Summary
يصف هذا المقال بروتوكولا سريعا لوصف الاوعيه الدموية في الأسماك تيليست عن طريق التروية القلبية من المخفف في المثبت ، وذلك باستخدام الميداكا (اوريزيز لا تيبس) كنموذج والتركيز علي الدماغ والانسجه النخامية.
Abstract
الاوعيه الدموية العصبية جميع الانسجه في الفقاريات ، مما يتيح البقاء علي قيد الحياة من خلال توفير المواد الغذائية اللازمة ، والأكسجين ، والإشارات الهرمونية. وهي واحده من الاجهزه الاولي التي تبدا العمل اثناء التنمية. أصبحت أليات تكوين الاوعيه الدموية موضوعا للاهتمام العلمي والسريري العالي. في البالغين ومع ذلك ، فانه من الصعب تصور الاوعيه الدموية في معظم الكائنات الحية بسبب توطينهم عميقا داخل الانسجه الأخرى. ومع ذلك ، لا يزال التصور من الاوعيه الدموية الهامه لعده دراسات مثل الغدد الصماء والبيولوجيا العصبية. في حين تم تطوير عده خطوط المحورة وراثيا في zebrafish ، مع الاوعيه الدموية تصور مباشره من خلال التعبير عن البروتينات الفلورية ، لا توجد مثل هذه الاداات للأنواع الأخرى تيليوست. باستخدام الميداكا (اوريزيراس لا تيبس) كنموذج ، والبروتوكول الحالي يقدم تقنيه سريعة ومباشره لتسميه الاوعيه الدموية في الدماغ والغدة النخامية من خلال الأداء المثالي عن طريق القلب مع المثبتة التي تحتوي علي الصورة. يسمح هذا البروتوكول بتحسين فهمنا لكيفيه تفاعل المخ والخلايا النخامية مع الاوعيه الدموية في الانسجه الكاملة أو شرائح الانسجه السميكة.
Introduction
تلعب الاوعيه الدموية جزءا أساسيا من الجسم الفقاري لأنها توفر العناصر الغذائية الضرورية والأكسجين والإشارات الهرمونية لجميع الأعضاء. أيضا ، منذ اكتشاف مشاركتهم في تطوير السرطان1، وقد تلقوا الكثير من الاهتمام في البحوث السريرية. وعلي الرغم من ان عددا من المنشورات قد حققت في أليات التي تسمح بنمو الاوعيه الدموية والمستنقعات ، وتم تحديد عدد كبير من الجينات الهامه لتشكيلها2، لا يزال هناك الكثير مما ينبغي فهمه فيما يتعلق بالتفاعل بين الخلايا أو الانسجه والدم المتداول.
التصور من الاوعيه الدموية في الدماغ والغدة النخامية مهم. الخلايا العصبية في الدماغ تتطلب إمدادات عاليه من الأكسجين والجلوكوز3, والغدة النخامية يحتوي علي ما يصل إلى ثمانيه أنواع الخلايا المنتجة للهرمونات الهامه التي تستخدم تدفق الدم لتلقي اشاره من الدماغ وإرسال الهرمونات الخاصة بهم إلى مختلف الاجهزه الطرفية4,5. بينما في الثدييات ، ونظام البوابة في قاعده تحت المهاد اسمه الفضيلة وسيط ، يربط الدماغ والغدة النخامية6، مثل هذا الجسر الدم واضحة لم يوصف في الأسماك تيليوست. في الواقع ، في teleosts ، preoptico-طائي الخلايا العصبية مباشره المشروع محاور في بارس العصبي من الغدة النخامية7 ومعظمها inعصبيه أنواع الخلايا الصماء المختلفة مباشره8،9. ومع ذلك ، فان بعض هذه الخلايا العصبية لها نهاياتها العصبية الموجودة في الفضاء الخارج ، في المنطقة القريبة من الشعيرات الدموية10. ولذلك ، فان الفرق بين الأسماك تيليوست والثدييات ليست واضحة جدا ، والعلاقة بين الاوعيه الدموية في الدم والدماغ والخلايا النخامية يتطلب المزيد من التحقيق في الأسماك تيليوست.
[زبرفيش] يتلقى, في كثير مظاهر, تشريحيا ووظيفيا قابل للمقارنة نظامه وعائية إلى أخرى فقاري أنواع11. وقد أصبح نموذج فقاري قويه للبحوث القلب والاوعيه الدموية في الغالب بفضل تطوير عده خطوط المحورة وراثيا حيث يتم تسميه مكونات نظام الاوعيه الدموية مع البروتينات الفلورية مراسل12. ومع ذلك ، قد يختلف تشريح نظام الدوران الدقيق بين الأنواع ، أو حتى بين شخصين ينتميان إلى نفس النوع. ولذلك ، فان التصور من الاوعيه الدموية قد تكون ذات فائده عاليه أيضا في الأنواع الأخرى تيليوست التي لا وجود لها أدوات التكوين.
وقد تم وصف العديد من التقنيات لتسميه الاوعيه الدموية في كل من الثدييات والتيليتات. وتشمل هذه التهجين في الموقع للجينات الاوعيه الدموية المحددة, تلطيخ الفوسفاتيز القلوية, تصوير الاوعيه الدقيقة, وحقن صبغ (للمراجعة انظر13). وقد استخدمت لأول مره لدراسة الدهون غشاء الحركية الجانبية والاحتفاظ بها في الطبقات الدهنية ويمكن ان تهاجر من خلال ذلك14,15,16. في الواقع ، يتكون جزيء من السلسلة الهيدروكربونية من سلسلتين من الهيدروكربونات والكروم. وفي حين ان السلاسل الهيدروكربونية تدمج في غشاء الخلية الدهنية للخلايا التي تلامسها ، فان الكروم لا يزال علي سطحه17. مره واحده في الغشاء ، وجزيئات الندية منتشر جانبيا داخل الطبقات الدهنية التي تساعد علي وصمه عار هياكل الاغشيه التي ليست علي اتصال مباشر مع حل الندية. التالي ، فان حقن محلول من خلال التروية القلبية ، سيقوم بتسميه جميع الخلايا البطانية في اتصال مع المركب الذي يسمح بالوسم المباشر للاوعيه الدموية. ويستخدم اليوم أيضا لأغراض تلطيخ أخرى ، مثل التصوير جزيء واحد ، وتعيين مصير ، وتتبع الخلايا العصبية. ومن المثير للاهتمام ، وجود العديد من الفلوروبورس (مع أطوال موجية مختلفه من الانبعاثات) مما يسمح بالجمع مع التسميات الفلورية الأخرى ، والتاسيس ، فضلا عن الانتشار الجانبي لل ، يمكن ان يحدث في كل من الانسجه الحية والثابتة18، التاسعة عشره
الفورمالديهايد ، التي اكتشفها فرديناند بلوم في 1893 ، وقد استخدمت علي نطاق واسع في الوقت الحاضر كالمادة الكيميائية المفضلة لتثبيت الانسجه20،21. هو يبدي خصوصية واسعه ل كثير أهداف خلوية ويحافظ البنية خلوية22,23. كما انه يحفظ الخصائص الفلورية لمعظم الفلوروبيورس ، التالي يمكن استخدامها لتثبيت الكائنات المحورة وراثيا التي تستهدف الخلايا التي تعبر عن البروتينات الفلورية مراسل.
في هذه المخطوطة ، تم تكييف بروتوكول سابق تم تطويره لتسميه الاوعيه الدموية في نماذج الثدييات التجريبية الصغيرة24 لاستخدامه في الأسماك. الاجراء بأكمله يستغرق سوي بضع ساعات لأداء. فانه يوضح كيفيه حقنت حل مثبت من الفورمالديهايد التي تحتوي علي الندية في قلب السمكة من أجل التسمية مباشره جميع الاوعيه الدموية في الدماغ والغدة النخامية للنموذج الأسماك medaka. Medaka هي سمكه صغيره المياه العذبة الاصليه إلى اسيا ، وجدت في المقام الأول في اليابان. وهو كائن نموذج البحث مع مجموعه من الاداات الجزيئية والجينية المتاحة25. ولذلك ، فان تحديد الاوعيه الدموية في هذا النوع وكذلك في غيرها من شانه ان يسمح لتحسين فهمنا حول كيفيه تفاعل الدماغ والخلايا النخامية مع الاوعيه الدموية في الانسجه الكاملة أو شرائح الانسجه السميكة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تم تنفيذ جميع التعامل مع الماشية وفقا لتوصيات لرعاية ورعاية البحوث الحيوانية في الجامعة النرويجية لعلوم الحياة ، وتحت اشراف المحققين المخولين.
1. اعداد الاداات والحلول
- اعداد الحل الأسهم ديي تذويب 5 ملغ من الكريستال اردي في 1.5 mL أنبوب من البلاستيك مع 1 مل من 96 ٪ EtOH. دوامه لمده 30 ثانيه والحفاظ علي تغطيتها باستخدام رقائق ألومنيوم.
ملاحظه: ويمكن الحفاظ علي حل الأسهم في الظلام في-20 درجه مئوية لعده أشهر. - اعداد حامل السمك (الشكل 1ا) عن طريق قطع قطعه من البوليسترين إلى طول 5 سم ، عرض 3 سم ، وسماكه 2 سم ، والتصاق به لطبق من البلاستيك قطرها 9 سم. جعل حفره علي شكل قارب 3 سم مع شفره مشرط في البوليسترين.
- اعداد النظام النبض (الشكل 2) عن طريق أضافه 30-50 cm البلاستيكية الطويلة قني في اقصي الابره.
- اعداد 40 مل من الطازجة محلول بارافورمالدهيد 4 ٪ (PFA) عن طريق تمييع 10 مل من 16 ٪ PFA مع 30 مل من الفوسفات محلول المالحة مخزنه (تلفزيوني) في أنبوب من البلاستيك 50 mL.
- اعداد 10 مل من الحل fixative/الندية عن طريق تمييع 1 مل من محلول الأسهم في 9 مل من الطازجة 4% PFA في أنبوب من البلاستيك 10 مل. يحفظ في الظلام حتى الاستخدام.
ملاحظه: ويمكن الاحتفاظ بلورات التي لم يتم حلها في أنبوب حل الأسهم ، ويمكن أضافه الايثانول الجديد لاعداد حل الأسهم الجديدة (انظر الخطوة 1.1). -
اعداد 50 مل من الأسهم tricaine (MS-222).
- تذوب 200 ملغ من مسحوق Tricaine في 48 mL من H2O. أضافه 2 مل من 1 M تريس قاعده (pH 9). ضبط إلى pH 7 مع 1 م HCl وتخزين في-20 درجه مئوية.
- تمييع 5 مل من الأسهم Tricaine في 50 مل من المياه النظيفة في زجاج صغير.
- اعداد العديد من الماصات الزجاجية بطول 5 سم (الشكل 2) عن طريق تمديد الشعرية الزجاجية مع ساحبه ماصه بعد تعليمات الشركة المصنعة.
2. تشريح و Perfusion
ملاحظه: PFA هو مركب المتطايرة السامة ، التالي فان تشريح والتروية ينبغي ان يؤديها في غطاء محرك المركبة أو في غرفه التهوية ، ويجب ان يكون المستخدم يرتدي قناع الغاز.
- اعداد أدوات تشريح بما في ذلك مقص صغير ، واحد حاد وملقط قوي واحد قبل تشريح.
- ملء حقنه مع الحل المعد من PFA/الندية عن طريق وضعه في أنبوب 50 mL والرسم. ثم ضع الابره مع الكانولا في اقصي الحقنه (الشكل 2).
- إصلاح حقنه علي مقاعد البدلاء باستخدام عده قطع من الشريط وضعت في اتجاات مختلفه ، وضبط موقف المجهر ومقعد للحصول علي موقف جيد لتشريح والضغط علي مكبس حقنه (الشكل 1ب).
ملاحظه: في هذا البروتوكول ، يتم استخدام الكوع للضغط علي مكبس المحقنة ، ولكن يمكن استخدام خيارات الاحتمالات الأخرى ، علي سبيل المثال ، المساعدة من شخص آخر. - موت ببطء السمك مع جرعه زائده من tricaine عن طريق وضع الأسماك في الحل أعدت في الخطوة 1.7. انتظر 30 ق واختبار ردود الفعل من الأسماك عن طريق الاستيلاء علي زعنفة الذيليه مع ملقط. ويمكن استخدام الأسماك عندما توقفت عن الاستجابة للمؤثرات.
- وضع الأسماك في حامل الأسماك مع البطن في مواجهه ودبوس ابره واحده في اقصي الراس واخر واحد فوق الذيل للحفاظ علي الأسماك في مكانها.
- فتح البطن الامامي مع مقص عن طريق قطع أفقيا طبقه سطحيه من الجلد.
- باستخدام ملقط ، وأزاله الجلد فوق القلب حتى وصول واضح إلى البطين ويتم توفير الشرايين الشريانية (الشكل 3).
- أضافه ماصه زجاجيه في اقصي الشعرية وكسر نهاية غيض من ماصه الزجاج.
ملاحظه: يجب ان يكون ثقب الطرف المكسور كبيرا بما يكفي للسماح للسائل بالخروج ، ولكن لا يزال صغيرا بما يكفي لإدخال الانسجه بسهوله. يمكن أعاده استخدام الماصة الزجاجية ان لم تكن مكسوره أو مسدودة. - احضر الماصة الزجاجية بالقرب من البطين وأضف الضغط إلى مكبس المحقنة مع الكوع لإجبار السائل علي الخروج.
- دبوس البطين القلب مع ماصه الزجاج مع أضافه الضغط علي حقنه.
- مباشره بعد ، تثقيب الجيوب الانفيه وريدي مع ملقط لتمكين الدم من ترك الدورة الدموية.
ملاحظه: يصبح البطين القلب أكثر هشاشة بسبب المثبت. كما انه يصبح اقل احمرارا كما يتم تخفيف الدم مع الحل fixative/الندية. - من البطين ، اضبط زاوية الماصة الزجاجية للعثور علي مدخل الشريان الشرياني. احضر فتحه الماصة داخل الشرايين الشريانية كما هو موضح في الشكل 2، وأضف المزيد من الضغط علي الحقنه.
ملاحظه: الشرايين الشريانية شفافة والانسجه مرنه. عند استبدال الدم بالشكل الداخلي/المثبت ، يجب ان تصبح الماصة الزجاجية داخل القلب أكثر وضوحا وباضافه الضغط ، يجب ان يتوسع حجم الشرايين الشريانية. هذه الخطوة حاسمه للتاكد من انه قد تم استخدام ما يكفي من الضغط لتحل محل كل الدم مع الحل fixative/الندية ، وانه تم التوصل إلى جميع الاوعيه الدموية. في كثير من الأحيان عندما الناجحة, PFA يثير انقباضات العضلات والأسماك سوف تتحرك. - مواصله أضافه الضغط علي حقنه ل 30-60 s لا يزال الحفاظ علي ماصه الزجاج داخل الشرايين بولبوس.
- أزاله ماصه الزجاج والابر من الأسماك.
- تشريح الدماغ والغدة النخامية ، واحتضان الانسجه في الطازجة 4 ٪ PFA في الخدمات التلفزيونية لمده 2 ح في الظلام في درجه حرارة الغرفة.
ملاحظه: تشريح الدماغ والغدة النخامية سابقا وقد وصفت بالتفصيل في طريقتين مختلفه من قبل فونتين et al.26 و Ager-ويك et al.27. بسبب التثبيت ، يصبح النسيج من الصعب جدا والحلقة الهشة بين الدماغ والغدة النخامية قد تكون مكسوره. بعد تشريح ، ويمكن أيضا اجراء عمليه التثبيت بعد الليل في 4 درجه مئوية. - شطف الانسجه مرتين في الاذاعه التلفزيونية لمده 10 دقيقه قبل التحضير للتصوير.
ملاحظه: ثم يمكن تركيب النسيج بين انزلاق الانزلاق والغطاء مع فواصل في الوسط والتركيب للتصوير البؤري (انظر الشكل 4) ، أو مقسمه مع الذبذبات كما هو موضح بالتفصيل في فونتين وآخرون26 قبل التصاعد بين انزلاق وغطاء للتصوير باستخدام مجسم فراغي (انظر الشكل 4).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
هذا البروتوكول يوضح اجراء خطوه بخطوه لتسميه الاوعيه الدموية في الدماغ الميداكا والغدة النخامية ، وفي الوقت نفسه إصلاح الانسجه. بعد الوسم عن طريق الحقن القلبي لمحلول مثبت يحتوي علي الصورة الضوئية في القلب ، يمكن ملاحظه الاوعيه الدموية علي الشرائح باستخدام المجسم الفراغي الفلوري (الشكل 4) أو علي الانسجه الكاملة باستخدام مجهر كونبؤري (الشكل 5). اما علي شريحة الانسجه السميكة أو علي النسيج كله ، يمكن ملاحظه الهندسة المعمارية للدم الاوعيه الدموية في ثلاثه ابعاد. يمكن تسميه شرائح الانسجه للبروتينات المحددة المستهدفة باستخدام بروتوكولات المناعة القياسية بعد نهاية التثبيت ، وعلي الخطوط المحورة وراثيا حيث الخلايا من الفائدة التعبير عن البروتينات الفلورية مراسل (الشكل 6). وهذا يسمح باجراء تحقيقات في التفاعلات بين الاوعيه الدموية وأنواع الخلايا المحددة الأخرى. هنا علي سبيل المثال ، واستخدام خط المحورة وراثيا من الميداكا حيث البروتين الفلوري الأخضر (gfp)-الخلايا المنتجة كشفت عن موقع الخلايا النخامية Lh28. يمكن للمرء ان نلاحظ ان هذه الخلايا إرسال ملحقات نحو الاوعيه الدموية. قد لا يتم تسميه بعض الاوعيه الدموية بشكل صحيح إذا كانت التروية شبه مثاليه. هذا يمكن ان يكون الحال ، علي سبيل المثال ، إذا تم حقن المحلول في البطين القلب بدلا من الشرايين الشريانية ، أو إذا كان استخدام ضغط منخفض جدا و/أو لفتره قصيرة جدا علي مكبس حقنه (الشكل 7). وأخيرا ، من خلال تصوير نفس النسيج مع نفس المعلمات التصوير ، وأظهرت كثافة الوسم لإنقاص بعد أربعه أيام ، مع اشاره أكثر انتشارا (الشكل 8).
الشكل 1 : صور للوحه القابضة لتجميع الأسماك (A) واعداد الحقن (B). يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2 : مخطط للقلب الأسماك الميداكا ونظام ترويه أظهرت مع موقع ايدل من ابره الزجاج في القلب لنجاح ترويه. عرض راس السهم حيث لتثقيب القلب للسماح للدم لترك الدورة الدموية. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3 : صوره من الجانب بطني من السمكة يفتح, مع القلب يعرض ل [برفوسيون]. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4 : صوره من الاوعيه الدموية في الدم في شريحة من انسجه المخ والغدة النخامية من medaka. وقد تم perfused البالغين ميداكا مع حل مثبت التي تحتوي علي الندية. تم تشريح الدماغ والغدة النخامية والثابتة بين عشيه وضحيها. وقد شنت الانسجه في 3 ٪ اجنشا واوما مع الذبذبات قبل التصوير مع المجهر مضان. وينظر إلى جميع الاوعيه الدموية المسمية بالأحرف الكاملة من خلال القسم كله الذي يظهر الاوعيه في الدماغ والغدة النخامية. OT = tectum البصرية ؛ Tel = telالدماغ; Hyp = المهاد. حفره = الغدة النخامية. Cb = المخيخ ؛ هند = الدماغ المؤخر. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5 : 3d تقديم من كومه التنسيق z-مكدس من الاوعيه الدموية في الغدة النخامية ميداكا. وقد تم perfused البالغين ميداكا مع حل مثبت التي تحتوي علي الندية. تم تشريح الدماغ والغدة النخامية والثابتة بين عشيه وضحيها. تم تشريح الغدة النخامية من الدماغ وشنت بين الشريحة والمشبك مع الفواصل ib بين, قبل التصوير مع المجهر البؤري. تم تسجيل Z-المكدس ، وقدم 3D جعل باستخدام البرمجيات فيجي والبرنامج المساعد 3D المشاهد29. ويمكن ملاحظه الاوعيه الدموية في الغدة النخامية بأكملها في 3D. Rpd = منقاري pars distalis ؛ PPD = القريب pars distalis; PI = pars intermedia. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 6 : Z الإسقاط من التراص z-كومه من شريحة الانسجه من الميداكا المحورة وراثيا حيث المروج lhβ يتحكم التعبير من البروتين الأخضر مراسل الفلورسنت. وكان الكبار tg (lhb: hrgfpii) الميداكا مع حل مثبت التي تحتوي علي الندية. تم تشريح الدماغ والغدة النخامية والثابتة بين عشيه وضحيها. وقد شنت الانسجه في 3 ٪ اجنشا واوما مع الذبذبات. بعض الخلايا المنتجة للهرمونات, الخلايا Lh في هذه الحالة, إرسال ملحقات (رؤوس الأسهم) نحو الاوعيه الدموية يمكن ملاحظتها, ربما لاستشعار الإشارات من الدم و/أو الإفراج عن هرموناتها في الدورة الدموية. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 7 : صوره من الاوعيه الدموية في الدم في شريحة من الدماغ والانسجه النخامية من medaka سيئه الاستخدام. وكان البالغين الميداكا سيئه الأداء مع حل مثبت التي تحتوي علي الحل عن طريق حقن المحلول في البطين فقط. تم تشريح الدماغ والغدة النخامية والثابتة بين عشيه وضحيها. وقد شنت الانسجه في 3 ٪ اجنشا واوما مع الذبذبات قبل التصوير مع المجهر البؤري. وكانت الاوعيه الدموية سيئه التسمية مع الندية وبعض منهم لم توصف علي الإطلاق. OT = tectum البصرية ؛ Tel =, [تلينسيمن]; Hyp = المهاد. حفره = الغدة النخامية. Cb = المخيخ ؛ هند = الدماغ المؤخر. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 8 : التصوير الفاصل الزمني للدم المسمي الاوعيه الدموية في الدماغ ميداكا-قسم الانسجه النخامية. وقد تم perfused البالغين ميداكا مع حل مثبت التي تحتوي علي الندية. تم تشريح الدماغ والغدة النخامية والثابتة بين عشيه وضحيها. وقد شنت الانسجه في 3 ٪ اجنشا واوما مع الذبذبات قبل التصوير مع المجسمة مباشره بعد تصاعد (ا) ، و 4 أيام بعد تصاعد (B) مع نفس المعلمات التصوير. لاحظ ان وضع العلامات قد انخفض وانتشر مع الوقت. OT = tectum البصرية ؛ Tel = telالدماغ; Hyp = المهاد. حفره = الغدة النخامية. Cb = المخيخ ؛ هند = الدماغ المؤخر. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وقد استخدمت ترويه القلب مع الشركة سابقا لتسميه الاوعيه الدموية في العديد من الأنواع النموذجية24، بما في ذلك الأسماك تيليوست13.
كما يتم تسليمها مباشره إلى غشاء الخلية البطانية من قبل ترويه في الاوعيه الدموية ، فمن الممكن لزيادة نسبه الاشاره إلى الضوضاء عن طريق زيادة تركيز الندية في الحل مثبت. الاضافه إلى ذلك ، فان فلوكوفيري يوفر تلطيخ شديد عندما متحمس مع الحد الأدنى من التبييض مما يسمح للانبعاثات طويلة الأمد نسبيا18،30. أيضا ، يمكن وضع العلامات لعده أيام واستخدامها في تركيبه مع تقنيات الوسم الأخرى التي تتطلب علاجات خفيفه ، مثل في إيمموفلوريسسينسي (IF)31.
ومع ذلك ، هذا الأسلوب لديه بعض القيود. بعد أزاله من الحل المثبت ، وينبغي ان يتم وضع العلامات والتصوير من الانسجه في أسرع وقت ممكن لان شده الوسم سوف تضعف ، وسوف تنتشر اشاره مع مرور الزمن (الشكل 8). وسوف تكون هذه العملية حتى أسرع عند استخدام المنظفات التي تزيد من مساميه الغشاء. أيضا ، لان PFA مركب المتطايرة السامة ، يجب اتخاذ العديد من الاحتياطات عند تنفيذ هذه التجربة. للتقليل من الجوانب الخطرة من هذا البروتوكول ، يمكن للمرء ان حقنت حلا لل والاذاعه التلفزيونية قبل تشريح الانسجه من الفائدة وإصلاحه مع الحل PFA الحق بعد perfusion. ومع ذلك ، وهذا يمكن ان يؤديها فقط للانسجه صغيره الحجم ، والاختراق من PFA في عينات الانسجه الكبيرة سيكون اقل كفاءه من خلال التروية.
يتم تحسين معدل نجاح هذا البروتوكول عن طريق التدريب ، لذلك فمن المتوقع ان الباحثين سوف تحتاج إلى بعض الوقت للتعرف علي الخطوات المختلفة لهذه التقنية. علي سبيل المثال ، فان الانصهار من الحل في الشرايين الشريانية هو خطوه حرجه بشكل خاص من البروتوكول ويتطلب بعض التدريب لتحقيق نتيجة جيده. أيضا الحفاظ علي الابره في الموضع الصحيح لفتره طويلة بما فيه الكفاية خلال ترويه ليست تافه ، وسوف تتطلب التدريب من قبل المناور.
وأخيرا ، تم تحسين هذا البروتوكول للبالغين الميداكا ولكن يمكن استخدامه للأنواع الأخرى مع بعض التعديلات. الانسجه المختلفة من الفائدة ، أو حتى مراحل الحياة المختلفة من الحيوانية داخل نفس النسيج وسوف تتطلب أيضا تحسينات لتركيز الندية والوقت من ترويه ، فضلا عن المواد المستخدمة (الابره والمحاقن الاحجام علي سبيل المثال).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
المؤلفون ليس لديهم ما يكشفون عنه
Acknowledgments
نشكر الدكتور شينجي كاندا لإظهار التروية القلبية مع الحل المثبت في ميداكا ، السيدة لورديس كارو G تان للمساعدة في تربيه ميداكا ، والسيد أنتوني بلتيير للرسوم التوضيحية. تم تمويل هذا العمل من قبل NMBU ومجلس البحوث في النرويج ، ومنح عدد 248828 (برنامج الحياة الرقمية النرويج).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 16% paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | RT 15711 | |
| 5 mL Syringe PP/PE without needle | Sigma | Z116866-100EA | syringes |
| BD Precisionglide syringe needles | Sigma | Z118044-100EA | needles 18G (1.20*40) |
| Borosilicate glass 10 cm OD 1.2 mm | sutter instrument | BF120-94-10 | glass pipette |
| DiI (1,1′-Dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindocarbocyanine perchlorate) | Invitrogen | D-282 | |
| LDPE tube O.D 1.7 mm and I.D 1.1 mm | Portex | 800/110/340/100 | canula |
| Phosphate Buffer Saline (PBS) solution | Sigma | D8537-6X500ML | |
| Pipette puller | Narishige | PC-10 | |
| Plastic Petri dishes | VWR | 391-0442 | |
| Super glue gel | loctite | c4356 | |
| Tricaine (ms-222) | sigma | E10521-50G |
References
- Nishida, N., Yano, H., Nishida, T., Kamura, T., Kojiro, M.
- Simon, M. C. Vascular morphogenesis and the formation of vascular networks. Developmental Cell. 6 (4), 479-482 (2004).
- Magistretti, P. J. Brain energy metabolism in Fundamental neuroscience. Zigmond, M., et al. , Academic Press. 389-413 (1999).
- Weltzien, F. A., Andersson, E., Andersen, O., Shalchian-Tabrizi, K., Norberg, B. The brain-pituitary-gonad axis in male teleosts, with special emphasis on flatfish (Pleuronectiformes). Comparative Biochemistry and Physiology - Part A: Molecular & Integrative Physiology. 137 (3), 447-477 (2004).
- Ooi, G. T., Tawadros, N., Escalona, R. M. Pituitary cell lines and their endocrine applications. Molecular and Cellular Endocrinology. 228 (1-2), 1-21 (2004).
- Knigge, K. M., Scott, D. E. Structure and function of the median eminence. American Journal of Anatomy. 129 (2), 223-243 (1970).
- Ball, J. N. Hypothalamic control of the pars distalis in fishes, amphibians, and reptiles. General Comparative Endocrinology. 44 (2), 135-170 (1981).
- Knowles, F., Vollrath, L. Synaptic contacts between neurosecretory fibres and pituicytes in the pituitary of the eel. Nature. 206 (4989), 1168 (1965).
- Knowles, F., Vollrath, L. Neurosecretory innervation of the pituitary of the eels Anguilla and Conger I. The structure and ultrastructure of the neuro-intermediate lobe under normal and experimental conditions. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 250 (768), 311-327 (1966).
- Golan, M., Zelinger, E., Zohar, Y., Levavi-Sivan, B. Architecture of GnRH-Gonadotrope-Vasculature Reveals a Dual Mode of Gonadotropin Regulation in Fish. Endocrinology. 156 (11), 4163-4173 (2015).
- Isogai, S., Horiguchi, M., Weinstein, B. M. The vascular anatomy of the developing zebrafish: an atlas of embryonic and early larval development. Developmental Biology. 230 (2), 278-301 (2001).
- Cha, Y. R., Weinstein, B. M. Visualization and experimental analysis of blood vessel formation using transgenic zebrafish. Birth Defects Research Part C: Embryo Today. 81 (4), 286-296 (2007).
- Kamei, M., Isogai, S., Pan, W., Weinstein, B. M.
- Wu, E. S., Jacobson, K., Papahadjopoulos, D. Lateral Diffusion in Phospholipid Multibilayers Measured by Fluorescence Recovery after Photobleaching. Biochemistry. 16 (17), 3936-3941 (1977).
- Schlessinger, J., Axelrod, D., Koppel, D. E., Webb, W. W., Elson, E. L. Lateral Transport of a Lipid Probe and Labeled Proteins on a Cell-Membrane. Science. 195 (4275), 307-309 (1977).
- Johnson, M., Edidin, M. Lateral Diffusion in Plasma-Membrane of Mouse Egg Is Restricted after Fertilization. Nature. 272 (5652), 448-450 (1978).
- Axelrod, D. Carbocyanine Dye Orientation in Red-Cell Membrane Studied by Microscopic Fluorescence Polarization. Biophysical Journal. 26 (3), 557-573 (1979).
- Honig, M. G., Hume, R. I. Fluorescent Carbocyanine Dyes Allow Living Neurons of Identified Origin to Be Studied in Long-Term Cultures. Journal of Cell Biology. 103 (1), 171-187 (1986).
- Godement, P., Vanselow, J., Thanos, S., Bonhoeffer, F. A study in developing visual systems with a new method of staining neurones and their processes in fixed tissue. Development. 101 (4), 697-713 (1987).
- Fox, C. H., Johnson, F. B., Whiting, J., Roller, P. P.
- Puchtler, H., Meloan, S. N. On the Chemistry of Formaldehyde Fixation and Its Effects on Immunohistochemical Reactions. Histochemistry. 82 (3), 201-204 (1985).
- Hoetelmans, R. W. M., et al. Effects of acetone, methanol, or paraformaldehyde on cellular structure, visualized by reflection contrast microscopy and transmission and scanning electron microscopy. Applied Immunohistochemistry & Molecular Morphology. 9 (4), 346-351 (2001).
- Hobro, A. J., Smith, N. I. An evaluation of fixation methods: Spatial and compositional cellular changes observed by Raman imaging. Vibrational Spectroscopy. 91, 31-45 (2017).
- Li, Y. W., et al. Direct labeling and visualization of blood vessels with lipophilic carbocyanine dye DiI. Nature Protocols. 3 (11), 1703-1708 (2008).
- Wittbrodt, J., Shima, A., Schartl, M. Medaka--a model organism from the far East. Nature Review Genetic. 3 (1), 53-64 (2002).
- Fontaine, R., Hodne, K., Weltzien, F. A. Healthy Brain-pituitary Slices for Electrophysiological Investigations of Pituitary Cells in Teleost Fish. Journal of Visual Experiments. (138), 57790 (2018).
- Ager-Wick, E., et al. Preparation of a High-quality Primary Cell Culture from Fish Pituitaries. Journal of Visual Experiments. (138), 58159 (2018).
- Hildahl, J., et al. Developmental tracing of luteinizing hormone beta-subunit gene expression using green fluorescent protein transgenic medaka (Oryzias latipes) reveals a putative novel developmental function. Developmental Dynamics. 241 (11), 1665-1677 (2012).
- Schmid, B., Schindelin, J., Cardona, A., Longair, M., Heisenberg, M. A high-level 3D visualization API for Java and ImageJ. BMC Bioinformatics. 11, 274 (2010).
- Honig, M. G., Hume, R. I. Dil and diO: versatile fluorescent dyes for neuronal labelling and pathway tracing. Trends Neurosciences. 12 (9), 333-335 (1989).
- Fontaine, R., et al. Dopaminergic Neurons Controlling Anterior Pituitary Functions: Anatomy and Ontogenesis in Zebrafish. Endocrinology. 156 (8), 2934-2948 (2015).
