Summary
Artikkelen beskriver en rask protokoll for merking blodkar i en tetramerisk fisk ved hjertestans av DiI fortynnet i bindemiddel, ved hjelp av medaka (Oryzias latipes) som en modell og fokus på hjerne og hypofysen vev.
Abstract
Blodårene innervate alle vev i virveldyr, slik at deres overlevelse ved å gi de nødvendige næringsstoffer, oksygen, og hormonelle signaler. Det er en av de første organene til å begynne å fungere under utvikling. Mekanismer for blodkar dannelse har blitt gjenstand for høy vitenskapelig og klinisk interesse. Hos voksne er det imidlertid vanskelig å visualisere blodkar i de fleste levende dyr på grunn av deres lokalisering dypt inne i andre vev. Likevel er visualisering av blodkar fortsatt viktig for flere studier som endokrinologi og nevrobiologi. Mens flere transgene Lines har blitt utviklet i sebrafisk, med blodkar direkte visualisere gjennom uttrykk for fluorescerende proteiner, finnes det ingen slike verktøy for andre tetramerisk arter. Bruke medaka (Oryzias latipes) som en modell, presenterer den nåværende protokollen en rask og direkte teknikk for å merke blodkar i hjernen og hypofysen ved perfusing gjennom hjertet med bindemiddel som inneholder DiI. Denne protokollen kan forbedring av vår forståelse om hvordan hjernen og hypofysen celler samhandle med blod blodkar i hele vev eller tykke vev skiver.
Introduction
Blodårene spiller en viktig del av virveldyr kroppen som de gir de nødvendige næringsstoffer, oksygen og hormonelle signaler til alle organer. Også, siden oppdagelsen av deres engasjement i kreftutvikling1, har de fått mye oppmerksomhet i klinisk forskning. Selv om en rekke publikasjoner har undersøkt mekanismene som gjør at blodkar vekst og morphogenesis, og et stort antall gener som er viktige for dannelsen, har blitt identifisert2, gjenstår mye å forstå om samspillet mellom celler eller vev og sirkulerende blod.
Visualisering av blod blodkar i hjernen og hypofysen er viktig. Neurons i hjernen krever en høy tilførsel av oksygen og glukose3, og hypofysen inneholder opptil åtte viktige hormon-produserende celletyper som bruker blodstrømmen til å motta signal fra hjernen og sende sine respektive hormoner til ulike perifere organer4,5. Mens i pattedyr, portalen systemet ved foten av hypothalamus navngitt median dominans, lenker hjernen og hypofysen6, har en slik klar blod bro ikke blitt beskrevet i tetramerisk fisk. Faktisk, i teleosts, preoptico-hypothalamus neurons direkte prosjektet deres axons inn i Pars nervosa av hypofysen7 og det meste innervate de ulike endokrine celletyper direkte8,9. Men noen av disse neurons har sine nerve avslutninger ligger i ekstravaskulær plass, i nærheten av blodkar10. Derfor er forskjellen mellom tetramerisk fisk og pattedyr ikke så klart, og forholdet mellom blod blodkar og hjernen og hypofysen cellene krever større etterforskning i tetramerisk fisk.
Sebrafisk har i mange aspekter, et anatomisk og funksjonelt sammenlignbart vaskulær system til andre virveldyr-arter11. Det har blitt en kraftig virveldyr modell for kardiovaskulær forskning hovedsakelig takket være utviklingen av flere transgene linjer hvor komponentene i det vaskulære systemet er merket med fluorescerende reporter proteiner12. Men nøyaktig sirkulasjonssystemet anatomi kan variere mellom arter, eller til og med mellom to individer som tilhører samme art. Derfor visualisering av blodkar kan være av høy interesse også i andre tetramerisk arter som transgenesis verktøy ikke eksisterer.
Flere teknikker har blitt beskrevet for å merke blodkar i både pattedyr og teleosts. Disse inkluderer in situ hybridisering for blodkar-spesifikke gener, alkalisk fosfatase farging, microangiography, og fargestoff injeksjoner (for en gjennomgang se13). Fluorescerende lipofile kationiske indocarbocyanine Dye (DiI) ble først brukt til å studere membran lipider lateral mobilitet som det er beholdt i lipid bilayers og kan migrere gjennom den14,15,16. Faktisk er et molekyl av DiI sammensatt av to hydrokarboner kjeder og chromophores. Mens hydrokarboner kjeder integreres i lipid bilayer celle membran av cellene i kontakt med den, forblir chromophores på overflaten17. En gang i membranen, DiI molekyler diffus sideveis i lipid bilayer som bidrar til å flekk membran strukturer som ikke er i direkte kontakt med DiI løsning. Injisering av en DiI-løsning gjennom hjerte-og blodlegemer, vil derfor merke alle endothelial celler i kontakt med det sammensatte som tillater direkte merking av blodårer. I dag DiI brukes også for andre farging formål, for eksempel enkelt molekyl Imaging, skjebne kartlegging, og neuronal tracing. Interessant, flere fluorophores finnes (med ulike bølgelengder av utslipp) slik at kombinasjonen med andre fluorescerende etiketter, og innlemmelse samt lateral diffusjon av DiI kan forekomme i både live og fast vev18, 19i denne.
Formaldehyd, oppdaget av Ferdinand Blum i 1893, har blitt brukt mye til i dag som den foretrukne kjemiske for vev fiksering20,21. Det viser bred spesifisitet for de fleste cellulære mål og bevarer den cellulære strukturen22,23. Det bevarer også de fluorescerende egenskapene til de fleste fluorophores, og kan dermed brukes til å fixate transgene-dyr som målrettede celler uttrykker fluorescerende reporter proteiner.
I dette manuskriptet, en tidligere protokoll utviklet for å merke blodkar i små eksperimentelle pattedyr modeller24 har blitt tilpasset bruk i fisk. Hele prosedyren tar bare et par timer å utføre. Det viser hvordan du perfuse en bindemiddel løsning av formaldehyd inneholder DiI i fisken hjertet for å direkte merke alle blodårer i hjernen og hypofysen av modellen fisken medaka. Medaka er en liten ferskvannsfisk innfødt til Asia, hovedsakelig funnet i Japan. Det er en forsknings modell organisme med en rekke molekylære og genetiske verktøy tilgjengelig25. Derfor identifisering av blodkar i denne arten så vel som i andre vil tillate å forbedre vår forståelse av hvordan hjernen og hypofysen celler samhandle med blod blodkar i hele vev eller tykke vev skiver.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyr håndtering ble utført i henhold til anbefalingene for omsorg og velferd for forsknings dyr ved Norges universitet for biovitenskap, og under tilsyn av autoriserte etterforskere.
1. utarbeidelse av instrumenter og løsninger
- Forbered DiI lagerløsning oppløsning 5 mg DiI krystall i 1,5 mL plastrør med 1 mL 96% EtOH. Vortex for 30 s og holde dekket med aluminiumsfolie.
Merk: DiI lagerløsning kan bevares i mørket ved-20 ° c i flere måneder. - Forbered fisken holderen (figur 1A) ved å kutte et stykke av polystyren til 5 cm lengde, 3 cm bredde, og 2 cm tykkelse, og liming den til en 9 cm-diameter plast parabolen. Lag en 3 cm båt-formet hull med en skalpell blad i polystyren.
- Klargjør perfusing systemet (figur 2) ved å tilsette en 30-50 cm lang plast kanyle på ytter enden av nålen.
- Forbered 40 mL frisk 4% paraformaldehyde oppløsning (PFA) ved å fortynne 10 mL 16% PFA med 30 mL fosfat bufret saltvann oppløsning (PBS) i et 50 mL plastrør.
- Klargjør 10 mL bindemiddel/DiI-oppløsning ved å fortynne 1 mL DiI lagerløsning i 9 mL nylaget 4% PFA i et plast rør på 10 mL. Oppbevares i mørket til bruk.
Merk: Den DiI krystaller som ikke er oppløst kan oppbevares i aksjen løsning tube, og nye etanol kan tilsettes for å forberede nye DiI lagerløsning (se trinn 1,1). -
Forbered 50 mL tricaine (MS-222) lager.
- Oppløsning 200 mg Tricaine pulver i 48 mL av H2O. Tilsett 2 ml 1 M Tris Base (pH 9). Juster til pH 7 med 1 M HCl og oppbevar ved-20 ° c.
- Fortynne 5 mL Tricaine lager i 50 mL rent vann i et lite glass.
- Klargjør flere 5 cm glass Pipetter (figur 2) ved å strekke en glass kapillær med en pipette avtrekker etter produsentens anvisninger.
2. disseksjon og
Merk: PFA er et giftig, flyktig stoff, derfor bør disseksjon og-luft utføres i en hette eller i et ventilert rom, og brukeren må ha på seg en gass maske.
- Forbered disseksjon verktøy inkludert liten saks, og en skarp og en sterk tang før disseksjon.
- Fyll sprøyten med den tilberedte løsningen av PFA/DiI ved å plassere den i 50 mL røret og trekke opp. Deretter plasserer du nålen med kanyle på ytter enden av sprøyten (figur 2).
- Fest sprøyten til benken ved hjelp av flere stykker av tape plassert i forskjellige retninger, justere plasseringen av mikroskopet og setet for å oppnå en god posisjon for disseksjon og for å trykke på sprøyte stempelet (figur 1B).
Merk: I denne protokollen, albuen brukes til å trykke ned sprøyten stempelet, men andre muligheter alternativer kan brukes, for eksempel assistanse fra en annen person. - Euthanize fisken med en overdose av tricaine ved å plassere fisken i løsningen utarbeidet i trinn 1,7. Vent 30 s og teste reflekser av fisken ved å ta tak i sin caudal fin med tang. Fisken kan brukes når den har sluttet å reagere på stimuli.
- Plasser fisken i fisken holderen med buken vendt opp og fest en nål i enden av hodet og en annen over halen for å holde fisken på plass.
- Åpne den fremre magen med saksen ved å horisontalt skjære det overfladiske laget av huden.
- Ved hjelp av tang, fjerne huden over hjertet til en klar tilgang til ventrikkel og bulbus arteriosus er gitt (Figur 3).
- Legg til et glass pipette på enden av kapillær og bryte enden av spissen av glasset pipette.
Merk: Hullet av den ødelagte spissen skal være stor nok til å la væsken ut, men likevel liten nok til å lett gå inn i vevet. Glasset pipette kan gjenbrukes hvis ikke brutt eller tilstoppet. - Bring glasset pipette nær ventrikkel og legge press på sprøyten stempelet med albuen å tvinge væsken ut.
- PIN hjerte ventrikkel med glasset pipette mens du legger press på sprøyten.
- Rett etter, perforere sinus venosus med tang for å aktivere blod til å forlate sirkulasjonen.
Merk: Hjerte ventrikkel blir mer skjør på grunn av bindemiddel. Det blir også mindre rødt som blodet er fortynnet med bindemiddel/DiI løsning. - Fra ventrikkel, justere vinkelen på glasset pipette å finne inngangen til bulbus arteriosus. Ta pipette åpningen inne i bulbus arteriosus som vist på figur 2, og tilsett mer press på sprøyten.
Merk: Den bulbus arteriosus er transparent og vevet er elastisk. Når du skifter blod med DiI/bindemiddel, glasset pipette inne i hjertet skal bli mer synlig og ved å legge press, størrelsen på bulbus arteriosus bør utvide. Dette trinnet er avgjørende for å sikre at nok trykk har blitt brukt til å erstatte alt blodet med bindemiddel/DiI-løsningen, og at alle blodkarene er nådd. Ofte når vellykket, den PFA provoserer muskelsammentrekninger og fisken skal flytte. - Fortsett å legge press på sprøyten for 30-60 s fortsatt holde glasset pipette inne i bulbus arteriosus.
- Fjern glass pipette og nåler fra fisken.
- Analysere hjernen og hypofysen, og ruge vev i frisk 4% PFA i PBS for 2 h i mørket ved romtemperatur.
Merk: Disseksjon av hjerne og hypofysen tidligere har blitt beskrevet i detalj på to forskjellige måter av Fontaine et al.26 og Ager-Wick et al.27. På grunn av fiksering, blir vevet ganske hardt og den skjøre koblingen mellom hjernen og hypofysen kan brytes. Etter disseksjon kan post fiksering også utføres over natten ved 4 ° c. - Skyll vevet to ganger i PBS i 10 minutter før du forbereder bildebehandling.
Merk: Vevet kan deretter monteres mellom Glide-og deksel slip med avstandsstykker mellom og monterings medium for konfokalmikroskopi avbildning (se Figur 4), eller delt med en vibratome som beskrevet i detalj i Fontaine et al.26 før montering mellom skyve-og deksel Seddelen for bildebehandling med en stereomikroskopet (se Figur 4).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denne protokollen demonstrerer en trinnvis prosedyre for å merke blodkar i medaka hjernen og hypofysen, og samtidig fikse vevet. Etter merking ved CARDIAC injeksjon av en bindemiddel løsning som inneholder DiI inn i hjertet, blodkar kan observeres på skiver ved hjelp av en fluorescerende stereomikroskopet (Figur 4) eller på hele vevet ved hjelp av et konfokalmikroskopi mikroskop (figur 5). Enten på tykt vev skive eller på hele vevet, kan arkitekturen av blod blodkar observeres i tre dimensjoner. Tissue skiver kan merkes for spesifikke målrettede proteiner ved hjelp av standard immunofluorescence protokoller etter slutten av fiksering, og på transgene linjer hvor celler av interesse uttrykke fluorescerende reporter proteiner (figur 6). Dette gjør det mulig å undersøke interaksjoner mellom blodkar og andre spesifikke celletyper. Her for eksempel bruk av en transgene linje med medaka der grønne fluorescerende protein (GFP)-produserende celler avslørte plasseringen av hypofysen LH celler28. Man kan observere at disse cellene sender utvidelser mot blodkarene. Noen blodkar er kanskje ikke merket riktig hvis det er sub-optimalt. Dette kan være tilfelle, for eksempel hvis løsningen injiseres i hjerte ventrikkel i stedet for bulbus arteriosus, eller hvis du bruker for lavt trykk og/eller for kort en periode på sprøyten stempelet (figur 7). Til slutt, ved Imaging samme vev med samme bildebehandling parametere, intensiteten av merkingen ble vist å avta etter fire dager, med signalet mer spredt (Figur 8).
Figur 1 : Bilder av holde platen for å gjøre fisken (A) og injeksjons oppsettet (B). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 : Skjema for medaka fiske hjerte og-system vist med den idel plasseringen av glass nålen i hjertet for vellykket Arrow hodet viser hvor du skal perforere hjertet å tillate blodet å forlate sirkulasjon. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3 : Bilde av den ventrale siden av fisken som åpnes, med hjertet eksponert for Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4 : Bilde av blodet blodkar i en skive av hjernen og hypofysen vev fra medaka. En voksen medaka ble perfusert med en bindemiddel løsning som inneholdt DiI. Brain og hypofysen var dissekert og fast over natten. Vevet ble montert i 3% agarose og delt med en vibratome før bildebehandling med et fluorescens mikroskop. Alle blodkar merket med DiI blir sett gjennom hele seksjonen viser blodkar i hjernen og hypofysen. OT = optikk tectum; Tel = Telencephalon; Hyp = hypothalamus; Pit = hypofysen; CB = lillehjernen; Hind = hindbrain. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5 : 3D-gjengivelse av en konfokalmikroskopi z-stabel fra blod blodkar i medaka hypofysen. En voksen medaka ble perfusert med en bindemiddel løsning som inneholdt DiI. Brain-hypofysen var dissekert og fast over natten. Hypofysen ble dissekert fra hjernen og monteres mellom et lysbilde og dekkglass med avstandsstykker IB mellom, før bildebehandling med en konfokalmikroskopi mikroskop. Z-stakken ble spilt inn, og en 3D-gjengivelse ble gjort ved hjelp av Fiji programvare og 3D-visning plugin29. Hele hypofysen blod blodkar kan observeres i 3D. RPD = rostral Pars distalis; PPD = proksimale Pars distalis; PI = Pars InterMedia. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6 : Z-projeksjon av konfokalmikroskopi z-stack fra et vev skive transgene medaka der Lhβ promoter styrer uttrykk for grønt fluorescerende reporter protein. En voksen TG (LHB: hrGfpII) medaka ble perfusert med en bindemiddel løsning som inneholdt DiI. Brain-hypofysen var dissekert og fast over natten. Vev ble montert i 3% agarose og delt med en vibratome. Noen hormon produserende celler, LH celler i dette tilfellet, sende utvidelser (pil hoder) mot blodårene kan observeres, trolig til fornuft signaler fra blodet og/eller slipp sine hormoner inn i sirkulasjonen. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 7 : Bilde av blod blodkar i en skive av hjernen og hypofysen vev fra dårlig perfusert medaka. En voksen medaka var dårlig perfusert med en bindemiddel løsning som inneholder DiI ved å injisere løsningen i ventrikkel bare. Brain-hypofysen var dissekert og fast over natten. Vevet ble montert i 3% agarose og delt med en vibratome før bildebehandling med et konfokalmikroskopi mikroskop. Blodkarene var dårlig merket med DiI og noen av dem var ikke merket i det hele tatt. OT = optikk tectum; Tlf =, Telencephalon; Hyp = hypothalamus; Pit = hypofysen; CB = lillehjernen; Hind = hindbrain. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 8 : Time lapse Imaging av merket blod blodkar i medaka hjerne-hypofysen vev delen. En voksen medaka ble perfusert med en bindemiddel løsning som inneholdt DiI. Brain-hypofysen var dissekert og fast over natten. Vevet ble montert i 3% agarose og delt med en vibratome før bildebehandling med en stereomikroskopet rett etter montering (a), og 4 dager etter montering (B) med de samme bilde parametrene. Merk at merkingen har gått ned og spredt ut med tiden. OT = optikk tectum; Tel = Telencephalon; Hyp = hypothalamus; Pit = hypofysen; CB = lillehjernen; Hind = hindbrain. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
DiI har tidligere blitt brukt til å merke blodkar i flere modell arter24, inkludert tetramerisk fisk13.
Siden DiI leveres direkte til endothelial celle membran ved å blodkar, er det mulig å øke signal-til-støy-forholdet ved å øke DiI-konsentrasjonen i bindemiddel-oppløsningen. I tillegg gir fluoroforen intens farging når den er spent med minimale blekemidler, noe som gir relativt langvarige utslipp18,30. Dessuten kan merkingen forbli i flere dager og brukes i kombinasjon med andre merkingsteknikker som krever milde behandlinger, for eksempel i immuofluorescence (IF)31.
Men denne teknikken har noen begrensninger. Etter fjerning fra bindemiddel løsning, merking og bildebehandling av vevet bør utføres så raskt som mulig fordi intensiteten av merkingen vil svekke, og signalet vil diffus med tiden (Figur 8). Denne prosessen vil bli enda raskere når du bruker vaskemidler som øker porøsitet av membranen. Også, fordi PFA er en giftig flyktig sammensatt, flere forholdsregler bør tas når du utfører dette eksperimentet. For å minimere de farlige aspektene ved denne protokollen, kan man perfuse en løsning av DiI og PBS før dissekere av vevet av interesse og fikse det med PFA løsningen rett etter å ha tatt. Imidlertid kan dette bare utføres for små-sized vev, som inntrengning av PFA i større vevsprøver vil være mindre effektiv enn under.
Suksessen rate av denne protokollen er forbedret ved å trene, så det er forventet at forskerne vil trenge litt tid til å bli kjent med de ulike trinnene i teknikken. For eksempel er mengden av løsningen i bulbus arteriosus et spesielt kritisk trinn i protokollen og krever litt trening for å oppnå et godt resultat. Også å holde nålen i riktig posisjon for lenge nok i løpet av å være ikke trivielt, og vil kreve opplæring av manipulator.
Til slutt, denne protokollen er optimalisert for voksne medaka men det kan brukes til andre arter med noen tilpasninger. Ulike vev av interesse, eller til og med ulike stadier av dyret i samme vev vil også kreve optimaliseringer for konsentrasjonen av DiI og tidspunktet for blod, så vel som materialet som brukes (nål og sprøyte størrelser for eksempel).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre
Acknowledgments
Vi takker Dr Shinji Kanda for demonstrasjon av hjerte-og bindemiddel løsning i medaka, Ms Lourdes Warcislaw G Tan for hjelp med medaka husdyrhold, og Mr Anthony Peltier for illustrasjoner. Dette arbeidet ble finansiert av NMBU og av Norges forskningsråd, stipend nummer 248828 (Digital Life Norway-programmet).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 16% paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | RT 15711 | |
| 5 mL Syringe PP/PE without needle | Sigma | Z116866-100EA | syringes |
| BD Precisionglide syringe needles | Sigma | Z118044-100EA | needles 18G (1.20*40) |
| Borosilicate glass 10 cm OD 1.2 mm | sutter instrument | BF120-94-10 | glass pipette |
| DiI (1,1′-Dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindocarbocyanine perchlorate) | Invitrogen | D-282 | |
| LDPE tube O.D 1.7 mm and I.D 1.1 mm | Portex | 800/110/340/100 | canula |
| Phosphate Buffer Saline (PBS) solution | Sigma | D8537-6X500ML | |
| Pipette puller | Narishige | PC-10 | |
| Plastic Petri dishes | VWR | 391-0442 | |
| Super glue gel | loctite | c4356 | |
| Tricaine (ms-222) | sigma | E10521-50G |
References
- Nishida, N., Yano, H., Nishida, T., Kamura, T., Kojiro, M.
- Simon, M. C. Vascular morphogenesis and the formation of vascular networks. Developmental Cell. 6 (4), 479-482 (2004).
- Magistretti, P. J. Brain energy metabolism in Fundamental neuroscience. Zigmond, M., et al. , Academic Press. 389-413 (1999).
- Weltzien, F. A., Andersson, E., Andersen, O., Shalchian-Tabrizi, K., Norberg, B. The brain-pituitary-gonad axis in male teleosts, with special emphasis on flatfish (Pleuronectiformes). Comparative Biochemistry and Physiology - Part A: Molecular & Integrative Physiology. 137 (3), 447-477 (2004).
- Ooi, G. T., Tawadros, N., Escalona, R. M. Pituitary cell lines and their endocrine applications. Molecular and Cellular Endocrinology. 228 (1-2), 1-21 (2004).
- Knigge, K. M., Scott, D. E. Structure and function of the median eminence. American Journal of Anatomy. 129 (2), 223-243 (1970).
- Ball, J. N. Hypothalamic control of the pars distalis in fishes, amphibians, and reptiles. General Comparative Endocrinology. 44 (2), 135-170 (1981).
- Knowles, F., Vollrath, L. Synaptic contacts between neurosecretory fibres and pituicytes in the pituitary of the eel. Nature. 206 (4989), 1168 (1965).
- Knowles, F., Vollrath, L. Neurosecretory innervation of the pituitary of the eels Anguilla and Conger I. The structure and ultrastructure of the neuro-intermediate lobe under normal and experimental conditions. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 250 (768), 311-327 (1966).
- Golan, M., Zelinger, E., Zohar, Y., Levavi-Sivan, B. Architecture of GnRH-Gonadotrope-Vasculature Reveals a Dual Mode of Gonadotropin Regulation in Fish. Endocrinology. 156 (11), 4163-4173 (2015).
- Isogai, S., Horiguchi, M., Weinstein, B. M. The vascular anatomy of the developing zebrafish: an atlas of embryonic and early larval development. Developmental Biology. 230 (2), 278-301 (2001).
- Cha, Y. R., Weinstein, B. M. Visualization and experimental analysis of blood vessel formation using transgenic zebrafish. Birth Defects Research Part C: Embryo Today. 81 (4), 286-296 (2007).
- Kamei, M., Isogai, S., Pan, W., Weinstein, B. M.
- Wu, E. S., Jacobson, K., Papahadjopoulos, D. Lateral Diffusion in Phospholipid Multibilayers Measured by Fluorescence Recovery after Photobleaching. Biochemistry. 16 (17), 3936-3941 (1977).
- Schlessinger, J., Axelrod, D., Koppel, D. E., Webb, W. W., Elson, E. L. Lateral Transport of a Lipid Probe and Labeled Proteins on a Cell-Membrane. Science. 195 (4275), 307-309 (1977).
- Johnson, M., Edidin, M. Lateral Diffusion in Plasma-Membrane of Mouse Egg Is Restricted after Fertilization. Nature. 272 (5652), 448-450 (1978).
- Axelrod, D. Carbocyanine Dye Orientation in Red-Cell Membrane Studied by Microscopic Fluorescence Polarization. Biophysical Journal. 26 (3), 557-573 (1979).
- Honig, M. G., Hume, R. I. Fluorescent Carbocyanine Dyes Allow Living Neurons of Identified Origin to Be Studied in Long-Term Cultures. Journal of Cell Biology. 103 (1), 171-187 (1986).
- Godement, P., Vanselow, J., Thanos, S., Bonhoeffer, F. A study in developing visual systems with a new method of staining neurones and their processes in fixed tissue. Development. 101 (4), 697-713 (1987).
- Fox, C. H., Johnson, F. B., Whiting, J., Roller, P. P.
- Puchtler, H., Meloan, S. N. On the Chemistry of Formaldehyde Fixation and Its Effects on Immunohistochemical Reactions. Histochemistry. 82 (3), 201-204 (1985).
- Hoetelmans, R. W. M., et al. Effects of acetone, methanol, or paraformaldehyde on cellular structure, visualized by reflection contrast microscopy and transmission and scanning electron microscopy. Applied Immunohistochemistry & Molecular Morphology. 9 (4), 346-351 (2001).
- Hobro, A. J., Smith, N. I. An evaluation of fixation methods: Spatial and compositional cellular changes observed by Raman imaging. Vibrational Spectroscopy. 91, 31-45 (2017).
- Li, Y. W., et al. Direct labeling and visualization of blood vessels with lipophilic carbocyanine dye DiI. Nature Protocols. 3 (11), 1703-1708 (2008).
- Wittbrodt, J., Shima, A., Schartl, M. Medaka--a model organism from the far East. Nature Review Genetic. 3 (1), 53-64 (2002).
- Fontaine, R., Hodne, K., Weltzien, F. A. Healthy Brain-pituitary Slices for Electrophysiological Investigations of Pituitary Cells in Teleost Fish. Journal of Visual Experiments. (138), 57790 (2018).
- Ager-Wick, E., et al. Preparation of a High-quality Primary Cell Culture from Fish Pituitaries. Journal of Visual Experiments. (138), 58159 (2018).
- Hildahl, J., et al. Developmental tracing of luteinizing hormone beta-subunit gene expression using green fluorescent protein transgenic medaka (Oryzias latipes) reveals a putative novel developmental function. Developmental Dynamics. 241 (11), 1665-1677 (2012).
- Schmid, B., Schindelin, J., Cardona, A., Longair, M., Heisenberg, M. A high-level 3D visualization API for Java and ImageJ. BMC Bioinformatics. 11, 274 (2010).
- Honig, M. G., Hume, R. I. Dil and diO: versatile fluorescent dyes for neuronal labelling and pathway tracing. Trends Neurosciences. 12 (9), 333-335 (1989).
- Fontaine, R., et al. Dopaminergic Neurons Controlling Anterior Pituitary Functions: Anatomy and Ontogenesis in Zebrafish. Endocrinology. 156 (8), 2934-2948 (2015).
