Summary
Estimater af hele nyre Neron nummer er vigtige klinisk og eksperimentelt, da der er en omvendt sammenhæng mellem Neron nummer og en øget risiko for renal og hjerte-kar-sygdom. Heri, brugen af syre maceration metode, som giver hurtige og pålidelige estimater af hele nyre Neron nummer, er påvist.
Abstract
Nephron begavelse refererer til det samlede antal nefronov en person er født med, som nefrogenese hos mennesker er afsluttet ved 36 uger af drægtighedsperioden og ingen nye nefronov dannes efter fødslen. Neron nummer refererer til det samlede antal nefronov målt på ethvert tidspunkt efter fødslen. Både genetiske og miljømæssige faktorer påvirker både nephron begavelse og antal. Forstå, hvordan specifikke gener eller faktorer påvirker processen med nefrogenese og nephron tab eller død er vigtig, da personer med lavere nephron begavelse eller tal menes at være i en højere risiko for at udvikle nyre-eller hjerte-kar-sygdom. Forstå, hvordan miljømæssige eksponeringer i løbet af en persons levetid påvirker Neron nummer vil også være afgørende for at afgøre fremtidige sygdomsrisiko. Således, evnen til at vurdere hele nyre Neron nummer hurtigt og pålideligt er en grundlæggende eksperimentelle krav til bedre at forstå mekanismer, der bidrager til eller fremme nefrogenese eller nephron tab. Her beskriver vi den sure maceration metode til vurdering af hele nyre Neron nummer baseret på den procedure, der er beskrevet af Damadian, Shawayri, og Bricker, med små ændringer. Den sure udblødning metode giver hurtige og pålidelige estimater af Neron nummer (vurderet ved at tælle glomeruli), der er inden for 5% af dem bestemmes ved hjælp af mere avancerede, omend dyre, metoder såsom magnetisk resonans imaging. Desuden er syre udblødning metode en fremragende høj-gennemløb metode til at vurdere Neron nummer i et stort antal prøver eller eksperimentelle betingelser.
Introduction
Den Neron er både den grundlæggende strukturelle og funktionelle enhed af nyrerne1. Strukturelt, Neron består af glomerulus (kapillærer og podocytter), der ligger inden for Bowmans kapsel og den renale tubulære, der består af den proksimale tubulære, loop af Henle, og den distale tubulære, der slutter ind i opsamlings kanalen. Funktionelt, den rolle, som Neron er filtrering og reabsorption af vand og elektrolytter og udskillelsen af affald. I almindelighed, nefrogenese er afsluttet på 36 uger af drægtighedsperioden hos mennesker og kort efter fødslen i flere arter som mus og rotte2. Nephron begavelse refererer til det samlede antal nefronov, som en person er født med, mens Neron nummer er det samlede antal nefronov målt på ethvert tidspunkt efter fødslen3. Betegnelsen Neron nummer og glomerulære tal bruges ofte i flæng. Fordi der kun er en glomerulus pr. Neron, vurderingen af glomeruli tal er en vigtig surrogat for estimering af Neron nummer.
Vurderingen af nephron-begavelsen og nephron-nummeret er af klinisk interesse, da undersøgelser har påvist en sammenhæng mellem nephron-begavelsen og reducerede Neron-tal med en øget forekomst af kardiovaskulær sygdom4,5 ,6,7,8,9,10,11,12,13,14, 15. baseret på fund i nyrerne ved obduktion bemærkede Brenner, at hypertensive individer havde et lavere samlet antal nephroner end Normotensive individer16. Således Brenner hypotese, at der er et omvendt forhold mellem Neron nummer og risikoen for at udvikle hypertension senere i livet. Brenner havde også en hypotese om, at der blev kompenseret for en reduktion i antallet af Neron-numre ved de tilbageholdt nephroner. For at opretholde den normale filtreringshastighed i nyrerne kompenserer residualnephroner ved at øge deres glomerulære overfladeareal (glomerulær hypertrofi), hvorved der arbejdes på at afbøde eventuelle negative virkninger af nefrotab på nyrefunktionen4 ,16.
Mens beskyttende på kort sigt, glomerulær hypertrofi, på lang sigt, fører til øget natrium-og væskeretention, øget ekstracellulærvæske volumen, og stigninger i arteriel blodtryk, hvilket fører til en ond cirkel af yderligere stigninger i glomerulær kapillartryk, glomerulær hyperfiltrering og Neron ardannelse (sklerose) og skade4,16.
Opnåelse af estimater eller antal af Neron nummer tilbyder et par eksperimentelle fordele: 1) det giver oplysninger om processen med nefrogenese, som derefter kan knyttes til specifikke gener eller faktorer i embryo eller maternel-føtale miljø, og 2) der er en sammenslutning af nephron nummer med hjerte-kar-sygdom, og derfor er der potentiale for, at estimater af Neron nummer kan bruges til at forudsige fremtidige kardiovaskulære risiko2,17,18, 19 ud af , 20 ud af , 21 ud af , 22. ud over moderdyret-føtale miljø, flere sygdomme direkte indvirkning Neron nummer og nyrefunktion, herunder åreforkalkning, diabetes, hypertension, og selv normal aldring2,9, 10,11,12,22,23. Således vurdering af hele nyre Neron nummer er vigtigt at forstå både de genetiske og miljømæssige faktorer, der påvirker nefrogenese (dvs., nephron begavelse) og nephron nummer i løbet af en persons liv og de resulterende virkninger nyrefunktion og hjerte-kar-sundhed.
I øjeblikket er der flere metoder til rådighed til bestemmelse og kvantificering af Neron nummer, hver med sine egne fordele og begrænsninger24,25,26,27,28 ,29,30. Sofistikerede metoder til bestemmelse af hele nyre Neron nummer omfatter stereologiske metoder, såsom dissector/Fractionator metode, og magnetisk resonans imaging25,26. Ofte betragtes som guld-standard til bestemmelse af hele nyre Neron nummer, den dissector/Fractionator metode er både dyrt og tidskrævende. Nylige fremskridt og forbedringer i magnetisk resonans scanning og behandling har givet værktøjerne til at tælle hver eneste nephron individuelt. Men, magnetisk resonans imaging er ikke kun tidskrævende, men også ekstremt dyrt. Desuden, både dissector/fraktionator metode og magnetisk resonans imaging kræver avanceret teknisk ekspertise, og dermed begrænse brugen af sådanne metoder i de fleste af forskningslaboratorier.
De fleste metoder til bestemmelse af Neron nummer gøre tæller eller estimater baseret på identifikation af glomeruli, da de er let identificerbare strukturelt. I dette papir er syre udblødning metode til estimering af Neron nummer i hele nyrerne beskrevet og demonstreret27. Den sure maceration metode er hurtig, pålidelig, og betydeligt billigere end andre metoder, såsom dissector/Fractionator metode og magnetisk resonans imaging. Desuden giver syre udblødning metode meget gentagelige estimater af Neron nummer, der er blevet rapporteret at være inden for intervallet af dem, der er bestemt ved hjælp af magnetisk resonans imaging26.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Forsyninger og reagenser, der er anført nedenfor, er til bestemmelse af hele nyre Neron nummer i en mus, det vil altså to nyrer. Ændringer for anvendelse af syre udblødning metode til rotte er identificeret med asterisker. Alle eksperimentelle protokoller er i overensstemmelse med de nationale Institut for sundhed guide til pleje og brug af forsøgsdyr og blev godkendt af den institutionelle Animal Care og brug Udvalget på University of Mississippi Medical Center.
1. nyre isolation procedure
- Veje musen (eller andre arter) og aflive det med en isofluran (5%-8%) overdosering eller pentobarbital (150 mg/kg intraperitoneal injektion).
- Når musen er euthanized, åbne sin bughulen ved hjælp af fine kirurgiske saks langs midterlinjen.
- Løft forsigtigt tarmene og det reproduktive fedtvæv til højre side af bughulen. Ved grov dissektion isoleres den venstre nyre. Ved hjælp af fine kirurgiske saks, skære den venstre nyrearterie og vene og forsigtigt fjerne den venstre nyre, placere nyrerne i en passende mærket (mus nummer/identifikator) vejer båd indeholder phosphor-buffer-bufferet saltvand (PBS).
- Gentag proceduren for den rigtige nyre.
- Fjern hver nyre fra sin respektive vejer båd og placere den på en kirurgisk gaze præ-fugtet med PBS.
- Forlader nyrerne på den kirurgiske gaze, hurtigt fjerne enhver vedklædet ikke-renal væv (såsom perirenalt fedtvæv eller binyre) efterfulgt af fjernelse af den renale kapsel. Vejning hver nyre individuelt, registrering af vægten af den venstre og højre nyre separat i en laboratorie notesbog.
2. homogenisering, inkubation, og Straining procedurer
- Når hver nyre er vejet, dræne hver vejer båd PBS og placere nyrerne tilbage i den passende mærket vejer båd. Ved hjælp af en ren barberblad, skære nyrerne i halve, i længderetningen. Placer hver nyre halvdel vender nedad og skær hver halvdel i 2-mm eller mindre stykker.
- Brug samme barberblad, omhyggeligt indsamle og placere de hakkede nyre stykker i en mærket 15-mL konisk rør (mus nummer/identifikator; venstre versus højre nyre).
- Gentag proceduren for den modsatte nyre ved hjælp af et nyt barberblad. Anbring den hakkede nyre i et separat mærket 15 mL konisk rør.
- I et godt ventileret stinkskab tilsættes 5 mL 6 M saltsyre (HCl) til hvert 15 mL konisk rør.
- Sæt hætten på det koniske rør, omrystes forsigtigt nyrerne/HCl-blandingen, og Anbring 15 mL konisk rør i et forvarmet vandbad indstillet til 37 °C i 90 min (* 120 min for rotte nyrer).
- Omrystes kortvarigt hvert 15 mL rør hver 15. minut under inkubationen for at sikre, at alt væv eksponeres for HCl-syre.
- Sæt en 18-G nål i en 5 mL sprøjte (* 10 mL sprøjte til rotte) og fjern forsigtigt sprøjtens stempel. Anbring sprøjten i et 50-mL konisk rør (rør #1) i en stinkhætte.
- Fjern nyre/HCl opløsningen fra vandbad og hæld vævs opløsningen i den åbne ende af sprøjten og sæt 15 mL konisk tube til side i en reagensglas rist. Udskift forsigtigt stemplet og tryk langsomt stemplet ind, så opløsningen udtrækkes gennem nålen og ind i røret #1.
- De 15 mL koniske rør vaskes med 5 mL PBS-opløsning. PBS drejes i det 15 mL koniske rør for at opløse det resterende nyre væv.
- Tag igen forsigtigt stemplet ud af 5 mL-sprøjten, der indeholder 18-G-nålen, og hæld indholdet fra den 15 mL koniske slange i den åbne ende af sprøjten. Udskift forsigtigt stemplet, og skyl sprøjten ved forsigtigt at skubbe stemplet ned i slange #1. Gentag denne proces 2x (udført 3x i alt).
- Sæt en 21-G nål i en ny 5 mL sprøjte (* 10 mL sprøjte til rotte) og fjern forsigtigt sprøjtens stempel. Anbring sprøjten med en 21 G nål påsat i et nyt 50-mL konisk rør (rør #2).
- Hæld indholdet fra slange #1 ind i den åbne ende af sprøjten, der indeholder 21-G nålen. Indsæt forsigtigt stemplet, og skyl sprøjten ved forsigtigt at skubbe ned på sprøjtens stempel og anbringe ekstruderet opløsning i slange #2.
- Vask røret #1 med 5 mL PBS-opløsning. Svor PBS i røret #1 for at opløse eventuelle resterende nyre væv.
- Tag igen forsigtigt stemplet ud af 5 mL-sprøjten, der indeholder 18-G nålen, og hæld indholdet fra slange #1 ind i den åbne ende af sprøjten. Udskift forsigtigt stemplet og skyl sprøjten ved forsigtigt at skubbe ned på stemplet, ekstrudering opløsning i røret #2. Gentag denne proces 2x (udført 3x i alt).
- Bring den totale volumen af røret #2 op til 50 mL ved at tilføje yderligere PBS, op til 50-mL linje på røret #2.
- Rør #2, der indeholder nyre vævs opløsningen, i et rørstativ på en vippe plade i et køleskab, der er indstillet til 4 °C om natten (minimum 8-10 h).
3. tælling af glomeruli og ekstrapolation af Neron nummeret
- Fjern røret #2 fra køleskabet og resuspension af pelleteret væv ved forsigtigt at invertere røret flere gange for at skabe en homogen opløsning. Vi anbefaler at tælle glomeruli inden for 5 d efter forarbejdning.
- Forsigtigt alikvot 500 μl af nyre opløsningen i en enkelt brønd af en 12-brønd plade. Gentag denne 2x, placere hver alikvot i en separat brønd, så der er tre brønde af nyre opløsning pr. nyre, til analyse i triplicat.
- Der tilsættes 500 μL PBS til hver af de tre brønde, der indeholder nyre opløsningen, til en 1:1 fortynding.
- Ved hjælp af en inverteret mikroskop, tælle antallet af glomeruli per brønd. Optælling er hjulpet ved hjælp af et gitter af 16 separate sektioner placeret på bunden af hver brønd. Tæl antallet af glomeruli pr hver gitter sektion og derefter opsummere tælle pr gitter for at få det samlede antal af glomeruli per brønd. Glomeruli kan let identificeres ved deres sfæriske struktur. Yderligere identifikatorer omfattede en rødlig nuance på grund af blod fyldte kapillærer, samt præ-eller post-arterioler, der forbliver fastgjort til kroppen af individuelle glomeruli (figur 1).
- Tilsæt det totale antal glomeruli, der tælles pr. hver af de tre brønde, og divider dem derefter med tre for det gennemsnitlige antal glomeruli pr. 500 μL nyre opløsning. Hvis variansen i det gennemsnitlige antal glomeruli pr. brønd er større end 10%, gentages proceduren for nephron-optælling, idet der lægges stor vægt på nyre opløsningens homogene karakter. Multiplicer antallet af glomeruli tælles pr. brønd gange 100 for det gennemsnitlige antal glomeruli per nyre. Total Neron nummer kan udtrykkes per nyre eller, ved hjælp af nyrevægt, per mg eller g af væv.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Nedenfor er repræsentative estimater af hele nyre Neron nummer fra en etableret musemodel af hypertension og en genetisk rotte model af aldersrelaterede kroniske nyresygdom. Centrale identificerende karakteristika for glomeruli, såsom en sfærisk struktur med eller uden fastgjort præ-eller post-arteriolar eller rørformede strukturer, er fremhævet for dem, der er nye for syre udmnings metoden (figur 1).
I det første eksperimentelle eksempel blev det totale antal Neron-numre bestemt hos mus (mand C57BL/6-ugers alderen), der blev inbrugt med vehikel (saltvand) eller angiotensin II i 14 dage. Hos mus med køretøjer var Neron-nummeret 12.411 ± 248 nefronov pr. nyre som bestemt ved hjælp af syre udblødning (figur 2). Disse estimater er konsistente med intervaller af hele nyre Neron nummer, der tidligere er rapporteret hos mus (tabel 1). Angiotensin øgede atrieflimren med ca. 40 mmHg efter 14 dages infusion og var associeret med en signifikant reduktion i Neron tallet (9.122 ± 193 nefronov pr. nyre) på næsten 26% (figur 2). Disse data tyder på, at angiotensin II-infusion ikke kun er forbundet med hypertension, men også en signifikant reduktion i Neron nummer er forbundet med nephron tab på grund af sklerose eller glomerulær skade.
I det andet eksperimentelle eksempel blev tidligere fund af Nefrotal i en genetisk rotte model af renal agenese, den heterogene stamafledte model af ensidig renal agenese (hsra) rotte, bekræftet. HSRA modellen udviser ufuldstændig gennemtrængende fænotyper for defekter i nyrerne og urinvejene, med nogle dyr, der er født normale (med to nyrer) og andre født med en nyre. Hos rotter født med to nyrer (mandlige hA-Control; 12 ugers alderen) var skønnene over antallet af Neron-numre ved hjælp af syre-udmnings metoden 27.288 ± 336 nefronov pr. nyre (figur 3). I modsætning hertil, hos rotter født med en ensomt nyre (mandlige hA-isolation; 4 ugers alderen) estimater af Neron nummer fandtes at være signifikant lavere ved 24.594 ± 883 nefronov per nyre (figur 3). Skøn over antallet af Neron-tal, der er opnået i disse prøver, er også i overensstemmelse med de intervaller, der tidligere er indberettet hos rotter (tabel 1). Bemærk, at disse data er i overensstemmelse med tidligere fund, hvor hA-solitær rotter fandtes at udstille nedsat nephron begavelse eller tal (sammenlignet med en kontrol nyre) mest sandsynligt afspejler de underliggende genetiske faktorer forbundet med at blive født med en enkelt nyre31.
Figur 1 : Centrale identifikatorer af glomeruli til optælling og vurdering af hele nyre Neron nummer. Glomeruli kan let identificeres ved deres sfæriske struktur, som angivet med pilene. Yderligere identifikatorer omfatter en rødlig nuance på grund af blod fyldte kapillærer, samt præ-eller post-arterioler (eller tubuler), der kan forblive fastgjort til kroppen af individuelle glomeruli efter behandling (som den, der er identificeret i bunden af denne Mikrograf). Også til stede i dette billede er rester af tubuler og blodkar. Forstørrelse = 10X; skala bjælken = 100 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 : Nephron tælle i mus. A) repræsentativt billede af glomeruli fra en enkelt muse nyre belagt i en 22,1-mm fladbundet brønd af en 12-brønd kultur plade, som det ses ved hjælp af et inverteret mikroskop. Glomeruli og renal tubuli ses ved moderat densitet ved fortynding med en faktor på to (0,5 mL nyre opløsning plus 0,5 mL 1x PBS). (B) virkning af et 14-dages køretøj eller angiotensin II-infusion på Neron nummer hos mandlige C57Bl/6-mus vurderet ved glomerulær tælling. Angiotensin II-infusionen ved 1.000 ng/kg/min (via osmotisk mini pumpe) var associeret med hypertension og en markant reduktion i antallet af Neron i forhold til Neron tallet hos mus, der blev infusioneret med køretøjet. Neron numre i køretøjer-inanvendte mus er i overensstemmelse med tidligere rapporterede estimater af Neron nummer i mus (tabel 1). Køretøj: n = 3, angiotensin II: n = 3, *p < 0,05. Fejllinjer = SE. forstørrelse = 4X; skala bjælken = 250 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3 : Nephron optælling i rotter. A) repræsentativt billede af glomeruli fra en enkelt nyre forzinket i en 22,1-mm fladbundet brønd af en 12-brønd kultur plade, som det ses ved hjælp af et inverteret mikroskop. Glomeruli og renal tubuli ses ved en signifikant højere densitet sammenlignet med mus. (B) kvantificering af Neron tallet i Hsra-Control og Hsra-s rotter afslører, at Neron tallet er mindre i Hsra-s sammenlignet med Hsra-C-rotter og i overensstemmelse med tidligere fund i denne model31. HSRA-C, rotter født med to nyrer: n = 3; HSRA-S, rotter født med en ensomt nyre: n = 3,* p < 0,05. Fejllinjer = SE. forstørrelse = 4X; skala bjælken = 250 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
| Arter | Nephron antal pr. nyre | Reference |
| Musen | 9000-21000 | 18-22, 28 |
| Rotte | 13000-27000 | 31, 33 |
| Får | 200000-800000 | 23, 29, 34 |
| Gris | 1600000-4600000 | 32, 35 |
| Menneskelige | 500000-2000000 | 8-15 af |
Tabel 1: rapporterede intervaller af Neron nummer i flere arter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Med god eksperimentel teknik, syre udblødning metode er ideel til at estimere Neron nummer i hele nyrerne. Selv om nyrerne er opløst i syre, glomeruli forbliver stort set intakt og er let identificerbare, hvilket gør optællingen af individuelle glomeruli relativt let og ligetil. Den syremace ration teknik er særlig fordelagtig af flere grunde. For det første er syre udblødning metode en hurtig og bekvem metode, der kræver relativt lidt i form af udgifter og fysisk anstrengelse. Alle reagenser og forbrugsstoffer, der er nødvendige for at udføre syre udmnings metoden, er let tilgængelige i de fleste basis laboratorier, og det eneste væsentlige krav er adgang til et inverteret mikroskop til glomerulær tælling. Med hensyn til bekostning, anslås det, at den sure maceration metode koster blot et par hundrede dollars pr. dyr, hvilket ikke er en masse i forhold til omkostninger forbundet med andre metoder til hele nyre glomerulær tælling, såsom magnetisk resonans imaging, som kan variere i tusindvis af dollars pr. dyr af scanningstid og teknisk ekspertise.
For det andet, den sure maceration metode indebærer betydeligt mindre væv-Processing tid i forhold til andre metoder til hele nyre Neron nummer såsom dissector/Fractionator metode24. Fra start til, syre udblødning metode kræver mindre end 24 timer af samlede tid, hvoraf mindre end 1-2 timer er brugt forarbejdning af nyrer og derefter tælle de enkelte glomeruli pr forsøgsdyr. I modsætning hertil er dissector/Fractionator metode arbejdskraftintensiv, der kræver en anslået 15 timers arbejdskraft (4-6 timer af skæring, 2-3 timers farvning, og 4-5 timers optælling tid) pr. nyre, ikke medregnet 48-72 timer, der er nødvendige for at behandle nyrerne i GL ycol methacrylat24. På grund af fordelene ved omkostninger og tid, syre maceration metode er især nyttig i undersøgelser, hvor estimater af hele nyre Neron nummer skal foretages i et stort antal dyr med eller uden genetiske eller farmakologiske interventioner. Både omkostninger og tid involveret med dissector/Fractionator metode og magnetisk resonans imaging er blevet betragtet som en væsentlig begrænsende faktor i deres vedtagelse i de fleste forskningslaboratorier.
Endelig, den sure maceration metode giver estimater af hele nyre Neron nummer, der er sammenlignelige med foranstaltninger ved hjælp af mere sofistikerede metoder såsom magnetisk resonans imaging26. For eksempel, ved hjælp af kationisk ferritin-mærkning af glomeruli og tredimensionel billedbehandling til at tælle hver Neron i en enkelt nyre fra Sprague-Dawley rotte, gav magnetisk resonans imaging på gennemsnitlige tællinger af 34.000 individuelle glomeruli per nyreinsufficiens26. I ikke-kationiske ferritin-mærkede nyrer, gav magnetisk resonansbilleddannelse antal af 2.000 nephron-lignende strukturer på grund af optælling af ikke-glomerulære regioner af nyre med magnetiske signaler af samme størrelsesorden og form som ferritin-mærket glomeruli. Når disse artefakter er trukket fra tællinger bestemt af kationiske ferritin-mærkede nyrer, det effektive antal af glomeruli bestemmes, ved hjælp af magnetisk resonans imaging, er tættere på 32.000 nefronov per nyre26. I samme undersøgelse gav validerings eksperimenter gennemsnitlige glomerulære tal på 31.000 pr. nyre ved hjælp af syre udblødning metode26. Således, syre maceration metode producerer estimater af hele nyre Neron nummer, der er inden for < 5% af dem, der bestemmes ved hjælp af state-of-the-art teknikker såsom magnetisk resonans imaging.
Selv om der er flere vigtige fordele forbundet med syre udblødning metode, bør investigatorerne også være opmærksomme på de begrænsninger, der er forbundet med denne metode. En begrænsning vedrører brugen af hele nyrer. Da hele nyrerne er opløst og homogeniseret, kan oplysninger om den rumlige fordeling af glomeruli i nyre cortex ikke bestemmes. Hvis kendskab til intrarenal fordeling af glomerulær volumen er vigtig, så brugen af magnetisk resonans imaging ville være en bedre egnet metode.
Sammenlignet med andre metoder, brugen af syre udblødning metode synes at en anelse undervurdere samlede Neron nummer. De mindre estimater skyldes sandsynligvis til dels opløsningen af en lille procentdel af glomeruli i syren eller under udblødning af nyrerne. Hertil kommer, med aldring eller sygdom, er der et tab af funktionelle nephrons, som, selv om de ikke bidrager til urin dannelse, kan være mere følsomme over for sure maceration og kan blive ødelagt under forarbejdningen, og dermed bidrage til lavere skøn over total nephron Antallet. Derfor bør der udvises forsigtighed ved opsamling og behandling af nyrer, så der ikke efterlades noget nyre væv in vivo ved hakning af nyrerne eller i sprøjter ved ekstrudering af vævsprøver. Samlet set ser det dog ud til, at den undervurdering af det totale nerontal, der skyldes vævs behandling, er relativt lille.
Da optællingen af glomeruli ved hjælp af syre udblødning metode er subjektiv, undervurdering af Neron nummer kan også være reflekterende af observatør bias, som let kan overvindes ved målinger, der udføres af to separate undersøgere blindet til oplysninger om forsøgsdyr eller tilstand. Hvis der er en betydelig bekymring for, hvad der udgør en glomerulus, ville en alternativ tilgang indebære, at forsøgsdyr med jernoxid blev inficeret før eutanasi. Ved intravenøs infusion vil jernoxid komme ind og blive fanget i glomerulus; således forarbejdede glomeruli bør plette mørk sort, giver mulighed for en større identifikation af glomeruli ved optælling30.
Den sure udblødning metode anslår hele nyre Neron nummer baseret på målingen af små prøver (3 x 0,5 mL eller 1,5 mL) i modsætning til målinger af hele opløsningen af nyre (50 mL). Syre udblødning metoden er meget reproducerbar i naturen, og glomeruli tæller i prøver af en enkelt nyre og inden for eksperimentelle grupper er fundet at være meget konsekvent. Desuden er repræsentative resultater rapporteret i denne undersøgelse af vildtype-C57Bl/6-mus og-rotter født med en enkelt nyre (figur 2 og 3) i høj grad konsistente med tidligere fund samt med tidligere rapporterede intervaller (tabel 1 )5,31. Hvis det ønskes, kan yderligere målinger let gøres for bedre at estimere det samlede Neron nummer pr. nyre.
Mens syren maceration teknik giver pålidelige og gentagelige estimater af Neron nummer, denne metode anbefales ikke til at opnå målinger af glomerulær volumen, som eksponering for syre sandsynligvis producerer ændringer i glomeruli volumen. Da bestemmelse af glomerulær volumen er vigtig ved bestemmelse af hele nyre-glomerulære overfladeareal, anbefales det, at sådanne målinger foretages ved hjælp af histologiske og stereologiske metoder24,25. Især, stereologiske metoder, der gør brug af glykol methacrylat indlejre nyrerne for at begrænse vævshævelse og ekspansion og dermed opretholde glomerulær geometri så tæt som muligt på, at in vivo.
Endelig, en anden begrænsning af syre udblødning teknik, og en, der er fælles for andre metoder til vurdering af Neron nummer, er, at ingen oplysninger om glomerulær funktion (såsom glomerulær filtrationshastighed) kan konstateres fra glomeruli gang Forarbejdede. Mens individuelle glomeruli kan tælles, kan dets funktionelle status (urin dannende eller ikke-urin dannende) således ikke bestemmes ved hjælp af syre-maceration metoden. På samme måde kan der ikke konstateres nogen tidsserie oplysninger ved hjælp af syre udblødning i individuelle mus. I stedet er særskilte grupper af dyr på forskellige tidspunkter forpligtet til at få indblik i ændringer i Neron nummer over et dyrs levetid eller præ-eller post genetiske eller farmakologiske intervention.
Sammenfattende, den syre maceration metode er en billig, høj gennemløb, og effektiv metode til at estimere hele nyre Neron nummer. Syre-maceration-metoden giver en høj grad af reproducerbarhed, som det fremgår af de to eksempler, der præsenteres her, samt af dem, der tidligere er rapporteret ved hjælp af denne metode18,19,20,21 , 22 ud af , 28. mens brugen af syre maceration metode blev beskrevet til brug i mus (og rotte), syre udblødning metode kan også skaleres til brug i større arter, såsom hunden og gris27,32.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev delvist støttet af National Institutes of Health, national Heart, Lung og Blood Institute (R01HL107632).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isoflurane anesthesia | Abbott Laboratories | 05260-05 | |
| Isoflurane vaporizor system & flow gauge | Braintree Scientific | VP I | Include medical grade oxygen supply |
| Leica Inverted Microscope DMIL LED | Leica Microsystems | DMIL LED | Any make also suitable |
| Digital water bath | Fisher Scientific | 2239 | Any make also suitable |
| ToughCut Fine surgical scissors | Fine Science Tools | 14058-11 | 25 mm cutting edge, 11.5 cm length; Tips: sharp-sharp; Tip shape: straight |
| Micro dissecting forceps 4 1/4 in. | Biomed Res Instruments, Inc | 10-1760 | Curved tip |
| Plexiglass board 5 in. x 7 in. | any source suitable | n/a | Any make also suitable |
| Hexagonal polystyrene weighing dish | Fisher Scientific | 02-2002-100 | Any make also suitable |
| Razor blades | Fisher Scientific | 12-640 | Single edge carbon steel 0.009 |
| Gauze sponges 4 x 4 in. 8 ply | Fisher Scientific | MSD-1400250 | |
| 10x concentrate phosphate buffered saline (PBS) | Sigma Aldrich | P5493-4L | Dilute to 1x |
| 6 N Hydrocholric acid solution | Sigma Aldrich | 3750-32 | |
| 15 mL conical centrifuge tube | Fisher Scientific | 14-959-70C | Any make also suitable |
| 50 mL conical centrifuge tube | Fisher Scientific | 14-959-49A | Any make also suitable |
| Disposable 5 mL syringe | Cole Palmer | EW-07944-06 | Any make also suitable |
| 18G1.5 disposable needle | Fisher Scientific | 14-826-5D | Any make also suitable |
| 21G1.5 disposable needle | Fisher Scientific | 14-826-5B | Any make also suitable |
| 12-well multiple-well cell culture plates with lid | Cole Palmer | #FW-01959-06 | Any make also suitable |
| Polypropylene modular test tube rack | Cole Palmer | #EW-06733-00 | Capable of accommodating 15 and 50 mL conical tubes; any make also suitable |
References
- Hall, J. E., Guyton, A. C. Guyton and Hall Textbook of Medical Physiology. , 13th, Elsevier. Philadelphia, PA. (2016).
- Wang, X., Garrett, M. R. Nephron number, hypertension, and CKD: physiological and genetic insight from humans and animal models. Physiological Genomics. 49 (3), 180-192 (2017).
- Didion, S. P. A novel genetic model to explore the Brenner hypothesis: Linking nephron endowment and number with hypertension. Medical Hypotheses. 106, 6-9 (2017).
- Brenner, B. M. Nephron adaptation to renal injury or ablation. American Journal of Physiology. 249 (3 Pt 2), F324-F337 (1985).
- Didion, S. P., Wang, X., Garrett, M. R. Direct correlation between blood pressure and nephron endowment in a genetic model of hypertension. Hypertension. 68, A052 (2016).
- Luyckx, V. A., Brenner, B. M. The clinical importance of nephron mass. Journal of the American Society of Nephrology. 21 (6), 898-910 (2010).
- Mackenzie, H. S., Brenner, B. M. Fewer nephrons at birth: a missing link in the etiology of essential hypertension? American Journal of Kidney Diseases. 26 (1), 91-98 (1995).
- Nyengaard, J. R., Bendtsen, T. F. Glomerular number and size in relation to age, kidney weight, and body surface in normal man. The Anatomical Record. 232 (2), 194-201 (1992).
- Denic, A., Glassock, R. J., Rule, A. D. Structural and functional changes with the aging kidney. Advances in Chronic Kidney Disease. 23 (1), 19-28 (2016).
- Denic, A., et al. The substantial loss of nephrons in healthy human kidneys with aging. Journal of the American Society of Nephrology. 28 (1), 313-320 (2016).
- Keller, G., Zimmer, G., Mall, G., Ritz, E., Amann, K. Nephron number in patients with primary hypertension. The New England Journal of Medicine. 348 (2), 101-108 (2003).
- Hoy, W. E., et al. Nephron number, glomerular volume, renal disease and hypertension. Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 17 (3), 258-265 (2008).
- Hoy, W. E., et al. Distribution of volumes of individual glomeruli in kidneys at autopsy: association with age, nephron number, birth weight and body mass index. Clinical Nephrology. 74 (Suppl 1), S105-S122 (2010).
- Hughson, M. D., et al. Hypertension, glomerular hypertrophy and nephrosclerosis: the effect of race. Nephrology Dialysis Transplantation. 29 (7), 1399-1409 (2014).
- Puelles, V. G., et al. Glomerular number and size variability and risk for kidney disease. Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 20 (1), 7-15 (2010).
- Brenner, B. M., Garcia, D. L., Anderson, S. Glomeruli and blood pressure. Less of one, more of the other? American Journal of Hypertension. 1 (4 Pt 1), 335-347 (1988).
- Clark, A. T., Bertram, J. F.
- Benz, K., et al. Early glomerular alterations in genetically determined low nephron number. American Journal of Physiology Renal Physiology. 300 (2), F521-F530 (2011).
- Zhao, H., et al. Role of fibroblast growth factor receptors 1 and 2 in the ureteric bud. Developmental Biology. 276 (2), 403-415 (2004).
- Sims-Lucas, S., Caruana, G., Dowling, J., Kett, M. M., Bertram, J. F. Augmented and accelerated nephrogenesis in TGF-beta2 heterozygous mutant mice. Pediatric Research. 63 (6), 607-612 (2008).
- Cullen-McEwen, L. A., Kett, M. M., Dowling, J., Anderson, W. P., Bertram, J. F. Nephron number, renal function, and arterial pressure in aged GDNF heterozygous mice. Hypertension. 41 (2), 335-340 (2003).
- Stelloh, C., et al. Prematurity in mice leads to reduction in nephron number, hypertension and proteinuria. Translational Research. 159 (2), 80-89 (2012).
- Galinsky, R., et al. Effect of intra-amniotic lipopolysaccharide on nephron number in preterm fetal sheep. American Journal of Physiology Renal Physiology. 301 (2), F280-F285 (2011).
- Bertam, J. F., et al. Why and how we determine nephron number. Pediatric Nephrology. 29 (4), 575-580 (2014).
- Nyengaard, J. R. Stereologic methods and their application in kidney research. Journal of the American Society of Nephrology. 10 (5), 1100-1123 (1999).
- Beeman, S. C., et al. Measuring glomerular number and size in perfused kidneys using MRI. American Journal of Physiology Renal Physiology. 300 (6), F1454-F1457 (2011).
- Damadian, R. V., Shawayri, E., Bricker, N. S. On the existence of non-urine forming nephrons in the diseased kidney of the dog. Journal of Laboratory and Clinical Medicine. 65, 26-39 (1965).
- Bonvalet, J. P., et al. Number of glomeruli in normal and hypertrophied kidneys of mice and guinea-pigs. The Journal of Physiology. 269 (3), 627-641 (1977).
- Bains, R. K., Sibbons, P. D., Murray, R. D., Howard, C. V., Van Velzen, D. Stereological estimation of the absolute number of glomeruli in the kidneys of lambs. Research in Veterinary Science. 60 (2), 122-125 (1996).
- Assmann, K. J., van Son, J. P., Koene, R. A. Improved method for the isolation of mouse glomeruli. Journal of the American Society of Nephrology. 2 (4), 944-946 (1991).
- Wang, X., et al. Nephron deficiency and predisposition to renal injury in a novel one-kidney genetic model. Journal of the American Society of Nephrology. 26 (7), 1634-1646 (2015).
- Lodrup, A. B., Karstoft, K., Dissing, T. H., Pedersen, M., Nyengaard, J. R. Kidney biopsies can be used for estimations of glomerular number and volume: a pig study. Virchows Archiv. 452 (4), 393-403 (2008).
- Fassi, A., et al. Progressive glomerular injury in the MWF rat is predicted by inborn nephron deficit. Journal of the American Society of Nephrology. 9 (8), 1399-1406 (1998).
- Wintour, E. M., et al. Reduced nephron number in adult sheep, hypertensive as a result of prenatal glucocorticoid treatment. The Journal of Physiology. 549 (Pt 3), 929-935 (2003).
- Van Vuuren, S. H., et al. Compensatory growth of congenital solitary kidneys in pigs reflects increased nephron numbers rather than hypertrophy. PLoS One. 7 (11), e49735 (2012).
