Summary
全腎ネフロン数の推定値は、ネフロン数と腎および心血管疾患のリスクの亢進との間に逆相関があるので、臨床的および実験的に重要である。ここで、全腎ネフロン数の迅速かつ信頼性の高い推定を提供する酸性揉捻法の使用が、実証されている。
Abstract
ネフロンは、ヒトの nephrogenesis が妊娠の36週までに完了し、新たなネフロンが誕生後に形成されないため、個体が生まれたネフロンの合計数を指します。ネフロン数は、出生後の任意の時点で測定されたネフロンの総数を指す。遺伝的要因と環境因子の両方がネフロンの両方のエンダウメントと数に影響を与えます。特定の遺伝子または因子が nephrogenesis およびネフロンの損失または終焉の過程にどのように影響するかを理解することは、より低いネフロンのエンダウメントまたは数を持つ個人が腎または心血管疾患を発症するリスクが高いと考えられるために重要である。人の一生にわたる環境曝露がネフロン数にどのように影響するかを理解することは、将来の疾患リスクを決定する上でも重要である。したがって、全腎ネフロン数を迅速かつ確実に評価する能力は、nephrogenesis またはネフロン損失に寄与または促進するメカニズムをよりよく理解するための基本的な実験要件である。ここでは、Damadian、Shawayri、およびブリッカーによって記述された手順に基づいて、腎臓全体のネフロン数を推定するための酸揉捻法について説明し、わずかな変更を加えた。酸性マセレーション法は、ネフロン数 (糸球体を計数することによって評価される) の 5% 以内であり、より高度な、しかし高価であるが、磁気共鳴イメージングなどの方法を用いて決定されたもののうちの、迅速で信頼できる推定値を提供する。さらに、酸性マセレーション法は、多数のサンプルまたは実験条件においてネフロン数を評価する優れた高スループット方法である。
Introduction
ネフロンは腎臓1の基本的な構造および機能単位の両方である。構造的には、ネフロンは、ボーマンカプセルおよび腎細管内に位置する糸球体 (毛細血管および podocytes) と、近位細管、ヘンレのループ、および収集ダクトに終端する遠位細管からなる。機能的には、ネフロンの役割は、水と電解質の濾過と再吸収、および廃棄物の分泌である。一般に、nephrogenesis は、マウスおよびラット2のようないくつかの種において出生直後のヒトおよび生後約36週に完了する。ネフロンは、個体が生まれたネフロンの総数を指し、一方、ネフロン数は出生後3の任意の時点で測定されたネフロンの合計数です。ネフロン数および糸球体数という用語は、しばしば同義的に用いられる。ネフロンごとの糸球体は1つしか存在しないため、糸球体数の評価はネフロン数を推定するための重要なサロゲートです。
ネフロンのエンダウメントとネフロン数の評価は、研究がネフロン基金と心血管疾患の発生率の増加とのネフロン数との関連を示したので、臨床的な関心である4,5 、6、7、8、9、10、11、12、13、14、剖検における腎臓の所見に基づいて、ブレンナーは、高血圧の個体が normotensive 個人16よりも低い総ネフロン数を提示したことを観察した。このように、ブレナーは、ネフロン数と、後の人生において高血圧を発症するリスクとの間に逆の関係があると仮説を立てた。ブレンナーはまた、ネフロン数の減少が残ったネフロンによって補われるという仮説を立てた。腎臓における正常な濾過速度を維持するために、残留ネフロンは糸球体表面領域 (糸球体肥大) を増加させることによって補償し、それによって腎機能上のネフロン損失の任意の有害作用を緩和するように働く4 、16。
短期的には、糸球体肥大は、長期的には、ナトリウムおよび体液貯留の増加、細胞外液量の増加、および動脈血圧の上昇を招き、さらに増加する悪循環に至る。糸球体毛細血管圧、糸球体 hyperfiltration、およびネフロン瘢痕化 (硬化症) および傷害4、16。
推定値またはネフロン数のカウントは、実験的な利点のカップルを提供しています: 1) それは、その後、胚または母体-胎児環境における特定の遺伝子または因子にリンクすることができる nephrogenesis のプロセスに関する情報を提供し、2)心血管疾患とネフロン数の関連があり、したがって、将来の心血管リスク2、17、18を予測するために、ネフロン数の推定値が使用できる可能性があります。19,20,21,22. 母体胎児環境に加えて、いくつかの疾患は、アテローム性動脈硬化症、糖尿病、高血圧、さらには正常な老化を含むネフロン数および腎機能に直接影響を与える2、9、 10、11、12、22、23。したがって、全腎ネフロン数の評価は、人の生命の経過にわたる nephrogenesis (すなわちネフロン) およびネフロン数に影響する遺伝的および環境的要因の両方を理解するために重要であり、その結果として生じる効果腎機能と心血管の健康に.
現在、ネフロン数の決定と定量化のために利用可能ないくつかの方法があり、それぞれに独自の利点と制限があります24、25、26、27、28 、29、30。全腎ネフロン数を決定するための洗練された方法には、解剖器/fractionator 法、および磁気共鳴画像25、26などの stereological 方法が含まれる。多くの場合、腎臓全体のネフロン数を決定するための金標準と考えられているが、解剖器/fractionator 法は高価で時間がかかる。磁気共鳴イメージングと処理の最近の進歩と改善は、一つ一つのネフロンを個別にカウントするためのツールを提供してきました。しかし、磁気共鳴イメージングは、時間がかかるだけでなく、非常に高価です。さらに、解剖器/fractionator 法と磁気共鳴画像の両方が高度な技術的専門知識を必要とするため、大部分の研究所でこのような方法の使用を制限しています。
ネフロン数を決定するほとんどの方法は、糸球体の同定に基づいてカウントまたは推定を行い、構造的に容易に識別可能である。本論文では、全腎臓においてネフロン数を推定するための酸揉捻法について説明し、27を示した。酸揉捻法は、高速で信頼性が高く、解剖器/fractionator 法や磁気共鳴イメージングなどの他の方法よりも大幅に安価です。さらに、この酸性揉捻法は、磁気共鳴イメージング26を用いて決定されたものの範囲内にあると報告しているネフロン数の再現性の高い推定値を提供する。
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Protocol
以下に記載されている供給物および試薬は、1匹のマウス、すなわち2つの腎臓における全腎ネフロン数の決定のためのものである。ラットのための酸揉捻法の使用のための修正は、アスタリスクで識別されます.すべての実験プロトコールは、実験動物のケアと使用のための健康ガイドの国立研究所に適合し、ミシシッピ大学医療センターの機関の動物ケアと使用委員会によって承認されました。
1. 腎分離手順
- マウス (または他の種) を計量し、イソフルラン (5%-8%) で euthanize過剰投与またはペントバルビタール (150 mg/kg 腹腔内注射).
- マウスを安楽死させると、正中線に沿って微細な外科用はさみを使用して腹腔を開く。
- 腸と生殖用脂肪を腹腔の右側に慎重に持ち上げます。グロス解剖によって、左腎臓を分離する。微細な手術用はさみを使用して、左腎動脈および静脈を切断し、慎重に左腎臓を除去し、腎臓を適切に標識された (マウス番号/識別子) 蛍光体緩衝生理食塩水 (PBS) を含むボートの重量を量る。
- 右の腎臓のための手順を繰り返します。
- それぞれの重さのボートから各腎臓を削除し、PBS で予め湿らせた手術用ガーゼの上に置きます。
- 手術ガーゼの上に腎臓を残し、すぐに腎カプセルの除去に続く任意の付着性の非腎組織 (perirenal 脂肪または副腎など) を除去します。それぞれの腎臓を個別に秤量し、実験ノートにおいて左右の腎臓の体重を別々に記録する。
2. 均質化、インキュベーション、および負担の手順
- 各腎臓を計量したら、PBS の各重量ボートを排水し、適切に標識された計量ボートに戻って腎臓を置きます。清潔なかみそりの刃を使用して、腎臓を縦に半分に切ってください。各腎臓を下に向けて半分にし、2 mm またはそれよりも小さい部分にそれぞれの半分をカットします。
- 同じ剃刀を使用して、細かく刻んだ腎臓の断片を標識された 15 mL の円錐形の管 (マウス番号 /識別子; 左と右の腎臓) に入れます。
- 新しいかみそりの刃を使用して、反対の腎臓のための手順を繰り返してください。みじん切りにした腎臓を、別々に標識された 15 mL 円錐状のチューブに入れます。
- 風通しの良いヒュームフードで、各 15 mL 円錐管に 6 M の塩酸 (HCl) 酸 5 mL を加えます。
- キャップを円錐管に交換し、腎臓/HCl 混合物を静かに攪拌し、15 mL の円錐形のチューブを、37° c で設定した予熱した水浴中に90分 (ラット腎臓の場合は * 120 min) に置きます。
- すべての組織が HCl に暴露されることを確実にするために、インキュベーション中に15分ごとに各 15 mL のチューブを簡単に攪拌ます。
- 18グラムの針を5ml の注射器に挿入し (* 10 mL シリンジをラット用)、慎重にシリンジを取り外します。50の円錐形のチューブ (チューブ #1) をヒュームフードに入れて注射します。
- 水浴から腎臓/HCl 溶液を取り出し、シリンジの開いた端に組織溶液を注ぎ、試験管ラックに 15 mL の円錐管を脇に置きます。慎重にプランジャーを交換し、溶液を針を通してチューブ #1 に押し出すようにプランジャーをゆっくりと押し込みます。
- 5ml の PBS 溶液で 15 mL の円錐形のチューブを洗浄します。残りの腎臓組織を可溶化ように、15 mL の円錐管で PBS を旋回させる。
- 再度、18 G 針を含んでいる 5 mL のスポイトからプランジャーを注意深く取除き、15の mL の円錐形の管からスポイトの開いた端に内容を注ぐ。慎重にプランジャーを交換し、チューブ #1 に、プランジャーをゆっくりと押し下げてシリンジをフラッシュします。このプロセスの2x を繰り返します (合計で3倍になります)。
- 新しい 5 mL シリンジ (ラット用10ml シリンジ) に 21 G 針を挿入し、注射器プランジャーを慎重に取り外します。新しい 50 mL の円錐形の管 (管 #2) に付す 21 G の針が付いているスポイトを置きなさい。
- チューブ #1 から、21 G 針を含むシリンジの開いた端に内容物を注ぎます。慎重にプランジャーを挿入し、シリンジのプランジャーをゆっくりと押し下げてシリンジをフラッシュし、押出液をチューブ #2 に入れます。
- PBS 溶液 5 mL で洗浄チューブ #1。可溶化チューブ内の PBS を旋回させることで、残りの腎臓組織を維持することができ #1。
- 再度、18 G 針を含んでいる 5 mL のスポイトからプランジャーを慎重に取除き、スポイトの開いた端に管 #1 からの内容を注ぐ。プランジャーを慎重に交換し、プランジャーを静かに押し下げてシリンジをフラッシュし、溶液をチューブ #2 に押し出します。このプロセスの2x を繰り返します (合計で3倍になります)。
- チューブ #2 の 50-mL ラインまで、PBS を追加して、チューブ #2 の総量を最大 50 mL にします。
- 4° c で一晩 (最小 8-10 h) に設定された冷蔵庫のロッカープレート上のチューブラックに腎臓組織溶液を含むインキュベートチューブ #2。
3. ネフロン数の糸球体と外挿のカウント
- 冷蔵庫からチューブ #2 を取り外し、均質な溶液を作成するために、チューブを穏やかに数回反転させることによってペレット化された組織を再懸濁します。処理後 5 d 以内で糸球体を数えることをお勧めします。
- 慎重にアリコートの500μ l を12ウェルプレートの単井戸に注入します。この2x を繰り返して、各アリコートを別々の井戸に置き、腎臓あたりの腎臓溶液の3つのウェルがあるように、三連での分析のために。
- 腎溶液を含む3つのウェルのそれぞれに500μ l の PBS を添加し、1:1 希釈する。
- 倒立顕微鏡を使用して、ウェルあたり糸球体の数をカウントします。カウントは、各ウェルの底部に配置された16の別々のセクションのグリッドを使用することによって助けられる。各グリッドセクションごとの糸球体の数をカウントし、1つのウェルあたりの合計数の糸球体を取得するには、1個あたりの数を合計します。糸球体は、それらの球状構造によって容易に識別可能である。付加的な識別子は、血液で満たされた毛細血管による赤みを帯びた色相、ならびに個々の糸球体の身体に付着したままであるプレ細動脈または後血管を含む (図 1)。
- 3つの井戸のそれぞれについてカウントされた糸球体の合計数を追加し、腎臓液500μ l あたり糸球体の平均数の3つによってそれらを分割します。ウェルあたりの平均糸球体数の分散が 10% を超える場合は、腎臓溶液の均質な性質に細心の注意を払って、ネフロンの手順を繰り返します。1腎あたりの平均糸球体数について、ウェルタイムズ100あたりの糸球体数を乗算します。合計ネフロン数は、腎臓ごとに、または腎臓の重量を使用して、mg または g の組織ごとに発現させることができる。
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Representative Results
以下は高血圧の確立されたマウスモデルからの全腎ネフロン数の代表的な推定値と加齢性慢性腎疾患の遺伝的ラットモデルである。事前または細動脈後、または管状構造に接続されているかどうかにかかわらず、球状構造のような糸球体の主要な識別特性は、酸性マセレーション法に新しいものについては強調しています (図 1)。
第1の実験例において、総ネフロン数は、ビヒクル (生理食塩水) またはアンジオテンシン II を注入したマウスにおいて14日間にわたって測定された。ビヒクル注入マウスにおいて、ネフロン数は、酸性マセレーション法を用いて決定された腎臓あたり12411±248ネフロンであった (図 2)。これらの推定値は、マウスで以前に報告された全腎ネフロン数の範囲と一致している (表 1)。アンジオテンシンは、注入の14日後に約40の mmHg によって心房圧を増加させ、ほぼ 26% のネフロン数 (9122 ±193ネフロン) の有意な減少と関連していた (図 2)。これらのデータは、アンジオテンシン II 注入が高血圧に関連しているだけでなく、また、ネフロン数の有意な減少が、硬化または糸球体損傷によるネフロンの損失に関連していることを示唆している。
第2の実験例では、腎 agenesis の遺伝子ラットモデルにおけるネフロン数の以前の所見が、片側腎 agenesis (HSRA) ラットの異種株由来モデルについて、確認された。HSRA モデルは、腎臓と尿路の欠陥のための不完全な penetrance 表現型を展示しています, いくつかの動物が正常に生まれていると (2 腎臓) そして、1つの腎臓で生まれた他の.2つの腎臓 (男性 hA 対照、12週齢) で生まれたラットでは、ネフロン数の推定値は、1腎臓当たり27288±336ネフロンであった (図 3)。これに対して、単独の腎臓で生まれたラット (男性 hA、4週齢) ではネフロン数の推定値は腎臓当たり24594±883ネフロンで有意に低いことがわかった (図 3)。これらのサンプルで達成されたネフロン数の推定値もまた、ラットで以前に報告した範囲と一致している (表 1)。これらのデータは、ネフロンのエンダウメントまたは数の減少を示すことが見出された以前の所見と一致していることに注意してください (1 つの対照腎臓と比較して) 生まれたことに関連する根底にある遺伝的要因の最も可能性の高い反射単一の腎臓31を有する。
図 1:すべての腎臓ネフロン数をカウントし、評価するための糸球体のキー識別子。糸球体は、矢印で示されるように、球体構造によって容易に識別可能である。追加の識別子は、血液によって満たされた毛細血管による赤みがかった色相、ならびに以下の処理の個々の糸球体の身体に付着したままであり得る前または後細動脈 (または細管) を含む (この底で同定されたもののように顕微鏡写真)。また、この画像には、細管および血管の残骸が存在する。倍率 = 10X;スケールバー = 100 μ m。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 2: ネフロンはマウスで数える。(A) 1 匹のマウスからの糸球体を12ウェル培養プレートの22.1 フラット底井戸に播種して、倒立顕微鏡を用いて観察した場合の代表的な画像。糸球体および腎尿細管は、2つの因子によって希釈されたときに適度な密度で見られる (0.5 mL の腎溶液と 1x PBS の 0.5 mL を加えた)。(B) 糸球体計数によって評価された雄 C57Bl/6 マウスにおけるネフロン数に対する14日ビヒクルまたはアンジオテンシン II 注入の効果。1000 ng/kg/分 (浸透圧ミニポンプを介して) のアンジオテンシン II 注入は、高血圧と関連し、ビヒクルを注入したマウスにおけるネフロン数と比較してネフロン数の減少を示した。ビヒクル注入マウスにおけるネフロン数は、マウスにおけるネフロン数の以前に報告された推定値と一致している (表 1)。車両: n = 3, アンジオテンシン II: n = 3, *p < 0.05.誤差バー = SE 倍率 = 4Xスケールバー = 250 μ m。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 3: ラットのネフロンカウント。(A) 倒立顕微鏡を用いて見られるように、1匹のラット糸球体から12ウェル培養プレートに22.1 でめっきされた単ねずみ腎の代表画像。糸球体および腎尿細管は、マウスにおけるそれと比較して有意に高い密度で見られる。(B) HSRA および HSRA ラットにおけるネフロン数の定量化は HSRA ラットと比較して HSRA においてネフロン数が少ないことを明らかにし、このモデル31における以前の所見と一致した。HSRA、2つの腎臓で生まれたラット: n = 3;HSRA-S, 孤立した腎臓で生まれたラット: n = 3,* p < 0.05.誤差バー = SE 倍率 = 4Xスケールバー = 250 μ m。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
| 種 | 腎臓あたりのネフロン数 | 参照 |
| マウス | 9000-21000 | 18-22, 28 |
| ラット | 13000-27000 | 31、33 |
| 羊 | 200000-800000 | 23、29、34 |
| 豚 | 1,600,000-4,600,000 | 32、35 |
| 人間 | 500000-2000000 | 8-15 |
表 1: いくつかの種におけるネフロン数の報告範囲。
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Discussion
優れた実験技術により、酸性マセレーション法は、腎臓全体のネフロン数を推定するのに理想的です。腎臓は酸に溶解しているが、糸球体はほとんど無傷のままであり、容易に識別可能であるため、個々の糸球体の計数は比較的容易で簡単である。この酸性マセレーション技術は、いくつかの理由により特に有利である。第1に、酸性マセレーション法は、費用と身体的努力の面で比較的少ない必要がある迅速かつ簡便な方法である。酸性マセレーション法を実行するために必要なすべての試薬および消耗品は、ほとんどの基本的な実験室で容易に入手可能であり、糸球体計数のための倒立顕微鏡へのアクセスである唯一の主要な要件である。費用の面では、酸マセレーション法は、動物1匹あたりわずか数百ドルの費用がかかると推定されており、これは、磁気共鳴画像法のような全腎糸球体の計数の他の方法に関連するコストと比較して、多くはないこれは、スキャン時間と技術的な専門知識の動物当たり数千ドルに及ぶことができます。
第2に、酸揉捻法は、解剖器/fractionator 法24のような全腎ネフロン数の他の方法と比較して有意に少ない組織処理時間を伴う。最初から最後まで、酸揉捻法は、1-2 時間未満は、腎臓の処理に費やされ、実験動物ごとに個々の糸球体をカウントしているの合計時間の24時間未満を必要とします。対照的に、解剖器/fractionator 法は、労働集約的であり、腎臓あたりの労働の推定15時間 (4-6 時間、染色の 2-3 時間、および 4-5 時間の計数時間) を必要とし、48-72 時間を含まない。ycol メタクリレート24.費用および時間の利点のために、酸性マセレーション法は、全腎ネフロン数の推定が遺伝的または薬理学的介入の有無にかかわらず多数の動物で行われる必要がある研究において特に有用である。解剖器/fractionator 法および磁気共鳴イメージングにかかるコストと時間の両方が、ほとんどの研究ラボでの採用における主要な制限要因であると考えられてきました。
最後に、酸性揉捻法は、磁気共鳴イメージング26などのより高度な方法を用いた対策に匹敵する全腎ネフロン数の推定値を提供する。例えば、糸球体および3次元画像処理のカチオン型フェリチンの標識を用いて、スプレイグ-スプラーグラットからの単一腎臓におけるネフロンをすべてカウントすると、磁気共鳴画像量は、34000個体当たりの平均度数で得られた糸球体腎臓26。非カチオン性フェリチン標識腎臓において、磁気共鳴画像は、フェリチン標識糸球体と同様の大きさおよび形状の磁気信号を有する腎臓の非糸球体領域の計数による2000ネフロン構造のカウントを生じた。これらのアーチファクトがカチオンフェリチン標識腎によって決定された計数から差し引くと、有効な数の糸球体が決定し、磁気共鳴イメージングを使用して、腎臓26当たり32000ネフロンに近い。この同じ研究において、検証実験は、酸性揉捻法26を用いて腎臓あたり31000の平均糸球体数を得た。このように、酸性マセレーション法は、磁気共鳴イメージングなどの最先端技術を用いて決定されたものの < 5% 以内にある全腎ネフロン数の推定値を生成する。
酸性マセレーション法に関連するいくつかの主要な利点があるが、調査者はまた、この方法に関連する制限を認識しなければならない。1つの制限は、腎臓全体の使用に関連します。腎臓全体が溶解して均質化されるので、腎皮質内の糸球体の空間的分布に関する情報は決定できない。糸球体の体積の intrarenal 分布を知ることが重要である場合、磁気共鳴画像の使用はより適した方法であろう。
他の方法と比較して、酸揉捻法の使用は、総ネフロン数を少し過小評価するように見える。小さな推定値は、部分的には、酸または腎臓の揉捻中の糸球体の小さな割合の溶解に起因する可能性がある。さらに、加齢や疾患に伴い、尿の形成に寄与していないにもかかわらず、酸性浸漬に対してより敏感であり、処理中に破壊される可能性がある機能ネフロンの喪失があり、その結果、総ネフロンの推定値が低下することに貢献する数。したがって、腎臓をチョッピングする際に生体内に腎臓組織を残さないように、または組織サンプルを押出したときにシリンジ内にあるように腎臓を採取して処理する際には注意が必要である。全体的に、しかし、組織処理による総ネフロン数の過小評価は比較的小さいように思われる。
酸揉捻法を用いた糸球体の計数が主観的であるように、ネフロン数の過小評価は、観察者バイアスを反射させることもでき、これは、盲検の2つの別々の研究者によって行われている測定によって容易に克服することができる実験動物または状態に関する情報。糸球体を構成するものについて重大な懸念がある場合、別のアプローチとして、安楽死の前に実験動物に酸化鉄を注入することが含まれる。静脈内に注入すると、酸化鉄が入り、糸球体に閉じ込められます。したがって、処理された糸球体は、暗い黒を染色し、30を数えるときに糸球体のより大きな識別を可能にする必要があります。
酸マセレーション法は、腎臓 (50 mL) の溶液全体の測定とは対照的に、小さなサンプル (3 x 0.5 mL または 1.5 mL) の測定に基づいて、全腎ネフロン数を推定します。酸揉捻法は、自然界において再現性が高く、単一腎臓のサンプル内と実験群内の糸球体カウントは、高い整合性があることが判明しています。また、野生型 C57Bl/6 マウスおよび1つの腎臓で生まれたラットからの本研究において報告された代表的な結果 (図 2および3) は、以前に報告した範囲と同様に以前の所見と非常に一致している (表1)5、31。必要であれば、追加の測定は、腎臓あたりの総ネフロン数をよりよく推定するために容易に行うことができる。
酸マセレーション技術はネフロン数の信頼性の高い反復可能な推定値を提供しますが、この方法は、酸への曝露が糸球体量の変化を引き起こす可能性が最も高いため、糸球体の体積の測定値を得るために推奨されません。糸球体体積の決定が全腎臓糸球体表面積を決定する上で重要であるように、そのような測定は組織学的および stereological 方法24、25を使用して行われることが推奨される。特に、グリコールメタクリレートを使用する stereological は、組織の腫脹および膨張を制限するために腎臓を埋め込み、したがって、インビボでできるだけ近い糸球体形状を維持する。
最後に、酸マセレーション技術の別の制限は、ネフロン数を評価する他の方法に共通するものと、糸球体機能に関する情報 (糸球体濾過速度など) が一度糸球体から確認できることであるということである処理。したがって、個々の糸球体を計数することができるが、その機能状態 (尿形成または非尿形成) は、酸性揉捻法を用いて決定することはできない。同様に、個々のマウスにおける酸揉捻法を用いて長手方向情報を確認することはできない。代わりに、様々な時点での動物の別々のグループは、動物の寿命、または事前または postgenetic または薬理学的介入にネフロン数の変化についての洞察を得るために必要とされる。
要約すると、酸性揉捻法は、腎臓全体のネフロン数を推定する低コスト、高スループット、効率的な方法です。酸揉捻法は、ここで提示された2つの例によって証明されるように再現性の高い程度を提供し、同様にこの方法を用いて以前に報告したものは18、19、20、21,22,28. マウス (およびラット) での使用のために酸性マセレーション法の使用を説明したが、この酸マセレーション法は、イヌおよびブタ27,32などのより大きな種に使用するために拡大縮小することもできる。
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Disclosures
作者は何も開示することはありません。
Acknowledgments
この作品は、一部の国立衛生研究所、国立心臓、肺、血液研究所 (R01HL107632) によって支持されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isoflurane anesthesia | Abbott Laboratories | 05260-05 | |
| Isoflurane vaporizor system & flow gauge | Braintree Scientific | VP I | Include medical grade oxygen supply |
| Leica Inverted Microscope DMIL LED | Leica Microsystems | DMIL LED | Any make also suitable |
| Digital water bath | Fisher Scientific | 2239 | Any make also suitable |
| ToughCut Fine surgical scissors | Fine Science Tools | 14058-11 | 25 mm cutting edge, 11.5 cm length; Tips: sharp-sharp; Tip shape: straight |
| Micro dissecting forceps 4 1/4 in. | Biomed Res Instruments, Inc | 10-1760 | Curved tip |
| Plexiglass board 5 in. x 7 in. | any source suitable | n/a | Any make also suitable |
| Hexagonal polystyrene weighing dish | Fisher Scientific | 02-2002-100 | Any make also suitable |
| Razor blades | Fisher Scientific | 12-640 | Single edge carbon steel 0.009 |
| Gauze sponges 4 x 4 in. 8 ply | Fisher Scientific | MSD-1400250 | |
| 10x concentrate phosphate buffered saline (PBS) | Sigma Aldrich | P5493-4L | Dilute to 1x |
| 6 N Hydrocholric acid solution | Sigma Aldrich | 3750-32 | |
| 15 mL conical centrifuge tube | Fisher Scientific | 14-959-70C | Any make also suitable |
| 50 mL conical centrifuge tube | Fisher Scientific | 14-959-49A | Any make also suitable |
| Disposable 5 mL syringe | Cole Palmer | EW-07944-06 | Any make also suitable |
| 18G1.5 disposable needle | Fisher Scientific | 14-826-5D | Any make also suitable |
| 21G1.5 disposable needle | Fisher Scientific | 14-826-5B | Any make also suitable |
| 12-well multiple-well cell culture plates with lid | Cole Palmer | #FW-01959-06 | Any make also suitable |
| Polypropylene modular test tube rack | Cole Palmer | #EW-06733-00 | Capable of accommodating 15 and 50 mL conical tubes; any make also suitable |
References
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