Summary
本稿は、DiI の心臓灌流を固定で希釈し、メダカ (Oryzias latipes) をモデルとして使用し、脳と下垂体組織に焦点を当てて、teleost 魚の血管を標識するための迅速なプロトコールについて説明する。
Abstract
血管は、脊椎動物のすべての組織を innervate し、必要な栄養素、酸素、ホルモンシグナルを提供することによって生存を可能にします。それは開発の間に機能し始める最初の器官の1つである。血管形成のメカニズムは、高い科学的、臨床的関心の対象となっています。.しかし、成人では、他の組織の深部への局在のために、ほとんどの生物動物の血管系を可視化することは困難である。それにもかかわらず、内分泌学や神経生物などのいくつかの研究において、血管の可視化は依然として重要である。ゼブラフィッシュにはいくつかの遺伝子導入ラインが開発されていますが、蛍光タンパク質の発現によって血管が直接視覚化されるため、他の teleost 種にはそのようなツールは存在しません。モデルとしてメダカ (Oryzias latipes) を使用して、現在のプロトコルは、DiI を含む固定液と心臓を介して等量によって脳と下垂体の血管を標識するための迅速かつ直接的な技術を提示します。このプロトコルは、脳と下垂体細胞が全体の組織または厚い組織スライスにおける血液脈管系と相互作用する方法についての我々の理解を改善することができます.
Introduction
血管は、すべての臓器に必要な栄養素、酸素、ホルモンシグナルを提供するため、脊椎動物の身体に不可欠な役割を果たします。また、がん開発に関与していることが発見されて以来、臨床研究において注目を集めています。多くの刊行物が血管の成長と形態形成を可能にするメカニズムを調査しており、その形成に重要な多数の遺伝子が同定されているが、その相互作用に関しては多くの理解が残っている細胞または組織と循環血液との間。
脳と下垂体の血液血管系の可視化が重要です。.脳内のニューロンは、酸素とグルコース3の高い供給を必要とし、下垂体は、脳からの信号を受信し、異なるにそれぞれのホルモンを送信する血流を使用して8つの重要なホルモン産生細胞の種類が含まれています末梢器官4,5.哺乳動物において、その中央値と称される視床下部の基部にある門脈システムは、脳と下垂体6とを結んでおり、このような明確な血中ブリッジは teleost 魚には記載されていない。実際には、魚類では、preoptico 視床下部ニューロンは直接下垂体7のパルスに軸索を投影し、主に異なる内分泌細胞の種類を直接8、9に innervate。しかし、これらのニューロンのいくつかは、血管外空間に位置する神経終末を有し、毛細血管10に近接している。したがって、teleost の魚と哺乳類の違いはそれほど明確ではなく、血液の脈管構造と脳と下垂体細胞との間の関係は teleost 魚においてより大きな調査を必要とする。
ゼブラフィッシュは、多くの局面において、他の脊椎動物種11に対して解剖学的および機能的に匹敵する血管系を有する。これは、血管系の成分が蛍光レポータータンパク質12で標識されているいくつかのトランスジェニック線の開発のおかげで主に心血管研究のための強力な脊椎動物モデルとなっている。しかし、正確な循環系の解剖学的構造は、種によって、あるいは同じ種に属する2人の個体間でも変化し得る。したがって、血管の可視化は、今後ツールが存在しない他の teleost 種においても高い関心を持つ可能性がある。
哺乳動物および魚類の両方で血管を標識するいくつかの技術が記載されている。これらには、脈管系特異的遺伝子の in situ ハイブリダイゼーション、アルカリホスファターゼ染色、microangiography、および色素注射が含まれる (レビューについては13を参照)。蛍光性の脂溶性カチオン indocarbocyanine 色素 (DiI) は、脂質りん中に保持されている膜脂質横移動を研究するために最初に使用され、そしてそれを介して移行することができる14,15,16.実際、DiI の分子は、2つの炭化水素鎖と発色団で構成されている。炭化水素鎖はそれに接触している細胞の脂質二重層細胞膜に統合されるが、発色団はその表面17上に残る。一度膜に、DiI 分子は、DiI 溶液と直接接触していない膜構造を染色するのに役立つ脂質二重層内に横方向に拡散します。心臓灌流によって DiI 溶液を注入すると、化合物と接触しているすべての内皮細胞に標識し、血管の直接標識を可能にする。今日 DiI は、単一分子イメージング、運命のマッピング、ニューロンのトレースなどの他の染色の目的にも使用されます。興味深いことに、いくつかの蛍光色素が存在し (異なる波長の発光)、他の蛍光標識との組み合わせを可能にし、DiI の横方向の拡散とともに、ライブおよび固定組織18の両方で発生する可能性があります。19.
ホルムアルデヒドは、1893年にフェルディナンド・ブルームによって発見され、組織固定20,21のための好ましい化学物質として現在の日に広く使用されるようになった。それはほとんどの細胞のターゲットのための広い特異性を示し、細胞構造22,23を維持する。また、ほとんどの蛍光色素の蛍光特性を保持しているため、標的細胞が蛍光レポータータンパク質を発現するトランスジェニック動物の固定に使用することができます。
この原稿においては、小実験哺乳動物モデル24における血管を標識するために開発された以前のプロトコルは、魚類における使用に適合している。手順全体を実行するには数時間しかかかりません。これは、直接脳内のすべての血管とモデル魚のメダカの下垂体にラベルを付けるために魚の心臓に DiI を含むホルムアルデヒドの定着性溶液を perfuse する方法を示しています。メダカはアジア原産の小さな淡水魚で、主に日本で見られます。これは、利用可能な分子および遺伝学的ツールのスイートと研究モデルの生物であります25.したがって、この種だけでなく、他の人における血管の同定は、脳と下垂体細胞が全体の組織または厚い組織スライス中の血液脈管系と相互作用する方法についての我々の理解を改善することを可能にする。
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Protocol
すべての動物の取り扱いは、ノルウェー生命科学大学の研究動物のケアと福祉のための勧告に従って行われ、認定研究者の監督下にありました。
1. 機器とソリューションの準備
- 1 mL の 96% Etoh 中で 1.5 mL プラスチックチューブに DiI 結晶の DiI を溶解させる。30 s のための渦およびアルミニウムホイルを使用して覆われ続ける。
注:DiI 原液は、数ヶ月間、-20 ° c で暗所で保存することができます。 - ポリスチレンの小片を5cm の長さ、3cm の幅、および2cm の厚さに切断し、直径9cm のプラスチック皿に接着することによって、魚のホルダー (図 1A) を準備します。ポリスチレンのメスの刃が付いている3cm のボート型の穴を作りなさい。
- 針の先端に 30-50 cm の長いプラスチックカニューレを加えて、等量システム (図 2) を準備します。
- 50 mL のプラスチックチューブに、30 mL のリン酸緩衝食塩水溶液 (PBS) で 16% PFA を 10 mL 希釈して、40 mL のフレッシュ 4% パラホルムアルデヒド溶液 (PFA) を調製します。
- DiI の原液 1 mL を 10 mL のプラスチックチューブに新しく調製した 4% PFA を 9 mL に希釈して、10 mL の固定液/DiI 溶液を調製します。使用するまで暗闇の中で保管してください。
注:溶解されていない DiI 結晶は、原液チューブに保持することができ、新しいエタノールは、新しい DiI ストック溶液を調製するために追加することができます (ステップ1.1 を参照)。 -
50 mL の tricaine (MS-222) ストックを準備します。
- 溶解 200 mg の Tricaine 粉末を 48 mL の H2O. 1 M トリスベース (pH 9) の 2 Ml を追加します。1 M HCl で pH 7 に調整し、-20 ° c で保管してください。
- 小さいガラスのきれいな水の 50 mL の Tricaine の在庫の5つの mL を希薄にしなさい。
- メーカーの指示に従ってピペットの引き手とガラス毛細管を伸ばすことによって、いくつかの5cm ガラスピペット (図 2) を準備します。
2. 解剖および灌流
注:PFA は有毒な揮発性化合物であるため、解剖および灌流は、フードまたは換気の良い場所で行う必要があり、ユーザーはガスマスクを着用している必要があります。
- 小さいはさみを含む解剖用具、および1つの鋭いおよび1強い鉗子を解剖の前に準備しなさい。
- 50 mL チューブに配置することにより、PFA/DiI の調製溶液でシリンジを充填し、上に描画します。次に、シリンジの先端にカニューレを付けて針を置きます (図 2)。
- 異なる方向に配置されたテープのいくつかの部分を使用して、ベンチにシリンジを固定し、解剖のための良好な位置を取得するために、シートの位置を調整し、シリンジのピストンを押します (図 1B)。
注:このプロトコルでは、肘は、シリンジのピストンを押すために使用されますが、他の可能性のオプション、例えば、他の人からの支援を使用することができます。 - Euthanize は、ステップ1.7 で調製した溶液中に魚を置くことによって、tricaine の過剰摂取で魚を投与する。30 s を待って、鉗子とその尾ひれをつかむことによって、魚の反射をテストします。この魚は、刺激に反応しなくなったときに使用することができます。
- 魚をその腹部を上に向けて、1本の針を頭の先端に、もう1つを尾の上に固定して魚を所定の位置に保つ。
- 皮膚の表層を水平に切断することによって、はさみで前腹部を開きます。
- 鉗子を使用して、心室と bulbus 管への明確なアクセスが提供されるまで、心臓の上の皮膚を取り除いてください (図 3)。
- ガラスピペットを毛細管の先端に加え、ガラスピペットの先端の端を破ります。
注:壊れた先端の穴は液体を出すのに十分な大きさであるべきですが、それでも組織に入るには十分に小さいです。ガラス製ピペットは、壊れたり詰まったりしていなければ再利用できます。 - ガラスピペットを心室に近づけ、肘を使って注射器のピストンに圧力をかけて液体を出します。
- 心臓心室をガラスピペットで固定し、シリンジに圧力を加えます。
- 直後に、ソトー氏を鉗子と venosus し、血液が循環を残すことを可能にする。
注:心臓心室は定着性のためにより脆くなる。また、血液が定着/DiI 溶液で希釈されるほど、赤色になります。 - 心室から、ガラスピペットの角度を調節して、bulbus 管の入口を見つけます。図 2に示すように、bulbus 管の内側にピペットの開口部を持ってきて、シリンジに圧力を加えます。
注:Bulbus 管は透明であり、ティッシュは伸縮性がある。DiI/固定液で血液を交換するときは、心臓の内側のガラスピペットがより見やすくなり、圧力を加えることにより、bulbus 管のサイズが拡大するはずです。このステップは、固定液/DiI 溶液ですべての血液を置換するのに十分な圧力が使用されていること、およびすべての血管が到達したことを確認するために不可欠です。しばしば成功すると、PFA は筋肉の収縮を引き起こし、魚は移動します。 - Bulbus 管の中のガラスピペットをまだ保っている 30-60 s のためのスポイトの圧力を加え続けなさい。
- ガラスピペットと魚の針を取り外します。
- 脳と下垂体を解剖し、室温で暗所で 2 h の PBS に 4% の新鮮な PFA で組織をインキュベートします。
注:脳および下垂体の解剖は、以前は、フォンテーヌ et al.26およびエージャー et al.27によって2つの異なる方法で詳細に説明されている。固定のために、組織はかなり硬くなり、脳と下垂体との間の脆弱なリンクが壊れることがあります。解離後、後固定処理も4° c で一晩実行することができる。 - イメージングの準備をする前に、PBS で10分間組織を2回すすいでください。
注:次に、この組織を、共焦点イメージング用の取り付け媒体との間にスペーサーを備えたスライドとカバースリップの間にマウントし (図 4を参照)、または、間に取り付ける前にフォンテーヌ et al.26で詳細に説明したようにビブラトームで断面化することができる。実体顕微鏡を使用したイメージング用のスライドとカバースリップ (図 4を参照)。
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Representative Results
このプロトコルは、メダカの脳と下垂体の血管を標識し、同時に組織を固定するための段階的な手順を示しています。DiI を含む固定液の心臓注射によって心に標識した後、蛍光実体顕微鏡 (図 4) または共焦点顕微鏡を用いた組織全体に血管を観察することができる (図 5)。厚い組織スライスまたは組織全体のいずれかに、血液脈管構造のアーキテクチャが三次元で観察され得る。組織スライスは、固定の終了後に標準免疫蛍光プロトコルを使用して特定の標的タンパク質に対して、および関心のある細胞が蛍光レポータータンパク質を発現するトランスジェニック線で標識することができる (図 6)。これは血管と他の特定の細胞のタイプ間の相互作用の調査を可能にする。ここで例えば、緑色蛍光タンパク質 (GFP) 産生細胞が下垂体 Lh 細胞28の位置を明らかにしたメダカのトランスジェニック線を使用する。これらの細胞が血管に向かって拡張を送ることを観察することができます。灌流が最適でない場合、一部の血管は適切に標識されないことがあります。これは、例えば、溶液が bulbus 管の代わりに心臓心室に注入される場合、または低すぎる圧力を使用した場合および/または、シリンジ・ピストン上に短すぎる期間を用いた場合にもよい (図 7)。最後に、同じ組織を同じ画像化パラメータで画像化することによって、標識の強度が4日後に減少することが示され、シグナルがより広がった (図 8)。
図 1: 魚の灌流のための保持板の画像 (a) と噴射セットアップ (B)。この図の大規模なバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 2: メダカの魚の心臓および灌流システムのスキーマで、灌流を成功させるために、ガラス針のアイドル位置を中心に示しています。矢印ヘッドは、血液が循環を残すことを可能にするために、心臓をソトー氏する場所を示しています。この図の大規模なバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 3: 魚の腹側の像が開き、心臓が灌流のために露出している。この図の大規模なバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 4: メダカの脳と下垂体組織における血液脈管構造の画像大人のメダカは、DiI を含んだ定着液を灌流ていた。脳と下垂体を解剖し、一晩固定した。組織を 3% アガロースに取り付け、蛍光顕微鏡で画像化する前にビブラトームで切片にした。DiI で標識されたすべての血管は、脳および下垂体の脈管系を示す全体のセクションを通して見られる。OT = 光学視蓋;Tel = telencephalon;Hyp = 視床下部;ピット = 下垂体;Cb = 小脳;後肢 = 後脳。この図の大規模なバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 5: メダカ・下垂体の血液血管系からの共焦点 z スタックの3d レンダリング。大人のメダカは、DiI を含んだ定着液を灌流ていた。脳下垂体を解剖し、一晩固定した。脳から下垂体を解剖し、その間にスペーサー ib を用いてスライドとカバースリップの間に取り付け、共焦点顕微鏡で画像化する。Z スタックが記録され、3D レンダリングがフィジーソフトウェアと3D ビューアプラグイン29を使用して行われました。下垂体全体の血液構造が3D で観察できた。RPD = 吻部のパルス distalis;PPD = 近位パルス distalis;PI = パルスインターメディア。この図の大規模なバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 6: Lhβプロモーターが緑色蛍光レポータータンパク質の発現を制御するトランスジェニックメダカの組織スライスからの共焦点 z スタックの z 投影。成人 tg (lhb: hrGfpII) のメダカは DiI を含む固定液で灌流していた。脳下垂体を解剖し、一晩固定した。組織を 3% アガロースに取り付け、ビブラトームで切片にした。いくつかのホルモン産生細胞、Lh 細胞この場合、血管の方への拡張 (矢印の頭部) を送ることが観察され、血液からのシグナルを感知し、そして/またはそれらのホルモンを循環中に放出する可能性がある。この図の大規模なバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 7: 不十分な灌流のメダカからの脳および下垂体組織のスライスにおける血液脈管構造の画像。大人のメダカは、心室にのみ溶液を注入することによって、DiI を含む固定液を灌流ていた。脳下垂体を解剖し、一晩固定した。組織を 3% アガロースに取り付け、共焦点顕微鏡で画像化する前にビブラトームで切片にした。血管は DiI では不十分で、その一部は標識されていませんでした。OT = 光学視蓋;Tel =, telencephalon;Hyp = 視床下部;ピット = 下垂体;Cb = 小脳;後肢 = 後脳。この図の大規模なバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 8: メダカの脳下垂体組織セクションにおける標識血液脈管構造のタイムラプス撮影。大人のメダカは、DiI を含んだ定着液を灌流ていた。脳下垂体を解剖し、一晩固定した。組織を 3% のアガロースに装着し、取り付け後に直接実体顕微鏡 (a) で撮像する前にビブラトームで切片化し、同一の撮像パラメータを用いて (B) に取り付けてから4日後にした。ラベリングが減少し、時間とともに広がっていることに注意してください。OT = 光学視蓋;Tel = telencephalon;Hyp = 視床下部;ピット = 下垂体;Cb = 小脳;後肢 = 後脳。この図の大規模なバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
DiI を用いた心臓灌流は、以前は、teleost 魚13を含むいくつかのモデル種24において血管を標識するために使用されてきた。
DiI が脈管系において灌流によって内皮細胞膜に直接送達されるように、固定液中の DiI 濃度を増加させることによってシグナル対雑音比を増加させることができる。さらに、蛍光色素分子は、最小限の漂白で励起すると強烈な染色を行い、比較的長続きする発光18,30を可能にします。また、ラベリングは数日間残ることができ、immuofluorescence (IF)31のような軽度の治療を必要とする他のラベリング技術と組み合わせて使用することができる。
ただし、この方法にはいくつかの制限があります。定着性溶液から除去した後、標識の強度が弱くなり、シグナルが時間とともに拡散するため、組織の標識および画像化は可能な限り迅速に行われるべきである (図 8)。膜の多孔性を増加させる洗剤を使用する場合、このプロセスはさらに高速になります。また、PFA は有毒な揮発性化合物であるため、この実験を行う際にはいくつかの予防措置を講じる必要があります。この議定書の危険な側面を最小にするために、1つは関心のティッシュを解剖する前に DiI および PBS の解決を perfuse し、灌流の直後に PFA 溶液でそれを固定することができます。しかし、これは、大規模な組織サンプルにおける PFA の浸透が灌流時よりも低くなるので、小規模組織に対してのみ行うことができます。
このプロトコルの成功率は、トレーニングによって改善されるので、研究者は、技術の異なるステップに慣れるためにいくつかの時間が必要になることが期待されます。例えば、bulbus 管における溶液の灌流は、プロトコルの特に重要なステップであり、良好な結果を達成するためにいくつかの訓練を必要とする。また、灌流中に十分長く正しい位置に針を保つことは些細なことではなく、マニピュレータによるトレーニングが必要になります。
最後に、このプロトコルは、大人のメダカのために最適化されていますが、いくつかの適応で他の種に使用することができます。興味のある異なる組織、または同じ組織内の動物の異なるライフステージも、使用される材料 (例えば、針およびシリンジサイズ) と同様に、DiI の濃度および灌流の時間についての最適化を必要とする。
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Disclosures
著者は何も開示することはありません
Acknowledgments
私たちは、メダカの定着性溶液による心灌流の実演をして神田先生に感謝し、メダカ・・キャリオンの助けをしてくれるように、ルルドの G タンと、イラストのためにアンソニー・ペルチェ氏を。この作品は、NMBU とノルウェーの研究評議会によって資金を供給されました, グラント番号 248828 (デジタルライフノルウェープログラム).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 16% paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | RT 15711 | |
| 5 mL Syringe PP/PE without needle | Sigma | Z116866-100EA | syringes |
| BD Precisionglide syringe needles | Sigma | Z118044-100EA | needles 18G (1.20*40) |
| Borosilicate glass 10 cm OD 1.2 mm | sutter instrument | BF120-94-10 | glass pipette |
| DiI (1,1′-Dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindocarbocyanine perchlorate) | Invitrogen | D-282 | |
| LDPE tube O.D 1.7 mm and I.D 1.1 mm | Portex | 800/110/340/100 | canula |
| Phosphate Buffer Saline (PBS) solution | Sigma | D8537-6X500ML | |
| Pipette puller | Narishige | PC-10 | |
| Plastic Petri dishes | VWR | 391-0442 | |
| Super glue gel | loctite | c4356 | |
| Tricaine (ms-222) | sigma | E10521-50G |
References
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