Summary
ويصف هذا البروتوكول كيفية تقييم التآزر بين جسم السرطان والأدوية أنتينيوبلاستيك في نماذج السريرية باستخدام معادلة مؤشر الجمع بين تشو وتالالاي.
Abstract
التقوية مونوكلونل معادية (ماب) من وكلاء العلاج الكيميائي يشكل استراتيجية قيمة لتصميم العلاج فعالة وأكثر أماناً ضد السرطان. هنا نقدم بروتوكول لتحديد مجموعة رشيد في الخطوة الإكلينيكية. أولاً، يصف لنا تحليل يستند إلى الخلية لتقييم التآزر بين ماب السرطان والعقاقير السامة للخلايا، ويستخدم معادلة مؤشر تركيبة شو وتالالاي1. ويشمل هذا القياس لورم الخلية المخدرات-الأجسام المضادة-حساسية واستخدام مقايسة MTT، يليها تحليل الحاسوب الآلي لحساب قيم الفهرس (CI) الجمع بين. قيم CI < 1 تشير إلى التآزر بين مابس المختبرة ووكلاء السامة للخلايا1. للتأكد من صحة في المختبر النتائج التي توصل إليها في فيفو، يصف لنا كذلك وسيلة لتقييم فعالية نظام الجمع في نموذج ورم xenograft. في هذا النموذج، يؤخر النظام إلى حد كبير نمو الورم، مما يؤدي بقاء موسعة كبيرة بالمقارنة مع عامل واحد عناصر التحكم. الأهم من ذلك، والتجريب في فيفو يكشف أن نظام الجمع هو جيد التحمل. يسمح هذا البروتوكول للتقييم الفعال لتركيبات المخدرات السرطان في نماذج السريري وتحديد تركيبة عقلانية لتقييم في التجارب السريرية.
Introduction
وكان النهج التقليدي في علاج عدد كبير من أنواع مختلفة من السرطان استناداً إلى الأحادي. حتى ولو أنه يزال يستخدم في كثير من الحالات، اجتمع هذا الأسلوب العديد من العوائق التي تؤدي إلى اختيار العلاجات المجمعة2. وخاصة الخلايا السرطانية أكثر عرضه لتطوير المقاومة عندما تعامل مع دواء واحد بحمل بديلة بقاء الآليات3، مما تسبب في تعطل العلاجية في مرضى4. وعلاوة على ذلك، هي المخدرات في الأحادي، وعادة ما تدار بجرعة عالية. هذه الحالة كثيرا ما ينتج عن حدوث الآثار الجانبية تعتمد على جرعة قوية يمكن لا تطاق وإجبار الأطباء بوقف العلاج2. لهذه الأسباب، الرابطة لجزيئات السرطان الآن يفضل الأحادي.
مزيج مثالي من المخدرات ستكون تلك التي تعمل في تضافر الجهود ضد الخلايا السرطانية، دون زيادة السمية ضد الخلايا الطبيعية. ويشير التآزر للتفاعل بين اثنين أو أكثر من المخدرات التي تنتج تأثير علاجي أكبر من مجموع كل العقاقير فردية تعمل بشكل منفصل. قد يؤدي مثل هذه التفاعلات في تعزيز الفعالية العلاجية السريرية2. يحد من مقاومة العلاج، ويزيد من فعالية، ويمكن أيضا تقليل سمية2. وفي الواقع، يمكن تخفيض الجرعة لكل دواء لتقليل آثارها الجانبية التي تستهدف مسارات مختلفة. وبالإضافة إلى ذلك، واحدة من الجزيئات يمكن أن تخدم أيضا كعامل توعية ضد الخلايا السرطانية. تأثير المخدرات الثانية وقد تتعزز في خلايا توعية وجرعات أقل يمكن استخدامها5.
يمكن أن تشمل العلاج بالجمع بين اثنين أو أكثر من المخدرات العلاج الكيميائي أو البيولوجي، مثل [مونوكلونل]6. هذه مابس تستهدف على وجه التحديد خلايا معربا عن خلية للمستضد سطحي للفائدة، وهي قادرة على قتل الخلايا السرطانية من خلال مسارات المناعية بما في ذلك تعتمد على جسم الخلية بوساطة سيتوتوكسيسيتي (ADCC)، بمشاركة الخلايا المناعية المستجيب 7، وتعتمد على تكملة سيتوتوكسيسيتي (CDC)6. أنها يمكن أن تعمل أيضا عبر إليه غير مناعية توسط المبرمج8،9،،من1011. في هذه الحالة، قد تقلد عملية موت الخلايا المبرمج توعية الخلايا السرطانية وتضعف وظيفتها وتزيد من فعالية العلاج الكيميائي المخدرات المرتبطة بها في جرعة أقل. على هذا النحو، تعتبر ماب بروابوبتوتيك مرشحا جيدا لتصميم نظم تركيبة مع الأدوية أنتينيوبلاستيك.
وقد وصف مختلف النماذج الرياضية لتقييم التآزر المخدرات؛ واحد منهم يستند إلى الجمع بين مؤشر الأسلوب1. هذا الأسلوب يستند إلى مبدأ الوسطية-تأثير وضعتها شو1. معادلة تأثير متوسط يرتبط بجرعة المخدرات وأثر المخدرات على النحو التالي.
وهنا هي د جرعة المخدرات؛ مارك ألماني هو تأثير متوسط الجرعة؛ اتحاد كرة القدم هو الكسر تتأثر الجرعة؛ m هو إس الذي يدل على شكل الأرض تأثير الجرعة1. متوسط-تأثير الجرعة يستخدم لحساب الجرعة Dx من الدواء الذي يمنع أو يقتل "x" في المئة من الخلايا. ثم يتم حساب قيمة CI لتقييم تأثير المواد المضافة للجمع بين المخدرات، على النحو التالي1.
قيمة CI 1 يشير إلى تأثير المواد مضافة وقيمة CI < 1 يشير إلى تأثير تآزري، بينما قيمة CI > 1 يشير إلى العداء1. تطبيق هذا الأسلوب هو زيادة تيسير توافر برنامج كمبيوتر، كومبوسين، الذي يحدد التآزر والعداء في كل جرعة أو مستويات تأثير محاكاة تلقائياً12.
مجموعتنا الخاصة 8B6 ماب س-أسيتيل-GD2 جانجليوسيدي (OAcGD2) نيوروبلاستوما مستضد13 وكذلك أظهرت أن هذا ماب قادرة على الحث على موت الخلايا مع سمات المبرمج11. لاختبار ما إذا كان يمكن توعية ماب 8B6 نيوروبلاستوما الخلايا توبوتيكان وكيل أنتينيوبلاستيك، نحن تكييف الأسلوب المذكورة أعلاه وضعتها شو1. أولاً، علينا أن نحدد الجرعة الفعالة 50 (ED50) قيم ماب 8B6 وتوبوتيكان. المقبل، تتعرض الخلايا نيوروبلاستوما مع نسب اكويبوتينت من المركبين استناداً إلى قيم50 اد لتحديد قيم CI باستخدام برامج المحاكاة المذكورة أعلاه. هذا الأسلوب يسمح لنا بإظهار التآزر بين ماب 8B6 وتوبوتيكان في المختبر. وبعد ذلك، يصف لنا بروتوكولا لمواصلة تقييم الفاعلية وسلامة هذا الجمع بين نظام في فيفو. يمكن بسهولة تطبيق هذا البروتوكول لتحديد ماب السرطان قوية وآمنة وتركيبات عوامل العلاج الكيميائي في الدراسات الإكلينيكية. ويرد تمثيل تخطيطي لهذه الدراسة في الشكل 1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
الإسكان الحيوان والإجراءات التجريبية بموافقة "الحكومة الفرنسية" (اتفاقات #C44-278 و #APAFIS 03479.01). رعاية الحيوان وإجراءات أجريت تحت توجيه الاتحاد الأوروبي 2010/63/الاتحاد الأوروبي والقانون الفرنسي #2013-118 لحماية الحيوانات المستخدمة لأغراض البحث العلمي.
1-تقييم 8B6 "المخدرات التفاعل بين" الإنسان والمحيط الحيوي وتوبوتيكان في المختبر
- إعداد عينة 96-جيدا
تنبيه: التشاور مع لجنة الصحة والسلامة للمؤسسة، واتباع قواعد التنظيم المحلية المتصلة بسلامة المختبرات. استعراض المعلومات المادية وصحيفة بيانات السلامة قبل العمل مع أي وسائط الإعلام، وخطوط الخلية، أو الكواشف. استخدام أسلوب تعقيم السليم والعمل في غطاء الاندفاق الصفحي. يجب أن تكون جميع الحلول والمعدات التي تستخدم للتلاعب بخلايا عقيمة.
ملاحظة: صمم بروتوكول التالية للاستخدام مع خلايا ملتصقة. التعديلات المطلوبة لتطبيق الأسلوب نوناديرينت الخلايا تنمو في التعليق؛ هذا البروتوكول يستخدم البيلوروسية لكل حالة تجريبية.- تنمو خلايا IMR5 في قارورة T75.
- في اليوم الأول (يوم 0)، مراعاة ثقافة الخلية تحت مجهر للتحقق من كونفلوينسي الخلية. نضح المتوسطة الخلية من قارورة وغسله مع 5 مل من المحلول الملحي مخزنة الفوسفات (PBS)، وأضف 3 مل حمض الإيثيلين 0.05% (يدتا)/حل برنامج تلفزيوني. العودة قارورة للحاضنة لمدة 3 دقائق (37 درجة مئوية، وأول أكسيد الكربون 5%2).
- دراسة ثقافة الخلية تحت مجهر لمفرزة الخلية.
ملاحظة: إذا لزم الأمر، العودة قارورة للحاضنة مين 3 إلى 5 إضافية، تبعاً لنوع الخلايا السرطانية. - إضافة 10 مل من خلية كاملة المتوسطة قارورة ونقل تعليق خلية إلى أنبوب مخروطي عقيمة 15 مل. الطرد المركزي الخلايا لمدة 5 دقائق في 300 x ز. عد الخلايا باستخدام هيموسيتوميتير.
- إزالة وتجاهل المادة طافية. ريسوسبيند بيليه خلية في المتوسط كاملة النمو. ضبط الحجم المتوسط للحصول على تركيز نهائي 1 × 105 خلايا/مل.
- الآبار البذور 84 من صفيحة الثقافة 96-جيدا مع 104 خلايا كل منها، وهو 100 ميليلتر من تعليق خلية. اتبع المخطط التجريبي المبين في الشكل 2.
- احتضان الخلايا ح 18 في الخلية الحاضنة (37 درجة مئوية، وأول أكسيد الكربون 5%2).
- إعداد حل المخدرات
ملاحظة: لدراسات التوعية بالمخدرات/ماب، تعديل التوقيت والطول، ومعاملة تركيز لتتناسب مع المخدرات/ماب خاصة في السؤال. لاحظ أن تركيز الأولى هو 3 × تركيز النهائي.- في صباح اليوم التالي (اليوم الأول)، إعداد الحلول المخدرات التالية باستخدام متوسط النمو الكامل.
-
إعداد الحل ماب
- تمييع ماب في 500 ميليلتر من متوسط النمو الكامل الحصول على جسم عامل حل مع تركيز ماب 240 ميكروغرام/مل.
- أداء خمس تخفيف المسلسل شقين كما هو مبين في الشكل 2.
-
إعداد حل توبوتيكان
- تمييع، وصفه أعلاه، المخدرات في 500 ميليلتر من متوسط النمو الكامل للحصول على حل عامل المخدرات بتركيز نهائي من 120 نانومتر.
- أداء خمس تخفيف المسلسل شقين كما هو مبين في الشكل 2.
-
إعداد حل جسم والمخدرات
- تمييع حلول المخدرات والإنسان والمحيط الحيوي في 500 ميليلتر من متوسط النمو الكامل للحصول على حل في 120 نانومتر المخدرات ومآب 240 ميكروغرام/مل (العامل الحل).
- أداء خمس تخفيف المسلسل شقين كما هو مبين في الشكل 2.
-
إعداد الحل ماب
- للوصول إلى تركيز النهائي، نقل 50 ميليلتر من كل حل المخدرات إلى الآبار المناظرة، كما هو مبين في المخطط التجريبي ( الشكل 2).
ملاحظة: نقل 50 ميليلتر من متوسط النمو الكامل في الآبار الخلايا غير المعالجة، كما هو مبين في الشكل 2. - احتضان الخلايا ح 72 في الحاضنة (37 درجة مئوية، وأول أكسيد الكربون 5%2).
- في صباح اليوم التالي (اليوم الأول)، إعداد الحلول المخدرات التالية باستخدام متوسط النمو الكامل.
- فحص MTT
- إضافة 10 ميليلتر MTT كاشف الحل في كل بئر.
- احتضان في 37 درجة مئوية ح 4.
- إضافة 100 ميليلتر من تحلل الحل (10% الحزب الديمقراطي الصربي في 0.01 M HCl) في كل بئر، استخدام ماصة متعددة القنوات، ومزيج دقيق من بيبيتينج.
- احتضان في 37 درجة مئوية ح 4 في دائرة هوميديفيد (95% رطوبة).
- قراءة امتصاص في 570 نانومتر (570) و 620 نانومتر (620) باستخدام جهاز المطياف الضوئي.
ملاحظة: خلط كل عينة مرة أخرى قبل بيبيتينج قبل قراءة امتصاص؛ امتصاص في 620 نانومتر يسمح تصحيح القيم الخلفية غير محدد. - حساب امتصاص المصححة: تصحيح امتصاص = من570-620.
- حساب بقاء الخلية كالتالي: الخلية صلاحية = 100 x (عينة يعني امتصاص المصححة/التحكم يعني امتصاص المصوبة).
- حساب القيم المتأثرة بالكسر (اتحاد كرة القدم) باستخدام المعادلة التالية: 1-(عينة يعني امتصاص المصححة/التحكم يعني امتصاص المصوبة).
- دراسات الجمع بين المخدرات والمخدرات التفاعل برامج المحاكاة التحليلية لواحد
- قم بتشغيل برنامج المحاكاة لفتح نافذة ابدأ.
- انقر فوق الزر التجربة الجديدة لفتح النافذة الرئيسية .
- اكتب الاسم للتجربة في إطار الاسم .
ملاحظة: يمكن إضافة تاريخ في إطار التاريخ . - انقر فوق الزر المخدرات واحدة جديدة .
- اكتب الاسم في إطار الاسم الكامل .
- اكتب الاختصار في إطار أبريف .
- اكتب وحدة تركيز المخدرات في إطار الوحدات .
- أدخل بيانات النقطة 1 الجرعة و قيمة فا، اضغط مفتاح الإدخال Enter.
- كرر هذه الخطوة حتى يتم إدخال كافة نقاط البيانات.
- انقر فوق الزر انتهى .
- اتبع نفس الخطوات لإدخال نقاط البيانات ماب.
ملاحظة: استخدام نفس وحدة تركيز كما يستخدم من قبل المخدرات. - انقر فوق الزر الجديد المخدرات التحرير والسرد .
- حدد المخدرات و الإنسان والمحيط الحيوي.
- تحديد نسبة ثابتة وانقر فوق موافق.
- اكتب الاسم في إطار الاسم الكامل .
- اكتب الاختصار في إطار أبريف .
- اكتب نسبة المخدرات/ماب في إطار نسبة .
- أدخل بيانات النقطة 1 الجرعة ، ثم اضغط Enter.
ملاحظة: سيقوم البرنامج تلقائياً بحساب الجرعات للإنسان والمحيط الحيوي، والتحرير والسرد. - قم بإدخال قيمة بيانات النقطة 1 اتحاد كرة القدم واضغط على Enter.
- كرر هذه الخطوة حتى يتم إدخال كافة نقاط البيانات.
- انقر فوق الزر انتهى ، وبعد ذلك، انقر فوق الزر إنشاء تقرير .
- حدد المخدرات والإنسان والمحيط الحيوي، ومن ثم انقر فوق موافق.
- حدد تحرير وسرد ، ومن ثم انقر فوق موافق.
- حدد رأس الجدول CI، و الجدول الموجز. ثم انقر فوق موافق.
- اكتب اسم ملف للملف تحليل ثم انقر فوق حفظ لإنشاء التقرير.
ملاحظة: بعد النقر فوق موافق، سيتم تلقائياً فتح التقرير في مستعرض ويب الافتراضي الخاص بجهاز الكمبيوتر. - لطباعة التقرير، اختر طباعة من القائمة ملف في مستعرض ويب. ويتضمن التقرير "مقطع الجدول الموجز" الذي يتضمن العنوان، التاريخ، اسم الملف، وملاحظة وصف، معلمات (m، مارك ألماني، والبحث والتطوير)، اد50 عامل أما المستخدمة في الأحادي أو في تركيبة، والجدول CI لكل تركيبة في اد50، اد 75، اد90و95من اد.
ملاحظة: قيمة CI من < 1 يشير إلى التآزر، قيمة CI = 1 يشير إلى الجمع، وقيمة CI > 1 يشير إلى العداء.
2-جيل تكثيفها نيوروبلاستوما البشرية في إيماءة السكري نونوبيسي غاما مشمولان الفئران (مجموعة موردي المواد النووية الفئران)
ملاحظة: استبعاد أي تلوث لثقافة الخلية. حيث المصفوفة الغشاء أشكال هلام أعلاه 5 درجة مئوية، وينبغي كل كولتوريواري أو وسائل الإعلام تأتي على اتصال الغشاء مصفوفة الكاشف بريشيليد والجليد-باردة. إبقاء المصفوفة الغشاء على الجليد خلال العملية بأكملها.
-
إعداد تعليق خلية IMR5
- ذوبان الغشاء مصفوفة الكاشف بين عشية وضحاها بغمر القنينة في الجليد في ثلاجة 4 درجة مئوية قبل الاستخدام.
- في اليوم 0، حصاد مثقف IMR5 الخلايا كما هو مفصل أعلاه.
- نقل الخلايا إلى 15 مل الأنبوبة المخروطية وأجهزة الطرد المركزي في 300 x ز لمدة 5 دقائق.
- تجاهل المادة طافية. تغسل الخلايا 2 x مع 15 مل من برنامج تلفزيوني المثلج، وإعداد تعليق خلية من 5 × 107 خلايا/مل في برنامج تلفزيوني المثلج.
ملاحظة: إذا لزم الأمر، نقل تعليق خلية إلى أنبوب ميكروسينتريفوجي 1.5 مل. - دوامة القنينة مصفوفة غشاء الطابق السفلي.
ملاحظة: ينبغي إذابة الغشاء مصفوفة الكاشف ومشتتة. - إضافة مجلد واحد من الغشاء مصفوفة الكاشف ومزجها بيبيتينج للحصول على تعليق خلية 2.5 × 107 خلايا/mL.
- ستبقى على تعليق خلية على الجليد.
-
إعداد الفئران
ملاحظة: يجب أن تكون الفئران ستة إلى سبعة أسابيع من العمر.- الحفاظ على الفئران تحت شرط معين خالية من مسببات الأمراض.
- يسمح بفترة تأقلم بين ثلاثة إلى خمسة أيام بعد أن وصلت الفئران.
- في يوم التطعيم، يحلق في الجناح حيث سيتم الحقن (راجع الخطوة 2.3.6).
-
إعداد حقن خلية ورم
ملاحظة: الاحتفاظ بتعليق خلية المصفوفة المثلج الغشاء العقيم طوال فترة الإجراءات.- مزيج الخلايا ورسم بعناية بتعليق خلية في محقن 1 مل مزودة بإبرة ز 21.
- تحقق للتأكد من أنه لا يوجد أي فقاعات الهواء في المحاقن.
- تطهير منطقة التطعيم للماوس مع حلاً مطهر.
- الضغط بلطف الجلد الماوس في الجناح بين الأصابع، في موقع الحقن.
- أدخل الإبرة بالضبط في حظيرة الجلد. لا تضع الإبرة عميقا في الأنسجة التأكد من حقن تحت الجلد.
- حقن 100 ميليلتر من تعليق خلية IMR5 (أي2.5 × 106 خلايا) تحت الجلد في الجناح الأيسر السفلي من الفئران.
- تدوير حقنه لمنع التسرب وسحب الإبرة.
-
رصد التغيرات في وزن الجسم ونمو الورم
- قياس الطول (A) والعرض (ب) للورم مع قدمه ذات الورنيّة.
- حساب حجم الورم باستخدام الصيغة (أ س ب2) × 0.5.
- بدء العلاج عندما وصلت الأورام بحجم متوسط ~ 50-60 مم3.
3-المخدرات وإدارة الأجسام المضادة في الفئران
-
الإدارة عن طريق الحقن الوريدي في ماب 8B6
- ملء حقنه 1 مل مزودة بإبرة ز 25 مع الحل ماب بعناية.
- ضع الماوس تحت مصباح حرارة لمدة 10 دقيقة تمدد الوريد الذيل.
- كبح جماح الماوس في ريستراينير القوارض.
- تطهير منطقة التطعيم للماوس مع حلاً مطهر.
- أدخل الإبرة موازية الوريد الذيل، اختراق 2-4 ملم في التجويف مع الحفاظ على المجسم مشطوف الحواف إبرة الوجه الأعلى (الشكل 3A).
- حقن 100 ميليلتر من جسم الحل عن طريق الوريد (رابعا).
- عند الانتهاء من الحقن الضغط بلطف موقع الحقن منع النزيف.
-
داخل الإدارة من توبوتيكان
- رسم الحل المخدرات في حقنه 1 مل مزودة بإبرة 25 جرام.
- أمسك الماوس في موقف ضعيف، مع نهايته مؤخرة مرتفعة قليلاً.
- تطهير منطقة التطعيم للماوس مع حلاً مطهر.
- تحديد موقع البطن خط الوسط الماوس وعقلياً تقسيم البطن الأرباع. تحديد موقع الحقن في الربع العلوي الأيمن أو الأيسر (الشكل 3B).
- أدخل الإبرة في البطن (عمق 5 مم) في زاوية ~ 10°، في الربع العلوي الأيمن أو الأيسر.
- حقن 100 ميليلتر من حل المخدرات إينترابيريتونيلي (القائمة).
- تطهير الموقع التطعيم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
الممثل النتائج والأرقام التي يتم تكييفها مع إذن من الأعمال المنشورة في وقت سابق14.
تآزر يعزز مكافحة OAcGD2 ماب 8B6 "الآثار المثبطة توبوتيكان نيوروبلاستوما الخلية خط" النمو:
لإنشاء المخدرات وتركيزات الأجسام المضادة التي ستستخدم لتقييم التآزر بين 8B6 توبوتيكان، والإنسان والمحيط الحيوي، والمخدرات وحساسيات جسم البشرية IMR5 نيوروبلاستوما الخلايا وقيست أولاً، استخدام فحص MTT. وأسفر التعرض إلى ماب 8B6 أو توبوتيكان وحدها إلى ح 72 تثبيط تعتمد على التركيز بقاء الخلية IMR5 (الشكل 4 أ). منحنيات الاستجابة للجرعة يسمح حساب اد قيم50 لكل مجمع. وتحقيقا لهذه الغاية، حسبت قيم كرة القدم باستخدام برامج المحاكاة في التحليل. وجد أن 10 من شمال البحر الأبيض المتوسط ± 1 توبوتيكان (الشكل 4 باء) و ± 18 ميكروغرام/مل 3 للإنسان والمحيط الحيوي 8B6 اد50 القيم المحسوبة (البيانات لا تظهر).
استناداً إلى هذه القيم50 اد، بعد ذلك، فاعلية اكويبوتينت التوافيقيه ستة نسب 8B6 ماب وتوبوتيكان اختبار (الشكل 2). تحول المنحنى الجمع بين الجرعة والاستجابة تجاه الجانب الحساس من الرسم البياني يشير إلى أن نظام الجمع بين أكثر فعالية من كل الأحادي (الشكل 4 أ). للحصول على المقابلة اد50 وقيم CI، حسبت قيم كرة القدم. قيم50 اد توبوتيكان كانت أقل بكثير حضور 8B6 ماب (ف < 0.05، الشكل 4B)، مما يشير إلى أن ماب 8B6 محسس خلية الورم إلى توبوتيكان. الأهم من ذلك، قيم CI كانت إلى حد كبير أقل من 1.0 (ف < 0.05)، مما يدل على وجود تفاعل تآزري (الشكل 5). وهكذا، 8B6 ماب كامنة كعامل أخرى الأعشاب علاجية للعلاج الكيميائي توبوتيكان.
ماب OAcGD2 مكافحة 8B6 "يعزز انتيتومور النشاط من توبوتيكان" في فيفو
لأن نماذج في المختبر ولا تأخذ في الاعتبار نصف المخدرات لا استقلاب المخدرات، من الضروري أن تثبت في المختبر نتائج فيفو. وعلاوة على ذلك، في فيفو نماذج مفيدة جداً لتقييم سلامة نظام مجموعة. لتأكيد أن التآزر بين 8B6 توبوتيكان ومآب محددة للخلايا السرطانية، قيمت آثار العلاج المركب في نموذج إكسينوجرافت ورم أنتينيوروبلاستوما. ولهذا الغرض، تم تحديد الضغط الماوس العوز الشديد في مجموعة موردي المواد النووية. هذه الفئران تفتقر الفطرية والجهاز المناعي التكيفي15، وذلك، تجعل من الممكن للباحثين لاستبعاد أي آثار إيمونومودولاتوري الناجمة عن العلاج توبوتيكان التي يمكن أن تؤثر على فاعلية الإنسان والمحيط الحيوي. وقد بدأ العلاج مجرد الأورام عرض وحدة تخزين يعني 50 ± 2.5 ملم3 (الشكل 6A). العلاجات وتألفت من أما 8B6 ماب (150 ميكروغرام رابعا، يوم 7 ويوم 11)، توبوتيكان (القائمة 0.36 مغ/كغ، أيام 7-11)، أو مزيج من 8B6 الإنسان والمحيط الحيوي وتوبوتيكان. وتم رصد حجم الورم خلال فترة التجربة. كل العلاجات التي أدت إلى تأخر نمو الورم بالمقارنة مع مجموعات التحكم (الشكل 6A). ومع ذلك، فعل نظام الجمع، تأثير أقوى (الشكل 6A).
يمكن تحليل نمو الورم كذلك دراسة معدل البقاء على قيد الحياة بعد العلاج. وتحقيقا لهذه الغاية، عرف هذا الحدث أسفر عن القتل الرحيم الماوس كحجم الورم ≥ 1 سم3 لأسباب أخلاقية. هذا يسمح لنا بإجراء تحليل كابلان-ماير للبقاء على قيد الحياة وحساب الوقت متوسط بقاء الحدث مجاناً لكل مجموعة تجريبية. كما هو موضح في الشكل 6B، كلا علاجاتها الأحادية تحسن البقاء خالية من الحدث (EFS) كثيرا بالمقارنة مع مجموعات التحكم (الوسيط EFS فريق المعالجة بالسيارة كان 21 يوما؛ مراقبة جسم الفريق، 22 يوما؛ ومجموعة توبوتيكان، 26 يوما ; ماب 8B6 الفريق، أيام 29 [الشكل 6B]). حتى الآن، كان العلاج مجتمعة أثر أقوى على بقاء الفئران، بمتوسط قدرة EFS تمتد إلى أيام 39.5 (ف < 0.05، 8B6 ماب مقابل تركيبة؛ ف < 0.01، توبوتيكان مقابل تركيبة [الشكل 6B]).
لأنه يمكن أن ينتج عن تفاعلات تآزرية زيادة السمية، سلامة نظام تركيبة يحتاج إلى تقييم. على هذا النحو، ويشيع استخدام فقدان الوزن كعلامة حساسة لرصد الصحة في القوارض16. وهكذا، وزن خسارة-تقاس كانخفاض في النسبة المئوية من الوزن الأولى-أبقى كمؤشر على قابلية التحمل المنهجي لكل نظام اختبار. ولوحظ عدم فقدان وزن الجسم، مما يوحي بأن العلاج كان جيدا التسامح (الشكل 7). تشير هذه البيانات إلى أن الجمع بين 8B6 توبوتيكان بالإضافة إلى ماب يمثل أقوى فعالية انتيتومور في فيفو من أما وكيل وحدها، دون السمية لا يمكن اكتشافها.
الشكل 1 : التمثيل التخطيطي للدراسة- الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 2 : تخطيط التجربة تركيبة على لوحة 96-جيدا مع نسب 8B6 توبوتيكان إلى ماب، أعد كحلول ستة. وتم إعداد الحلول كما هو موضح في البروتوكول. الآبار المسمى 1 إلى 4 بمثابة ماب 8B6 الحلول والآبار المسمى 5 إلى 8 بمثابة حلول توبوتيكان والآبار المسمى 9 إلى 12 بمثابة 8B6 ماب وتوبوتيكان (تركيبة) الحلول. الآبار التي وصفت خدمة A و H الضوابط؛ الآبار المسمى ب بمثابة 0.125 س اد50 تركيز المخدرات الحلول؛ الآبار المسمى ج بمثابة 0.25 س اد50 تركيز المخدرات الحلول؛ الآبار المسمى د بمثابة 0.5 س اد50 تركيز المخدرات الحلول؛ الآبار المسماة تخدم ه كاد50 تركيز المخدرات الحلول؛ بمثابة الآبار المسمى و 2 س اد50 تركيز المخدرات الحلول؛ بمثابة الآبار المسمى ز 4 س اد50 تركيز المخدرات الحلول، كما هو مبين. ويتم تحليل العوامل العلاجية مع اثنين من وحدات مختلفة (أي، ميكروغرام/مل للإنسان والمحيط الحيوي 8B6، وشمال البحر الأبيض المتوسط توبوتيكان) في تركيبة نسبة ثابتة (0.075، توبوتيكان/8B6). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3 : حقن. (أ) الحقن الوريد ذيل ماوس مقيدة، باستخدام حقنه الأنسولين من 27 x 1/2 في 1 مل. (ب) الحقن داخل إلى الربع العلوي الأيمن من البطن للماوس واستخدام المحاقن 1 مل مزودة بإبرة 25 جرام. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4 : العلاقة بين الجرعة والنتيجة توبوتيكان، 8B6 الإنسان والمحيط الحيوي، والجمع بينهما في إعاقة استمرارية النمو IMR5 نيوروبلاستوما الخلايا بعد 72 ساعة من التعرض- وأجرى فحص MTT كما هو موضح في البروتوكول. (A) الاستجابة للجرعة منحنيات سيظهر ممثل replicates المستقلة الثلاثة، كل تشغيل في كوادروبليكاتيس. وترد البيانات ± تعني التنمية المستدامة؛ ف < 0.001. (ب) اد50 من توبوتيكان المستخدمة كعامل واحد أو في تركيبة مع 8B6 الإنسان والمحيط الحيوي. وترد البيانات ± يعني sem. وقد تم تعديل هذا الرقم من فرج et al. 14- الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 5 : قيم الفهرس تركيبة. نسبة بقاء القيم تم تحويلها إلى قيم (اتحاد كرة القدم) المتأثرة بكسر والمستخدمة لحساب مؤشر تركيبة (قدر من التآزر، والجمع، والعداء) باستخدام برامج الكمبيوتر، كما ورد في النص. تعرض البيانات في قطع مؤشر تركيبة، كما يعني ± التنمية المستدامة لثلاثة replicates المستقلة. وتبين النتائج أن 8B6 ماب أثر تآزري مع توبوتيكان (CI < 1). وقد تم تعديل هذا الرقم من فرج et al. 14- الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الرقم 6 : الجمع بين العلاج لتكثيفها IMR5 في الفئران مجموعة موردي المواد النووية مع 8B6 الإنسان والمحيط الحيوي بالإضافة إلى توبوتيكان. الفئران (A) إذ تضع البشرية نيوروبلاستوما IMR5 يعاملون تكثيفها مع مركبة (برنامج تلفزيوني، والقائمة)، توبوتيكان وحدة (0.36 مغ/كغ، والقائمة)، مراقبة مفتش وحدها (150 ميكروغرام، رابعا)، ماب 8B6 وحدها (رابعا)، أو 8B6 توبوتيكان ومآب جنبا إلى جنب، كما هو مبين. إدارة ماب 8B6 أو مراقبة علاج جسم بدأت في يوم 7 بعد تلقيح الخلية IMR5 وتكررت مرة واحدة في اليوم 11. توبوتيكان أو برنامج تلفزيوني العلاج قد بدأت في يوم 7 ونظرا لمدة خمسة أيام متتالية. تم رصد نمو الورم، وحسبت حجم الورم. ± حجم الورم يعني SEM كل مجموعة العلاج (فريق برنامج تلفزيوني، الفئران 9؛ وجميع الفئات الأخرى، الفئران 10) يصور (* ف < 0.05 ماب 8B6 ضد 8B6 ماب وتوبوتيكان معا، * * ف < 0.01 توبوتيكان ضد 8B6 ماب وتوبوتيكان معا)، كما وأشارت إلى. ولوحظ انخفاض كبير في حجم إكسينوجرافت ماب 8B6/توبوتيكان تركيبة، مقارنة مع الضوابط المخدرات وحدها، كما هو مبين (ف < 0.05). (ب) خالية من الحدث تظهر منحنيات البقاء على قيد الحياة كابلان-ماير من مجموعات مختلفة تعالج. وقد تم تعديل هذا الرقم من فرج et al. 14- الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 7 : يعني الوزن بالنسبة لكل مجموعة العلاج، كما هو مبين. متوسط وزن الفئران في اليوم 0 عرف أنه الوزن 100%. الوزن في كل مجموعة ظلت مستقرة للفترة العلاج. وترد البيانات ± يعني sem. وقد تم تعديل هذا الرقم من فرج et al. 14- الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
للتنبؤ بتأثير التفاعلات المخدرات، يمكن استخدام ثلاثة أساليب: منهجية إيسوبولوجرام17و نموذج الخليط غير الخطية18والتركيبة فهرس1. تحليل مؤشر تركيبة هو الأكثر استخداماً لأن تطبيقه هو تبسيط بتوافر برنامج كمبيوتر سهلة الاستعمال. لهذا الغرض، نحن أولاً تتسم الاستجابة تأثير الجرعة لكل عامل تستخدم منفردة أو مجتمعة، بالقيام فحص MTT19. تعتمد هذه المنهجية على قدرة خلايا قابلة للتطبيق لتقليل الملح tetrazolium في منتج formazan الأرجواني الملون حد أقصى امتصاص 570 نانومتر19. في الموت، تفقد الخلايا القدرة على تحويل MTT formazan. وهكذا، كمية المنتج formazan الملونة يتناسب مع العدد الخلايا قادرة على البقاء في الثقافة19. وفي الواقع، اخترنا هذه المنهجية كبديل نونراديواكتيفي لإدماج thymidine تريتياتيد في الحمض النووي لقياس انتشار الخليوي19. على هذا النحو، فحوصات MTT قد اعتمدت على نطاق واسع وما زالت شعبية في مختبرات الأكاديمية كما يدل على ذلك آلاف مقالات المنشورة. بينما يتم قياس كمية فورمازان عن طريق تسجيل امتصاص في 570 نانومتر باستخدام جهاز المطياف الضوئي لوحة القراءة موجه إشارة من 620 نانومتر في بعض الأحيان استخدامها ولكن ليس ضروريا لمعظم شروط المقايسة. نظراً لأن الخطوة الحاسمة الموصوفة هنا، وجدنا أن أحوال الثقافة المستخدمة لزراعة الخلايا يمكن أن تؤثر على نتائج فحوصات MTT. ووجدنا أن عدد الخلايا قابلة للحياة والنشاط الأيضي في الخلية، وعصر الثقافات وعدد الممرات، وتفاصيل عن متوسط النمو كل ما يمكن من العوامل الهامة. وهكذا، أنها يجب أن تؤخذ في الاعتبار عند تكرار المقايسة وتحليل البيانات. وعلاوة على ذلك، تختلف ظروف الثقافة خلية لكل خطوط الخلايا. وهكذا، أنها معقدة لتقديم أي دلائل حول الخلية البذر كثافة واضحة. وكقاعدة عامة، ينصح عدد متوسط من الخلايا بين الخلايا 2,000-10,000 الواحدة وكذلك لتحقيق بكثافة خلية مثلى داخل 72 h. الأهم من ذلك، خفض MTT يعكس استقلاب الخلية قادرة على البقاء وليس، على وجه التحديد، خلية انتشار أو خلية الموت. ولذلك، لا يمكن وصف فحوصات MTT كقياس الخلية الانتشار ولا خلية سيتوتوكسيسيتي20،11. الكشف عن موت الخلية يعتمد على فحوصات معينة يستند إلى الخلية. على سبيل المثال، في دراسات سابقة، استخدمنا تحليل لطخة غربية للكشف عن تفعيل caspase 3 و/أو التدفق الخلوي التحليل للكشف عن فوسفاتيديلسيريني في النشرة البلازما الغشاء الخارجي، أدلة على نشاط بروابوبتوتيك ماب 8B613.
عند الجمع بين اختبار المخدرات، هم يمكن أن يسلموا معا أو تباعا في الوقت المناسب. وبالنظر إلى تنوع إليه العمل، من الصعب توفير مبادئ توجيهية دقيقة للإعداد التجريبية ذات الصلة. حتى الآن، تستخدم معظم المحققين الاختبار مباشرة من تركيبات العقاقير. وباﻹضافة إلى ذلك، يشيع استخدام التركيزات التي ينتج عنها أثر عامل واحد محدد لتثبيط نمو الخلايا 50%. تركيزات المخدرات يعكس تركيزات البلازما يمكن تحقيقها في المرضى عموما تعتبر ذات الصلة سريرياً. على هذا النحو، يتم تحليل تأثير الجرعة تركيبة لعدة جرعات، إبقاء نسبة تركيبة ثابتة مع إضعاف مسلسل (ED50)ماب/نسبةالمخدرات (ED50)، على الرغم من أنها ليست شرط مطلق 1-المذكرة، قيم CI ينبغي أيضا حساب في مختلف اد اختبار (مثلاً، اد50واد75، واد90) نظراً لأنها قد تغير مع اتحاد كرة القدم في طريقة غير خطية1. بعد إجراء التحليل الآلي لقيم CI، معامل الارتباط الخطي r-يجب أن تكون القيمة المقدرة من الخوارزميات > 0.9، تعكس الخير ملاءمة البيانات التجريبية. قيم CI < 1 تشير إلى التآزر وقيم CI = 1 تشير إلى الجمع، وقيم CI > 1 الدلالة العداء1. نظراً للتغير في أساليب تجريبية والنظام البيولوجي، ينبغي إخضاع CI محسوب كذلك لدراسة إحصائية. على هذا النحو، طريقة بسيطة لتكرار التجربة تركيبة المخدرات عدة مرات متبوعاً بحساب القيم CI الناتجة قبل تحديد إحصائيات يعني ± SD1. كما ينصح باختبار التركيبة في لوحة ممكن أكبر من خطوط الخلايا، أن تأخذ في الاعتبار التباين القائم بينهما.
الأهم من ذلك، العديد من المعلمات في الدراسة في المختبر لا تؤخذ في الاعتبار للاستقراء في فيفو . على سبيل المثال، في المختبر صلاحية فحوصات لا تأخذ في الاعتبار في فيفو نصف عمر الدواء، ولا في فيفو المخدرات الأيض التي قد تسفر عن المخدرات المنظمة. وهكذا، الاستقراء من المختبر في فيفو تظل مسألة منفصلة، وتفاعل يدل على المخدرات مفيداً في المختبر ينبغي زيادة مؤكدة في فيفو. على هذا النحو، كانت تعبيراً واضحا عن التآزر في الفئران مع تكثيفها الورم، استخدام أسلوب المؤشر المختلط، منشورة21. حتى الآن، في فيفو الدراسات تتطلب عدد كبير من الحيوانات دقة تحديد أوجه التآزر وهي أكثر تكلفة وأكثر استهلاكاً للوقت. نموذج فعال البديلة واﻻختبار لا يزال يتطلب موارد كبيرة22. كما يتكون نهج مختلفة للحد من استخدام عدد كبير من الحيوانات في إظهار التآزر المخدرات في نماذج الثقافة الخلية متبوعاً بالأدلة لاستجابة انتيتومور زيادة في مزيج في دراسة محدودة xenograft14، قمنا باستخدام الخلايا البشرية نيوروبلاستوما IMR5 كهدف استئصال ورم للدراسة في فيفو . علينا الاحتفاظ بالخلايا IMR5 لأنهم الورمية في الفئران المناعة23. في حين توفر نماذج xenograft الأورام البشرية نماذج قيمة لاختبار المخدرات تركيبات في فيفو24، يمكن أن تكون صعبة إنشاء مثل هذه النماذج من مجموعة متنوعة من خطوط الخلية25. إلى زيادة حالات الإصابة بتشكيل الأورام في الفئران، الخلايا يمكن أن حقن الفئران بمصفوفة الطابق السفلي غشاء كمركبات25. الأهم من ذلك، منذ مصفوفة الطابق السفلي غشاء بوليميريزيس ويتصلب في درجات حرارة أعلى 5 درجة مئوية، ينبغي أن تكون جميع كولتوريواري أو وسائل الإعلام تأتي على اتصال بالمصفوفة الطابق السفلي غشاء بريتشيليد والجليد-باردة، وينبغي أن تظل الحلول الطابق السفلي غشاء الجليد خلال العملية بكاملها25. باستخدام مصفوفة الطابق السفلي غشاء، لاحظنا بمعدل 100% تأخذ مع الخلايا IMR5، بينما، في غياب الغشاء الطابق السفلي مصفوفة، أثبت هذا الخط خلية < تأخذ 80% معدل (البيانات لا تظهر). وبالإضافة إلى ذلك، زيادة حالات الإصابة بورم الفساد، غشاء الطابق السفلي مصفوفة يمكن أيضا زيادة معدل نمو الورم25. ولاحظنا أن جميع تكثيفها قد ظهرت قبل يوم 11. ومع ذلك، خلال الأيام السبعة الأولى التالية لتحدي خلية الورم، وجود كتل يمكن ملاحظة، الذي قد يكون بسبب وجود العدوى الأولية (البيانات لا تظهر). وهكذا، نحن لا تعتبر قياسات لحجم الورم ذات مغزى قبل هذا الوقت. استخدام مصفوفة الطابق السفلي غشاء جعلت من الممكن الحد من عدد الفئران في الإعداد التجريبية، والقيام بالتجربة في فيفو في غضون ثلاثة أشهر.
قد تختلف جرعات المخدرات/جسم اعتماداً على سلالة الماوس وخط الخلية. بسبب الحد فحص السلامة في المختبر لاستقراء في فيفو المخدرات/جسم الجرعة الموصوفة أعلاه، أبقى على الجرعات ذات الصلة سريرياً ل 8B6 توبوتيكان ومآب في فيفو الإعداد التجريبية، استناداً إلى البيانات الصادرة عن الآخرين26،27. لاستقراء وضع الجرعة البشرية للفئران، اتبعت المبادئ التوجيهية المنشورة سابقا28 . في حد ذاتها، ونحن حقن 150 ميكروغرام من جسم 8B6 الرابع في يوم 7، متبوعاً حقنه ثانية بعد خمسة أيام (مجموع الجرعات/الفأر = 300 ميكروغرام). بدأ العلاج توبوتيكان في اليوم نفسه كحقن 8B6 ماب الأول عن طريق حقن توبوتيكان 0.36 مغ/كغ أو القائمة عنصر التحكم في برنامج تلفزيوني لمدة خمسة أيام متتالية. نظراً لأن الخطوة الحاسمة الموصوفة هنا، نوصي ببدء ضخ جسم عندما تصل إلى تكثيفها الورم ~ 50 ملم3. سيؤدي إلى زيادة حجم إكسينوجرافت الورم في انخفاض معدل استجابة نظراً لأعباء الورم وضوح ترتبط عكسيا مع تركيز الأجسام المضادة، والتعرض لجسم وجسم نجاعة29. نحن أيضا الإبقاء على الوزن كمؤشر على قابلية التحمل المنهجي لكل نظام اختبار16. غير أن تفسير الأوزان التي تم جمعها قد لا تكون مفيدة مع وجود ورم كبير الكتلة. وفي هذه الحالة، هيئة شرط التسجيل, كما هو موضح في مكان آخر من16، ينصح.
ويمكن جمع الأورام عند نقاط زمنية مختلفة لتحليل immunochemistry، لتوفير زيادة المعلومات عن الآلية عمل آثار فيفو. في عمل سابق، تم تقييم مؤشر apoptotic الورم بعد ماب 8B6 ضخ13. وتحقيقا لهذه الغاية، تم الكشف عن الخلايا السرطانية apoptotic استخدام الإنزيم TUNEL13. وباﻹضافة إلى ذلك، سجلت النسبة المئوية لنواة خلية الورم مع تلطيخ إيجابية مستضد Ki67 لتحليل مؤشر انتشار الورم13.
الفئران العوز الشديد عدم الحصانة الفطرية، والتكيف مع فقدان خلايا T وخلايا ب وخلايا (ناغورني كاراباخ) القاتل الطبيعية مع انخفاض بلعم وعرض مستضد وظائف الخلية وعدم وجود تعميم تكملة30. وهكذا، لا يسمح هذا البروتوكول الباحثين لاستخلاص أي استنتاجات بشأن الآثار المفترضة للعلاج الكيميائي في قد ماب العلاج عن طريق تغيير المكروية ورم في فيفو31. لكن كلا من آثار immunomodulatory المفترضة من عامل العلاج الكيميائي ودور المنطقة (Fc) fragment للتبلر الإنسان والمحيط الحيوي في تعزيز فاعلية انتيتومور المخدرات جديرة بالنظر، ولكن هذه المسائل تتطلب التوافر سينجينيك النموذجي مع نظام المناعة سليمة وفسيولوجيه وورم المكروية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
S.Fa. و J.F. ونشره بوصفها المخترعين من انتظار براءات الاختراع تغطي التطبيق السريري للأجسام المضادة-O-أسيتيل-GD2 العلاجية.
Acknowledgments
منح الدعم: مؤسسة de Projet de L 'جامعة نانت، ليه باجوز' à مانون، الدوري الفرنسي ضد السرطان اللجنة دي لوار-أتلانتيك، لجنة موربيهان دو، ولجنة دي فونديه، une ارتفع من أجل S.A.R.A.H ومارتن دي توال ولوس أنجليس الفرنسية Société de Lutte مكافحة ليه سرطانات et les leucémies الطفل et de شرور (سفسي). M.B. و J.F. معتمدة من قبل الرابطة La مكافحة السرطان. يشكر المؤلفون يوت-مرفق بونامي فرانسوا هيكل Fédérative البحوث. كما يشكر المؤلفون سوزين س. د. (Inserm، باريس) لتزويد الخلايا IMR5 والسيدة H. Estéphan لتقديم المساعدة التقنية لها.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell Proliferation kit (MTT) | Roche | 11-465-007-001 | |
| CompuSyn software | ComboSyn | Combosyn can be downloaded for free at http://www.combosyn.com | |
| Electric shaver | Bioseb | BIO-1556 | |
| Fetal calf serum | Eurobio | CVFSVFF00-01 | 10% heat-inactivated fetal calf serum in RPMI 1640 |
| Firefox | Mozilla Corporation | Firefox can be downloaded for free at http://www.mozilla.org/en-US/firefox/ | |
| Heat lamp | Verre&Quartz | 4003/1R | |
| Human neuroblastoma IMR-5 cell line | Accegen Biotechnology | ABC-TC0450 | IMR-5 is a clone of the human neuroblastoma cell line IMR32 5459762. IMR-5 cells were generously provided by Dr. Santos Susin (U.872, Paris, France) |
| L-glutamine | Gibco | 25030-024 | 2 mM in RPMI 1640 |
| Lysis solution | Roche | 11-465-007-001 | |
| mAb 8B6 | University of Nantes | N/A | |
| Matrigel | Corning | 354248 | |
| Multiskan FC | Thermofischer Scientific | N08625 | |
| Needle 21G 1 ½ | BD Microlance | 304432 | |
| Needle 25G 1 | Terumo | NN-2525R | |
| NSG mice | Charles River Laboratories | 5557 | |
| Nunc MicroWell 96-well microplates | Thermofisher | 167008 | |
| PBS | VWR | L182-10 | |
| PBS, 0,05% EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | |
| PC that runs windows 7 | Microsoft | Windows 7 can be purchased at http://www.microsoft.com/en-gb/software-download/windows7 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | 100 units/mL penicillin and 100 mg/mL streptomycin in RPMI 1640 |
| Reagent reservoir | Thermofischer Scientific | 8094 | |
| Rodent restrainer | Bioseb | TV-150-SM | |
| RPMI 1640 | Gibco | 31870-025 | |
| Syringe 1 mL | Henke Sass Wolf | 5010.200V0 | |
| Topotecan | Sigma-Aldrich | T2705 |
References
- Chou, T. C. Theoretical basis, experimental design, and computerized simulation of synergism and antagonism in drug combination studies. Pharmacological Reviews. 58 (3), 621-681 (2006).
- Bayat Mokhtari, R., et al.
- Zahreddine, H., Borden, K. L. Mechanisms and insights into drug resistance in cancer. Frontiers in Pharmacology. 4, 28 (2013).
- Martin, T. P., Baguley, D., et al. Re: "Postoperative validation of bone-anchored implants in the single-sided deafness population." Snapp et al. Otol Neurotol 2012: 33;291-6. Otol Neurotol. 34 (4), 777-778 (2013).
- Choi, B., et al. Sensitization of lung cancer cells by altered dimerization of HSP27. Oncotarget. 8 (62), 105372-105382 (2017).
- Weiner, L. M., Surana, R., Wang, S. Monoclonal antibodies: versatile platforms for cancer immunotherapy. Nature Reviews Immunology. 10 (5), 317-327 (2010).
- Mellor, J. D., Brown, M. P., Irving, H. R., Zalcberg, J. R., Dobrovic, A. A critical review of the role of Fc gamma receptor polymorphisms in the response to monoclonal antibodies in cancer. Journal of Hematology & Oncology. 6, 1 (2013).
- Kowalczyk, A., et al. The GD2-specific 14G2a monoclonal antibody induces apoptosis and enhances cytotoxicity of chemotherapeutic drugs in IMR-32 human neuroblastoma cells. Cancer Letters. 281 (2), 171-182 (2009).
- Retter, M. W., et al. Characterization of a proapoptotic antiganglioside GM2 monoclonal antibody and evaluation of its therapeutic effect on melanoma and small cell lung carcinoma xenografts. Cancer Research. 65 (14), 6425-6434 (2005).
- Nakamura, K., et al. Apoptosis induction of human lung cancer cell line in multicellular heterospheroids with humanized antiganglioside GM2 monoclonal antibody. Cancer Research. 59 (20), 5323-5330 (1999).
- Cochonneau, D., et al. Cell cycle arrest and apoptosis induced by O-acetyl-GD2-specific monoclonal antibody 8B6 inhibits tumor growth in vitro and in vivo. Cancer Letters. 333 (2), 194-204 (2013).
- Chou, T. C., Martin, N. CompuSyn for drug combinations: PC software and user’s guide: a computer program for quantitation of synergism and antagonism in drug combinations, and the determination of IC50 and ED50 and LD50 values. , ComboSyn Inc. Paramus, NJ. (2005).
- Alvarez-Rueda, N., et al. A monoclonal antibody to O-acetyl-GD2 ganglioside and not to GD2 shows potent anti-tumor activity without peripheral nervous system cross-reactivity. PLoS One. 6 (9), e25220 (2011).
- Faraj, S., et al. Neuroblastoma chemotherapy can be augmented by immunotargeting O-acetyl-GD2 tumor-associated ganglioside. Oncoimmunology. 7 (1), e1373232 (2017).
- Ishikawa, F., et al. Development of functional human blood and immune systems in NOD/SCID/IL2 receptor {gamma} chain(null) mice. Blood. 106 (5), 1565-1573 (2005).
- Ullman-Cullere, M. H., Foltz, C. J. Body condition scoring: a rapid and accurate method for assessing health status in mice. Laboratory Animal Science. 49 (3), 319-323 (1999).
- Teicher, B. A. Assays for in vitro and in vivo synergy. Methods in Molecular Medicine. 85, 297-321 (2003).
- White, D. B., Slocum, H. K., Brun, Y., Wrzosek, C., Greco, W. R. A new nonlinear mixture response surface paradigm for the study of synergism: a three drug example. Current Drug Metabolism. 4 (5), 399-409 (2003).
- Mosmann, T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays. Journal of Immunological Methods. 65 (1-2), 55-63 (1983).
- Huyck, L., Ampe, C., Van Troys, M. The XTT cell proliferation assay applied to cell layers embedded in three-dimensional matrix. Assay and Drug Development Technologies. 10 (4), 382-392 (2012).
- Thompson, J., et al. Synergy of topotecan in combination with vincristine for treatment of pediatric solid tumor xenografts. Clinical Cancer Research. 5 (11), 3617-3631 (1999).
- Tan, M., Fang, H. B., Tian, G. L., Houghton, P. J. Experimental design and sample size determination for testing synergism in drug combination studies based on uniform measures. Statistic in Medicine. 22 (13), 2091-2100 (2003).
- Tang, X. X., et al. Implications of EPHB6, EFNB2, and EFNB3 expressions in human neuroblastoma. Proceding of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (20), 10936-10941 (2000).
- Mehta, R. R., Graves, J. M., Hart, G. D., Shilkaitis, A., Das Gupta, T. K. Growth and metastasis of human breast carcinomas with Matrigel in athymic mice. Breast Cancer Research and Treatment. 25 (1), 65-71 (1993).
- Mullen, P., Ritchie, A., Langdon, S. P., Miller, W. R. Effect of Matrigel on the tumorigenicity of human breast and ovarian carcinoma cell lines. International Journal of Cancer. 67 (6), 816-820 (1996).
- Feng, C., Tang, S., Wang, J., Liu, Y., Yang, G. Topotecan plus cyclophosphamide as maintenance chemotherapy for children with high-risk neuroblastoma in complete remission: short-term curative effects and toxicity. Nan Fang Yi Ke Da Xue Xue Bao. 33 (8), 1107-1110 (2013).
- Cheung, N. K., et al. Ganglioside GD2 specific monoclonal antibody 3F8: a phase I study in patients with neuroblastoma and malignant melanoma. Journal of Clininical Oncology. 5 (9), 1430-1440 (1987).
- Nair, A. B., Jacob, S. A simple practice guide for dose conversion between animals and human. Journal of Basic Clinical Pharmacy. 7 (2), 27-31 (2016).
- Dayde, D., et al. Tumor burden influences exposure and response to rituximab: pharmacokinetic-pharmacodynamic modeling using a syngeneic bioluminescent murine model expressing human CD20. Blood. 113 (16), 3765-3772 (2009).
- Racki, W. J., et al. NOD-scid IL2rgamma(null) mouse model of human skin transplantation and allograft rejection. Transplantation. 89 (5), 527-536 (2010).
- Sherif, A., Winerdal, M., Winqvist, O. Immune Responses to Neoadjuvant Chemotherapy in Muscle Invasive Bladder Cancer. Bladder Cancer. 4 (1), 1-7 (2018).
