Summary
Uppskattningar av hela njure nefronen antal är viktiga kliniskt och experimentellt, eftersom det finns ett omvänt samband mellan nefronen antal och en ökad risk för njur-och hjärt-kärlsjukdom. Häri, är användningen av syran maceration metod, som ger snabba och pålitliga uppskattningar av hela njure nefronen nummer, demonstreras.
Abstract
Nephron begåvning hänvisar till det totala antalet nephrons en individ föds med, som necygenes hos människor avslutas med 36 graviditets veckor och inga nya nephrons bildas efter födseln. Nephron nummer avser det totala antalet nephrons mätt vid varje tidpunkt efter födseln. Både genetiska och miljömässiga faktorer påverkar både nefronen begåvning och antal. Förstå hur specifika gener eller faktorer påverkar processen för nekan och nefronen förlust eller död är viktigt som individer med lägre nefronen begåvning eller antal tros vara en högre risk att utveckla njur-eller hjärt-kärlsjukdom. Att förstå hur miljö exponeringar under loppet av en persons livstid påverkar nefronen antal kommer också att vara avgörande för att fastställa framtida sjukdoms risk. Således, förmågan att bedöma hela njure nefronen nummer snabbt och tillförlitligt är ett grundläggande experimentellt krav för att bättre förstå mekanismer som bidrar till eller främja neuringenes eller nefronförlust. Här beskriver vi syran maceration metod för uppskattning av hela njure nefronen nummer baserat på det förfarande som beskrivs av Damadian, shawayri, och Bricker, med smärre modifieringar. Syran maceration metoden ger snabba och pålitliga uppskattningar av nefronen antal (bedömt genom att räkna Glomeruli) som ligger inom 5% av dem som bestäms med hjälp av mer avancerade, om än dyra, metoder såsom magnetisk resonanstomografi. Dessutom är syran maceration metoden en utmärkt hög genom strömning metod för att bedöma nefronen nummer i ett stort antal prover eller experimentella tillstånd.
Introduction
Den nefronen är både den grundläggande strukturella och funktionell enhet i njuren1. Strukturellt, den nefronen består av glomerulus (kapillärer och podocyter) ligger inom Bowman ' s kapsel och njurtubuli, bestående av proximala tubuli, loop of Henle, och distala tubuli som slutar i uppsamlings kanalen. Funktionellt, är den roll som nefronen filtrering och reabsorption av vatten och elektrolyter och utsöndringen av avfall. I allmänhet, nekan är avslutad vid 36 graviditets vecka hos människor och strax efter födseln i flera arter som mus och råtta2. Nefronen begåvning hänvisar till det totala antalet nephrons som en individ föds med, medan nefronen nummer är det totala antalet nephrons mätt när som helst efter födseln3. Termen nefrontal och glomerulär tal används ofta omväxlande. Eftersom det finns bara en glomerulus per nefronen, är bedömningen av glomeruli nummer en viktig surrogat för att uppskatta nefronen nummer.
Bedömningen av nefronen begåvning och nefronen nummer är av kliniskt intresse eftersom studier har visat ett samband mellan nefronen begåvning och minskat nefronen nummer med en ökad förekomst av hjärt-kärlsjukdom4,5 ,6,7,8,9,10,11,12,13,14, 15. baserat på fynd i njurar vid obduktion, Brenner observerade att hypertensiva individer presenteras med ett lägre totalt antal nephrons än normotensiva individer16. Således, Brenner hypotesen att det finns ett omvänt förhållande mellan nefronen antal och risken att utveckla hypertoni senare i livet. Brenner en hypotes om att en minskning av nefronen antal kompenserades av nephrons som återstod. För att bibehålla den normala filtrerings hastigheten i njuren, kompenserar resterande nephrons genom att öka deras glomerulär yta (glomerulär hypertrofi), och arbetar därmed för att lindra eventuella negativa effekter av neyloförlust på njur funktion4 ,16.
Medan skyddande på kort sikt, glomerulär hypertrofi, på lång sikt, leder till ökad natrium-och vätskeretention, ökad extracellulär vätske volym, och ökningar av arteriellt blod tryck, vilket leder till en ond cirkel av ytterligare ökningar i glomerulär kapillärtryck, glomerulär hyperfiltration och nefrorärr (skleros) och skada4,16.
Att få uppskattningar eller räkningar av nefronen nummer erbjuder ett par experimentella fördelar: 1) det ger information om processen för neolgenesis, som sedan kan kopplas till specifika gener eller faktorer i embryot eller maternell-fetal miljö, och 2) Det finns en sammanslutning av nefronen nummer med hjärt-kärlsjukdom och därmed finns det potential att uppskattningar av nefronen antal kan användas för att förutsäga framtida kardiovaskulär risk2,17,18, den 19 , 20 och andra , 21 för att , 22. Förutom moderns-fetal miljö, flera sjukdomar direkt inverkan nefronen antal och njur funktion, inklusive åder förkalkning, diabetes, hypertoni, och även normalt åldrande2,9, 10,11,12,22,23. Således, bedömning av hela njure nefronen antal är viktigt att förstå både genetiska och miljömässiga faktorer som påverkar nedegenes (dvs.neger begåvning) och nefronen nummer under loppet av en persons liv och de resulterande effekterna njur funktion och kardiovaskulär hälsa.
För närvarande finns det flera metoder som är tillgängliga för bestämning och kvantifiering av nefronen nummer, var och en med sina egna fördelar och begränsningar24,25,26,27,28 ,29,30. Sofistikerade metoder för bestämning av hela njure nefronen antal inkluderar stereologiska metoder, såsom dissector/fraktionator metod, och magnetisk resonanstomografi25,26. Ofta anses vara guld-standard för att bestämma hela njure nefronen nummer, dissector/fraktionator metoden är både dyrt och tids krävande. Senaste framstegen och förbättring av magnetisk resonanstomografi och bearbetning har gett verktyg för att räkna varje nefronen individuellt. Magnetisk resonanstomografi är dock inte bara tids krävande utan också extremt dyrt. Dessutom kräver både dissector/fraktionator-metoden och magnetisk resonanstomografi avancerad teknisk expertis, vilket begränsar användningen av sådana metoder i de flesta forsknings laboratorier.
De flesta metoder för att fastställa nefronen antal göra räknas eller uppskattningar baserade på identifiering av glomeruli, eftersom de är lätt identifierbara strukturellt. I detta dokument, den syra maceration metod för att uppskatta nefronen nummer i hela njuren beskrivs och visas27. Syran maceration metoden är snabb, pålitlig, och betydligt billigare än andra metoder, såsom dissector/fraktionator metod och magnetisk resonanstomografi. Dessutom ger syran maceration metod mycket repeterbara uppskattningar av nefronen nummer som har rapporter ATS vara inom intervallet för dem som bestäms med hjälp av magnetisk resonanstomografi26.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tillförsel och reagenser som anges nedan är för bestämning av hela njuren nefronen nummer i en mus, det vill, två njurar. Ändringar för användning av syran maceration metod för råtta identifieras med asterisker. Alla experimentella protokoll har kon centrer at till National Institute of Health Guide för skötsel och användning av försöks djur och godkändes av den institutionella djur omsorg och användning kommittén vid University of Mississippi Medical Center.
1. förfarande för njure isolering
- Väg musen (eller andra arter) och euthanize den med en isofluran (5%-8%) Överdosering eller pentobarbital (150 mg/kg intraperitoneal injektion).
- När musen är euthanized, öppna sin bukhålan med fina kirurgiska saxar längs mitt linjen.
- Lyft försiktigt tarmen och reproduktiv fett till höger sida av bukhålan. Genom grov dissektion, isolera den vänstra njuren. Använda fina kirurgiska saxar, skär vänster Njurartären och ven och försiktigt bort den vänstra njuren, placera njuren i en korrekt märkt (mus nummer/identifierare) väga båten som innehåller fosfor-buffrad saltlösning (PBS).
- Upprepa proceduren för rätt njure.
- Ta bort varje njure från respektive väga båten och placera den på en kirurgisk gasväv förfuktade med PBS.
- Lämnar njuren på kirurgisk gasbinda, snabbt ta bort alla anhängare icke-renal vävnad (såsom perirenal fett eller binjurarna) följt av avlägsnande av njur kapseln. Väg varje njure individuellt, registrera vikten av vänster och höger njure separat i en laboratorie antecknings bok.
2. homogenisering, inkubation och ansträngnings procedurer
- När varje njure vägs, dränera varje väga båten av PBS och placera njurarna tillbaka till lämpligt märkt väga båten. Med hjälp av en ren rakblad, skär njuren på mitten, på längden. Placera varje njure halv vänd nedåt och skär varje halv i 2-mm eller mindre bitar.
- Med samma Razorblade, omsorgsfullt samla in och placera de hackade njure bitarna i en märkt 15-mL konisk tub (mus nummer/identifierare, vänster kontra höger njure).
- Upprepa proceduren för den motsatta njuren, med hjälp av ett nytt rakblad. Placera den hackade njuren i en separat märkt 15 mL konisk tub.
- Tillsätt 5 mL 6 M saltsyra (HCl) till varje 15 mL konisk tub i en välventilerad draghuv.
- Sätt tillbaka locket på det koniska röret, skaka försiktigt njure/HCl-blandningen och placera den 15 mL koniska slangen i ett förvärmd vatten bad inställt på 37 ° c för 90 min (* 120 min för rått njurar).
- Skaka varje 15 mL tub en gång var 15 minut under inkubationen för att säkerställa att all vävnad utsätts för HCl-syra.
- Sätt i en 18-G nål i en 5-mL spruta (* 10-mL spruta för råtta) och ta försiktigt bort sprutkolven. Placera sprutan i ett 50-mL koniskt rör (rör #1) i en draghuv.
- Ta bort njuren/HCl-lösningen från vatten badet och häll i vävnads lösningen i den öppna änden av sprutan och Ställ in den 15 mL koniska slangen åt sidan i en provrörsställ. Byt försiktigt ut kolven och tryck långsamt på kolven för att pressa lösningen genom nålen och in i röret #1.
- Tvätta 15 mL koniskt rör med 5 mL PBS-lösning. Snurra PBS i 15-mL koniskt rör för att solubilisera kvarvarande njure vävnad.
- Igen, ta försiktigt bort kolven från 5-mL sprutan som innehåller 18-G nål och häll innehållet från 15 mL koniskt rör i den öppna änden av sprutan. Byt försiktigt ut kolven och spola sprutan genom att försiktigt trycka ned kolven, i röret #1. Upprepa denna process 2x (utförs 3x totalt).
- Sätt i en 21-G nål i en ny 5-mL spruta (* 10-mL spruta för råtta) och ta försiktigt bort sprutkolven. Placera sprutan med 21 G-nålen fastsatt i ett nytt 50-mL koniskt rör (rör #2).
- Häll innehållet från röret #1 i den öppna änden av sprutan som innehåller en 21-G nål. Sätt försiktigt in kolven och spola sprutan genom att försiktigt trycka ned sprutkolven och placera den strängpressade lösningen i rör #2.
- Tvätta röret #1 med 5 mL PBS-lösning. Snurra PBS i röret #1 för att solubilize eventuella kvarvarande njure vävnad.
- Igen, ta försiktigt bort kolven från 5-mL sprutan som innehåller 18-G nål och häll innehållet från röret #1 i den öppna änden av sprutan. Byt försiktigt ut kolven och spola sprutan genom att försiktigt trycka ned kolven, extruderande lösning till rör #2. Upprepa denna process 2x (utförs 3x totalt).
- Ta den totala volymen av röret #2 upp till 50 mL genom att tillsätta ytterligare PBS, upp till 50-mL linjen på röret #2.
- Inkubera röret #2 innehåll ande njur vävnads lösningen i ett rörställ på en vippplatta i ett kyl skåp satt vid 4 ° c över natten (minst 8-10 h).
3. räkning av glomeruli och extrapolering av Nephron-talet
- Ta bort röret #2 från kyl skåpet och omsuspendera den pelleterade vävnaden genom att försiktigt vända röret flera gånger för att skapa en homogen lösning. Vi rekommenderar att du räknar glomeruli inom 5 d efter bearbetning.
- Noggrant alikvot 500 μL av njur lösningen i en enda brunn av en 12-brunn tallrik. Upprepa detta 2x, placera varje alikvot i en separat brunn så att det finns tre brunnar av njur lösning per njure, för analys i tre exemplar.
- Tillsätt 500 μL PBS till var och en av de tre brunnar som innehåller njur lösningen, för en 1:1 spädning.
- Räkna antalet glomeruli per brunn med hjälp av ett inverterat Mikroskop. Inventering med hjälp av ett rutnät av 16 separata sektioner placeras på botten av varje brunn. Räkna antalet glomeruli per varje inrutade sektion och summera sedan antalet per rutnät för att få det totala antalet glomeruli per brunn. Glomeruli är lätt att identifiera genom sin sfäriska struktur. Ytterligare identifierare inkluderade en rödaktig nyans på grund av blodfyllda kapillärer, samt pre-eller post-arterioler som förblir knutna till kroppen av enskilda glomeruli (figur 1).
- Tillsätt det totala antalet glomeruli räknat per var och en av de tre brunnarna och dela dem sedan med tre för genomsnittligt antal glomeruli per 500 μL njurlösning. Om var Ian sen i genomsnittligt antal glomeruli per brunn är större än 10%, upprepa förfarandet för Neron-räkning och ägna stor uppmärksamhet åt den homogena karaktären hos njur lösningen. Multiplicera antalet glomeruli räknat per brunn gånger 100 för genomsnittligt antal glomeruli per njure. Totalt nefronen antal kan uttryckas per njure eller, med hjälp av njure vikt, per mg eller g av vävnad.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Nedan är representativa uppskattningar av hela njure nefronen nummer från en etablerad mus modell av hypertoni och en genetisk råtta modell av åldersrelaterade kronisk njur sjukdom. Viktiga identifierande egenskaper hos glomeruli, såsom en sfärisk struktur med eller utan bifogade pre-eller post-arteriolära eller tubulära strukturer, är markerade för de som är nya för syra maceration metoden (figur 1).
I det första experimentella exemplet fastställdes de totala nefronen-talen hos möss (manliga C57BL veckors ålder) infunderade med vehikel (saltlösning) eller angiotensin II i 14 dagar. I fordon-infunderas möss, nefronen antalet var 12 411 ± 248 nephrons per njure som bestäms med hjälp av syran maceration metod (figur 2). Dessa uppskattningar är förenliga med intervall av hela njuren nerontal som tidigare rapporter ATS hos möss (tabell 1). Angiotensin ökade förmaks trycket med cirka 40 mmHg efter 14 dagar av infusion och var associerat med en signifikant minskning av nefronen antal (9 122 ± 193 nephrons per njure) på nästan 26% (figur 2). Dessa data tyder på att angiotensin II infusion är inte bara förknippad med hypertoni, men också, en signifikant minskning av nefronen antal är associerad med nefronen förlust på grund av skleros eller glomerulär skada.
I det andra experimentella exemplet, tidigare fynd av nefronen antal i en genetisk råtta modell av renal agenesi, den heterogena lager-härledda modellen av ensidig renal agenesi (hsra) råtta, bekräftades. Den hsra modellen uppvisar ofullständig penetrans fenotyper för defekter i njurarna och urinvägarna, med vissa djur som föds normalt (med två njurar) och andra födda med en njure. Hos råttor födda med två njurar (manliga ha-kontroll; 12 veckors ålder), uppskattningar av nefronen nummer med hjälp av Acid maceration metoden var 27 288 ± 336 nephrons per njure (figur 3). I motsats, i råttor födda med en enslig njure (manliga ha-ensam, 4 veckors ålder) uppskattningar av nefronen antal konstaterades vara betydligt lägre på 24 594 ± 883 nephrons per njure (figur 3). Uppskattningar av antalet Neron som uppnåtts i dessa prover överensstämmer också med de intervall som tidigare rapporter ATS hos råtta (tabell 1). Observera att dessa data är förenliga med tidigare fynd där hA-Solitary råttor konstaterades uppvisar minskade Neron begåvning eller nummer (jämfört med en kontroll njure) sannolikt återspeglar de underliggande genetiska faktorer som är förknippade med att vara född med en enda njure31.
Figur 1 : Nyckel identifierare för glomeruli för räkning och bedömning av hela njure nefrontal. Glomeruli är lätt att identifiera genom sin sfäriska struktur, vilket indikeras av pilarna. Ytterligare identifierare inkluderar en rödaktig nyans på grund av blodfyllda kapillärer, samt pre-eller post-arterioler (eller tubuli) som kan förbli knutna till kroppen av enskilda glomeruli efter bearbetning (som den som identifierats längst ner på denna mikrograf). Också närvarande i denna bild är rester av tubuli och blod kärl. Förstoring = 10X; skala bar = 100 μm. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 : Nephron räknar med möss. (A) representativ bild av glomeruli från en enda mus njure klädd i en 22,1-mm flatbottnad brunn av en 12-well kultur plattan, som kan ses med hjälp av ett inverterat Mikroskop. Glomeruli och njurtubuli ses i måttlig densitet när de späds med en faktor på två (0,5 mL njurlösning plus 0,5 mL 1x PBS). (B) effekten av en 14-dagars vehikel eller angiotensin II-infusion på nefronen-tal hos manliga C57BL/6-möss enligt bedömning av glomerulär räkning. Den angiotensin II infusion på 1 000 ng/kg/min (via osmotisk minipump) var förknippad med hypertoni och en markant minskning av nefronen antal jämfört med nefronen antalet i möss infunderas med fordon. Nefronen-tal i fordonsinfunderade möss överensstämmer med tidigare rapporterade uppskattningar av nefronen-tal hos möss (tabell 1). Fordon: n = 3, angiotensin II: n = 3, *p < 0,05. Felstaplar = SE. förstoring = 4X; skala bar = 250 μm. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 : Nephron räknat på råtta. (A) representativ bild av glomeruli från en enda råtta njure pläterad i en 22,1-mm flatbottnad brunn av en 12-brunn odla pläterar, som sett med ett inverterat Mikroskop. Glomeruli och njurtubuli ses med en signifikant högre densitet jämfört med den i musen. (B) kvantifiering av nefronen-talet i hsra-Control och hsra-s-råttor visar att neronantalet är mindre i hsra-s jämfört med hsra-C-råttor och överensstämde med tidigare fynd i denna modell31. HSRA-C, råttor födda med två njurar: n = 3; HSRA-S, råttor födda med en enslig njure: n = 3,* p < 0,05. Felstaplar = SE. förstoring = 4X; skala bar = 250 μm. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Arter | Nephron antal per njure | Referens |
| Musen | 9000-21000 | 18-22, 28 |
| Råtta | 13000-27000 | 31, 33 |
| Får | 200000-800000 | 23, 29, 34 |
| Gris | 1600000-4600000 | 32, 35 |
| Mänskliga | 500000-2000000 | 8-15 |
Tabell 1: rapporterade intervall av nefronen antal i flera arter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Med god experimentell teknik, är syran maceration metod idealisk för att uppskatta nefronen nummer i hela njuren. Även om njuren löses i syra förblir glomeruli i stort sett intakt och är lätt att identifiera, vilket gör det relativt enkelt och okomplicerat att räkna enskilda glomeruli. Syran maceration teknik är särskilt fördelaktigt av flera skäl. För det första är syran maceration metoden en snabb och bekväm metod som kräver relativt lite när det gäller bekostnad och fysisk ansträngning. Alla reagenser och förbruknings material som krävs för att utföra syran maceration metoden är lätt tillgängliga i de flesta grundläggande laboratorier, det enda stora kravet är till gång till ett inverterat Mikroskop för glomerulär räkning. När det gäller bekostnad, det uppskattas att syran maceration metoden kostar bara ett par hundra dollar per djur, vilket inte är mycket jämfört med kostnader i samband med andra metoder för hela njure glomerulär räkning, såsom magnetisk resonanstomografi, som kan variera i tusentals dollar per djur skannings tid och teknisk expertis.
För det andra, syra maceration metoden innebär betydligt mindre vävnads bearbetning tid jämfört med andra metoder för hela njure nefronen nummer såsom dissector/fraktionerare metod24. Från början till, kräver syra maceration metoden mindre än 24 timmar av total tid, varav mindre än 1-2 timmar används för bearbetning av njurar och sedan räknar enskilda glomeruli per försöks djur. I kontrast, dissector/fraktionator metoden är arbets intensiva, som kräver uppskattnings vis 15 timmars arbete (4-6 timmar av snittning, 2-3 timmar av färgning, och 4-5 timmar av att räkna tid) per njure, exklusive den 48-72 timmar som behövs för att behandla njurarna i gl ycol metakrylat24. På grund av fördelarna med kostnader och tid, är syran maceration metoden särskilt användbar i studier där uppskattningar av hela njure nefrontal måste göras i ett stort antal djur med eller utan genetiska eller farmakologiska interventioner. Både kostnader och tid i samband med dissector/fraktionator metod och magnetisk resonanstomografi har ansetts vara en viktig begränsande faktor i deras antagande i de flesta forsknings laboratorier.
Slutligen ger syran maceration metod uppskattningar av hela njure nefronen nummer som är jämförbara med åtgärder med hjälp av mer sofistikerade metoder såsom magnetisk resonanstomografi26. Till exempel, med hjälp av katjoniska ferritin-märkning av glomeruli och tredimensionell bild behandling för att räkna varje nefronen i en enda njure från Sprague-Dawley råtta, magnetisk resonanstomografi gav i genomsnitt antal 34 000 enskilda glomeruli per och njure26. I icke-katjoniska ferritin-märkta njurar, gav magnetisk resonanstomografi räknas av 2 000 nephron-liknande strukturer på grund av räkning av icke-glomerulär områden av njure med magnetiska signaler av liknande magnitud och form som ferritin-märkt glomeruli. När dessa artefakter subtrareras från de värden som bestäms av katjoniska ferritin-märkta njurar, är det effektiva antalet glomeruli bestäms, med hjälp av magnetisk resonanstomografi, närmare 32 000 nephrons per njure26. I samma studie, validering experiment gav genomsnittliga glomerulär antal 31 000 per njure med hjälp av Acid maceration metod26. Således producerar syra maceration metod uppskattningar av hela njure nefronen nummer som ligger inom < 5% av dem som bestäms med hjälp av State-of-the-art tekniker såsom magnetisk resonanstomografi.
Även om det finns flera viktiga fördelar i samband med syran maceration metod, utredare bör också vara medveten om de begränsningar som är förknippade med denna metod. En begränsning gäller användning av hela njure. Eftersom hela njuren löses upp och homogeniseras, kan information om den rumsliga fördelningen av glomeruli i njurbarken inte bestämmas. Om att veta intrarenal distribution av glomerulär volym är viktigt, då användningen av magnetisk resonanstomografi skulle vara en bättre lämpad metod.
Jämfört med andra metoder, användning av syran maceration metoden verkar något unders katta totala nefronen nummer. De mindre uppskattningarna beror sannolikt delvis på upplösningen av en liten andel av glomeruli i syran eller under maceration av njuren. Dessutom, med åldrande eller sjukdom, det finns en förlust av funktionella nephrons, som, men inte bidrar till urin bildning, kan vara känsligare för sura maceration och kan förstöras under bearbetning, vilket bidrar till lägre uppskattningar av den totala Neron Nummer. Därför bör försiktighet användas vid insamling och bearbetning av njurar för att inte lämna någon njure vävnad in vivo när hugga njuren, eller i sprutorna vid extruderande vävnadsprover. Sammantaget förefaller dock underskattning av det totala antalet nefronen på grund av vävnads bearbetning vara relativt liten.
Eftersom beräkningen av glomeruli med hjälp av syran maceration metoden är subjektiv, underskattning av nefronen nummer kan också vara reflekterande av observatör bias, som lätt kan övervinnas genom mätningar som utförs av två separata utredare förblindade till information om försöks djur eller tillstånd. Om det finns en betydande oro för vad som utgör en glomerulus, skulle ett alternativt tillvägagångs sätt innebära infusion av försöks djur med järnoxid före eutanasi. När infunderas intravenöst, kommer järnoxid in och fastna i glomerulus; Därför bör bearbetade glomeruli färga mörkt svart, vilket möjliggör en större identifiering av glomeruli när man räknar30.
Den Acid maceration metoden uppskattar hela njure nefronen nummer baserat på mätningen av små prover (3 x 0,5 ml eller 1,5 ml) i motsats till mätningar av hela lösningen av njure (50 ml). Syran maceration metoden är mycket reproducerbar i naturen, och glomeruli räknas inom prover av en enda njure och inom experimentella grupper visar sig vara mycket konsekventa. Dessutom är representativa resultat som rapporter ATS i den aktuella studien från vildtyps-C57Bl/6-möss och råttor födda med en enda njure (figur 2 och 3) i hög grad förenliga med tidigare fynd, liksom med intervall som tidigare rapporter ATS (tabell 1 )5,31. Om så önskas kan ytterligare mätningar lätt göras för att bättre uppskatta det totala nefronen antalet per njure.
Medan syran maceration teknik ger tillförlitliga och repeterbara uppskattningar av nefronen nummer, denna metod rekommenderas inte för att erhålla mätningar av glomerulär volym, som exponering för syra troligen producerar förändringar i glomeruli volym. Eftersom bestämning av glomerulär volym är viktigt vid bestämning av hela njurglomerulär ytarea, rekommenderas att sådana mätningar görs med hjälp av histologiska och stereologiska metoder24,25. Särskilt, stereologiska metoder som använder sig av glykol metakrylat bädda in njurar för att begränsa vävnad svullnad och expansion och därmed bibehålla glomerulär geometri så nära som möjligt till att in vivo.
Slutligen, en annan begränsning av syran maceration teknik, och en som är gemensam för andra metoder för att bedöma nejontal, är att ingen information om glomerulär funktion (t. ex. glomerulär filtrationshastighet) kan fastställas från Glomeruli en gång Bearbetade. Således, medan enskilda glomeruli kan räknas, kan dess funktionella status (urin-formning eller icke-urin-formning) inte bestämmas med hjälp av syran maceration metod. På samma sätt kan ingen longitudinell information fastställas med hjälp av Acid maceration-metoden hos enskilda möss. I stället krävs separata grupper av djur vid olika tidpunkter för att få insikt i förändringar i nefronen nummer över ett djurs livs längd eller pre-eller postgenetisk eller farmakologisk intervention.
Sammanfattnings vis är syran maceration metod en låg kostnad, hög genom strömning, och effektiv metod för att uppskatta hela njure nefronen nummer. Acid maceration-metoden ger en hög grad av reproducerbarhet, vilket framgår av de båda exemplen som presenteras här, liksom av dem som tidigare rapporter ATS med denna metod18,19,20,21 , 22 i den , 28. även om användningen av Acid maceration metod beskrevs för användning i mus (och råtta), kan Acid maceration metoden också skalas för användning i större arter, såsom hund och gris27,32.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes delvis av nationella institut för hälsa, nationella hjärta, lung och Blood Institute (R01HL107632).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isoflurane anesthesia | Abbott Laboratories | 05260-05 | |
| Isoflurane vaporizor system & flow gauge | Braintree Scientific | VP I | Include medical grade oxygen supply |
| Leica Inverted Microscope DMIL LED | Leica Microsystems | DMIL LED | Any make also suitable |
| Digital water bath | Fisher Scientific | 2239 | Any make also suitable |
| ToughCut Fine surgical scissors | Fine Science Tools | 14058-11 | 25 mm cutting edge, 11.5 cm length; Tips: sharp-sharp; Tip shape: straight |
| Micro dissecting forceps 4 1/4 in. | Biomed Res Instruments, Inc | 10-1760 | Curved tip |
| Plexiglass board 5 in. x 7 in. | any source suitable | n/a | Any make also suitable |
| Hexagonal polystyrene weighing dish | Fisher Scientific | 02-2002-100 | Any make also suitable |
| Razor blades | Fisher Scientific | 12-640 | Single edge carbon steel 0.009 |
| Gauze sponges 4 x 4 in. 8 ply | Fisher Scientific | MSD-1400250 | |
| 10x concentrate phosphate buffered saline (PBS) | Sigma Aldrich | P5493-4L | Dilute to 1x |
| 6 N Hydrocholric acid solution | Sigma Aldrich | 3750-32 | |
| 15 mL conical centrifuge tube | Fisher Scientific | 14-959-70C | Any make also suitable |
| 50 mL conical centrifuge tube | Fisher Scientific | 14-959-49A | Any make also suitable |
| Disposable 5 mL syringe | Cole Palmer | EW-07944-06 | Any make also suitable |
| 18G1.5 disposable needle | Fisher Scientific | 14-826-5D | Any make also suitable |
| 21G1.5 disposable needle | Fisher Scientific | 14-826-5B | Any make also suitable |
| 12-well multiple-well cell culture plates with lid | Cole Palmer | #FW-01959-06 | Any make also suitable |
| Polypropylene modular test tube rack | Cole Palmer | #EW-06733-00 | Capable of accommodating 15 and 50 mL conical tubes; any make also suitable |
References
- Hall, J. E., Guyton, A. C. Guyton and Hall Textbook of Medical Physiology. , 13th, Elsevier. Philadelphia, PA. (2016).
- Wang, X., Garrett, M. R. Nephron number, hypertension, and CKD: physiological and genetic insight from humans and animal models. Physiological Genomics. 49 (3), 180-192 (2017).
- Didion, S. P. A novel genetic model to explore the Brenner hypothesis: Linking nephron endowment and number with hypertension. Medical Hypotheses. 106, 6-9 (2017).
- Brenner, B. M. Nephron adaptation to renal injury or ablation. American Journal of Physiology. 249 (3 Pt 2), F324-F337 (1985).
- Didion, S. P., Wang, X., Garrett, M. R. Direct correlation between blood pressure and nephron endowment in a genetic model of hypertension. Hypertension. 68, A052 (2016).
- Luyckx, V. A., Brenner, B. M. The clinical importance of nephron mass. Journal of the American Society of Nephrology. 21 (6), 898-910 (2010).
- Mackenzie, H. S., Brenner, B. M. Fewer nephrons at birth: a missing link in the etiology of essential hypertension? American Journal of Kidney Diseases. 26 (1), 91-98 (1995).
- Nyengaard, J. R., Bendtsen, T. F. Glomerular number and size in relation to age, kidney weight, and body surface in normal man. The Anatomical Record. 232 (2), 194-201 (1992).
- Denic, A., Glassock, R. J., Rule, A. D. Structural and functional changes with the aging kidney. Advances in Chronic Kidney Disease. 23 (1), 19-28 (2016).
- Denic, A., et al. The substantial loss of nephrons in healthy human kidneys with aging. Journal of the American Society of Nephrology. 28 (1), 313-320 (2016).
- Keller, G., Zimmer, G., Mall, G., Ritz, E., Amann, K. Nephron number in patients with primary hypertension. The New England Journal of Medicine. 348 (2), 101-108 (2003).
- Hoy, W. E., et al. Nephron number, glomerular volume, renal disease and hypertension. Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 17 (3), 258-265 (2008).
- Hoy, W. E., et al. Distribution of volumes of individual glomeruli in kidneys at autopsy: association with age, nephron number, birth weight and body mass index. Clinical Nephrology. 74 (Suppl 1), S105-S122 (2010).
- Hughson, M. D., et al. Hypertension, glomerular hypertrophy and nephrosclerosis: the effect of race. Nephrology Dialysis Transplantation. 29 (7), 1399-1409 (2014).
- Puelles, V. G., et al. Glomerular number and size variability and risk for kidney disease. Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 20 (1), 7-15 (2010).
- Brenner, B. M., Garcia, D. L., Anderson, S. Glomeruli and blood pressure. Less of one, more of the other? American Journal of Hypertension. 1 (4 Pt 1), 335-347 (1988).
- Clark, A. T., Bertram, J. F.
- Benz, K., et al. Early glomerular alterations in genetically determined low nephron number. American Journal of Physiology Renal Physiology. 300 (2), F521-F530 (2011).
- Zhao, H., et al. Role of fibroblast growth factor receptors 1 and 2 in the ureteric bud. Developmental Biology. 276 (2), 403-415 (2004).
- Sims-Lucas, S., Caruana, G., Dowling, J., Kett, M. M., Bertram, J. F. Augmented and accelerated nephrogenesis in TGF-beta2 heterozygous mutant mice. Pediatric Research. 63 (6), 607-612 (2008).
- Cullen-McEwen, L. A., Kett, M. M., Dowling, J., Anderson, W. P., Bertram, J. F. Nephron number, renal function, and arterial pressure in aged GDNF heterozygous mice. Hypertension. 41 (2), 335-340 (2003).
- Stelloh, C., et al. Prematurity in mice leads to reduction in nephron number, hypertension and proteinuria. Translational Research. 159 (2), 80-89 (2012).
- Galinsky, R., et al. Effect of intra-amniotic lipopolysaccharide on nephron number in preterm fetal sheep. American Journal of Physiology Renal Physiology. 301 (2), F280-F285 (2011).
- Bertam, J. F., et al. Why and how we determine nephron number. Pediatric Nephrology. 29 (4), 575-580 (2014).
- Nyengaard, J. R. Stereologic methods and their application in kidney research. Journal of the American Society of Nephrology. 10 (5), 1100-1123 (1999).
- Beeman, S. C., et al. Measuring glomerular number and size in perfused kidneys using MRI. American Journal of Physiology Renal Physiology. 300 (6), F1454-F1457 (2011).
- Damadian, R. V., Shawayri, E., Bricker, N. S. On the existence of non-urine forming nephrons in the diseased kidney of the dog. Journal of Laboratory and Clinical Medicine. 65, 26-39 (1965).
- Bonvalet, J. P., et al. Number of glomeruli in normal and hypertrophied kidneys of mice and guinea-pigs. The Journal of Physiology. 269 (3), 627-641 (1977).
- Bains, R. K., Sibbons, P. D., Murray, R. D., Howard, C. V., Van Velzen, D. Stereological estimation of the absolute number of glomeruli in the kidneys of lambs. Research in Veterinary Science. 60 (2), 122-125 (1996).
- Assmann, K. J., van Son, J. P., Koene, R. A. Improved method for the isolation of mouse glomeruli. Journal of the American Society of Nephrology. 2 (4), 944-946 (1991).
- Wang, X., et al. Nephron deficiency and predisposition to renal injury in a novel one-kidney genetic model. Journal of the American Society of Nephrology. 26 (7), 1634-1646 (2015).
- Lodrup, A. B., Karstoft, K., Dissing, T. H., Pedersen, M., Nyengaard, J. R. Kidney biopsies can be used for estimations of glomerular number and volume: a pig study. Virchows Archiv. 452 (4), 393-403 (2008).
- Fassi, A., et al. Progressive glomerular injury in the MWF rat is predicted by inborn nephron deficit. Journal of the American Society of Nephrology. 9 (8), 1399-1406 (1998).
- Wintour, E. M., et al. Reduced nephron number in adult sheep, hypertensive as a result of prenatal glucocorticoid treatment. The Journal of Physiology. 549 (Pt 3), 929-935 (2003).
- Van Vuuren, S. H., et al. Compensatory growth of congenital solitary kidneys in pigs reflects increased nephron numbers rather than hypertrophy. PLoS One. 7 (11), e49735 (2012).
