Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

הוספת תוויות של כלי דם במוח Teleost ואת בלוטת היותרת שימוש בפרזיה לב עם DiI-fixative

Published: June 13, 2019 doi: 10.3791/59768
Automatic Translation
1, 1
1Department of Basic Sciences and Aquatic Medicine, Faculty of Veterinary Medicine, Norwegian University of Life Sciences

Summary

המאמר מתאר פרוטוקול מהיר לתיוג כלי דם בדגים teleost על ידי זלוף הלב של dii מדולל בתיקונים, באמצעות מסדר (oryziasלטיפס) כמודל והתמקדות במוח ובבלוטת יותרת השומן.

Abstract

כלי הדם מinnervate את כל הרקמות בחוליות, ומאפשרים את הישרדותה על ידי מתן החומרים המזינים, החמצן והאותות ההורמונליים הנחוצים. זהו אחד האיברים הראשונים להתחיל לתפקד במהלך הפיתוח. מנגנונים של היווצרות כלי הדם הפכו להיות נושא של עניין מדעי וקליני גבוה. אצל מבוגרים עם זאת, קשה לדמיין את היום ברוב חיות החיים בשל הלוקליזציה שלהם עמוק בתוך רקמות אחרות. עם זאת, הדמיה של כלי הדם ממשיכה להיות חשובה למספר מחקרים כגון אנדוקרינולוגיה ונוירוביולוגיה. בעוד כמה קווים טרנסגניים פותחו ב zebrafish, עם כלי הדם לדמיין ישירות דרך הביטוי של חלבונים פלורסנט, אין כלים כאלה קיימים עבור מינים teleost אחרים. הפרוטוקול הנוכחי מציג טכניקה מהירה וישירה כדי לתייג כלי דם במוח ובבלוטת יותרת, באמצעות השימוש בשיטת "הצדקה" (Oryzias) כמודל. פרוטוקול זה מאפשר שיפור של ההבנה שלנו על איך בתאי המוח ובלוטת ההיפופיזה לקיים אינטראקציה עם דם ובללטורה ברקמה שלמה או פרוסות רקמה עבה.

Introduction

כלי הדם משחקים חלק חיוני של הגוף בעלי החוליות כפי שהם מספקים את החומרים המזינים הדרושים, חמצן ואותות הורמונליים לכל האיברים. גם, מאז התגלית של המעורבות שלהם בפיתוח סרטן1, הם קיבלו הרבה תשומת לב במחקר קליני. למרות שמספר פרסומים חקרו את המנגנונים המאפשרים צמיחה של כלי דם ומורפולגנזה, ומספר רב של גנים חשובים להיווצרות שלהם זוהו2, הרבה נשאר להבין בקשר לאינטראקציה בין תאים או רקמות לדם מחזורי.

, ויזואליזציה של דם ובלוטת יותרת המוח. זה חשוב נוירונים במוח דורשים אספקת גבוהה של חמצן וגלוקוז3, ואת בלוטת ההיפופיזה מכיל עד שמונה סוגי תאים חשובים הורמון מייצר המשתמשות זרימת הדם כדי לקבל אות מהמוח ולשלוח הורמונים שלהם שונים איברים היקפיים4,5. בעוד ביונקים, מערכת הפורטל בבסיס של ההיפותלמוס בשם הוד רוממותו, מקשרת את המוח ואת בלוטת ההיפופיזה6, כגון גשר דם ברור לא תוארה ב teleost דגים. אכן, ב teleosts, preoptico-הנוירונים היפוטתלמי ישירות פרויקט אקסונים שלהם לתוך pars נרבוזה של בלוטת יותרת7 ובעיקר innervate סוגי תאים האנדוקרינית שונים ישירות8,9. עם זאת, כמה נוירונים אלה יש קצות העצבים שלהם ממוקם בחלל extravascular, בקרבת מקום נימים בדם10. לכן, ההבדל בין הדגים teleost ויונקים הוא לא כל כך ברור, ואת הקשר בין הדם ובדיקת המוח ואת התאים בלוטת ההיפופיזה דורש חקירה גדולה יותר של הדגים teleost.

Zebrafish יש, בהיבטים רבים, מערכת כלי דם המקבילה מבחינה אנטומית ופונקציונלית למינים אחרים בעלי חוליות11. זה הפך למודל בעלי חוליות רב עוצמה עבור מחקר לב וכלי דם בעיקר בזכות הפיתוח של קווים טרנסגניים מספר שבו מרכיבים של מערכת כלי הדם מסומנים עם חלבונים כתבת פלורסנט12. עם זאת, אנטומיה מדויקת של מערכת הדם עשויה להשתנות בין מינים, או אפילו בין שני אנשים השייכים לאותו מינים. לכן, הדמיה של כלי הדם עשויה להיות בעלת עניין רב גם במינים אחרים של teleost שבהם כלים טרנסגנזה אינם קיימים.

מספר טכניקות תוארו לתייג כלי דם בשני היונקים והטלאוסטים. אלה כוללים היברידיזציה באתרו עבור גנים ספציפיים ואסילטורה, כתמים הזרחן אלקליין, microangiography, וזריקות צבע (עבור סקירה ראה13). ליפולי פלורסנט indocarbocyanine צבען (dii) השתמשו לראשונה כדי ללמוד ממברנה לאורך ניידות לרוחב כפי שהוא נשמר bilayers ליפיד והוא יכול להעביר דרך זה14,15,16. ואכן, מולקולה של DiI מורכבת משתי שרשראות פחמנים וכרומואופהורס. בעוד שרשראות פחממים לשלב את קרום התא bilayer השומנים של התאים במגע עם זה, ראשון להישאר על פני השטח שלה17. פעם אחת בקרום, מולקולות DiI לפזר בתוך השומנים bilayer שעוזר להכתים מבנים ממברנה כי הם לא במגע ישיר עם פתרון DiI. הזרקת פתרון DiI דרך הפרזיה לב, ולכן מתייג את כל תאי האנדותל במגע עם התרכובת המאפשרת תיוג ישיר של כלי הדם. היום DiI משמש גם למטרות כתמים אחרים, כגון הדמיה מולקולה אחת, מיפוי הגורל, ומעקב עצבי. מעניין, מספר fluorophores קיים (עם אורכי גל שונים של פליטה) המאפשר את השילוב עם תוויות פלורסנט אחרות, ואת התאגדות, כמו גם את הדיפוזיה לרוחב של DiI יכול להתרחש הן לחיות וקבוע רקמות18, . בן 19

פורמלדהיד, התגלה על ידי פרדיננד בלום ב-1893, שימש באופן נרחב ליום הנוכחי ככימיקל המועדף לקיבוע רקמות20,21. הוא מראה ספציפיות למרבית היעדים הסלולאריים ומשמר את המבנה התאי22,23. הוא גם שומר על תכונות פלורסנט של רוב fluorophores, ובכך ניתן להשתמש כדי לקבוע בעלי חיים טרנסגניים שבהם תאים ממוקדות לבטא העיתונאי פלורסנט חלבונים.

בכתב יד זה, פרוטוקול קודם שפותח כדי לתייג כלי דם בדגמי יונקים קטנים וניסיוניים24 הותאם לשימוש בדגים. ההליך כולו לוקח רק כמה שעות לבצע. זה מדגים כיצד לעשות פתרון קבע של פורמלדהיד המכיל dii בלב הדג כדי לתייג ישירות את כל כלי הדם במוח ואת בלוטת ההיפופיזה של הדג המודל הצדקה. מאקה הוא דג מים מתוקים קטן יליד אסיה, שנמצא בעיקר ביפן. זה אורגניזם מודל מחקר עם חבילה של כלים מולקולריים וגנטיים זמינים25. לכן, זיהוי כלי הדם במין זה כמו גם באחרים יאפשר לשפר את ההבנה שלנו על איך המוח ואת התאים בבלוטת ההיפופיזה אינטראקציה עם דם ובלוטת הדם ברקמה שלמה או פרוסות רקמה עבה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל הטיפול בבעלי חיים התבצע על פי המלצות הטיפול והרווחה של בעלי חיים מחקריים באוניברסיטה הנורבגית למדעי החיים, ותחת פיקוחו של חוקרים מוסמכים.

1. הכנת המכשירים והפתרונות

  1. להכין פתרון מלאי DiI המסת 5 מ"ג של קריסטל DiI ב 1.5 mL שפופרת פלסטיק עם 1 מ ל של 96% אטוח. מערבולת עבור 30 ולהמשיך לכסות באמצעות רדיד אלומיניום.
    הערה: פתרון המניה DiI ניתן לשימור בחשיכה ב-20 ° c במשך מספר חודשים.
  2. הכן את מחזיק הדגים (איור 1א) על-ידי גזירה של פוליסטירן לאורך של 5 ס מ, רוחב 3 ס"מ, ו-2 ס מ עובי, ומדביק אותו לצלחת פלסטיק בקוטר 9 ס מ. הפוך חור בצורת סירה בגודל 3 ס מ עם להב אזמל בפוליסטירן.
  3. הכן מערכת מבשם (איור 2) על-ידי הוספת צינורית פלסטיק באורך 30-50 ס מ בקצה המחט.
  4. הכינו 40 mL של טרי 4% הפתרון פאראפורמלדהיד (בתחתית) על ידי דילול 10 מ ל של 16% בתחתית עם 30 מ ל של פוספט באגירה תמיסת מלח (PBS) בצינור פלסטיק 50 mL.
  5. הכינו 10 מ ל של פתרון fixative/DiI על ידי דילול 1 מ ל של פתרון מלאי DiI ב 9 מ ל של טרי מוכן 4% כלטין בצינור פלסטיק 10 mL. . שמור באפלה עד השימוש
    הערה: גבישים DiI כי הם לא מומס ניתן לשמור בצינור פתרון המניה, אתנול חדש ניתן להוסיף כדי להכין פתרון מלאי חדש DiI (ראה שלב 1.1).
  6. להכין 50 mL של tricaine (MS-222) מניות.
    1. התמוססות 200 מ"ג של אבקת Tricaine ב 48 מ ל של H2O. Add 2 mL של 1 M בסיס טריס (pH 9). התאם ל-pH 7 עם HCl 1 M וחנות ב-20 ° c.
  7. לדלל 5 מ ל של מלאי Tricaine ב 50 mL של מים נקיים בזכוכית קטנה.
  8. הכינו מספר ברטט זכוכית בגודל 5 ס מ (איור 2) על ידי מתיחת נימי זכוכית עם פולר פיפטה בעקבות הוראות היצרן.

2. חיתוך ופרזיה

הערה: למעלה הוא תרכובת הפכפכה רעילה, ולכן יש לבצע את הניתוח והפרזיה במכסה המנוע או בחדר מאוורר, והמשתמש חייב לענוד מסכת גז.

  1. הכינו את כלי החיתוך, כולל מספריים קטנים, ומלקחיים חזקים וחד אחד לפני הניתוח.
  2. מלאו את המזרק בתמיסה המוכנה של הלגון/DiI על-ידי הצבתו בשפופרת 50 mL ורישום למעלה. ואז הניחו את המחט בצינורית בקצה המזרק (איור 2).
  3. לתקן את המזרק על הספסל באמצעות כמה פיסות קלטת להציב בכיוונים שונים, להתאים את המיקום של המיקרוסקופ ואת המושב כדי לקבל עמדה טובה לניתוח ולחיצה על המזרק בוכנה (איור 1B).
    הערה: בפרוטוקול זה, המרפק משמש כדי להקיש את המזרק בוכנה, אבל אפשרויות אחרות ניתן להשתמש, למשל, סיוע מאדם אחר.
  4. המתת חסד הדג עם מנת יתר של tricaine ידי הצבת הדג בפתרון הכין בשלב 1.7. לחכות 30 s ולבדוק את הרפלקסים של הדג על ידי לתפוס את הפין שלה caudal עם מלקחיים. ניתן להשתמש בדגים כאשר הוא מפסיק להגיב לגירויים.
  5. מניחים את הדג במחזיק הדג עם הבטן שלו מול ולהצמיד מחט אחת לתוך הקצה של הראש ועוד אחד מעל הזנב כדי לשמור את הדג במקום.
  6. פתח את הבטן הקדמית עם המספריים על ידי גזירה אופקית של שכבת העור השטחית.
  7. באמצעות מלקחיים, להסיר את העור מעל הלב עד הגישה ברורה אל החדר ואת הריוסוס בולבוס מסופק (איור 3).
  8. הוסיפו פיפטה מזכוכית בקצות הקפילר ושוברים את סוף קצהו של פיפטה הזכוכית.
    הערה: החור של קצה שבור צריך להיות גדול מספיק כדי לאפשר את הנוזל החוצה, אבל עדיין קטן מספיק כדי להיכנס בקלות את הרקמה. ניתן להשתמש בצנרת הזכוכית אם לא נשברה או סתומה.
  9. הביאו את פיפטה הזכוכית קרוב לחדר והוסיפו לחץ למזרק בוכנה עם המרפק כדי לאלץ את הנוזל לצאת.
  10. הצמד את חדר הלב עם הצנרת זכוכית תוך הוספת לחץ על המזרק.
  11. מיד לאחר מכן, נקב venosus סינוס עם מלקחיים כדי לאפשר לדם לעזוב את זרימת הדם.
    הערה: חדר הלב הופך להיות שברירי יותר בגלל הקיבעון. זה גם הופך להיות פחות אדום כמו הדם הוא מדולל עם פתרון fixative עצמי/DiI.
  12. מחדר החדר, התאימו את זווית הפיפטה של הזכוכית כדי למצוא את הכניסה של הריוסוס הבולבוס. הביאו את הפיפטה שנפתח בתוך הריויוסוס, כמוצג באיור 2, והוסיפו עוד לחץ למזרק.
    הערה: הריוסוס הבולבוס הוא שקוף והרקמה גמישה. בעת החלפת דם עם DiI/fixative, הצנרת זכוכית בתוך הלב צריך להיות גלוי יותר על ידי הוספת לחץ, הגודל של בולבוס הריוסוס צריך להתרחב. שלב זה חיוני כדי לוודא כי הלחץ מספיק שימש כדי להחליף את כל הדם עם פתרון fixative/DiI, וכי כל כלי הדם הושגו. לעתים קרובות כאשר מוצלחת, הלבלבין הכפילה מעוררת התכווצויות שרירים הדג יהיה לנוע.
  13. להמשיך להוסיף לחץ על המזרק עבור 30-60 s עדיין שמירה על הצנרת זכוכית בתוך הריוסוס בולבוס.
  14. הסירו את הפיפטה מזכוכית. ואת המחטים מהדגים
  15. מנתחים את המוח ואת בלוטת ההיפופיזה, ורקמות הדגירה ב-4% בכיוון השני ב PBS עבור 2 h בחושך בטמפרטורת החדר.
    הערה: ניתוח מוחי ובלוטת יותרת המוח בעבר תואר בפירוט בשתי דרכים שונות מאת פונטיין ואח '26 ואגר-Wick ואח '27. בגלל הקיבעון, הרקמה הופכת קשה למדי והקשר שברירי בין המוח לבלוטת יותרת ההיפופיזה עלול להישבר. לאחר הניתוח ניתן גם לבצע עיבוד קיבעון לילה ב -4 ° c.
  16. שטפו את הרקמה פעמיים ב-PBS במשך 10 דקות לפני ההכנה להדמיה.
    הערה: לאחר מכן ניתן לטעון את הרקמה בין שקופית לכריכה כיסוי עם מרווחים בין ובין הרכבה בינונית לדימות ממוקד (ראה איור 4), או שנות מנות עם הרטט כמתואר בפירוט בפונטיין ואח '26 לפני ההרכבה בין שקופית ושובר כיסוי לדימות עם stereomicroscope (ראה איור 4).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

פרוטוקול זה מדגים הליך צעד אחר צעד כדי לתייג את כלי הדם במוח מאקה ובלוטת היותרת, ובאותו זמן לתקן את הרקמה. לאחר תיוג על ידי הזרקה לב של פתרון קבע המכיל dii ללב, כלי הדם ניתן לצפות על פרוסות באמצעות stereomicroscope פלורסנט (איור 4) או על רקמות שלמות באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלית וקד (איור 5). או על הפרוסה רקמה עבה או על הרקמה כולה, את הארכיטקטורה של הדם ובקרה ניתן להבחין בשלושה מימדים. פרוסות רקמה יכול להיות מתויג עבור חלבונים ייעודיים ספציפיים באמצעות פרוטוקולים immunofluorescence תקן החיסונית לאחר סוף הקיבעון, ועל קווים טרנסגניים שבהם תאים של ריבית מהירה הכתב פלורסנט חלבונים (איור 6). הדבר מאפשר חקירות על אינטראקציות בין כלי דם וסוגי תאים ספציפיים אחרים. כאן למשל, השימוש קו טרנסגניים של מאקה שבו חלבון פלורסנט ירוק (GFP)-הפקת תאים חשף את המיקום של התאים Lh בבלוטת יותרת28. ניתן להבחין כי תאים אלה שולחים הרחבות לעבר כלי הדם. כלי דם מסוימים לא ניתן לתייג כראוי אם זלוף הוא תת אופטימלי. זה יכול להיות המקרה, למשל, אם הפתרון מוזרק בחדר הלב במקום בולבוס הריוסוס, או אם באמצעות לחץ נמוך מדי ו/או לתקופה קצרה מדי על המזרק בוכנה (איור 7). לבסוף, על ידי הדמיה של אותה רקמה עם פרמטרי הדמיה זהה, את עוצמת התיוג הוכח להקטין לאחר ארבעה ימים, עם האות התפשט החוצה (איור 8).

Figure 1
איור 1 : תמונות של צלחת ההחזקה לפרזיה של הדג (א) וכיוונון ההזרקה (ב). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2 : סכימת הלב של הדג מאקה ומערכת זלוף הראו עם מיקומו של המחט זכוכית בלב עבור זלוף מוצלחת. ראש החץ להראות איפה לנקב את הלב כדי לאפשר לדם לעזוב את זרימת הדם. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3 : תמונה של הצד הגחוני של הדג נפתח, עם הלב נחשף עבור perfusion. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4 : תמונה של דם הצינור בתוך פרוסת המוח ורקמת יותרת המוח מצדקה. מודעת צדקה בוגרת הייתה בעלת פתרון מייצב המכיל DiI. המוח ובלוטת היותרת. נלקחו ותוקנו בלילה הרקמות היו רכוב ב 3% העלה ומנות עם הרטט לפני הדמיה עם מיקרוסקופ פלואורסצנטית. כל כלי הדם המסומנים עם DiI נראים באמצעות כל הסעיף המציג את ובסיסה במוח ואת בלוטת היותרת. OT = tectum אופטי; טל = טלנצאלון; Hyp = ההיפותלמוס; בור = יותרת הבלוטת; Cb = מוח משכל; הינד = המוח המולא. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 5
איור 5 : עיבוד תלת-ממדי של מחסנית-z מתוך מודם הדם בבלוטת יותרת המוח. מודעת צדקה בוגרת הייתה בעלת פתרון מייצב המכיל DiI. . בלוטת יותרת המוח הייתה מועלת ותוקנה בלילה בלוטת יותרת המוח היה גזור מהמוח ורכוב בין שקופית לבין שמיכות עם מרווחים ליברות בין, לפני הדמיה עם מיקרוסקופ קונפוקלית וקד. Z-מחסנית נרשמה, עיבוד תלת-ממד נעשה באמצעות התוכנה פיג'י ו-3D תוסף מציג29. כל דם ההיפופיזה. ניתן לתצפית ב-3D RPD = rostral pars; PPD = האבופה ביותר; PI = מדיה intermedia. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 6
איור 6 : הטלה z של קונפוקלית z-מחסנית מתוך פרוסת רקמה של מסדר טרנסגניים שבו Lhβ יזם שולטת ביטוי של חלבון כתבת פלורסנט ירוק. למבוגרים tg (lhb: hrgfpii) הצדקה היתה בעלת פתרון מתקבע המכיל dii. . בלוטת יותרת המוח הייתה מועלת ותוקנה בלילה הרקמות היו רכוב ב 3% העלה ומנות עם הרטט. הורמון מסוים לייצר תאים, Lh תאים במקרה זה, שליחת הרחבות (ראשי חץ) לכיוון כלי הדם יכול להיות נצפתה, כנראה לחוש אותות מהדם ו/או לשחרר את ההורמונים שלהם לתוך זרימת הדם. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 7
איור 7 : דימוי של דם ובדיקת בלוטת יותרת המוח בפרוסת מוחי מודעת צדקה בוגרת הייתה בעלת פתרון מיותר מגוון המכיל DiI על ידי הזרקת הפתרון בחדר הטיפול בלבד. . בלוטת יותרת המוח הייתה מועלת ותוקנה בלילה הרקמות היו רכוב ב 3% העלה ומנות עם הרטט לפני הדמיה עם מיקרוסקופ קונפוקלית וקד. כלי הדם היו מסומנים בצורה גרועה עם DiI וחלק מהם לא סומנו כלל. OT = tectum אופטי; תל =, טלנצאלון; Hyp = ההיפותלמוס; בור = יותרת הבלוטת; Cb = מוח משכל; הינד = המוח המולא. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 8
איור 8 : הדמיית זמן הדמיה של התווית ומסד דם ב מסדר המוח-בלוטת ההיפופיזה מקטע. מודעת צדקה בוגרת הייתה בעלת פתרון מייצב המכיל DiI. . בלוטת יותרת המוח הייתה מועלת ותוקנה בלילה הרקמות היו רכוב ב 3% מנות ומנות עם הרטט לפני הדמיה עם stereomicroscope ישירות לאחר ההרכבה (א), ו 4 ימים לאחר הטעינה (ב) עם אותם פרמטרים הדמיה. שים לב כי התיוג ירד והתפשט עם הזמן. OT = tectum אופטי; טל = טלנצאלון; Hyp = ההיפותלמוס; בור = יותרת הבלוטת; Cb = מוח משכל; הינד = המוח המולא. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

הפרזיה לב עם DiI בעבר השתמשו כדי לתייג כלי דם במספר מיני דגם24, כולל teleost דגים13.

כפי dii מועברת ישירות קרום התא אנדותל על ידי זלוף ב vasculature ניתן להגדיל את היחס אות אל הרעש על ידי הגברת ריכוז dii בפתרון הקבע. בנוסף, fluorophore מספק מכתים אינטנסיבי כאשר מתרגש עם הלבנת מינימלי המאפשר פליטה יחסית ארוכת טווח18,30. כמו כן, התיוג יכול להישאר במשך מספר ימים ולשמש בשילוב עם טכניקות תיוג אחרות הדורשות טיפולים מתונים, כגון ב-immuofluorescence (IF)31.

עם זאת, טכניקה זו יש כמה מגבלות. לאחר ההסרה מהפתרון הקבע, תיוג והדמיה של הרקמות יש לבצע מהר ככל האפשר, כי עוצמת התיוג יהיה להחליש, ואת האות יהיה לפזר עם הזמן (איור 8). תהליך זה יהיה מהיר עוד יותר בעת שימוש בדטרגנטים המגבירים את הקרום. כמו כן, מכיוון שה, בכיוון המגרש הוא מתחם נדיף רעיל, יש לנקוט מספר אמצעי זהירות בעת ביצוע ניסוי זה. כדי למזער את ההיבטים המסוכנים של פרוטוקול זה, ניתן להכין פתרון של DiI ו-PBS לפני שהוא מבתר את רקמת העניין ומתקן אותו באמצעות הפתרון בחצי הראשון מיד לאחר הפרזיה. עם זאת, ניתן לבצע זאת רק עבור הרקמות בגודל קטן, כמו החדירה של התחתית בדגימות רקמות גדולות יהיה פחות יעיל מאשר במהלך perfusion.

שיעור ההצלחה של פרוטוקול זה משופר על ידי הדרכה, כך צפוי כי החוקרים יצטרכו קצת זמן כדי להכיר את השלבים השונים של הטכניקה. למשל, הפרזיה של הפתרון בהריוסוס הבולבוס היא צעד קריטי במיוחד של הפרוטוקול ודורשת הכשרה מסוימת כדי להשיג תוצאה טובה. גם שמירה על המחט בתנוחה הנכונה מספיק זמן במהלך זלוף אינו טריוויאלי, וידרוש הכשרה על ידי מניפולטור.

לבסוף, פרוטוקול זה מותאם במיוחד לצדקה מבוגרת, אך ניתן להשתמש בה למינים אחרים עם כמה עיבודים. רקמות שונות של עניין, או אפילו שלבים חיים שונים של החיה בתוך אותה רקמה ידרוש גם אופטימיזציות לריכוז DiI ואת הזמן של הפרזיה, כמו גם את החומר המשמש (מחטים וגדלים למשל).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף

Acknowledgments

אנו מודים לד ר שינג קאנדה להדגמה של מיזוג לב עם פתרון מתואם במיאקה, גברת לאורדז קארב ג'י טאן לקבלת עזרה בנוגע לטיפול בצדקה, ומר אנתוני פלטייר לאיורים. עבודה זו ממומנת על ידי NMBU ועל ידי מועצת המחקר של נורבגיה, גרנט מספר 248828 (התוכנית הדיגיטלית נורווגיה).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
16% paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences RT 15711
5 mL Syringe PP/PE without needle Sigma Z116866-100EA syringes
BD Precisionglide syringe needles Sigma Z118044-100EA needles 18G (1.20*40)
Borosilicate glass 10 cm OD 1.2 mm sutter instrument BF120-94-10 glass pipette
DiI (1,1′-Dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindocarbocyanine perchlorate) Invitrogen D-282
LDPE tube O.D 1.7 mm and I.D 1.1 mm Portex 800/110/340/100 canula
Phosphate Buffer Saline (PBS) solution Sigma D8537-6X500ML
Pipette puller Narishige PC-10
Plastic Petri dishes VWR 391-0442
Super glue gel loctite c4356
Tricaine (ms-222) sigma E10521-50G

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Nishida, N., Yano, H., Nishida, T., Kamura, T., Kojiro, M. Angiogenesis in cancer. Vascular Health and Risk Management. 2 (3), 213-219 (2006).
  2. Simon, M. C. Vascular morphogenesis and the formation of vascular networks. Developmental Cell. 6 (4), 479-482 (2004).
  3. Magistretti, P. J. Brain energy metabolism in Fundamental neuroscience. Zigmond, M., et al. , Academic Press. 389-413 (1999).
  4. Weltzien, F. A., Andersson, E., Andersen, O., Shalchian-Tabrizi, K., Norberg, B. The brain-pituitary-gonad axis in male teleosts, with special emphasis on flatfish (Pleuronectiformes). Comparative Biochemistry and Physiology - Part A: Molecular & Integrative Physiology. 137 (3), 447-477 (2004).
  5. Ooi, G. T., Tawadros, N., Escalona, R. M. Pituitary cell lines and their endocrine applications. Molecular and Cellular Endocrinology. 228 (1-2), 1-21 (2004).
  6. Knigge, K. M., Scott, D. E. Structure and function of the median eminence. American Journal of Anatomy. 129 (2), 223-243 (1970).
  7. Ball, J. N. Hypothalamic control of the pars distalis in fishes, amphibians, and reptiles. General Comparative Endocrinology. 44 (2), 135-170 (1981).
  8. Knowles, F., Vollrath, L. Synaptic contacts between neurosecretory fibres and pituicytes in the pituitary of the eel. Nature. 206 (4989), 1168 (1965).
  9. Knowles, F., Vollrath, L. Neurosecretory innervation of the pituitary of the eels Anguilla and Conger I. The structure and ultrastructure of the neuro-intermediate lobe under normal and experimental conditions. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 250 (768), 311-327 (1966).
  10. Golan, M., Zelinger, E., Zohar, Y., Levavi-Sivan, B. Architecture of GnRH-Gonadotrope-Vasculature Reveals a Dual Mode of Gonadotropin Regulation in Fish. Endocrinology. 156 (11), 4163-4173 (2015).
  11. Isogai, S., Horiguchi, M., Weinstein, B. M. The vascular anatomy of the developing zebrafish: an atlas of embryonic and early larval development. Developmental Biology. 230 (2), 278-301 (2001).
  12. Cha, Y. R., Weinstein, B. M. Visualization and experimental analysis of blood vessel formation using transgenic zebrafish. Birth Defects Research Part C: Embryo Today. 81 (4), 286-296 (2007).
  13. Kamei, M., Isogai, S., Pan, W., Weinstein, B. M. Imaging blood vessels in the zebrafish. Methods Cell Biology. 100, 27-54 (2010).
  14. Wu, E. S., Jacobson, K., Papahadjopoulos, D. Lateral Diffusion in Phospholipid Multibilayers Measured by Fluorescence Recovery after Photobleaching. Biochemistry. 16 (17), 3936-3941 (1977).
  15. Schlessinger, J., Axelrod, D., Koppel, D. E., Webb, W. W., Elson, E. L. Lateral Transport of a Lipid Probe and Labeled Proteins on a Cell-Membrane. Science. 195 (4275), 307-309 (1977).
  16. Johnson, M., Edidin, M. Lateral Diffusion in Plasma-Membrane of Mouse Egg Is Restricted after Fertilization. Nature. 272 (5652), 448-450 (1978).
  17. Axelrod, D. Carbocyanine Dye Orientation in Red-Cell Membrane Studied by Microscopic Fluorescence Polarization. Biophysical Journal. 26 (3), 557-573 (1979).
  18. Honig, M. G., Hume, R. I. Fluorescent Carbocyanine Dyes Allow Living Neurons of Identified Origin to Be Studied in Long-Term Cultures. Journal of Cell Biology. 103 (1), 171-187 (1986).
  19. Godement, P., Vanselow, J., Thanos, S., Bonhoeffer, F. A study in developing visual systems with a new method of staining neurones and their processes in fixed tissue. Development. 101 (4), 697-713 (1987).
  20. Fox, C. H., Johnson, F. B., Whiting, J., Roller, P. P. Formaldehyde Fixation. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 33 (8), 845-853 (1985).
  21. Puchtler, H., Meloan, S. N. On the Chemistry of Formaldehyde Fixation and Its Effects on Immunohistochemical Reactions. Histochemistry. 82 (3), 201-204 (1985).
  22. Hoetelmans, R. W. M., et al. Effects of acetone, methanol, or paraformaldehyde on cellular structure, visualized by reflection contrast microscopy and transmission and scanning electron microscopy. Applied Immunohistochemistry & Molecular Morphology. 9 (4), 346-351 (2001).
  23. Hobro, A. J., Smith, N. I. An evaluation of fixation methods: Spatial and compositional cellular changes observed by Raman imaging. Vibrational Spectroscopy. 91, 31-45 (2017).
  24. Li, Y. W., et al. Direct labeling and visualization of blood vessels with lipophilic carbocyanine dye DiI. Nature Protocols. 3 (11), 1703-1708 (2008).
  25. Wittbrodt, J., Shima, A., Schartl, M. Medaka--a model organism from the far East. Nature Review Genetic. 3 (1), 53-64 (2002).
  26. Fontaine, R., Hodne, K., Weltzien, F. A. Healthy Brain-pituitary Slices for Electrophysiological Investigations of Pituitary Cells in Teleost Fish. Journal of Visual Experiments. (138), 57790 (2018).
  27. Ager-Wick, E., et al. Preparation of a High-quality Primary Cell Culture from Fish Pituitaries. Journal of Visual Experiments. (138), 58159 (2018).
  28. Hildahl, J., et al. Developmental tracing of luteinizing hormone beta-subunit gene expression using green fluorescent protein transgenic medaka (Oryzias latipes) reveals a putative novel developmental function. Developmental Dynamics. 241 (11), 1665-1677 (2012).
  29. Schmid, B., Schindelin, J., Cardona, A., Longair, M., Heisenberg, M. A high-level 3D visualization API for Java and ImageJ. BMC Bioinformatics. 11, 274 (2010).
  30. Honig, M. G., Hume, R. I. Dil and diO: versatile fluorescent dyes for neuronal labelling and pathway tracing. Trends Neurosciences. 12 (9), 333-335 (1989).
  31. Fontaine, R., et al. Dopaminergic Neurons Controlling Anterior Pituitary Functions: Anatomy and Ontogenesis in Zebrafish. Endocrinology. 156 (8), 2934-2948 (2015).

Tags

ביו-הנדסה סוגיה 148 DiI שילוב לב תיוג ואצלב כלי דם דגים מוח בלוטת היותרת
הוספת תוויות של כלי דם במוח Teleost ואת בלוטת היותרת שימוש בפרזיה לב עם DiI-fixative
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Fontaine, R., Weltzien, F. A.… More

Fontaine, R., Weltzien, F. A. Labeling of Blood Vessels in the Teleost Brain and Pituitary Using Cardiac Perfusion with a DiI-fixative. J. Vis. Exp. (148), e59768, doi:10.3791/59768 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter