Summary
Polyamine tabanlı peptid amphiphiles (PPAs) sentezi gruplar bu reaktif işlevler maske korumanın akılcı kullanımı gerektiren birden çok Amin nitrogens, varlığı nedeniyle önemli bir sorundur. Bu yazıda, bu yeni sınıf kendi kendine montaj moleküllerin hazırlanması için facile yöntemi açıklanmaktadır.
Abstract
Polyamine tabanlı peptid Amphiphiles (PPAs) kendi kendine montaj amfifilik Biyomalzeme-peptid amphiphiles (PAs) ile ilgili yeni bir sınıf vardır. Geleneksel PAs şarj edilmiş amino asitler (lizin, arginin), doğrudan bir lipid segmente bağlı olan veya nötr amino asitleri yapılan bir bağlayıcı bölge içerebilir grupları çözücü olarak sahip. PAs peptit dizisi ayarlama çeşitli türleri morfoloji yol açabilir. Benzer şekilde, PPAs hidrofobik bir kesimi ve tarafsız amino asitler sahip, aynı zamanda polyamine molekülleri çözücü (hidrofilik) gruplar su içerir. PAs modelinde olduğu gibi PPAs da küçük çubuklar, bükülmüş nano-şeritler ve erimiş nano-sayfaları, suda zaman da dahil olmak üzere çeşitli türleri morfoloji, içine kendi kendine monte edebilirsiniz. Ancak, bir tek polyamine molekül üzerinde birincil ve ikincil aminlerin varlığı PPAs sentezleme ne zaman önemli bir sorun teşkil etmektedir. Bu yazıda, katı faz peptid sentez (SPP'ler) kullanarak PPAs facile sentezi ulaşmak için edebiyat emsal üzerinde dayalı basit bir protokol gösteriyoruz. Bu iletişim kuralı PAs ve diğer benzer sistemleri sentezi için genişletilebilir. Biz de bölünme reçine, kimlik ve arıtma için gerekli adımları göstermektedir.
Introduction
Kendi kendine montaj peptid amphiphiles (PAs) genellikle aşağıdaki segmentlerinin oluşan Biyomalzeme bir sınıf vardır: (a) hidrofilik baş, (b) bağlayıcı bölge ve (c) hidrofobik kuyruk. Çoğu PAs literatürde açıklanan şarj edilmiş veya polar aminoasit artıkları1,2,3,4' oluşan bir hidrofilik baş sahip. PAs Biyomedikal ilaç dağıtım, hastalık teşhis, rejeneratif tıp, vb5de dahil olmak üzere geniş bir uygulama yelpazesi bulduk. Onların amino asit sıralamasına dayanan, PAs nanoyapıların küresel micelles ve nano-filamentler dahil olmak üzere çok çeşitli oluşabilir. Son zamanlarda hibrid polyamine tabanlı peptid amphiphiles, PPAs6olarak adlandırdığı bir sınıf bildirdin. Türleri morfoloji, kendi kendine montaj kinetik ve metabolik bozulma bu Biyomalzeme kendi solubilizing baş grubuyla ilgili bulunmuştur. Ayrıca, PPA nanoyapıların toksisite memeli hücreleri (MiaPaCa2 ve HeLa hücre hatları) test konsantrasyonlarda doğru belli etmedi. PPA tabanlı nanocarriers çünkü çekici ilaç dağıtım araçlar vardır: (1) polyamine alımı ve metabolizma kanserli hücrelerde arttırılması için kanıtlanmıştır, (2) katyonik nanoyapıların endosomal kaçış7,8, elde edebilirsiniz Hangi yüksek dolaşım ve bir hücre ve (3) PA ile; karşılaştırıldığında farklı bir metabolik profili olmalıdır içinde ikamet yol açar Örneğin, onlar-ecek var olmak daha kararlı insan vücudunda bulunan proteaz doğru (her ne kadar onlar belki diğer enzimler, Amin oxidases gibi duyarlı)9,10. Ayrıca, PPAs farklı türleri morfoloji, Fizikokimyasal özellikleri, nanopartikül sertlik ve derleme kinetik uzunluğu ve bireysel PPA molekül6adet bağlı olarak tespit edilmiştir. Burada, sentez, kimlik ve PAs veya benzer hibrid peptid molekülleri hazırlanması için uygulanabilir PPAs arınma için detaylı bir protokolü açıklar.
Polyamines yaygın olarak piyasada korumalı formlarında bulunan olmadığından ve polyamines birincil ve ikincil aminlerin korumak onları amino asitler ve diğer moleküller ile biz belirttiğimiz conjugating için son derece önemlidir çünkü onların koruma elde etmek için sentetik adımları. Bu iletişim kuralı genel amacı polyamines amino asitler için conjugating basit bir yöntem sağlamaktır. Polyamines karboksilik grubu eksikliği; Böylece, onlar Rink Amid veya Wang reçineler birleştiğinde olamaz. Bunun yerine, 2-chlorotrityl klorür gibi reçineler sentetik protokolü için tavsiye edilir. Ana PPA sentezi için birincil ve ikincil Amin fonksiyonel grupların varlığı mücadeledir. Bizim için biz birincil amino grubu kaplin tepki izin vermek ücretsiz polyamine tutarken polyamine tüm İkincil aminler korumalı. Reaksiyon sağlam bir destek ilkeleri katı faz peptid sentez (SPP'ler) iş-up her bağlantı ve deprotection adımdan sonra kolaylaştırmak için aşağıdaki üzerinde yapıldı. (Bazı adımlar doğrulama otomatik bir sistem içinde zor) aşağıdaki iletişim kuralı her iki el ile ve otomatik bir sentez PPAs için yeterlidir. Bu moleküllerin sentezi de dışarı otomatik bir synthesizer veya mikrodalga reaktör yardımı ile yapılabilir (otomatik veya yarı otomatik). Reaksiyon şeması Şekil 1' de özetlenen.
Şekil 1: (A) A genel reaksiyon şeması PPAs sentezi. Kullanılabilir (B) temsilcisi polyamines PPAs burada açıklanan sentez. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. genel protokol PPAs sentezi için
- Sentez (genellikle mmol) hesaplamak. Bu ölçek hedef PPA tutar kitle üzerinde temel alır. SPP'ler reaksiyon verimliliğini yavaş yavaş amino asit dizisi bir artış ile azalır unutmayın. Bu nedenle, tam reaksiyon verimlilik hesaplamak zordur.
- Reçine yükleme göre kullanılacak reçine ağırlığını hesaplayın. Yükleme kapsayıcı veya Çözümleme Protokolü reçine ve mmol/g içinde dile getirdi. Reçine ağırlığını hesaplamak için aşağıdaki formül kullanılır:
- 2-chlorotrityl klorür reçine dikkatlice tartmak (bizim'de yükleme ~0.85 mmol olduğu)
- Aşağıdaki özelliklere sahip bir fritted sentez gemi reçine yerleştirin: kapasite – 50 mL, Fritted disk – 25 mm, gözeneklilik-orta.
- 15 mL diklorometan (DCM) reçine için ekleyin.
- Bir değişken hız mekanik shaker (şişesi shaker/karıştırıcı) sentez gemi atmak ve ajitasyon maksimize etmek için gemiler 45 ° açıyla (veya yatay) açın.
- Şişmeye reçine boncuk izin moleküler difüzyon ve aktif, erişilebilirlik kolaylaştırır çünkü için 15 dk. şişme tepki verim kaplin verimliliği arttırmak artırır.
- 8 karşılıkları (0,25 mmol ölçek için 2 mmol) istenen polyamine (Spermine, Spermidine, Diethyelenetriamine, 1,3-diaminopropane, vb) için reçine ekleyin ve 5 h için tepki sağlar.
Not: Daha az tepki süre verimi azaltacaktır. - Bir Kaiser ( Tablo malzemelerigörmek) için reçine polyamine, başarılı bağlantı doğrulamak için sınama gerçekleştirme. Birincil aminlerin başarılı bağlantı ücretsiz Amin için karşılık gelen bir menekşe/mavi renk verir.
- Susuz metanol (15 mL), çözünmüş 1-(4,4-dimethyl-2,6-dioxocyclohex-1-ylidene)ethyl (Dde), 4 karşılıkları tepki karışımı gece11sallayarak kullanarak birincil amin grubu korumak.
Not: Daha az tepki süresi verim azaltır. - Kaiser testi gerçekleştirin. Reçine boncuk mavi renkten bir yokluğu başarılı koruma onaylar. Birincil Amin başarısız korunması durumunda, önceki adımı yineleyin.
- DCM drenaj ve reçineler iki kez DCM ve DMF (2:1, 15 mL) karışımı ile yıkayın.
- 20 karşılıkları (5 mmol) di-tert butil di-karbonat (Boc) DCM (20 mL) içinde dağıtılması ve tepki 3 h için devam etmek izin verir.
- Bir chloranil mı (bkz. Tablo reçetesi) ikincil Amin tam bir koruma doğrulamak için sınama gerçekleştirme. Bir pozitif test (koruma) renksiz veya açık sarı renk verir. Birincil aminler kırmızı bir renk verirken ücretsiz İkincil aminler koyu yeşil/mavi renk verin.
- Solvent karışımı drenaj ve iki kez DCM ve DMF (2:1, 15 mL) karışımı ile yıkayın.
- DMF (10 mL) hidrazin % 2 çözeltisi ekleyin ve 1 h için çalkalanır.
- Bir Kaiser birincil Amin başarılı deprotection onaylamak için test.
-
İstenen amino asitler hangi sen yazma/onları çekmek ters sırada ekleyin. Peptidler N termini C termini çizilir ama ters yönde, C-N. sentez Örneğin, aşağıdaki peptid gerektiren bir PPA - GLFD core-, aspartik asit (D), ardından Fenilalanin (F), lösin (L) ve nihayet glisin (G) ekleyin.
Not: çoğu amino asitler için aşağıdaki bağlantı kokteyl bağlantı yüklenen polyamine reçineler için uygundur.- 4 karşılıkları (1 mmol) Fmoc korumalı amino asit, 2-(1H-benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium hexafluorophosphate (HBTU) 3.95 karşılıkları ve diisopropylethyl Amin (DIPEA) 15 karşılıkları karıştırın.
- Onları DCM ve DMF (1:1, 15 mL) karışımı dağıtılması ve kokteyl için 2 dk (kadar tam çözülme) solüsyon içeren temizleyicide.
- Karboksilik asit amino asit aktivasyonu emin olmak için ek bir 3-5 dakika bekleyin.
- Gemi tepki karışımı ekleyin. Ortam sıcaklığında 2-4 h için tepki yerine getirir.
Not: Biz (genellikle daha düşük miktarda amino asitler ve Bağlantı Aracısı gerektiren) aşağıdaki HBTU verimli alternatif olarak bulduk: COMU, DIC/Oxima PyBOP, HATU. - Bir Kaiser başarılı bağlantı doğrulamak için sınama gerçekleştirme.
- Amino asit Fmoc gruptan 4-metil Piperodin (10 mL) % 20 çözeltisi içinde DMF ekleyerek de-korumak. Bunu iki kez, her zaman tepki karışımı 15dk için titriyor.
Not: Piperazin/DBU12Fmoc giderilmesi için etkili bir alternatiftir.- DCM (15 mL) yıkama eklemeler arasında gerçekleştirin.
- Bir Kaiser amino asitin başarılı de-koruma onaylamak için test.
- İyice 4-metil bütün izlerini kaldırmak için reçine yıkayın. Reçine DMF (10 mL), 5 min için süren her yıkama ile iki kez yıkayın ve nihayet DCM (10 mL) 10 dakika ile.
- Kalan tüm amino asitler gittikçe kaplin yineleyerek ekleyin ve adımları de-koruma.
-
Son olarak, tüm gerekli amino asitler kaplin sonra polyamine-peptid yapı son amino asit hidrofobik kuyruğuna eşlenik:
- 10 HBTU 9,5 karşılıkları ve 12 DIPEA karşılıkları için istenen karboksilik asit işlevselliği karşılıkları DCM ve DMF karışımı (1:1, 20 mL) çözünmüş ekleyin.
Not: daha bazı kuyrukları solvent (genellikle DCM bir daha büyük %) veya ek veya başka bir çözücü N-methylpyrrolidone (NMP) gibi farklı bir kısmı gerekebilir unutmayın. - (Biz kuyruk tamamen erimesi için daha uzun sürerse gördüm) fesih kadar kokteyl 5-10 dk için solüsyon içeren temizleyicide ve gemi ekleyin.
Not: birden çok reaktif site içeren kuyrukları için onları kaplin önce korunmaya ihtiyaçları olacak. - Bu gece en yüksek verim için yürütmek için tavsiye edilir, ancak bu reaksiyon (hidrofobik kuyruk kancası) en az 5 h için taşırlar.
- 10 HBTU 9,5 karşılıkları ve 12 DIPEA karşılıkları için istenen karboksilik asit işlevselliği karşılıkları DCM ve DMF karışımı (1:1, 20 mL) çözünmüş ekleyin.
2. PPA bölünme sağlam destek
Bu adımın amacı PPA reçine ve amino asitler ve polyamine artıkları Boc koruma grupları kaldırmak için bölünme var.
- Reçine DCM (8 mL, 5 min için her zaman) ile iki kez DMF (2 min için 8 mL) ile yıkayın. Her eklenmesinden önce solvent gemisinden drenaj. Son yıkama yürütüldükten sonra reçine 15dk için vakum altında kuru.
- Aşağıdaki karışım oranı kullanarak bölünme çözüm hazırlamak: 28:1:1 trifluoroacetic asit (TFA): H2O: Triisopropyl silane (ipuçları). 15 mL 0.5 mL H2O ve ipuçları 0.5 mL TFA, 14 mL ekleyin dekolte kokteyl yapmak için.
- Bu bölünme çözüm için reçine ekleyin ve oda sıcaklığında 2-4 h için çalkalanır.
- Bir 25 çözümde toplamak veya 50 mL yuvarlak alt şişesi.
- TFA vacuo olarak 1-2 ml karışımı 40 ° C'de Isıtma sırasında düşük basınçta bir rotary evaporatör kullanarak konsantre (PPA ayrışma önlemek için 55 ° C aşmak değil).
- Buharlaşma sonra elde edilen TFA çözüm (dropwise) susuz soğuk eter (15 mL) içeren bir yuvarlak alt şişe ekleyin. Bu hemen PPA çökelti.
- Buna ek olarak, susuz soğuk eter (5 mL) nerede TFA konsantre orijinal şişeye ekleyin.
- Ek katı yeniden elde etmek ve eter eriyik--dan adım 2.6 ile birleştirmek için bu şişeyi solüsyon içeren temizleyicide.
Not: Transfer pipet-ebilmek var olmak yıkamak DCM birimi ile küçük bir. Bu bir jel madde formu eğilimindedir çünkü DMF işlemi sırasında tanıtan kaçının. - (Buzdolabı içinde ele) şişeye koyun ve yağış en üst düzeye çıkarmak için gece stand izin verin.
- Sinterlenmiş disk filtre huni kullanarak vakum filtrasyon tarafından çöktürülmüş malzeme toplamak. İdeal gözenek boyutları iyi veya orta vardır.
- Çökelti kalan herhangi bir organik kaldırmak için iki kez soğuk eter (5-10 mL) ile yıkayın.
3. maldı kurutulmuş bırak yöntemini kullanarak ham ürün tanımlaması
-
Olumlu modunda analiz için matris hazırlık:
- Matris yardımlı Lazer Desorpsiyon/iyonlaşma (MALDI) kütle spektrometresi kullanılarak moleküler ağırlık Analizi başlatmak için bir microcentrifuge tüp için 10-20 mg α-cyano-4-hydroxycinnamic asit ekleyin.
- Su/Asetonitril (1:1, 1.0 mL) % 0,1 Trifluoroacetic asit (TFA) ile çözüm ekleyin. Vortexing tarafından iyice karıştırın.
Not: Bu matris için pozitif yüklü peptidler kullanılmalıdır. MALDI negatif modu benzer, ancak 9-aminoacridine % 0.1 amonyak ile solvent katkı maddesi içeren bir matris gerektirir. - Örnek 1-2 µL maldı için paslanmaz çelik hedef plakasına eklemek ve örnek hava kuru. 1-2 µL matris ekleyin ve tekrar kuru.
Not: Dairesel işaretler belirli nokta bulmanıza yardımcı olması için hedef plaka gridded plakaları var.
- Kendi kimliğini doğrulamak için maldı alet örnekleri analiz. Electrospray iyonlaşma (ESI) PPAs kimliğini onaylamak için geçerli bir alternatiftir.
4. partiye hazırlık ters fazlı yüksek performanslı sıvı kromatografi (HPLC) arıtma kullanarak PPAs arıtma
-
PPA çökelti Asetonitril ve su en az bir miktarda geçiyoruz.
- Kural olarak 100 mg 5 ml su ve Asetonitril az kuru ham PPA geçiyoruz. Daha hidrofobik PPAs çözülmeye Asetonitril büyük bir yüzdesi gerektirebilir ve ayrıca solvent daha büyük bir hacim genel olarak, net ücretten PPAs (Tablo 1) bağlı olarak gereksinim duyabilir.
- Tam çözülme yer almaz, % 1 ekleyerek TFA (ACN veya H2O). Dimethylsulfoxide, metanol veya isopropanol gibi diğer uyumlu çözücüler eser miktarda eklemek mümkündür (%5 için onların içeriği sınırlama).
| Solvent | Pozitif yüklü PPAs | Olumsuz PPAs tahsil | ||
| %0.1 TFA su | %0.1 NH3 su | |||
| %0,1 ACN TFA | %0.1 NH3 ' te Afrika Kupası | |||
Tablo 1: Solvent sistemleri. Çözücü sistemi için olumlu ve olumsuz PPAs tahsil evlenme teklif etti.
- Bir boynuz sonicator % 48 20 dk 10 s darbeleri ile Amp1, ya da 2-3 h bir ultrasonik banyo kullanarak PPA solüsyon içeren temizleyicide.
-
Daha sonra 0.20 mikron politetrafloroetilin (PTFE) şırınga filtre kullanarak filtre tarafından takip 0,45 mikron şırınga filtre kullanarak filtre uygulayın. PPA çözüm açık ve ücretsiz olarak tüm Partikül malzemeler olmalıdır.
- Filtrasyon çok zor ise, uzun bir süre için solüsyon içeren temizleyicide. Uzun süreli depolama toplamak veya gelate, kendisine hangi yeniden sonication ve, belki, yeniden filtrasyon gerektiren neden olabilir gibi PPA çözüm arıtılmış hemen şırınga filtrasyon sonra olduğunu önerilir.
- Sırasında ve sonrasında arıtma, HPLC sınıf çözücüler ya olanlar bir 0,25 mikron şırınga filtre/membran filtre kullanın.
Not: PPAs arındırmak için en yaygın solvent koşulları O ve Afrika Kupası H2Gradyanda oluşur. - Standart bir ters fazlı HPLC aleti bu iletişim kuralı için kullan. Bu bir elüsyon degrade programcı, ikili bir çözelti iletim sistemi, 220 ve 254 nm ve programlanabilir kesir toplayıcı tespit yetenekli bir UV dedektörü içermelidir. Maksimum akış hızı 50 mL/dakika olmalıdır.
- Kullanım bir C-18 faz sütun ayrılması için ters. Sütunlar aşağıdaki boyutları katı saf kitle bağlı olarak kullanılabilir ve net ücret PPA (Tablo 2).
| PPA şarj | Partikül büyüklüğü | Sütun boyutu | Ham PPA kütlesi |
| + ve ücretli | 5 mikron | 150 x 30 mm | 170 mg |
| -ve ücretli | 5 mikron | 150 x 30 mm | 170 mg |
| + ve ücretli | 5 mikron | 150 x 21,2 mm | 90 mg |
| -ve ücretli | 5 mikron | 150 x 21,2 mm | 90 mg |
Tablo 2: sütunlar önerdi: Sütun boyutları, Parçacık boyut ve enjeksiyon C18 için başına maksimum yük kapasitesi faz HPLC kolonları ters
- PPA ile her iki sütun kapasitesini ve HPLC enjeksiyon döngüsünü hacmi tarafından belirlenen bir birimi enjekte. Tablo 3 ' te (40 dk elüsyon zaman) görülen ayarlara göre HPLC degrade yöntemini çalıştırın.
| Zaman | Solvent (Asetonitril) | Çözücü B (su) | Akış hızı (mL/dk) |
| 0 | % 5 | % 95 | Akış hızı sütun ambalaj ve boyutuna bağlıdır. |
| 2 | % 5 | % 95 | |
| 35 | % 95 | % 5 | |
| 38 | % 100 | % 0 | |
| 40 | % 5 | % 95 |
Tablo 3: önerilen degrade: Su vs Asetonitril göreli kompozisyon bir süre gösterilen ters faz degrade önerdi. Akış hızı sütun özellikleri üzerinde bağlıdır.
-
MALDI kullanarak çeşitli test tüpleri üzerinde toplanan kesirler çözümlemek ve hangi tüp (ya da tüpler) PPA içeren belirlemek. Bu her tüpün içinde bulunan molekül ağırlığı inceleyerek değerlendirilir.
- Bir analitik HPLC üzerinde kesirler saflığı kontrol edin. 220 ayarla bir UV dedektörü ile donatılmış bir HPLC-gradient sistemi kullanmak nm.
- Yabancı maddeler varsa, HPLC ile arınma ek bir döngü yapmak. Partiye Hazırlık HPLC için kullanılan yukarıdaki geçişin sütun dönüştürme online yazılımı kullanarak analitik HPLC ile kullanmak için ölçeklendirilebilir. Her kesir çok ≥95% fiziksel karakterizasyonu veya biyolojik değerlendirme için saf olmak.
- Büyük yuvarlak popolu şişesi veya buharlaşma şişesi kesirleri toplamak ve tüm Asetonitril ve su çoğunu kaldırın. Nihai PPA çözüm en fazla 10 mL olmalıdır.
- Bu konsantre 50 mL santrifüj tüpü aktarın. PPAs deterjan benzeri maddelerdir dikkatli olun; Böylece, kabarcıklar çözücü buharlaşma sırasında oluşturulur. Etil alkol ilavesi kabarcık oluşumu azalır bulduk.
- Vakum konsantre konsantre ol. Vakum buharlaşma sırasında PPA büyük miktarda konteyner duvarlar için uygun. Bu tekrar tekrar şişeye duvar HPLC su ile durulama tarafından yeniden elde etmek. Kombine hacmi konsantre PPA ve rinsate en fazla 30 mL olmalıdır.
- 50 mL tüp içinde sulu çözüm yerleştirin.
-
Flaş dondurma bu PPA çözüm sıvı azot içinde:
Not: hangi daha hızlı lyophilizer Yüce daha küçük buz-kristalleri dondurucu sonuçları Flash. Ayrıca, daha yavaş dondurma kendi kendine monte supramolecular yapıları oluşumu izin verebilir. Yavaş yavaş-80 ° C Buzlukta dondurma veya kuru buz + aseton karışımı kullanarak dondurmak için başka bir alternatif (ama daha az arzu) olduğunu- Santrifüj tüpü içinde lyophilizer yerleştirerek önce ekleyip veya nem örnek kaçış ve soğutma grubu toplanan almak için izin vermek için tüpün kapağı gevşetin. -54 ° C ve 0,016 mbar ayarlama lyophilization birimini ayarlayın.
Not: Kapağını çıkarın ve (ile bir lastik bant) mendil açılması üzerine yerleştirmek için başka bir seçenek. Ayrıca, belirli bir açıyla örnekleri dondurma veya küçük porsiyonlar buzları yüzey alanı bir artış nedeniyle daha hızlı ve daha iyi lyophilization için sağlar bulduk. - Katı erimeye başlarsa, bu organik bir çözücü (genellikle Asetonitril) izleri bulunduğunu gösterir. Dondurucu adımı yineleyin ve lyophilization durumunu değerlendirmek.
- Erime devam ederse, iki olası çözümü vardır:
- İki porsiyon (tüplerde yerleştirilmesi için), örnekte suyla seyreltik ve tekrar donmasına Böl. Büyük miktarda organik çözücüler ekipmana zarar çünkü bu çözüm kez kullanmayın.
- Alternatif olarak, örnek bir şişeye koyun ve daha fazla vakum altında organik çözücü buharlaşır. Sıvı formda zaman öyledir bir örnek lyophilizing darbeleme ve PPA bileşik kaybına yol açar.
- Santrifüj tüpü içinde lyophilizer yerleştirerek önce ekleyip veya nem örnek kaçış ve soğutma grubu toplanan almak için izin vermek için tüpün kapağı gevşetin. -54 ° C ve 0,016 mbar ayarlama lyophilization birimini ayarlayın.
5. PPAs depolanmasını
- Mağaza ve kapaklar ile-20 ° C'de PPAs sıkılır ve bir tüp ile uygun bir etiket üzerinde Parafilm ile mühürlenmiş.
- Önce kullanma, PPA geri su buharının PPAs üzerinde yoğunlaşma önlemek için bir vakum odasında ortam sıcaklığı getirmek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Sonra sentez ve arıtma ve fizikokimyasal veya biyolojik değerlendirme önce PPAs yeniden denetlenmiş işçiyiz ve saflık analitik HPLC kullanarak tespit önerilir. Malzeme karakterizasyonu veya biyolojik değerlendirme için PPAs bir saflığı olması gerekir > % 95. Şekil 2 HPLC izleme (üst) ve ürünün varlığını teyit maldı spectra (alt) gösterir. HPLC analitik sistemleri (AUC) eğri altındaki alan entegre ve bir AUC > % 95 ürün saflık için ilgili. HPLC UV tabanlı sistemlerde, bir tek, keskin tepe görmek için bekleyin. MALDI spectra PPA ±1 Da (bağlı olarak maldı göre analiz modu) içinde hesaplanan moleküler ağırlığı olan için karşılık gelmelidir.
PPAs kendinden montajlı görüntülenmeyecektir ve transmisyon elektron mikroskobu (TEM) (Şekil 3A, B), atomik kuvvet mikroskobu (AFM) (Şekil 3 c, D), küçük açı röntgen de dahil olmak üzere sayısız teknikleri kullanılarak analiz Saçılma (SAXS), elektron mikroskobu (SEM) ve dinamik ışık saçılma (DL) tarama. Başarılı kendinden montajlı AFM ve TEM iyi tanımlanmış nanoyapıların neden olur. Kendi kendine bir araya başarısızlık birkaç yüz nanometre boyutunda olan düzensiz toplamları oluşumunda her iki sonuç olacaktır.
Resim 2: Temsilcisi analitik HPLC kromatografik (üst) ve maldı spektrum (alt) PPA C16V22Spermine. Bu rakam Samad vd 20176değiştirildi; John Wiley & Sons, 2018 izniyle yeniden. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3: temsilcisi transmisyon elektron mikroskobu (TEM) test. (A) TEM görüntü nanofiber ve yuvarlak nanosheets, (B) Magnified iç metin birlikte nano-yaprak, (C) atom oluşumu gösterilen kuvvet mikroskobu (AFM) test, (D) ve yükseklik harita elde edilen gösterilen test C16V22KDiethyelenetriamine için. (D) X ve Y eksenlerini gösteren nano-Levha genişliği ve nano-sayfa yüksekliği anılan sıraya göre. Bu rakam Samad vd 20176değiştirildi; John Wiley & Sons, 2018 izniyle yeniden. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada açıklanan protokoller PAs kuyuları ve peptid tabanlı molekülleri (örneğin, karma PA-peptoids) ile ilgili PPAs sentez için kullanılabilir. SPP'ler kullanarak peptidler sentezi basit bir işlem olmakla birlikte, biyolojik izleme molekülleri içeren peptidler sentezi özellikle zor olabilir. Polyamines spermine, spermidine, diethyelenetriamine, vb, gibi kanser hücreleri13hedefleme için izleme moleküller gibi davranabilir. PPAs farklı türleri morfoloji6nanoyapıların içine kendi kendine monte edebilirsiniz. Onların olumlu ücret aynı zamanda dolaşım uzun (nedeniyle endosomal kaçış) ve farklı bir metabolik profili (geleneksel PA ile karşılaştırıldığında) ile yardımcı olabilir. Ancak, birincil ve ikincil aminlerin varlığı nedeniyle PPAs ve kendi analogları sentezleme belirli bir meydan okuma olabilir. Sunulan sentetik strateji bu meydan okuma ortogonal koruma grubu rasyonel kullanımı tarafından üstesinden gelir. Dde molekül seçmeli olarak reaksiyon yalnızca birincil aminler11ile uğrar. Boc, öte yandan, gelişigüzel birincil ve ikincil aminlerin ile reaksiyona girer ve birincil Amin korunduktan sonra bu nedenle, yalnızca eklenebilir. Diğer koruma grupları Boc yerine kullanılabilir bahsetmek istiyoruz. Örneğin, reaksiyon asetik anhidrit ile kalıcı olarak (Bu grup bölünme sırasında kaldırılmaz) İkincil aminler acetylate. Aynı şekilde, benzylcarbamate H2/Ni14tarafından kaldırılabilir bir grup verirken trifluoacetic anhidrit kullanımı Bankası duyarlı koruma sağlar. Bir kez polyamines gerektiği gibi korunur, PPA sentezi standart SPP'ler kullanarak devam edebilirsiniz. Kaplin hidrofobik kuyruk geri kalanına polyamine-peptid yapı sadece çift için daha uzun bir süre alır ama ayrıca amino asitler iki kez molar miktarda gerektirir. Bazı hidrofobik kuyrukları değil erimesi de bazı geleneksel çözücüler içinde oda sıcaklığında veya bile ilk dağılmasından sonra çökelti. Bu tür reaksiyonlar en iyi hafif ısıtma (40 ° C) altında alt şişe yuvarlamak tüm Reaktanları aktararak devam etmektedir. Alternatif olarak, bir ceketli synthesizer gemi Reaktanları tepki boyunca sıcak tutmak için kullanılabilir. Varsa, bir mikrodalga synthesizer ile kaplin15yardımcı olabilir.
Kütle spektroskopisi birçok formları PPAs kitlelerin belirlemek mevcut olmasına rağmen biz maldı spektroskopisi bizim tanımlama amacıyla kullanılır. Parçalanma minimize maldı moleküler iyon doruklarına üretiminde daha etkili olduğu bulduk ve oluşumu adduct. MALDI PPA olasılıkla iyonlaşma durumuna karşılık gelen bir iyon oluşturmak için programlanmış. İyon belirli bir ücret üretmek için araç programlama yanı sıra, biz de örnekleri ile biz kullanacağız modu için uygundur uygun matris birleştirmek gerekir.
PAs kez form için bir eğilim var tuz maldı plaka üzerinde adducts. Bu sorun ile olumsuz ücret molekülleri daha sık görülür. En ortak tuzları bunlar sodyum (Na+ = 23 Da) ve potasyum (K+ = 39 Da). Bunlar adducts Mayıs bastırılmış 1 – 2 µL asetik asitin ekleyerek. PPAs genellikle+ H adduct sağlar. Bu sadece nanopore su veya sentetik boyunca HPLC su ve arıtma işlemi ek iyonları giriş önlemek için kullanmak tavsiye edilir. Borosilikat cam kaplar ve reaksiyon gemiler son üründe leach sodyum iyonları kayda değer miktarda içerebilir. Dikkatli bir şekilde nanopurewater için son yıkama kullanarak Züccaciye durulayın.
Moleküler iyon doruklarına belirlenmesi de matris çözüm tam katı matris ile doymuş değil eğer zor olur. Doygunluk emin olmak için her zaman olmalıdır küçük bir miktar katı Matrix'in değil çözündürüldükten.
Son bir not olarak, bazı PPAs veya PAs herhangi bir çökelti eter eklenmesi üzerine form değil lütfen göz önünde bulundurun. Bu esas olarak daha hidrofilik PPAs gözlendi. Böyle olaylar, biz ilk tüm eter buharlaşır, NH4OH ile aşırı TFA nötralize ve su ve Asetonitril (% 0,1 TFA veya NH4OH ile) tam olarak solubilize ve her zamanki gibi arındırmak için devam etmek için ekleyin.
Burada açıklanan protokolü kendi kendine göre polyamine peptid amphiphiles (PPAs) ve aynı zamanda PAs montaj son derece saf türevleri sentezlemek için kullanılabilir. Ortogonal koruma/deprotection adımlar birincil ve ikincil Amin grupları seçici maskeleme gerektiren diğer durumlarda kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar hiçbir bildirmek için çıkar çatışması var.
Acknowledgments
Bu proje Nebraska Üniversitesi Tıp Merkezi (başlangıç fonlar, MC-S); tarafından finanse edildi NIH-COBRE, 5P20GM103480 (T. Bronich) ve Amerikan Kimya Birliği, darbe tekrarlama frekansı # 57434-DNI7(MC-S).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Chlorotrityl chloride resin | AappTec | RTZ001 | |
| SynthwareTM synthesis vessel | Aldrich | SYNP120050M | |
| Dichloromethane | Acros | AC406920250 | Fisher Sci. Catalogue # |
| Wrist Shaker | Boekel Scientific | 401000-2 | |
| Kaiser test kit | Sigma-Aldrich | 60017 | |
| 2-[(4,4-dimethyl-2,6-dioxocyclohex-1-ylidene)ethyl-amino]-ethanol | Sigma-Aldrich | CDS004772 | |
| Anhydrous Methanol | Acros | AC610981000 | Fisher Sci. Catalogue # |
| Chloranil test kit | TCI | TCC1771-KIT | VWR Catalogue # |
| Di-tert butyl di-carbonate | Acros | AC194670250 | Fisher Sci. Catalogue # |
| Dimethylformamide | Fisher Scientific | BP1160-4 | |
| Hydrazine | Acros | AC296815000 | FIsher Sci. Catalogue # |
| (2-(1H-benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium hexafluorophosphate) | p3biosystems | 31001 | |
| 4-methyl piperidine | Acros | AC127515000 | FIsher Sci. Catalogue # |
| Trifluoroacetic Acid | AappTec | CXZ035 | |
| Triisopropyl Silane | Sigma-Aldrich | 233781 | |
| Ether | Fisher Scientific | E138-1 | |
| α-Cyano-4-hydroxycinnamic acid | Sigma-Aldrich | C8982 | |
| 9-Aminoacridine | Sigma-Aldrich | 92817 | |
| Fisherbrand Syringe Filters: PTFE Membrane | Fisher Scientific | 09-730-21 |
References
- Cui, H., Pashuck, E. T., Velichko, Y. S., Weigand, S. J., Cheetham, A. G., Newcomb, C. J., Stupp, S. I. Spontaneous and x-ray-triggered crystallization at long range in self-assembling filament networks. Science. 327, 555-559 (2010).
- Pashuck, E. T., Cui, H., Stupp, S. I. Tuning supramolecular rigidity of peptide fibers through molecular structure. Journal of the American Chemical Society. 132, 6041-6046 (2010).
- Stupp, S. I., Zha, R. H., Palmer, L. C., Cui, H., Bitton, R. Self-assembly of biomolecular soft matter. Faraday Discussions. 166, 9-30 (2013).
- Conda-Sheridan, M., Lee, S. S., Preslar, A. T., Stupp, S. I. Esterase-activated release of naproxen from supramolecular nanofibres. Chemical Communications. 50, 13757-13760 (2014).
- Mata, A., Palmer, L., Tejeda-Montes, E., Stupp, S. I. Design of biomolecules for nanoengineered biomaterials for regenerative medicine. Nanotechnology in Regenerative Medicine. , Springer. 39-49 (2012).
- Samad, M. B., Chhonker, Y. S., Contreras, J. I., McCarthy, A., McClanahan, M. M., Murry, D. J., Conda-Sheridan, M. Developing Polyamine-Based Peptide Amphiphiles with Tunable Morphology and Physicochemical Properties. Macromolecular bioscience. 17, (2017).
- Nel, A. E., Mädler, L., Velegol, D., Xia, T., Hoek, E. M., Somasundaran, P., Klaessig, F., Castranova, V., Thompson, M. Understanding biophysicochemical interactions at the nano-bio interface. Nature Materials. 8, 543 (2009).
- Gujrati, M., Malamas, A., Shin, T., Jin, E., Sun, Y., Lu, Z. -R. Multifunctional cationic lipid-based nanoparticles facilitate endosomal escape and reduction-triggered cytosolic siRNA release. Molecular Pharmaceutics. 11, 2734-2744 (2014).
- Zhu, Y., Li, J., Kanvinde, S., Lin, Z., Hazeldine, S., Singh, R. K., Oupický, D. Self-immolative polycations as gene delivery vectors and prodrugs targeting polyamine metabolism in cancer. Molecular Pharmaceutics. 12, 332-341 (2014).
- Planas-Portell, J., Gallart, M., Tiburcio, A. F., Altabella, T. Copper-containing amine oxidases contribute to terminal polyamine oxidation in peroxisomes and apoplast of Arabidopsis thaliana. BMC Plant Biology. 13, 109 (2013).
- Nash, I. A., Bycroft, B. W., Chan, W. C. Dde - A selective primary amine protecting group: A facile solid phase synthetic approach to polyamine conjugates. Tetrahedron Letters. 37, 2625-2628 (1996).
- Ralhan, K., KrishnaKumar, V. G., Gupta, S. Piperazine and DBU: a safer alternative for rapid and efficient Fmoc deprotection in solid phase peptide synthesis. RSC Advances. 5, 104417-104425 (2015).
- Casero, R. A. Jr, Marton, L. J. Targeting polyamine metabolism and function in cancer and other hyperproliferative diseases. Nature Reviews Drug Discovery. 6, 373 (2007).
- Wuts, P. G. M., Greene, T. W. Protection for the Amino Group. In Greene's Protective Groups in Organic Synthesis. , John Wiley &, Sons, Inc. 696-926 (2006).
- Palasek, S. A., Cox, Z. J., Collins, J. M. Limiting racemization and aspartimide formation in microwave-enhanced Fmoc solid phase peptide synthesis. Journal of Peptide Science. 13, 143-148 (2007).
