Summary
تقديرات كامله عدد neفرون الكلي هي مهمة سريريا وتجريبيا, كما ان هناك علاقة عكسية بين عدد النيفرون وزيادة خطر الاصابه بامراض الكلي والقلب والاوعيه الدموية. هنا ، يتم التدليل علي استخدام طريقه النقع الحمضية ، والتي توفر تقديرات سريعة وموثوقه للعدد الكلي من النيفرون.
Abstract
[نفرون] يشير هبه إلى الرقم إجماليه [نيفرون] [بورن] فرده مع, بما ان [كليجنسيس] في أناس يكون أتمت ب 36 أسابيع الحمل وما من [نيوفرون] جديده يكون شكلت [بوست-بيرث]. يشير عدد النيفرون إلى العدد الإجمالي للنيفرون المقيسة في اي وقت بعد الولادة. وتؤثر كل من العوامل الوراثية والبيئية علي كل من الوقف والعدد. فهم كيف الجينات أو العوامل محدده تؤثر علي عمليه نشاه الكلي وفقدان neفرون أو زوال أمر مهم كافراد مع انخفاض الهبات neفرون أو عدد يعتقد ان تكون في خطر اعلي من تطوير امراض الكلي أو القلب والاوعيه الدموية. سيكون فهم كيفيه تاثير التعرض البيئي علي مدي حياه الشخص علي عدد النيفرون أيضا أمرا حيويا في تحديد مخاطر المرض في المستقبل. التالي ، فان القدرة علي تقييم الكلي كامل neفرون عدد بسرعة وبشكل موثوق هو شرط التجريبية الاساسيه لفهم أفضل أليات التي تسهم في أو تعزيز نشاه الكلي أو فقدان neفرون. هنا ، ونحن وصف طريقه النقع الحمضية لتقدير الكلي كامل عدد neفرون علي أساس الاجراء الموصوف من قبل Damadian ، الشوايري ، و Bricker ، مع تعديلات طفيفه. طريقه النقع حمض يوفر تقديرات سريعة وموثوق بها من عدد نيفرون (كما تقييمها من قبل العد الكبيبات) التي هي في حدود 5 ٪ من تلك التي حددت باستخدام أكثر تقدما ، وان كانت مكلفه ، وأساليب مثل التصوير بالرنين المغناطيسي. وعلاوة علي ذلك ، فان طريقه النقع الحمضية هي طريقه ممتازة عاليه الانتاجيه لتقييم عدد النيفرون في اعداد كبيره من العينات أو الظروف التجريبية.
Introduction
ال [نفرون] علي حد سواء الاساسيه انشائيه والوحدة وظيفية من الكلية1. هيكليا ، يتكون النيفرون من الكبيبه (الشعيرات الدموية و podocytes) الموجودة داخل كبسوله بومان والبولية الكلوية ، التي تتكون من الأنابيب القريبة ، حلقه Henle ، والبولي البعيد الذي ينتهي في قناه جمع. وظيفيا ، دور النيفرون هو الترشيح وأعاده امتصاص المياه والشوارد وإفراز النفايات. بشكل عام ، يكتمل تكوين الكلي في 36 أسابيع من الحمل في البشر وبعد فتره وجيزة من الولادة في عده أنواع مثل الفار والجرذ2. تشير الأوقاف إلى العدد الإجمالي للنيفرون الذي يولده الفرد ، في حين ان عدد النيفرون هو العدد الإجمالي للنيفرون الذي يقاس في اي وقت بعد الولادة3. وغالبا ما تستخدم مصطلح neفرون عدد وعدد الكبيبي بالتبادل. لان هناك واحد فقط الكبيبولوس في نيفرون ، وتقييم عدد الكبيبات هو بديل مهم لتقدير عدد النيفرون.
التقييم من [نفرون] هبه و [نفرون] رقم من فائده سريريه بما ان دراسات قد برهنوا علاقة بين [نفرون] هبه وقلل [نفرون] أرقام مع يزاد حدوث من امراض قلبي وعائي4,5 ،6،7،8،9،10،11،12،13،14، 15. استنادا إلى النتائج في الكلي في تشريح الجثة, لاحظ برينر ان الافراد ارتفاع ضغط الدم المقدمة مع عدد اقل من الإجمالي من النورموتينسيفي الافراد16. وهكذا ، افترض برينر ان هناك علاقة عكسية بين عدد نيفرون وخطر الاصابه بارتفاع ضغط الدم في وقت لاحق في الحياة. [برينر] افترض أيضا ان تخفيض في [نفرون] رقم كان عوضت ب ال [نيفرون] ان بقي. من أجل الحفاظ علي معدل الترشيح العادي في الكلي ، نفرون المتبقية تعويض عن طريق زيادة مساحة السطح الكبيبي (تضخم الكبيبي) ، التالي العمل علي تخفيف اي تاثير سلبي من فقدان neفرون علي وظيفة الكلي4 ،16.
بينما واقيه في المدى القصير ، تضخم الكبيبي ، علي المدى الطويل ، يؤدي إلى زيادة احتباس الصوديوم والسوائل ، وزيادة حجم السوائل خارج الخلية ، وزيادات في ضغط الدم الشرياني ، مما يؤدي إلى حلقه مفرغه من زيادات أخرى في الضغط الشعري الكبيبي ، فرط الترشيح الكبيبي ، وتندب النيفرون (التصلب) والاصابه4،16.
الحصول علي تقديرات أو حسابات من عدد نيفرون تقدم اثنين من المزايا التجريبية: 1) انه يوفر معلومات بشان عمليه نشاه الكلي ، والتي يمكن بعد ذلك ان تكون مرتبطة بجينات محدده أو عوامل في الجنين أو بيئة الام والجنين ، و 2) هناك جمعيه من عدد نيفرون مع امراض القلب والاوعيه الدموية ، التالي ، هناك احتمال ان يتم استخدام تقديرات عدد نيفرون للتنبؤ مخاطر القلب والاوعيه الدموية في المستقبل2،17،18، 19 , 20 , 21 , 22. بالاضافه إلى بيئة الام والجنين, العديد من الامراض تؤثر بشكل مباشر علي عدد نيفرون ووظائف الكلي, بما في ذلك تصلب الشرايين, مرض السكري, ارتفاع ضغط الدم, وحتى الشيخوخة العادية2,9, 10،11،12،22،23. التالي ، فان التقييم الكلي لعدد النيفرون الكلية مهم لفهم كل من العوامل الوراثية والبيئية التي تؤثر علي نشاه الكلي (ايالهبات النيفرون) وعدد النيفرون علي مدي حياه الشخص والآثار الناتجة علي وظيفة الكلي وصحة القلب والاوعيه الدموية.
حاليا ، هناك العديد من الطرق المتاحة لتحديد والتقدير الكمي لعدد نيفرون ، لكل منها مزاياه الخاصة والقيود24،25،26،27،28 و29و30. وتشمل الأساليب المتطورة لتحديد الكلي بأكمله عدد neفرون الطرق الفراغية ، مثل طريقه dissector/مجزا ، والتصوير بالرنين المغناطيسي25،26. في كثير من الأحيان تعتبر الذهب القياسية لتحديد كامل الكلي عدد neفرون ، وأسلوب dissector/مجزا علي حد سواء مكلفه وتستغرق وقتا طويلا. وقد وفرت التطورات الاخيره والتحسن في التصوير بالرنين المغناطيسي وتجهيز الاداات اللازمة لحساب كل neفرون كل علي حده. ومع ذلك ، التصوير بالرنين المغناطيسي ليس فقط مضيعه للوقت ولكن أيضا مكلفه للغاية. الاضافه إلى ذلك ، فان كلا من أسلوب التفكيك/التجزئة والتصوير بالرنين المغناطيسي يتطلب خبره تقنيه متقدمة ، مما يحد من استخدام هذه الأساليب في غالبيه مختبرات البحوث.
معظم طرق تحديد عدد نيفرون جعل التهم أو التقديرات علي أساس تحديد الكبيبات ، كما انها يسهل التعرف عليها هيكليا. في هذه الورقة ، يتم وصف طريقه النقع الحمضية لتقدير عدد النيفرون في الكلي كله وأظهرت27. طريقه النقع الحمضية سريعة وموثوق بها ، واقل تكلفه بكثير من الطرق الأخرى ، مثل طريقه التفكيك/التجزئة والتصوير بالرنين المغناطيسي. وعلاوة علي ذلك ، فان طريقه النقع الحمضية توفر تقديرات قابله للتكرار للغاية من عدد النيفرون التي تم الإبلاغ عنها ضمن نطاق تلك التي تم تحديدها باستخدام التصوير بالرنين المغناطيسي26.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
اللوازم والكاشفات المذكورة أدناه هي لتحديد الكلي كامل عدد neفرون في الماوس واحد ، وهذا هو ، اثنين من الكلي. يتم تحديد التعديلات لاستخدام طريقه النقع الحمضية للفئران مع العلامات النجميه. وتتفق جميع البروتوكولات التجريبية مع الدليل الوطني للمعاهد الصحية لرعاية واستخدام المختبرات الحيوانية ووافقت عليها اللجنة المؤسسية للعناية بالماشية واستخدامها في المركز الطبي لجامعه ميسيسيبي.
1. عزل الكلي الاجراء
- تزن الماوس (أو الأنواع الأخرى) وموت ببطئه مع ايزوفلواني (5 ٪-8 ٪) جرعه زائده أو بنتوباربيتال (150 مغ/كغ حقن انترابيرتينيال).
- بمجرد رحيم الماوس ، افتح تجويف البطن باستخدام مقص جراحي دقيق علي طول الخط الأوسط.
- رفع بعناية الأمعاء والدهنية الانجابيه إلى الجانب الأيمن من تجويف البطن. بالتشريح الإجمالي ، عزل الكلية اليسرى. باستخدام مقص الجراحية غرامه ، وقطع الشريان الكلوي الأيسر والوريد وأزاله بعناية الكلي اليسرى ، ووضع الكلي في المسمي بشكل مناسب (رقم الماوس/معرف) وزن القارب الذي يحتوي علي الفوسفور-مخزنه المالحة (تلفزيوني).
- كرر الاجراء الخاص بالكلية الصحيحة.
- أزاله كل الكلي من القارب وزنها الخاصة ووضعه علي الشاش الجراحية قبل مبلل مع تلفزيوني.
- ترك الكلي علي الشاش الجراحية ، وأزاله بسرعة اي الانسجه غير الكلوية الملتصقة (مثل الدهنية الكلوية أو الغدة الكظرية) تليها أزاله كبسوله الكلي. تزن كل الكلي بشكل فردي ، وتسجيل وزن الكلي الأيسر والأيمن علي حده في دفتر المختبرات.
2. التجانس ، والحضانة ، وإجهاد الإجراءات
- مره واحده يتم وزن كل الكلي ، واستنزاف كل قارب تزن من تلفزيوني ووضع الكلي مره أخرى في قارب وزنها المسمية بشكل مناسب. باستخدام شفره حلاقه نظيفه ، وقطع الكلي في النصف ، بالطول. وضع كل نصف الكلي التي تواجه أسفل وقطع كل نصف في 2-مم أو قطع أصغر.
- باستخدام الشفرة نفسها ، وجمع بعناية ووضع قطع الكلي المفروم في أنبوب مخروطي الشكل 15 مل المسمي (رقم الماوس/معرف ؛ اليسار مقابل الكلية اليمني).
- كرر الاجراء للكلي المعاكس ، وذلك باستخدام شفره حلاقه جديده. ضع الكلي المفروم في أنبوب مخروطي الشكل بحجم 15 مل.
- في غطاء الدخان الجيد التهوية ، أضف 5 مل من حمض الهيدروكلوريك 6 م (HCl) إلى كل أنبوب مخروطي 15 مل.
- استبدل الغطاء بالأنبوب المخروطي ، وقم بلطف بمزج الكلي/حمض الهيدروكلوريك ، وضع الأنبوب المخروطي 15 مل في حمام مياه محمي علي حرارة 37 درجه مئوية لمده 90 دقيقه (* 120 دقيقه لكلي الفئران).
- لفتره وجيزة التحريض كل أنبوب 15 مل كل 15 دقيقه خلال الحضانة من أجل التاكد من ان جميع الانسجه يتعرض لحمض HCl.
- ادراج ابره 18-ز في حقنه 5 مل (* 10-مل حقنه للفئران) وأزاله بعناية الغطاس حقنه. ضع الحقنه في أنبوب مخروطي 50-mL (أنبوب #1) في غطاء الدخان.
- أزاله محلول الكلي/HCl من حمام المياه وصب محلول الانسجه في نهاية مفتوحة من الحقنه وتعيين أنبوب مخروطي 15 مل جانبا في أنبوب اختبار الرف. بعناية استبدال المكبس ودفع ببطء الغطاس وذلك للبثق الحل من خلال الابره والي أنبوب #1.
- غسل أنبوب مخروطي 15 مل مع 5 مل من حل التلفزيونية. دوامه التلفزيوني في أنبوب مخروطي 15 مل وذلك لأذابه اي انسجه الكلي المتبقية.
- مره أخرى ، بعناية أزاله المكبس من حقنه 5 مل تحتوي علي ابره 18-ز وتصب محتويات من أنبوب مخروطي 15 مل في نهاية مفتوحة من الحقنه. بعناية استبدال المكبس ودافق حقنه بالضغط برفق إلى أسفل علي المكبس ، في أنبوب #1. كرر هذه العملية 2x (أداء 3x في المجموع).
- ادخل ابره 21 غرام في حقنه 5 مل جديده (* حقنه 10 مل للفئران) وأزاله بعناية الغطاس حقنه. ضع الحقنه مع ابره 21-ز المرفقة في أنبوب مخروطي جديد 50-mL (أنبوب #2).
- صب المحتويات من أنبوب #1 في نهاية مفتوحة من الحقنه التي تحتوي علي ابره 21-ز. بعناية ادراج المكبس ودافق حقنه بالضغط برفق إلى أسفل علي حقنه الغطاس ووضع الحل مقذوف في أنبوب #2.
- يغسل أنبوب #1 مع 5 مل من الحل تلفزيوني. دوامه التلفزيونية في أنبوب #1 وذلك لأذابه اي انسجه الكلي المتبقية.
- مره أخرى ، بعناية أزاله المكبس من حقنه 5 مل تحتوي علي ابره 18-ز وتصب محتويات من أنبوب #1 في نهاية مفتوحة من الحقنه. بعناية استبدال المكبس ودافق حقنه بالضغط برفق إلى أسفل علي الغطاس ، والحل البثق في أنبوب #2. كرر هذه العملية 2x (أداء 3x في المجموع).
- تحقيق الحجم الإجمالي للأنبوب #2 يصل إلى 50 mL عن طريق أضافه تلفزيونيه اضافيه, تصل إلى 50 خط علي أنبوب #2.
- حضن أنبوب #2 التي تحتوي علي محلول انسجه الكلي في رف أنبوب علي لوحه الروك في الثلاجة تعيين في 4 °C بين عشيه وضحيها (الحد الأدنى 8-10 h).
3. عد الكبيولي واستقراء عدد النيفرون
- أزاله أنبوب #2 من الثلاجة وأعاده تعليق الانسجه التي تغلف عن طريق عكس بلطف الأنبوب عده مرات من أجل خلق حل متجانس. نوصي بالعد الكبيبات في غضون 5 د بعد المعالجة.
- بعناية قسامه 500 μl من محلول الكلي في بئر واحده من 12 بئر لوحه. كرر هذا 2x ، وضع كل قسامه في بئر منفصلة بحيث يكون هناك ثلاثه ابار من محلول الكلي في الكلي ، للتحليل في ثلاثي النسخ.
- أضافه 500 μL من تلفزيوني إلى كل من الآبار الثلاثة التي تحتوي علي حل الكلي ، لتخفيف 1:1.
- باستخدام المجهر المقلوب ، عد عدد الكبيبات لكل بئر. ويساعد العد باستخدام شبكه من 16 أقسام منفصلة وضعت علي الجزء السفلي من كل بئر. عد عدد الكبيبات في كل مقطع موزع جيس ثم قم بجمع العدد لكل شبكه للحصول علي العدد الإجمالي للكبيبات في البئر. يمكن التعرف علي الكبيبات بسهوله من خلال بنيتها الكروية. وشملت المعرفات الاضافيه صبغه ضاربه إلى الحمرة بسبب الشعيرات الدموية المملوءة بالدم ، وكذلك ما قبل أو بعد الشرايين التي تظل ملتصقة بجسم الكبيبات الفردية (الشكل 1).
- أضافه العدد الإجمالي للكبيبات تحسب لكل من الآبار الثلاثة ومن ثم تقسيمها بمقدار ثلاثه لمتوسط عدد الكبيبات لكل 500 μL من محلول الكلي. إذا كان الفرق في متوسط عدد الكبيبات لكل بئر أكبر من 10 ٪ ، كرر اجراء العد التنازلي ، وإيلاء اهتمام وثيق للطبيعة المتجانسة للحل الكلي. مضاعفه عدد الكبيبات المحسوبة في الأوقات الجيدة 100 لمتوسط عدد الكبيبات لكل كليه. ويمكن التعبير عن عدد إجمالي neفرون في الكلي أو, باستخدام وزن الكلي, لكل ملغ أو غرام من الانسجه.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
وفيما يلي التقديرات التمثيلية للعدد الكلي neفرون الكلية من نموذج الماوس المعمول بها من ارتفاع ضغط الدم ونموذج الفئران الوراثية لمرض الكلي المزمن المرتبط بالسن. يتم تسليط الضوء علي الخصائص الرئيسية لتحديد الكبيبات ، مثل الهيكل الكروي مع أو بدون الهياكل المرفقة قبل أو بعد شرايين أو أنبوبي ، لتلك الجديدة لطريقه النقع الحمضية (الشكل 1).
في المثال التجريبي الأول ، تم تحديد إجمالي أرقام النيفرون في الفئران (الذكور C57BL/6 ، 6 أسابيع من العمر) محمله المركبة (المالحة) أو انجيوتنسين الثاني لمده 14 يوما. في الفئران التي غرست السيارة ، وكان عدد neفرون 12,411 ± 248 neفرون في الكلي كما هو محدد باستخدام طريقه النقع الحمضية (الشكل 2). هذا تقديرات متسقة مع مدي من كامله كليه [نيفرون] رقم يفاد سابقا في فيران (جدول 1). انجيوتنسين زيادة الضغط الأذيني من قبل حوالي 40 ملم زئبق بعد 14 يوما من التسريب وارتبط مع انخفاض كبير في عدد نيفرون (9,122 ± 193 neفرون في الكلي) من ما يقرب من 26 ٪ (الشكل 2). وتشير هذه البيانات إلى ان التسريب انجيوتنسين الثاني ليست مرتبطة فقط مع ارتفاع ضغط الدم ولكن, أيضا, ويرتبط انخفاض كبير في عدد نيفرون مع فقدان neفرون بسبب التصلب أو الاصابه الكبيبي.
في المثال التجريبي الثاني ، تم تاكيد النتائج السابقة لعدد النيفرون في نموذج الفئران الوراثية من الجينات الكلوية ، والنموذج المشتق من الأسهم غير المتجانسة من جانب واحد من الفئران الكلوية. ويعرض نموذج HSRA الظواهر الظاهرية غير مكتملة الاختراق لعيوب الكلي والمسالك البولية, مع بعض الكائنات التي ولدت طبيعيه (مع اثنين من الكلي) وغيرهم من المولودين بكلية واحده. في الفئران التي ولدت مع اثنين من الكلي (الذكور hA-السيطرة ؛ 12 أسابيع من العمر) ، وكانت تقديرات عدد النيفرون باستخدام طريقه النقع حمض 27,288 ± 336 neفرون في الكلي (الشكل 3). وعلي النقيض من ذلك ، في الفئران التي ولدت مع الكلي الانفرادي (الذكور hA-الانفرادي ؛ 4 أسابيع من العمر) تم العثور علي تقديرات لعدد نيفرون لتكون اقل بكثير في 24,594 ± 883 neفرون في الكلي (الشكل 3). كما ان تقديرات عدد النيفرون التي تحققت في هذه العينات تتسق أيضا مع النطاقات التي سبق الإبلاغ عنها في الفئران (الجدول 1). لاحظ ان هذه البيانات تتسق مع النتائج السابقة التي تم العثور علي الفئران hA-الانفرادي لإظهار انخفاض neفرون الهبات أو الأرقام (بالمقارنة مع واحده الكلي السيطرة) علي الأرجح تعكس العوامل الوراثية الكامنة المرتبطة بالولادة مع كليه واحده31.
الشكل 1 : المعرفات الرئيسية من الكبيبات للعد وتقييم الكلي كامل عدد neفرون. يمكن التعرف علي الكبيبات بسهوله من خلال بنيتها الكروية ، كما هو مبين في الأسهم. وتشمل المعرفات الاضافيه صبغه ضارب إلى الحمرة بسبب الشعيرات الدموية المملوءة بالدم ، فضلا عن ما قبل أو بعد الشرايين (أو الأنابيب) التي قد تظل ملتصقة بجسم الكبيبات الفردية التالية للمعالجة (مثل الذي تم تحديده في الجزء السفلي من هذا ميكروغراف). أيضا موجودة في هذه الصورة هي بقايا الأنابيب والاوعيه الدموية. التكبير = 10X; شريط مقياس = 100 μm. الرجاء النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2 : [نفرون] يعد في فيران. (ا) صوره تمثيليه من الكبيبات من الكلي ماوس واحد مطلي في بئر مسطحه القاع 22.1 ملم من لوحه ثقافة 12 بئر ، كما راينا باستخدام المجهر المقلوب. وينظر إلى الأنابيب الكبيولي والكلي في كثافة معتدله عندما تضعف بعامل اثنين (0.5 مل من محلول الكلي بالاضافه إلى 0.5 mL من 1x تلفزيوني). (ب) تاثير السيارة لمده 14 يوما أو التسريب انجيوتنسين II علي عدد النيفرون في الفئران C57Bl/6 الذكور كما تقييمها من قبل العد الكبيبي. وكان التسريب الثاني انجيوتنسين في 1,000 ng/kg/min (عبر الاسموزي minipump) المرتبطة بارتفاع ضغط الدم وشهدت انخفاضا في عدد نيفرون بالمقارنة مع عدد neفرون في الفئران غرست مع السيارة. وتتسق أرقام نيفرون في الفئران التي غرست فيها المركبات مع التقديرات المبلغ عنها سابقا لعدد النيفرون في الفئران (الجدول 1). السيارة: n = 3 ، انجيوتنسين الثاني: n = 3 ، *p < 0.05. أشرطه الخطا = SE. التكبير = 4X; شريط مقياس = 250 μm. الرجاء النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3 : [نفرون] يعد في فيران. (ا) صوره تمثيليه للكبيبات من كليه فئران واحده مطليه ببئر مسطحه القاع بحجم 22.1 ملم من صفيحه ثقافة 12 بئر ، كما شوهد باستخدام مجهر مقلوب. وينظر إلى الأنابيب الكبيولي والكلي في كثافة اعلي بكثير بالمقارنة مع ذلك في الماوس. (ب) القياس الكمي لعدد النيفرون في الفئران التي تسيطر عليها والجرذان التابعة لهذه المجموعة يكشف عن ان عدد النيفرون اقل من ذلك بالمقارنة مع الفئران المصابة بالملاريا والجرذان ويتسق مع النتائج السابقة في هذا النموذج31. Hnnc ، الفئران التي ولدت مع اثنين من الكلي: n = 3 ؛ الفئران التي ولدت مع الكلي الانفرادي: n = 3 ،* p < 0.05. أشرطه الخطا = SE. التكبير = 4X; شريط مقياس = 250 μm. الرجاء النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
| الانواع | عدد نيفرون في الكلي | مرجع |
| الماوس | 9000-21000 | 18-22, 28 |
| الفئران | 13000-27000 | 31 و 33 |
| الاغنام | 200000-800000 | 23 و 29 و 34 |
| خنزير | 1600000-4600000 | 32 و 35 |
| الانسان | 500000-2000000 | 8-15 |
الجدول 1: النطاقات المبلغ عنها من عدد النيفرون في عده أنواع.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
مع تقنيه تجريبية جيده ، وطريقه النقع حمض مثاليه لتقدير عدد النيفرون في الكلي كله. علي الرغم من ان الكلي يذوب في الحمض ، لا تزال الكبيبات سليمه إلى حد كبير ويمكن التعرف عليها بسهوله ، مما يجعل عد الكبيبات الفردية سهلا ومباشرا نسبيا. تقنيه النقع الحمضية مفيده بشكل خاص لعده أسباب. أولا ، طريقه النقع الحمضية هي طريقه سريعة ومريحه تتطلب القليل نسبيا من حيث النفقات والجهد البدني. جميع الكواشف والمواد الاستهلاكية المطلوبة لأداء طريقه النقع الحمضية متاحه بسهوله في معظم المختبرات الاساسيه ، والشرط الرئيسي الوحيد هو الوصول إلى المجهر المقلوب للعد الكبيبي. من حيث النفقات ، ويقدر ان طريقه النقع الحمضية تكلف مجرد بضع مئات من الدولارات لكل الحيوانية ، والتي ليست كثيرا بالمقارنة مع التكاليف المرتبطة بطرق أخرى للعد الكبيبي كلي كامل ، مثل التصوير بالرنين المغناطيسي ، والتي يمكن ان تتراوح إلى آلاف الدولارات لكل الحيوانية من الوقت المسح والخبرة التقنية.
ثانيا ، أسلوب النقع الحمضي ينطوي علي اقل بكثير من الوقت اللازم لمعالجه الانسجه بالمقارنة مع الطرق الأخرى للعدد الكلي من النيفرون مثل الطريقة المتقطعة/المجزاه24. من البداية إلى النهاية ، تتطلب طريقه النقع الحمضية اقل من 24 ساعة من الوقت الإجمالي ، والتي تنفق اقل من 1-2 ساعة في معالجه الكلي ومن ثم عد الكبيبات الفردية لكل الحيوانية التجريبية. وعلي النقيض من ذلك ، فان طريقه التفكيك/التجزئة كثيفه العمالة ، وتتطلب ما يقدر ب 15 ساعة من المخاض (4-6 ساعة من التقسيم ، و 2-3 ساعة من التلطيخ ، و 4-5 ساعة من وقت العد) لكل كليه ، وليس بما في ذلك الساعات 48-72 اللازمة لمعالجه الكلي في gl ycol ميثاكريلات24. وبسبب مزايا التكلفة والوقت ، فان طريقه النقع الحمضية مفيده بشكل خاص في الدراسات التي تحتاج فيها تقديرات الكلية إلى عدد كبير من الماشية مع أو بدون تدخلات وراثيه أو دوائية. وقد اعتبرت كل من التكلفة والوقت الذي ينطوي علي طريقه التفكيك/التجزئة والتصوير بالرنين المغناطيسي عاملا مقيدا رئيسيا في اعتمادها في معظم مختبرات البحوث.
وأخيرا ، فان طريقه النقع الحمضية توفر تقديرات للعدد الكلي لعدد النيفرون التي يمكن مقارنتها بالتدابير التي تستخدم أساليب أكثر تطورا مثل التصوير بالرنين المغناطيسي26. علي سبيل المثال ، باستخدام التسمية الكترونيه فيريتين-وضع العلامات علي الكبيبات ومعالجه الصور ثلاثية الابعاد لحساب كل neفرون في كليه واحده من الفئران Sprague-Dawley ، والتصوير بالرنين المغناطيسي أسفرت عن التهم المتوسطة من 34,000 كبيبات فرديه لكل الكلي26. في الكلي غير cationic المسمي الكليتين ، أنتجت التصوير بالرنين المغناطيسي التهم من 2,000 الهياكل الشبيهة نيفرون بسبب عد المناطق غير الكبيبي من الكلي مع إشارات مغناطيسيه من نفس الحجم والشكل كبيبات المسمية فيريتين. عندما يتم طرح هذه القطع الاثريه من التهم المحددة من قبل الكليات المسمية فيريتين ، فان العدد الفعال من الكبيبات يحدد ، باستخدام التصوير بالرنين المغناطيسي ، هو أقرب إلى 32,000 neفرون في الكلي26. في هذه الدراسة نفسها ، أسفرت التجارب التحقق من الصحة متوسط التهم الكبيبي 31,000 لكل الكلي باستخدام طريقه النقع حمض26. وهكذا ، فان طريقه النقع الحمضية تنتج تقديرات للعدد الكلي من النيفرون الكلية التي هي ضمن < 5 ٪ من تلك التي تحدد باستخدام أحدث التقنيات مثل التصوير بالرنين المغناطيسي.
علي الرغم من ان هناك العديد من المزايا الرئيسية المرتبطة بطريقه النقع الحمضية ، يجب علي المحققين أيضا ان يكونوا علي بينه من القيود المرتبطة بهذه الطريقة. ويتعلق أحد القيود باستخدام الكلي بأكمله. كما يتم حل الكلي كله ومتجانسة ، لا يمكن تحديد المعلومات المتعلقة بالتوزيع المكاني للكبيبات داخل قشره الكلي. إذا كانت معرفه توزيع الحجم الكبيبي أمر مهم ، فان استخدام التصوير بالرنين المغناطيسي سيكون أسلوبا مناسبا بشكل أفضل.
بالمقارنة مع الطرق الأخرى ، يبدو استخدام طريقه النقع الحمضية تقلل قليلا من إجمالي عدد النيفرون. ومن المرجح ان تكون التقديرات الصغيرة ناجمه جزئيا عن انحلال نسبه مئوية صغيره من الكبيبات في الحمض أو اثناء النقع في الكلي. الاضافه إلى ذلك ، مع الشيخوخة أو المرض ، وهناك خسارة من النيفرون الوظيفية ، والتي ، علي الرغم من عدم المساهمة في تشكيل البول ، قد تكون أكثر حساسية لنقع الأحماض ويمكن ان تدمر اثناء المعالجة ، التالي المساهمة في انخفاض تقديرات من إجمالي النيفرون عدد. التالي ، ينبغي استخدام الرعاية عند جمع ومعالجه الكلي حتى لا تترك اي انسجه الكلي في الجسم المجري عند تقطيع الكلي ، أو في المحاقن عند البثق عينات الانسجه. وعموما ، ومع ذلك ، فان التقدير البخس من إجمالي عدد النيفرون بسبب معالجه الانسجه يبدو صغيرا نسبيا.
كما ان عد الكبيبات باستخدام طريقه النقع الحمضية غير موضوعي ، فان بخس عدد النيفرون قد يكون أيضا انعكاسا لتحيز المراقب ، الذي يمكن التغلب عليه بسهوله عن طريق القياسات التي يقوم بها اثنان من المحققين المنفصلين المكفوفين معلومات بشان الحيوانية التجريبية أو حاله. إذا كان هناك قلق كبير بشان ما يشكل الكبيبه ، ونهج بديل ينطوي علي غرس الحيوانية التجريبية مع أكسيد الحديد قبل القتل الرحيم. عندما غرست عن الوريد, أكسيد الحديد سوف تدخل وتصبح محصورة في الكبيبه; التالي ، يجب ان المعالجة الكبيبات وصمه عار الأسود الداكن ، مما يسمح لتحديد أكبر من الكبيبات عند العد30.
وتقدر طريقه النقع الحمضية عدد الكلية الكاملة neفرون علي أساس قياس العينات الصغيرة (3 × 0.5 مل أو 1.5 مل) بدلا من قياسات الحل الكامل للكلي (50 مل). طريقه النقع الحمضية قابله للتكرار بشكل كبير في الطبيعة ، ويتم العثور علي التهم الكبيبيه داخل عينات من كليه واحده وداخل المجموعات التجريبية لتكون متسقة للغاية. وعلاوة علي ذلك ، فان النتائج التمثيلية المبلغ عنها في الدراسة الحالية من الفئران البرية C57Bl/6 والجرذان المولودة بكلية واحده (الشكلان 2 و 3) تتسق إلى حد كبير مع النتائج السابقة ، وكذلك مع النطاقات المبلغ عنها سابقا (الجدول 1 )5و31. وإذا رغبت في ذلك ، يمكن اجراء قياسات اضافيه بسهوله لتحسين تقدير إجمالي عدد النيفرون لكل كليه.
في حين ان تقنيه النقع الحمضية توفر تقديرات موثوقه وقابله للتكرار من عدد النيفرون ، لا ينصح بهذه الطريقة للحصول علي قياسات للحجم الكبيبي ، حيث ان التعرض للحمض علي الأرجح ينتج تغييرات في حجم الكبيبات. كما ان تحديد حجم الكبيبي مهم في تحديد الكلي كامل المنطقة السطحية الكبيبي ، فمن المستحسن ان يتم اجراء مثل هذه القياسات باستخدام النسيجية والفراغية الطرق24،25. بشكل خاص ، الطرق المجسمة التي تجعل استخدام غليكول ميثاكريلات تضمين الكلي من أجل الحد من تورم الانسجه والتوسع ، التالي ، الحفاظ علي الهندسة الكبيبي أقرب ما يمكن لذلك في الجسم المجري.
وأخيرا ، هناك قيد آخر علي تقنيه النقع الحمضي ، والذي هو شائع في الطرق الأخرى لتقييم عدد النيفرون ، هو انه لا يمكن التاكد من اي معلومات تتعلق بوظيفة الكبيبي (مثل معدل الترشيح الكبيبي) من الكبيبات مره واحده معالجه. التالي ، في حين يمكن حساب الكبيبات الفردية ، لا يمكن تحديد حالتها الوظيفية (تشكيل البول أو عدم تشكيل البول) باستخدام طريقه النقع الحمضية. المثل ، لا يمكن التاكد من المعلومات الطولية باستخدام طريقه النقع الحمضية في الفئران الفردية. بدلا من ذلك ، مطلوب مجموعات منفصلة من الحيوانية في نقاط زمنيه مختلفه للحصول علي نظره ثاقبه في التغيرات في عدد النيفرون علي مدي عمر الحيوانية أو التدخل قبل أو بعد الجينية أو الدوائية.
وباختصار ، فان طريقه النقع الحمضية هي طريقه منخفضه التكلفة ، وعاليه الانتاجيه ، وفعاله لتقدير عدد الكلية الكاملة neفرون. طريقه النقع الحمضية توفر درجه عاليه من الاستنساخ كما يتضح من المثالين المعروضين هنا ، وكذلك من قبل تلك التي تم الإبلاغ عنها سابقا باستخدام هذه الطريقة18،19،20،21 , 22 , 28-وفي حين وصف استخدام طريقه النقع الحمضي للاستخدام في الفاره (والفئران) ، يمكن أيضا تحجيم طريقه النقع الحمضية لاستخدامها في الأنواع الأكبر ، مثل الكلبة والخنزير27،32.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وليس لدي المؤلفين ما يفصحون عنه.
Acknowledgments
وقد تم دعم هذا العمل جزئيا من قبل المعاهد الوطنية للصحة والقلب الوطني والرئة ومعهد الدم (R01HL107632).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isoflurane anesthesia | Abbott Laboratories | 05260-05 | |
| Isoflurane vaporizor system & flow gauge | Braintree Scientific | VP I | Include medical grade oxygen supply |
| Leica Inverted Microscope DMIL LED | Leica Microsystems | DMIL LED | Any make also suitable |
| Digital water bath | Fisher Scientific | 2239 | Any make also suitable |
| ToughCut Fine surgical scissors | Fine Science Tools | 14058-11 | 25 mm cutting edge, 11.5 cm length; Tips: sharp-sharp; Tip shape: straight |
| Micro dissecting forceps 4 1/4 in. | Biomed Res Instruments, Inc | 10-1760 | Curved tip |
| Plexiglass board 5 in. x 7 in. | any source suitable | n/a | Any make also suitable |
| Hexagonal polystyrene weighing dish | Fisher Scientific | 02-2002-100 | Any make also suitable |
| Razor blades | Fisher Scientific | 12-640 | Single edge carbon steel 0.009 |
| Gauze sponges 4 x 4 in. 8 ply | Fisher Scientific | MSD-1400250 | |
| 10x concentrate phosphate buffered saline (PBS) | Sigma Aldrich | P5493-4L | Dilute to 1x |
| 6 N Hydrocholric acid solution | Sigma Aldrich | 3750-32 | |
| 15 mL conical centrifuge tube | Fisher Scientific | 14-959-70C | Any make also suitable |
| 50 mL conical centrifuge tube | Fisher Scientific | 14-959-49A | Any make also suitable |
| Disposable 5 mL syringe | Cole Palmer | EW-07944-06 | Any make also suitable |
| 18G1.5 disposable needle | Fisher Scientific | 14-826-5D | Any make also suitable |
| 21G1.5 disposable needle | Fisher Scientific | 14-826-5B | Any make also suitable |
| 12-well multiple-well cell culture plates with lid | Cole Palmer | #FW-01959-06 | Any make also suitable |
| Polypropylene modular test tube rack | Cole Palmer | #EW-06733-00 | Capable of accommodating 15 and 50 mL conical tubes; any make also suitable |
References
- Hall, J. E., Guyton, A. C. Guyton and Hall Textbook of Medical Physiology. , 13th, Elsevier. Philadelphia, PA. (2016).
- Wang, X., Garrett, M. R. Nephron number, hypertension, and CKD: physiological and genetic insight from humans and animal models. Physiological Genomics. 49 (3), 180-192 (2017).
- Didion, S. P. A novel genetic model to explore the Brenner hypothesis: Linking nephron endowment and number with hypertension. Medical Hypotheses. 106, 6-9 (2017).
- Brenner, B. M. Nephron adaptation to renal injury or ablation. American Journal of Physiology. 249 (3 Pt 2), F324-F337 (1985).
- Didion, S. P., Wang, X., Garrett, M. R. Direct correlation between blood pressure and nephron endowment in a genetic model of hypertension. Hypertension. 68, A052 (2016).
- Luyckx, V. A., Brenner, B. M. The clinical importance of nephron mass. Journal of the American Society of Nephrology. 21 (6), 898-910 (2010).
- Mackenzie, H. S., Brenner, B. M. Fewer nephrons at birth: a missing link in the etiology of essential hypertension? American Journal of Kidney Diseases. 26 (1), 91-98 (1995).
- Nyengaard, J. R., Bendtsen, T. F. Glomerular number and size in relation to age, kidney weight, and body surface in normal man. The Anatomical Record. 232 (2), 194-201 (1992).
- Denic, A., Glassock, R. J., Rule, A. D. Structural and functional changes with the aging kidney. Advances in Chronic Kidney Disease. 23 (1), 19-28 (2016).
- Denic, A., et al. The substantial loss of nephrons in healthy human kidneys with aging. Journal of the American Society of Nephrology. 28 (1), 313-320 (2016).
- Keller, G., Zimmer, G., Mall, G., Ritz, E., Amann, K. Nephron number in patients with primary hypertension. The New England Journal of Medicine. 348 (2), 101-108 (2003).
- Hoy, W. E., et al. Nephron number, glomerular volume, renal disease and hypertension. Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 17 (3), 258-265 (2008).
- Hoy, W. E., et al. Distribution of volumes of individual glomeruli in kidneys at autopsy: association with age, nephron number, birth weight and body mass index. Clinical Nephrology. 74 (Suppl 1), S105-S122 (2010).
- Hughson, M. D., et al. Hypertension, glomerular hypertrophy and nephrosclerosis: the effect of race. Nephrology Dialysis Transplantation. 29 (7), 1399-1409 (2014).
- Puelles, V. G., et al. Glomerular number and size variability and risk for kidney disease. Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 20 (1), 7-15 (2010).
- Brenner, B. M., Garcia, D. L., Anderson, S. Glomeruli and blood pressure. Less of one, more of the other? American Journal of Hypertension. 1 (4 Pt 1), 335-347 (1988).
- Clark, A. T., Bertram, J. F.
- Benz, K., et al. Early glomerular alterations in genetically determined low nephron number. American Journal of Physiology Renal Physiology. 300 (2), F521-F530 (2011).
- Zhao, H., et al. Role of fibroblast growth factor receptors 1 and 2 in the ureteric bud. Developmental Biology. 276 (2), 403-415 (2004).
- Sims-Lucas, S., Caruana, G., Dowling, J., Kett, M. M., Bertram, J. F. Augmented and accelerated nephrogenesis in TGF-beta2 heterozygous mutant mice. Pediatric Research. 63 (6), 607-612 (2008).
- Cullen-McEwen, L. A., Kett, M. M., Dowling, J., Anderson, W. P., Bertram, J. F. Nephron number, renal function, and arterial pressure in aged GDNF heterozygous mice. Hypertension. 41 (2), 335-340 (2003).
- Stelloh, C., et al. Prematurity in mice leads to reduction in nephron number, hypertension and proteinuria. Translational Research. 159 (2), 80-89 (2012).
- Galinsky, R., et al. Effect of intra-amniotic lipopolysaccharide on nephron number in preterm fetal sheep. American Journal of Physiology Renal Physiology. 301 (2), F280-F285 (2011).
- Bertam, J. F., et al. Why and how we determine nephron number. Pediatric Nephrology. 29 (4), 575-580 (2014).
- Nyengaard, J. R. Stereologic methods and their application in kidney research. Journal of the American Society of Nephrology. 10 (5), 1100-1123 (1999).
- Beeman, S. C., et al. Measuring glomerular number and size in perfused kidneys using MRI. American Journal of Physiology Renal Physiology. 300 (6), F1454-F1457 (2011).
- Damadian, R. V., Shawayri, E., Bricker, N. S. On the existence of non-urine forming nephrons in the diseased kidney of the dog. Journal of Laboratory and Clinical Medicine. 65, 26-39 (1965).
- Bonvalet, J. P., et al. Number of glomeruli in normal and hypertrophied kidneys of mice and guinea-pigs. The Journal of Physiology. 269 (3), 627-641 (1977).
- Bains, R. K., Sibbons, P. D., Murray, R. D., Howard, C. V., Van Velzen, D. Stereological estimation of the absolute number of glomeruli in the kidneys of lambs. Research in Veterinary Science. 60 (2), 122-125 (1996).
- Assmann, K. J., van Son, J. P., Koene, R. A. Improved method for the isolation of mouse glomeruli. Journal of the American Society of Nephrology. 2 (4), 944-946 (1991).
- Wang, X., et al. Nephron deficiency and predisposition to renal injury in a novel one-kidney genetic model. Journal of the American Society of Nephrology. 26 (7), 1634-1646 (2015).
- Lodrup, A. B., Karstoft, K., Dissing, T. H., Pedersen, M., Nyengaard, J. R. Kidney biopsies can be used for estimations of glomerular number and volume: a pig study. Virchows Archiv. 452 (4), 393-403 (2008).
- Fassi, A., et al. Progressive glomerular injury in the MWF rat is predicted by inborn nephron deficit. Journal of the American Society of Nephrology. 9 (8), 1399-1406 (1998).
- Wintour, E. M., et al. Reduced nephron number in adult sheep, hypertensive as a result of prenatal glucocorticoid treatment. The Journal of Physiology. 549 (Pt 3), 929-935 (2003).
- Van Vuuren, S. H., et al. Compensatory growth of congenital solitary kidneys in pigs reflects increased nephron numbers rather than hypertrophy. PLoS One. 7 (11), e49735 (2012).
