksjonen ordningen for syntese av PPAs. (B) representant polyaminer som kan brukes til syntetisert PPAs beskrevet her. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. generelle protokoll for syntese av PPAs
- Beregne skaleringen for syntese (vanligvis mmol). Denne skalaen er basert på massen av PPA målbeløpet. Vær oppmerksom som reaksjon effektiviteten av SPPER gradvis minsker med en økning av aminosyresekvens. Nøyaktig reaksjon effektiviteten er derfor vanskelig å beregne.
- Beregne vekten av skal brukes etter lasting av harpiks. Lasting er funnet på beholderen eller analyse protokollen av harpiks og uttrykt i mmol/g. Følgende formel kan brukes til å beregne vekten av harpiks:
- Nøye veie ut 2-chlorotrityl chloride harpiks (i vårt tilfelle lasting er ~0.85 mmol)
- Plasser harpiks i en fritted syntese fartøy med følgende spesifikasjoner: kapasitet-50 mL, Fritted plate-25 mm, porøsitet-Medium.
- Legge til 15 mL diklormetan (DCM) harpiks.
- Påføre syntese fartøyet til en variabel hastighet mekanisk shaker (kolbe shaker/rørestang), og slå fartøyene til en vinkel på 45 grader (eller horisontalt) for å maksimere agitasjon.
- Tillate harpiks perler å svelle i 15 min. hevelse forbedrer avkastningen av reaksjon fordi det forenkler diffusjon og tilgjengelighet til det aktive området, styrke kopling effektivitet.
- Legg 8 ekvivalenter (2 mmol for en 0,25 mmol skala) av den ønskede polyamin (Spermine, Spermidine, Diethyelenetriamine, 1,3-diaminopropane, etc.) til harpiks og tillate den å reagere for 5 h.
Merk: En mindre reaksjon periode vil redusere avkastningen. - En Kaiser test (se Tabell for materiale) for å bekrefte vellykket koblingen av polyamin til harpiks. Vellykket kobling av av primære aminer gir en fiolett/blå farge, som tilsvarer gratis Amin.
- Beskytte primære Amin gruppen med 4 ekvivalenter av 1-(4,4-dimethyl-2,6-dioxocyclohex-1-ylidene)ethyl (Dde), oppløst i vannfri metanol (15 mL), ved å riste den reaksjon blanding overnatting11.
Merk: En mindre reaksjonstid reduserer avkastning. - Utfør en Kaiser. Et fravær av blått fra harpiks perlen bekrefter vellykket beskyttelse. Ved mislykket beskyttelse av primære Amin, gjenta forrige trinn.
- Avløp i DCM og vaske harpikser to ganger med en blanding av DCM og DMF (2:1, 15 mL).
- Oppløse 20 ekvivalenter (5 mmol) av di-tert butyl di-karbonat (Boc) i DCM (20 mL) og la reaksjonen fortsette for 3t.
- Gjøre en chloranil test (se Tabell for materiale) for å bekrefte komplett beskyttelse av sekundær Amin. En positiv test (beskyttelse) gir en fargeløs eller lys gul farge. Gratis sekundære aminer gir en mørk grønn/blå farge, mens primære aminer gir en rød farge.
- Avløp løsemiddel blandingen og vaske to ganger med en blanding av DCM og DMF (2:1, 15 mL).
- Legge til en 2% løsning av hydrazine i DMF (10 mL) og rist 1t.
- En Kaiser test for å bekrefte vellykket deprotection av primære Amin.
-
Legg til ønskede aminosyrer i omvendt rekkefølge som du ville skrive/tegne dem. Peptider er tiltrukket av Termini N C jernbanestasjonen termini, men er synthesized i motsatt retning, C til N. For eksempel for en PPA krever følgende peptid core - GLFD-, legge Aspartic syre (D), etterfulgt av fenylalanin (F), Leucine (L) og endelig glysin (G).
Merk: For de fleste aminosyrer, følgende kopling cocktail er egnet for vedlegg til polyamin lastet harpiks.- Bland 4 ekvivalenter (1 mmol) av aminosyren Fmoc-beskyttet, 3,95 ekvivalenter av 2-(1H-benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium hexafluorophosphate (HBTU) og 15 ekvivalenter av diisopropylethyl Amin (DIPEA).
- Oppløse dem i en blanding av DCM og DMF (1:1, 15 mL) og sonicate cocktail i 2 minutter (til komplett oppløsning).
- Vent en ytterligere 3-5 minutter for å sikre aktivering av karboksylsyre på aminosyren.
- Legge til reaksjonsblandingen fartøyet. Bære ut for 2-4 h ved omgivelsestemperatur.
Merk: Vi har funnet følgende som effektive alternativer til HBTU (vanligvis krever lavere mengder aminosyrer og kopling agent): COMU, PyBOP, HATU, DIC/Oxima. - En Kaiser test for å bekrefte vellykket kopling.
- De-beskytte Fmoc-gruppen fra aminosyren ved å legge en 20% løsning av 4-methyl piperidine (10 mL) i DMF. Gjør det to ganger, hver gang risting reaksjonsblandingen i 15 min.
Merk: Et effektivt Fmoc fjerning er piperazin/DBU12.- Utføre en DCM (15 mL) vask mellom tillegg.
- En Kaiser test for å bekrefte vellykket de beskyttelse av aminosyren.
- Vask harpiks nøye for å fjerne alle spor av 4-metyl. Vask harpiks to ganger med DMF (10 mL), hver vask varer i 5 minutter, og til slutt med DCM (10 mL) i 10 min.
- Legge til alle de gjenværende aminosyrene ved suksessivt gjentatte koblingen og de beskyttelse trinnene.
-
Endelig, etter kopling alle nødvendige aminosyrer, bøy hydrofobe halen til den siste aminosyren av polyamin-peptid Konstruer:
- Legge 10 ekvivalenter av ønsket karboksylsyre funksjonaliteten til 9,5 ekvivalenter av HBTU og 12 ekvivalenter av DIPEA oppløst i DCM og DMF blanding (1:1, 20 mL).
Merk: Huske på enn noen haler må en annen del av løsemidler (vanligvis en større % av DCM) eller tillegg eller et annet løsemiddel som N-methylpyrrolidone (NMP). - Sonicate cocktail for 5-10 minutter til oppløsning (vi har sett den tar lengere for halen å løse) og legge til fartøyet.
Merk: For haler som inneholder flere reaktive områder, vil de må beskyttes før kobles sammen. - Utføre denne reaksjonen (kopling hydrofobe halen) minst 5 h, selv om det er tilrådelig å utføre den over natten for høyest avkastning.
- Legge 10 ekvivalenter av ønsket karboksylsyre funksjonaliteten til 9,5 ekvivalenter av HBTU og 12 ekvivalenter av DIPEA oppløst i DCM og DMF blanding (1:1, 20 mL).
2. PPA Cleavage fra Solid støtte
Formålet med dette trinnet er i spalting av PPA harpiks og til å fjerne Boc beskytte gruppene fra aminosyrer og polyamin rester.
- Vask harpiks DMF (8 mL til 2 min) og to ganger med DCM (8 mL, hver gang etter 5 min). Før hvert tillegg, avløp løsemiddel fartøyet. Når siste vask utføres, tørr harpiks under vakuum i 15 min.
- Forberede cleavage løsningen bruker følgende blanding forholdet: 28:1:1 trifluoroacetic acid (TFA): H2O: Triisopropyl silane (TIPS). Gjøre 15 mL cleavage cocktail legge 14 mL TFA, til 0,5 mL H2O og 0,5 mL tips.
- Legge cleavage løsningen til harpiks og shake 2-4 h ved romtemperatur.
- Samle løsningen i en 25 eller 50 mL rundt bunnen kolbe.
- Konsentrere det TFA i vacuo til 1-2 mL bruker en roterende fordamperen ved redusert trykk mens oppvarming blandingen på 40 ° C (ikke overstiger 55 ° C for å unngå nedbryting av PPA).
- Etter fordampning, legge innhentet TFA løsningen (dropwise) til en rund bunn kolbe som inneholder vannfri kaldt Eter (15 mL). Dette vil umiddelbart utløse PPA.
- I tillegg legge til vannfri kaldt Eter (5 mL) opprinnelige kolbe der TFA var konsentrert.
- Sonicate denne flasken for å gjenopprette mer tørrstoff og kombinere med Eter løsningen fra trinn 2.6.
Merk: Den overføre pipette kan vaskes med en liten mengde DCM. Unngå å innføre DMF under prosessen fordi det har en tendens til å danne en pærer. - Plasser kolbe (dekket) inne i kjøleskapet og la den stå over natten for å maksimere nedbør.
- Samle utfelt materialet av vakuum filtrering ved hjelp av sintered plate filter trakt. Ideell pore størrelsene er fint eller middels.
- Vask bunnfall to ganger med kaldt Eter (5-10 mL) å fjerne eventuelle gjenværende organiske.
3. identifikasjon av råolje produktet bruker MALDI tørket-slipp-metoden
-
Matrix forberedelse for analyse i positiv modus:
- For å starte molekylvekt analyse bruker Matrix assistert Laser desorpsjon/Ionization (MALDI) massespektrometri, legge 10 til 20 mg α-cyano-4-hydroxycinnamic syre slik microcentrifuge.
- Legge til en løsning av vann/acetonitrile (1:1, 1,0 mL) med 0,1% Trifluoroacetic syre (TFA). Bland godt av vortexing.
Merk: Denne matrisen skal brukes for positivt ladede peptider. MALDI negative modus ligner, men krever en matrise som inneholder 9-aminoacridine med 0,1% ammoniakk som løsemiddel additiv. - Legge til 1-2 µL av utvalget av rustfritt stål målet platen for MALDI og tørr prøven i luften. Legg til 1-2 µL av matrix og tørk den igjen.
Merk: Platene har sirkulære tegninger gridded langs målet platen du kan finne et bestemt sted.
- Analysere eksemplene i MALDI instrument for å verifisere sin identitet. Electrospray ionization (ESI) er et gyldig alternativ å bekrefte identiteten til PPAs.
4. rensing av PPAs ved hjelp av skytevåpen omvendt-fase høyytelses flytende kromatografi (HPLC) rensing
-
Oppløse PPA bunnfall i et minimum av acetonitrile og vann.
- Som en tommelfingerregel, løses 100 mg av tørr råolje PPA i mindre enn 5 mL av acetonitrile og vann. Mer hydrofobe PPAs kan kreve en større prosentandel av acetonitrile å oppløse og kan også kreve en større mengde løsemiddel, avhengig av netto ladning av PPAs (tabell 1).
- Hvis komplett oppløsning ikke finner sted, legge til 1% TFA (ACN eller H2O). Det er også mulig å legge spormengder av andre kompatible midler, inkludert dimethylsulfoxide, metanol eller isopropanol (begrense innholdet 5%).
| Løsemiddel | Positivt ladede PPAs | Negativt ladet PPAs | ||
| 0,1% TFA i vann | 0,1% NH3 i vann | |||
| 0,1% TFA i ACN | 0,1% NH3 i ACN | |||
Tabell 1: løsemiddel systemer. Foreslåtte løsemiddel systemet for positivt og negativt ladet PPAs.
- Sonicate PPA bruker en horn sonicator for 20 min på 10 s pulser med Amp1 på 48% eller 2-3 h i ultralydbad.
-
Deretter filtrere bruke filtere for 0,45 μm-sprøyte etterfulgt av filtrering bruker filtere 0,20 μm Polytetrafluoroethylene (PTFE) sprøyten. PPA løsningen skal være klar og fri for alle partikler.
- Hvis filtrering er for vanskelig, sonicate i lengre tid. Det anbefales sterkt at PPA løsningen er renset umiddelbart etter sprøyte filtrering, som langvarig lagring kan føre til samlet eller gelate, som vil nødvendiggjøre re sonication og, kanskje, re filtrering.
- Under og etter rensing, bruke HPLC klasse løsemidler eller de som filtreres gjennom en 0,25 μm sprøyte filter/membran.
Merk: De vanligste løsemiddel forholdene å rense PPAs består en stigning av H2O og ACN. - Bruk en standard omvendt-fase HPLC instrument for denne protokollen. Den bør inneholde en elueringsrør gradient programmerer, en binær løsemiddel levering system, en UV-detektor stand til å oppdage 220 og 254 nm og en programmerbar brøkdel samler. Maksimal flow rate bør være 50 mL/min.
- Bruk en C-18 reversert fase kolonnen for separasjon. Kolonner med følgende dimensjoner kan brukes avhengig av massen av solid blir renset og nettet ansvar for PPA (tabell 2).
| PPA kostnad | Partikkelstørrelse | Kolonnestørrelse | Masse råolje PPA |
| + ve ladede | 5 μm | 150 x 30 mm | 170 mg |
| -ve ladede | 5 μm | 150 x 30 mm | 170 mg |
| + ve ladede | 5 μm | 150 x 21,2 mm | 90 mg |
| -ve ladede | 5 μm | 150 x 21,2 mm | 90 mg |
Tabell 2: foreslo kolonner: Kolonnedimensjoner, partikkelstørrelser og maksimal lastekapasitet per injeksjon for C18 omvendt fase HPLC kolonner
- Injisere PPA med et volum bestemmes av både kapasiteten til kolonnen og volumet av injeksjon løkken av HPLC. Kjør metoden HPLC gradert i henhold til innstillingene i tabell 3 (elueringsrør tiden av 40 min).
| Tid | Løsemiddel en (Acetonitrile) | Løsemiddel B (vann) | Flow Rate (mL/min) |
| 0 | 5% | 95% | Infusjonshastigheten avhenger av kolonnen pakking og størrelse. |
| 2 | 5% | 95% | |
| 35 | 95% | 5% | |
| 38 | 100% | 0% | |
| 40 | 5% | 95% |
Tabell 3: foreslåtte gradering: Foreslått omvendt fase graderingen viser relativ sammensetningen av vann vs acetonitrile over en periode. Infusjonshastigheten vil avhenge kolonnen spesifikasjonene.
-
Analysere fraksjoner samlet på ulike reagensglass med MALDI og se hvilke rør (eller rør) inneholder PPA. Dette vurderes ved å studere molekylvekt funnet i hver retning.
- Sjekk renhet fraksjoner på en analytisk HPLC. Bruke en såkalt HPLC-gradient systemet utstyrt med en UV-detektor satt på 220 nm.
- Hvis urenheter, gjøre en ekstra syklus av rensingen ved HPLC. Over forløpningen brukes for skytevåpen HPLC kan skaleres til bruk med den analytiske HPLC med online konverteringsprogramvare kolonnen. Hver fraksjon være mye ≥95% ren fysisk karakteristikk eller biologisk vurdering.
- Samle fraksjoner i en stor rund bunn kolbe eller fordampning kolbe og fjerne alle acetonitrile og det meste av vannet. Den endelige PPA løsningen bør være mer enn 10 mL.
- Overføre denne konsentrat til en 50 mL sentrifuge rør. Vær oppmerksom på at PPAs er vaskemiddel-lignende stoffer; Dermed vil bobler bli generert i løpet av fordampning løsemiddel. Vi har funnet at tillegg av etylalkohol reduserer boble formasjon.
- Vakuum konsentrat konsentrat. Under vakuum fordampning, kan en stor mengde PPA overholder veggene i beholderen. Gjenopprette dette gjentatte ganger skylling kolbe veggen med HPLC vann. Kombinert volumet av konsentrert PPA og den rinsate skal ikke mer enn 30 mL.
- Plass vandig løsningen i en 50 mL tube.
-
Flash fryse PPA løsningen i flytende nitrogen:
Merk: Flash fryse resultater i mindre is-krystaller som vil sublime raskere i lyophilizer. Videre kan tregere frysing dannelsen av selv montert supramolecular strukturer. En annen alternativ (men mindre ønskelig) er gradvis fryse i-80 ° C fryser eller fryse bruker en tørris + aceton blanding- Før du plasserer sentrifuge røret i lyophilizer, måte eller løsne hetten av røret slik at fuktighet rømme prøven og bli samlet i kjøleenheten. Sett lyophilization-enhet-54 ° C og 0.016 mbar.
Merk: Et annet alternativ er å fjerne hetten og plassere en tørke (med en gummi band) over åpningen. Vi har også funnet at frysing prøver i en vinkel eller bryte isen i små porsjoner gir en raskere og bedre lyophilization skyldes en økning i areal. - Hvis solid begynner å smelte, kan det indikere spor av en organisk løsemiddel (vanligvis acetonitrile) finnes. Gjenta trinnet frysing og vurdere tilstanden til lyophilization.
- Hvis smelting vedvarer, er det to mulige løsninger:
- Split eksemplet i to deler (skal plasseres i rør), fortynnet med vann, og fryse igjen. Ikke bruk denne løsningen ofte fordi store mengder organiske løsemidler kan skade utstyret.
- Alternativt sted prøven i en bolle og ytterligere fordampe organisk løsemiddelet under vakuum. Lyophilizing et eksempel som er i flytende form vanligvis fører til dunk og tap av PPA sammensatte.
- Før du plasserer sentrifuge røret i lyophilizer, måte eller løsne hetten av røret slik at fuktighet rømme prøven og bli samlet i kjøleenheten. Sett lyophilization-enhet-54 ° C og 0.016 mbar.
5. lagring av PPAs
- Butikken PPAs i en 20 ° C med caps strammet og forseglet med Parafilm på et rør med en riktig etikett.
- Før bruk, bringe PPA tilbake til romtemperatur i et vakuum kammer å unngå kondens av vanndamp på PPAs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Etter syntese og rensing og før mekanisk- eller biologiske evaluering anbefales det massene av PPAs er nytt sjekket og renheten konstatert bruke analytisk HPLC. Materielle karakteristikk eller biologisk vurdering, PPAs må ha renhet av > 95%. Figur 2 viser HPLC spor (øverst) og MALDI spectra (nederst) bekrefter tilstedeværelsen av produktet. HPLC analytisk systemer vil integrere området under kurven (AUC) og en AUC > 95% kan være relatert til produktet renhet. I UV-baserte HPLC systemer, forvente å se en enkelt, skarpe topp. MALDI spectra bør tilsvare av den beregnede Molekylvekten av PPA innen ±1 Da (avhengig av modus for analyse av MALDI).
Den selv-montering av PPAs kan bli visualisert og analysert ved hjelp av utallige teknikker, inkludert overføring elektronmikroskop (TEM) (figur 3A, B), Atomic Force mikroskopi (AFM) (Figur 3 c, D), liten vinkel X-ray Spredning (SAXS), skanning elektronmikroskop (SEM) og dynamisk lys spredning (DLS). Vellykket vil selvstendig montering medføre veldefinerte nanostrukturer både AFM og TEM. Unnlatelse av å selv sette sammen vil enten resulterer i dannelsen av uregelmessig aggregater som er flere hundre nanometer i størrelse.
Figur 2: Representant Analytical HPLC chromatogram (øverst) og MALDI spectrum (nederst) av PPA C16V22Spermine. Dette tallet har blitt endret fra Samad et al. 20176; på nytt med tillatelse fra John Wiley & Sons, 2018. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: representant Transmission elektron mikroskop (TEM) mikroskop-bilde. (A) TEM bildet viser dannelsen av nanofiber og smeltet nanosheets, (B) Magnified innfelt viser dannelsen av medfølgende nano-ark, (C) Atomic force mikroskopi (AFM) mikroskop-bilde, (D) og høyde kart avledet fra den mikroskop-bilde C16V22KDiethyelenetriamine. X og Y aksene av (D) representerer nano arks bredde og nano arks høyde henholdsvis. Dette tallet har blitt endret fra Samad et al. 20176; på nytt med tillatelse fra John Wiley & Sons, 2018. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollene beskrevet her kan brukes å syntetisere PPAs brønner som PAs og relaterte peptid-baserte molekyler (som hybrid PA-peptoids). Selv om syntesen av peptider bruker SPPER er en enkel prosedyre, kan syntese av peptider som inneholder biologiske homing molekyler være spesielt utfordrende. Polyaminer som spermine, spermidine, diethyelenetriamine, etc., kan fungere som homing molekyler for målretting kreft celler13. PPAs kan selv montere i nanostrukturer med varierte morphologies6. Deres positive ladningen kan også hjelpe med lengre sirkulasjon (på grunn av endosomal rømme) og en annen metabolske profil (sammenlignet med tradisjonelle PA). Men kan syntetisere PPAs og deres analoger være en spesiell utfordring på grunn av primære og sekundære aminer. Presentert syntetiske strategien seirer denne utfordringen av rasjonell bruk av ortogonale beskytte gruppe. DDE-molekylet gjennomgår selektivt reaksjon bare med primære aminer11. Boc, derimot, reagerer ukritisk med både primære og sekundære aminer og derfor kan bare legges til etter primære Amin er beskyttet. Vi ønsker å nevne at andre beskytte grupper kan brukes i stedet for Boc. For eksempel vil reaksjon med eddiksyre permanent acetylate de sekundære aminer (denne gruppen ikke vil bli fjernet under spalting). Likeledes, bruk av trifluoacetic anhydride vil gi en base-sensitive beskyttelse mens benzylcarbamate vil gi en gruppe som kan fjernes av H2/Ni14. Når polyaminer er beskyttet etter behov, kan syntese av PPA fortsette med standard SPPER. Koplingen hydrofobe halen til resten av polyamin-peptid Konstruer ikke bare tar lengre tid å par, men også krever molar dobbelte av aminosyrer. Noen av de hydrofobe haler kan ikke løses i romtemperatur i noen tradisjonelle løsemidler eller kan utløse selv etter første oppløsning. Slike reaksjoner er best utført under mild oppvarming (40 ° C) ved å overføre alle reaktantene å runde bunnen kolbe. Alternativt kan en jacketed synthesizer fartøy brukes til å holde reaktantene varme gjennom reaksjonen. Hvis tilgjengelig, kan en mikrobølgeovn synthesizer hjelpe med kopling15.
Selv om mange former for masse spektroskopi er tilgjengelig for å fastslå massene av PPAs, brukte vi MALDI spektroskopi for våre identifikasjon. Vi har funnet MALDI å være mer effektiv i å produsere molekylær ion toppene, minimere fragmentering og adduct formasjon. MALDI må programmeres til å generere et ion som tilsvarer den mest sannsynlig ionisering delstaten PPA. Foruten programmering apparatet produserer av en bestemt belastning, må vi også kombinere prøvene med den aktuelle matrisen som er egnet for modus vil vi bruke.
PAs ofte har en tendens til skjemaet salt addukter på MALDI plate. Problemet er ofte sett med negativt ladde molekyler. Den mest felles salter er de av natrium (Na+ = 23 Da) og kalium (K+ = 39 Da). Disse addukter kan skjules ved å legge til 1-2 µL av eddiksyre. PPAs gir vanligvis H+ adduct. Det anbefales å bare bruke nanopore vann eller HPLC vann gjennom syntetiske og renselsesprosess for å unngå innføring av ytterligere ioner. Borosilikatglass beholdere og reaksjon fartøy kan inneholde merkbare mengder av natrium ioner som vil lekke inn i det endelige produktet. Skyll glass forsiktig med nanopurewater for siste vask.
Identifisere molekylær ion toppene også blir vanskelig hvis matrise løsningen ikke er fullstendig mettet med solid matrix. For å sikre metning, bør det alltid være en liten mengde solid matrisen som ikke har solubilized.
Som et siste notat, kan du vurdere at noen PPAs eller PAs ikke kan danne noen bunnfall på tillegg Ether. Dette var hovedsakelig observert i de mer hydrofile PPAs. I slike hendelser, vil vi først fordampe alle Eter, nøytralisere den overskytende TFA med NH4OH og legge til vann og Acetonitrile (med 0,1% TFA eller NH4OH) fullt solubilize den og Fortsett å rense som vanlig.
Protokollen beskrevet her kan brukes å syntetisere svært ren varianter av selv monterer polyamin basert peptid amphiphiles (PPAs) samt PAs. Ortogonale beskyttelse/deprotection fremgangsmåten kan brukes i andre situasjoner som krever selektiv maskering av primære og sekundære Amin grupper.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har noen interessekonflikt å erklære
Acknowledgments
Dette prosjektet ble finansiert av University of Nebraska Medical Center (oppstart midler, MC-S); NIH-COBRE, 5P20GM103480 (T. Bronich) og American Chemical Society, PRF # 57434-DNI7(MC-S).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Chlorotrityl chloride resin | AappTec | RTZ001 | |
| SynthwareTM synthesis vessel | Aldrich | SYNP120050M | |
| Dichloromethane | Acros | AC406920250 | Fisher Sci. Catalogue # |
| Wrist Shaker | Boekel Scientific | 401000-2 | |
| Kaiser test kit | Sigma-Aldrich | 60017 | |
| 2-[(4,4-dimethyl-2,6-dioxocyclohex-1-ylidene)ethyl-amino]-ethanol | Sigma-Aldrich | CDS004772 | |
| Anhydrous Methanol | Acros | AC610981000 | Fisher Sci. Catalogue # |
| Chloranil test kit | TCI | TCC1771-KIT | VWR Catalogue # |
| Di-tert butyl di-carbonate | Acros | AC194670250 | Fisher Sci. Catalogue # |
| Dimethylformamide | Fisher Scientific | BP1160-4 | |
| Hydrazine | Acros | AC296815000 | FIsher Sci. Catalogue # |
| (2-(1H-benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium hexafluorophosphate) | p3biosystems | 31001 | |
| 4-methyl piperidine | Acros | AC127515000 | FIsher Sci. Catalogue # |
| Trifluoroacetic Acid | AappTec | CXZ035 | |
| Triisopropyl Silane | Sigma-Aldrich | 233781 | |
| Ether | Fisher Scientific | E138-1 | |
| α-Cyano-4-hydroxycinnamic acid | Sigma-Aldrich | C8982 | |
| 9-Aminoacridine | Sigma-Aldrich | 92817 | |
| Fisherbrand Syringe Filters: PTFE Membrane | Fisher Scientific | 09-730-21 |
References
- Cui, H., Pashuck, E. T., Velichko, Y. S., Weigand, S. J., Cheetham, A. G., Newcomb, C. J., Stupp, S. I. Spontaneous and x-ray-triggered crystallization at long range in self-assembling filament networks. Science. 327, 555-559 (2010).
- Pashuck, E. T., Cui, H., Stupp, S. I. Tuning supramolecular rigidity of peptide fibers through molecular structure. Journal of the American Chemical Society. 132, 6041-6046 (2010).
- Stupp, S. I., Zha, R. H., Palmer, L. C., Cui, H., Bitton, R.
- Conda-Sheridan, M., Lee, S. S., Preslar, A. T., Stupp, S. I. Esterase-activated release of naproxen from supramolecular nanofibres. Chemical Communications. 50, 13757-13760 (2014).
- Mata, A., Palmer, L., Tejeda-Montes, E., Stupp, S. I. Design of biomolecules for nanoengineered biomaterials for regenerative medicine. Nanotechnology in Regenerative Medicine. , Springer. 39-49 (2012).
- Samad, M. B., Chhonker, Y. S., Contreras, J. I., McCarthy, A., McClanahan, M. M., Murry, D. J., Conda-Sheridan, M. Developing Polyamine-Based Peptide Amphiphiles with Tunable Morphology and Physicochemical Properties. Macromolecular bioscience. 17, (2017).
- Nel, A. E., Mädler, L., Velegol, D., Xia, T., Hoek, E. M., Somasundaran, P., Klaessig, F., Castranova, V., Thompson, M. Understanding biophysicochemical interactions at the nano-bio interface. Nature Materials. 8, 543 (2009).
- Gujrati, M., Malamas, A., Shin, T., Jin, E., Sun, Y., Lu, Z. -R. Multifunctional cationic lipid-based nanoparticles facilitate endosomal escape and reduction-triggered cytosolic siRNA release. Molecular Pharmaceutics. 11, 2734-2744 (2014).
- Zhu, Y., Li, J., Kanvinde, S., Lin, Z., Hazeldine, S., Singh, R. K., Oupický, D. Self-immolative polycations as gene delivery vectors and prodrugs targeting polyamine metabolism in cancer. Molecular Pharmaceutics. 12, 332-341 (2014).
- Planas-Portell, J., Gallart, M., Tiburcio, A. F., Altabella, T. Copper-containing amine oxidases contribute to terminal polyamine oxidation in peroxisomes and apoplast of Arabidopsis thaliana. BMC Plant Biology. 13, 109 (2013).
- Nash, I. A., Bycroft, B. W., Chan, W. C. Dde - A selective primary amine protecting group: A facile solid phase synthetic approach to polyamine conjugates. Tetrahedron Letters. 37, 2625-2628 (1996).
- Ralhan, K., KrishnaKumar, V. G., Gupta, S. Piperazine and DBU: a safer alternative for rapid and efficient Fmoc deprotection in solid phase peptide synthesis. RSC Advances. 5, 104417-104425 (2015).
- Casero, R. A. Jr, Marton, L. J. Targeting polyamine metabolism and function in cancer and other hyperproliferative diseases. Nature Reviews Drug Discovery. 6, 373 (2007).
- Wuts, P. G. M., Greene, T. W. Protection for the Amino Group. In Greene's Protective Groups in Organic Synthesis. , John Wiley &, Sons, Inc. 696-926 (2006).
- Palasek, S. A., Cox, Z. J., Collins, J. M. Limiting racemization and aspartimide formation in microwave-enhanced Fmoc solid phase peptide synthesis. Journal of Peptide Science. 13, 143-148 (2007).
