Summary
Artiklen beskriver en hurtig protokol til mærkning blodkar i en teleost fisk ved hjerte perfusion af DiI fortyndet i fikseringsmiddel, ved hjælp af medaka (Oryzias latipes) som model og med fokus på hjernen og hypofyse væv.
Abstract
Blodkar innerverer alle væv i hvirveldyr, så deres overlevelse ved at give de nødvendige næringsstoffer, ilt, og hormonelle signaler. Det er et af de første organer til at begynde at fungere under udvikling. Mekanismer af blodkar dannelse er blevet et emne af høj videnskabelig og klinisk interesse. Hos voksne er det imidlertid vanskeligt at visualisere Vaskulaturen i de fleste levende dyr på grund af deres lokalisering dybt inde i andre væv. Ikke desto mindre, visualisering af blodkar er stadig vigtigt for flere undersøgelser såsom endokrinologi og Neurobiologi. Mens flere transgene linjer er blevet udviklet i zebrafish, med blodkar direkte visualiseret gennem udtryk af fluorescerende proteiner, findes der ikke sådanne værktøjer til andre teleost arter. Ved hjælp af medaka (oryzias latipes) som model, den nuværende protokol præsenterer en hurtig og direkte teknik til at mærke blodkar i hjernen og hypofysen ved perfusing gennem hjertet med fiksativ indeholder DiI. Denne protokol giver mulighed for forbedring af vores forståelse af, hvordan hjernen og hypofyse celler interagerer med blod vaskulatur i hele væv eller tykke vævs skiver.
Introduction
Blodkarrene spiller en væsentlig rolle i hvirveldyr, da de giver de nødvendige næringsstoffer, ilt og hormonelle signaler til alle organer. Også, da opdagelsen af deres involvering i kræft udvikling1, har de fået megen opmærksomhed i klinisk forskning. Selv om en række publikationer har undersøgt de mekanismer, der tillader blodkar vækst og morfogenese, og et stort antal gener er vigtige for deres dannelse er blevet identificeret2, en masse mangler at blive forstået med hensyn til samspillet mellem celler eller væv og cirkulerende blod.
Visualisering af blod vaskulatur i hjernen og hypofysen er vigtig. Neuroner i hjernen kræver en høj tilførsel af ilt og glucose3, og hypofysen indeholder op til otte vigtige hormon-producerende celletyper, der bruger blodgennemstrømningen til at modtage signal fra hjernen og sende deres respektive hormoner til forskellige perifert organ4,5. Mens der i pattedyr, portalsystemet i bunden af hypothalamus navngivet median eminence, forbinder hjernen og hypofysen6, sådan en klar blod bro er ikke blevet beskrevet i teleost fisk. Faktisk, i teleosts, preoptico-hypothalamus neuroner direkte projekt deres axoner i pars nervosa af hypofysen7 og for det meste innerverer de forskellige endokrine celletyper direkte8,9. Men, nogle af disse neuroner har deres nerveender placeret i det ekstravaskulære rum, i umiddelbar nærhed af blod kapillærer10. Derfor er forskellen mellem teleost fisk og pattedyr ikke så klar, og forholdet mellem blod Vaskulaturen og hjernen og hypofyse celler kræver større undersøgelse i teleost fisk.
Zebrafish har i mange henseender et anatomisk og funktionelt sammenligneligt vaskulære system til andre hvirveldyr arter11. Det er blevet en kraftfuld hvirveldyr model for kardiovaskulær forskning mest takket være udviklingen af flere transgene linjer, hvor komponenterne i det vaskulære system er mærket med fluorescerende reporter proteiner12. Men, nøjagtige kredsløbssygdomme anatomi kan variere mellem arter, eller endda mellem to individer, der tilhører den samme art. Derfor, visualisering af blodkar kan være af stor interesse også i andre teleost arter, som gensplejsning værktøjer ikke eksisterer.
Flere teknikker er blevet beskrevet for at mærke blodkarrene i både pattedyr og teleoster. Disse omfatter in situ-hybridisering for vaskulatur-specifikke gener, alkalisk fosfatasefarvning, mikroangiografi og farve indsprøjtninger (til en gennemgang Se13). Fluorescerende lipofile kationiske indocarbocyanine Dye (DiI) blev først brugt til at studere membran lipider lateral mobilitet, da det er bevaret i lipid dobbeltlag og kan migrere gennem det14,15,16. Faktisk et molekyle af DiI er sammensat af to kulbrinte kæder og chromophores. Mens kulbrinte kæderne integreres i lipid-bilags cellemembranen i cellerne i kontakt med den, forbliver chromophorerne på dens overflade17. Når i membranen, DiI molekyler diffuse sideværts inden for lipid tolags som hjælper til at plette membran strukturer, der ikke er i direkte kontakt med den DiI løsning. Indsprøjtning en DiI opløsning gennem hjerte perfusion, vil derfor mærke alle endotel celler i kontakt med den sammensatte, der tillader direkte mærkning af blodkarrene. I dag DiI bruges også til andre farvning formål, såsom enkelt molekyle billeddannelse, skæbne kortlægning, og neuronal sporing. Interessant, flere fluorophores eksisterer (med forskellige bølgelængder af emission) tillader kombinationen med andre fluorescerende etiketter, og inkorporering samt den laterale diffusion af DiI kan forekomme i både levende og faste væv18, 19. det er
Formaldehyd, som blev opdaget af Ferdinand Blum i 1893, har været anvendt bredt i dag som det foretrukne kemikalie til vævs fiksering20,21. Det viser bred specificitet for de fleste cellulære mål og bevarer cellulære struktur22,23. Det bevarer også de fluorescerende egenskaber af de fleste fluorophores, og dermed kan anvendes til fikse transgene dyr, for hvilke målrettede celler udtrykke fluorescerende reporter proteiner.
I dette manuskript er en tidligere protokol udviklet til at mærke blodkarrene i små eksperimentelle pattedyrs modeller24 er blevet tilpasset til brug i fisk. Hele proceduren tager kun et par timer at udføre. Det viser, hvordan man kan perfuse en fikativ opløsning af formaldehyd, der indeholder DiI i fiskens hjerte for direkte at mærke alle blodkar i hjernen og hypofysen af modellen fisk medaka. Medaka er en lille ferskvandsfisk indfødte til Asien, primært findes i Japan. Det er en forskning model organisme med en række molekylære og genetiske værktøjer til rådighed25. Derfor, identifikation af blodkar i denne art samt i andre vil gøre det muligt at forbedre vores forståelse af, hvordan hjernen og hypofyse celler interagerer med blod vaskulatur i hele væv eller tykke væv skiver.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Al håndtering af dyr blev udført i overensstemmelse med anbefalingerne vedrørende omsorg og velfærd for forsknings dyrene ved det norske Universitet for biovidenskab og under opsyn af autoriserede efterforskere.
1. forberedelse af instrumenter og løsninger
- Forbered DiI stamopløsning opløse 5 mg af DiI krystal i 1,5 mL plastrør med 1 mL af 96% EtOH. Vortex for 30 s og holde dækket ved hjælp af aluminiumsfolie.
Bemærk: Den DiI stamopløsning kan bevares i mørke ved-20 °C i flere måneder. - Forbered fiske holderen (figur 1A) ved at skære et stykke polystyren til 5 cm længde, 3 cm bredde, og 2 cm tykkelse, og limning det til en 9 cm-diameter plastik skål. Lav et 3 cm bådformet hul med en skalpel klinge i polystyren.
- Forbered perfusing-systemet (figur 2) ved at tilsætte en 30-50 cm lang plastik kanyle ved nålens ekstremitet.
- Der tilberedes 40 mL frisk 4% PARAFORMALDEHYD opløsning (PFA) ved fortynding af 10 mL 16% PFA med 30 mL phosphatbufferet saltvandsopløsning (PBS) i et 50 mL plastrør.
- Der tilberedes 10 mL fixative/DiI opløsning ved fortynding af 1 mL DiI stamopløsning i 9 mL frisk fremstillet 4% PFA i et 10 mL plastrør. Opbevares i mørke indtil brug.
Bemærk: Den DiI krystaller, der ikke er opløst kan holdes i bestanden løsning tube, og ny ethanol kan tilsættes til at forberede nye DiI stamopløsning (Se trin 1,1). -
Forbered 50 mL tricain (MS-222) lager.
- 200 mg Tricaine pulver opløses i 48 mL H2O. Tilsæt 2 ml 1 M Tris-base (pH 9). Juster til pH 7 med 1 M HCl og opbevares ved-20 °C.
- 5 mL Tricaine-bestand fortyndes i 50 mL rent vand i et lille glas.
- Forbered flere 5 cm glas pipetter (figur 2) ved at strække en glas kapillar med en pipette aftrækker efter producentens anvisninger.
2. dissektion og perfusion
Bemærk: PFA er en giftig flygtige forbindelse, derfor dissektion og perfusion bør udføres i en hætte eller i et ventileret rum, og brugeren skal være iført en gasmaske.
- Forbered dissektions værktøjerne, herunder en lille saks, og en skarp og en stærk Tang før dissektion.
- Fyld sprøjten med den tilberedte opløsning af PFA/DiI ved at anbringe den i 50 mL-røret og udarbejde. Anbring derefter nålen med kanylen ved sprøjtens yderste kant (figur 2).
- Fastgør sprøjten til bænken ved hjælp af flere stykker tape placeret i forskellige retninger, Juster placeringen af mikroskopet og sædet for at opnå en god position for dissektion og for at trykke på sprøjtens stempel (figur 1B).
Bemærk: I denne protokol bruges albuen til at trykke ned på sprøjtens stempel, men andre muligheder kan anvendes, fx assistance fra en anden person. - Euthanize fiskene med en overdosis af tricain ved at placere fiskene i opløsningen udarbejdet i trin 1,7. Vent 30 s og test reflekser af fiskene ved at snuppe sin halefinne med pincet. Fisken kan bruges, når den er holdt op med at reagere på stimuli.
- Anbring fiskene i fiske holderen med maven opad og fastgør den ene nål til hovedet og en anden over halen for at holde fisken på plads.
- Åbn den forreste abdomen med saksen ved horisontalt at skære det overfladiske lag af huden.
- Brug pincet, fjerne huden over hjertet, indtil en klar adgang til ventrikel og bulbus arteriosus er forudsat (figur 3).
- Tilsæt en glas pipette ved den yderste ende af kapillar og bryd enden af spidsen af glas pipetten.
Bemærk: Hullet i den brudte spids skal være stort nok til at lade væsken ud, men stadig lille nok til nemt at komme ind i vævet. Glas pipetten kan genbruges, hvis den ikke er brudt eller tilstoppet. - Bring glas pipetten tæt på ventriklen og tilsæt tryk til sprøjtens stempel med albuen for at tvinge væsken ud.
- Fastgør hjerte ventriklen med glas pipetten, mens du øger trykket på sprøjten.
- Umiddelbart efter perforeres sinus venosus med pincet, så blodet kan forlade kredsløbet.
Bemærk: Hjerte ventriklen bliver mere skrøbelig på grund af den fixative. Det bliver også mindre rødt, da blodet fortyndes med fixative/DiI opløsning. - Fra ventriklen justeres vinklen på glas pipetten for at finde indgangen til bulbuarteriosus. Bring pipette åbningen ind i bulbuarteriosus som vist i figur 2, og tilsæt mere tryk til sprøjten.
Bemærk: Den bulbus arteriosus er gennemsigtig og vævet er elastisk. Ved udskiftning af blod med DiI/fixative, glas pipette inde i hjertet bør blive mere synlig og ved at tilføje tryk, størrelsen af bulbus arteriosus bør udvide. Dette trin er afgørende for at sikre, at tilstrækkeligt tryk er blevet brugt til at erstatte alle blodet med fixative/DiI opløsning, og at alle blodkar er nået. Ofte når det lykkes, PFA provokerer muskelsammentrækninger og fiskene vil være i bevægelse. - Fortsæt med at tilføje Tryk på sprøjten for 30-60 s stadig holde glasset pipette inde i bulbus arteriosus.
- Fjern glas pipetten og nålene fra fisken.
- Dissekere hjernen og hypofysen, og inkube væv i frisk 4% PFA i PBS for 2 h i mørke ved stuetemperatur.
Bemærk: Dissektion af hjernen og hypofysen tidligere er blevet beskrevet i detaljer på to forskellige måder af Fontaine et al.26 og ager-Wick et al.27. På grund af fiksering, vævet bliver ganske hårdt og den skrøbelige forbindelse mellem hjernen og hypofysen kan brydes. Efter dissektion kan post fikserings behandling også udføres natten over ved 4 °C. - Skyl vævet to gange i PBS i 10 minutter, før det forberedes til billeddannelse.
Bemærk: Vævet kan derefter monteres mellem slide og Cover slip med afstandsstykker i mellem og monterings medium for confokal Imaging (Se fig. 4), eller opdelt med en vibratome som beskrevet i detaljer i Fontaine et al.26 før montering mellem glide-og dækseddel til billeddannelse med stereo mikroskopi (Se fig. 4).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denne protokol viser en trinvis procedure til at mærke blodkar i medaka hjernen og hypofysen, og samtidig fastsætte væv. Efter mærkning ved hjerte injektion af en fikserende opløsning, der indeholder DiI i hjertet, kan blodkarrene observeres på skiver ved hjælp af et fluorescerende stereo mikroskopi (figur 4) eller på hele væv ved hjælp af et confokalt mikroskop (figur 5). Enten på den tykke vævs skive eller på hele vævet, kan arkitekturen i blod Vaskulaturen observeres i tre dimensioner. Væv skiver kan mærkes for specifikke målrettede proteiner ved hjælp af standard immunofluorescens protokoller efter afslutningen af fiksering, og på transgene linjer, hvor celler af interesse udtrykke fluorescerende reporter proteiner (figur 6). Dette giver mulighed for undersøgelser af interaktioner mellem blodkar og andre specifikke celletyper. Her for eksempel, brugen af en transgene linje af medaka hvor grønne fluorescerende protein (GFP)-producerende celler afslørede placeringen af hypofyse LH celler28. Man kan observere, at disse celler sender udvidelser mod blodkarrene. Nogle blodkar kan ikke mærkes korrekt, hvis perfusion er suboptimal. Dette kan for eksempel være tilfældet, hvis opløsningen injiceres i hjerte ventriklen i stedet for bulbuarteriosus, eller hvis der anvendes for lavt tryk og/eller for kort tid på sprøjtens stempel (figur 7). Endelig, ved at afbilde det samme væv med de samme Imaging parametre, intensiteten af mærkningen blev vist sig at falde efter fire dage, med signalet mere spredt ud (figur 8).
Figur 1 : Billeder af holde pladen til perfusion af fisken (a) og Indsprøjtnings opsætningen (B). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 : Skema af medaka fisk hjerte og perfusion system vist med Idel placering af glas nålen i hjertet for vellykket perfusion. Pilehoved viser, hvor at perforere hjertet til at tillade blodet til at forlade cirkulation. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3 : Billede af den ventrale side af fisken åbnet, med hjertet eksponeret for perfusion. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4 : Billede af blod Vaskulaturen i en skive af hjernen og hypofyse vævet fra medaka. En voksen medaka blev perfekbrugt med en fikativ opløsning, der indeholder DiI. Hjernen og hypofysen blev dissekeret og fast natten. Væv blev monteret i 3% agopstået og sekteret med en vibratome før billeddannelse med et fluorescens mikroskop. Alle blodkar mærket med DiI er set gennem hele afsnittet viser Vaskulaturen i hjernen og hypofysen. OT = optisk tectum; Tel = telencephalon; Hyp = hypothalamus; Pit = hypofyse; CB = cerebellum; Hind = hindbrain. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5 : 3D-gengivelse af en confokal z-stak fra blod Vaskulaturen i medaka hypofyse. En voksen medaka blev perfekbrugt med en fikativ opløsning, der indeholder DiI. Hjernen-hypofyse blev dissekeret og fast natten. Hypofysen blev dissekeret fra hjernen og monteret mellem et dias og dækglas med Spacers Ib mellem, før billedbehandling med en confokal mikroskop. Z-stakken blev indspillet, og en 3D-gengivelse blev foretaget ved hjælp af Fiji software og 3D Viewer plugin29. Hele hypofysen blod vaskulatur kunne observeres i 3D. RPD = rostral pars distalis; PPD = proximal pars distalis; PI = pars intermedia. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6 : Z projektion af confokal Z-stack fra en vævs skive af transgene medaka, hvor Lhβ-promotoren styrer ekspression af grønt fluorescerende reporter protein. En voksen TG (LHB: hrgfpii) medaka blev perfekperet med en fikativ opløsning, der indeholder DiI. Hjernen-hypofyse blev dissekeret og fast natten. Væv blev monteret i 3% agopstået og sekteret med en vibratome. Nogle hormon producerer celler, LH celler i dette tilfælde, sende extensions (pilehoveder) mod blodkarrene kan observeres, sandsynligvis at fornemme signaler fra blodet og/eller frigive deres hormoner i cirkulation. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 7 : Billede af blod vaskulatur i et udsnit af hjernen og hypofyse vævet fra dårligt perfbrugte medaka. En voksen medaka var dårligt perfekperet med en fikativ opløsning indeholdende DiI ved at injicere opløsningen i ventrikel alene. Hjernen-hypofyse blev dissekeret og fast natten. Væv blev monteret i 3% agopstod og sekteret med en vibratome før billedbehandling med et confokal mikroskop. Blodkarrene var dårligt mærket med DiI og nogle af dem var ikke mærket på alle. OT = optisk tectum; Tel =, telencephalon; Hyp = hypothalamus; Pit = hypofyse; CB = cerebellum; Hind = hindbrain. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 8 : Time lapse billeddannelse af mærket blod vaskulatur i medaka hjernen-hypofyse væv sektion. En voksen medaka blev perfekbrugt med en fikativ opløsning, der indeholder DiI. Hjernen-hypofyse blev dissekeret og fast natten. Væv blev monteret i 3% agopstået og sekteret med en vibratome før billeddannelse med en stereo mikroskopi direkte efter montering (a), og 4 dage efter montering (B) med de samme billeddiagnostiske parametre. Bemærk, at mærkningen er faldet og spredt ud med tiden. OT = optisk tectum; Tel = telencephalon; Hyp = hypothalamus; Pit = hypofyse; CB = cerebellum; Hind = hindbrain. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hjerte perfusion med DiI tidligere har været brugt til at mærke blodkar i flere model arter24, herunder teleost fisk13.
Som DiI er direkte leveret til endotel cellemembranen ved perfusion i Vaskulaturen, er det muligt at øge signal-til-støj forholdet ved at øge DiI koncentrationen i fiksativ løsning. Derudover giver fluorophore intens farvning, når den er spændt med minimal blegning, hvilket giver relativt langvarig emission18,30. Også, mærkningen kan forblive i flere dage og anvendes i kombination med andre mærknings teknikker, der kræver milde behandlinger, såsom i immuofluorescence (IF)31.
Men denne teknik har nogle begrænsninger. Efter fjernelse fra den fiksive opløsning, bør mærkning og billeddannelse af væv udføres så hurtigt som muligt, fordi intensiteten af mærkningen vil svække, og signalet vil sprede med tiden (figur 8). Denne proces vil være endnu hurtigere, når du bruger vaskemidler, der øger porøsitet af membranen. Også, fordi PFA er en giftig flygtige stof, flere forholdsregler bør tages, når du udfører dette eksperiment. For at minimere de farlige aspekter af denne protokol, kan man perfuse en opløsning af DiI og PBS før dissekting væv af interesse og ordne det med PFA løsning lige efter perfusion. Dette kan dog kun udføres for små væv, da indtrængning af PFA i større vævsprøver vil være mindre effektiv end under perfusion.
Den succesrate af denne protokol er forbedret ved uddannelse, så det forventes, at forskerne får brug for lidt tid til at stifte bekendtskab med de forskellige trin i teknikken. For eksempel er perfusion af opløsningen i bulbus arteriosus et særligt kritisk skridt i protokollen og kræver en vis uddannelse for at opnå et godt resultat. Også holde nålen i den korrekte position for længe nok under perfusion er ikke trivielt, og vil kræve uddannelse af manipulatoren.
Endelig er denne protokol optimeret til voksne medaka, men det kan bruges til andre arter med nogle tilpasninger. Forskellige væv af interesse, eller endda forskellige livsstadier af dyret inden for samme væv vil også kræve optimeringer for koncentrationen af DiI og tidspunktet for perfusion samt det anvendte materiale (nål og sprøjte størrelser for eksempel).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre
Acknowledgments
Vi takker Dr. Shinji Kanda for demonstration af kardiel perfusion med fikativ opløsning i medaka, Lourdes Carreon G Tan for hjælp med medaka-opdræt og Anthony Peltier til illustrationer. Dette arbejde blev finansieret af NMBU og af Forskningsrådet i Norge, tilskud nummer 248828 (Digital Life Norge program).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 16% paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | RT 15711 | |
| 5 mL Syringe PP/PE without needle | Sigma | Z116866-100EA | syringes |
| BD Precisionglide syringe needles | Sigma | Z118044-100EA | needles 18G (1.20*40) |
| Borosilicate glass 10 cm OD 1.2 mm | sutter instrument | BF120-94-10 | glass pipette |
| DiI (1,1′-Dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindocarbocyanine perchlorate) | Invitrogen | D-282 | |
| LDPE tube O.D 1.7 mm and I.D 1.1 mm | Portex | 800/110/340/100 | canula |
| Phosphate Buffer Saline (PBS) solution | Sigma | D8537-6X500ML | |
| Pipette puller | Narishige | PC-10 | |
| Plastic Petri dishes | VWR | 391-0442 | |
| Super glue gel | loctite | c4356 | |
| Tricaine (ms-222) | sigma | E10521-50G |
References
- Nishida, N., Yano, H., Nishida, T., Kamura, T., Kojiro, M. Angiogenesis in cancer. Vascular Health and Risk Management. 2 (3), 213-219 (2006).
- Simon, M. C. Vascular morphogenesis and the formation of vascular networks. Developmental Cell. 6 (4), 479-482 (2004).
- Magistretti, P. J. Brain energy metabolism in Fundamental neuroscience. Zigmond, M., et al. , Academic Press. 389-413 (1999).
- Weltzien, F. A., Andersson, E., Andersen, O., Shalchian-Tabrizi, K., Norberg, B. The brain-pituitary-gonad axis in male teleosts, with special emphasis on flatfish (Pleuronectiformes). Comparative Biochemistry and Physiology - Part A: Molecular & Integrative Physiology. 137 (3), 447-477 (2004).
- Ooi, G. T., Tawadros, N., Escalona, R. M. Pituitary cell lines and their endocrine applications. Molecular and Cellular Endocrinology. 228 (1-2), 1-21 (2004).
- Knigge, K. M., Scott, D. E. Structure and function of the median eminence. American Journal of Anatomy. 129 (2), 223-243 (1970).
- Ball, J. N. Hypothalamic control of the pars distalis in fishes, amphibians, and reptiles. General Comparative Endocrinology. 44 (2), 135-170 (1981).
- Knowles, F., Vollrath, L. Synaptic contacts between neurosecretory fibres and pituicytes in the pituitary of the eel. Nature. 206 (4989), 1168 (1965).
- Knowles, F., Vollrath, L. Neurosecretory innervation of the pituitary of the eels Anguilla and Conger I. The structure and ultrastructure of the neuro-intermediate lobe under normal and experimental conditions. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 250 (768), 311-327 (1966).
- Golan, M., Zelinger, E., Zohar, Y., Levavi-Sivan, B. Architecture of GnRH-Gonadotrope-Vasculature Reveals a Dual Mode of Gonadotropin Regulation in Fish. Endocrinology. 156 (11), 4163-4173 (2015).
- Isogai, S., Horiguchi, M., Weinstein, B. M. The vascular anatomy of the developing zebrafish: an atlas of embryonic and early larval development. Developmental Biology. 230 (2), 278-301 (2001).
- Cha, Y. R., Weinstein, B. M. Visualization and experimental analysis of blood vessel formation using transgenic zebrafish. Birth Defects Research Part C: Embryo Today. 81 (4), 286-296 (2007).
- Kamei, M., Isogai, S., Pan, W., Weinstein, B. M. Imaging blood vessels in the zebrafish. Methods Cell Biology. 100, 27-54 (2010).
- Wu, E. S., Jacobson, K., Papahadjopoulos, D. Lateral Diffusion in Phospholipid Multibilayers Measured by Fluorescence Recovery after Photobleaching. Biochemistry. 16 (17), 3936-3941 (1977).
- Schlessinger, J., Axelrod, D., Koppel, D. E., Webb, W. W., Elson, E. L. Lateral Transport of a Lipid Probe and Labeled Proteins on a Cell-Membrane. Science. 195 (4275), 307-309 (1977).
- Johnson, M., Edidin, M. Lateral Diffusion in Plasma-Membrane of Mouse Egg Is Restricted after Fertilization. Nature. 272 (5652), 448-450 (1978).
- Axelrod, D. Carbocyanine Dye Orientation in Red-Cell Membrane Studied by Microscopic Fluorescence Polarization. Biophysical Journal. 26 (3), 557-573 (1979).
- Honig, M. G., Hume, R. I. Fluorescent Carbocyanine Dyes Allow Living Neurons of Identified Origin to Be Studied in Long-Term Cultures. Journal of Cell Biology. 103 (1), 171-187 (1986).
- Godement, P., Vanselow, J., Thanos, S., Bonhoeffer, F. A study in developing visual systems with a new method of staining neurones and their processes in fixed tissue. Development. 101 (4), 697-713 (1987).
- Fox, C. H., Johnson, F. B., Whiting, J., Roller, P. P. Formaldehyde Fixation. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 33 (8), 845-853 (1985).
- Puchtler, H., Meloan, S. N. On the Chemistry of Formaldehyde Fixation and Its Effects on Immunohistochemical Reactions. Histochemistry. 82 (3), 201-204 (1985).
- Hoetelmans, R. W. M., et al. Effects of acetone, methanol, or paraformaldehyde on cellular structure, visualized by reflection contrast microscopy and transmission and scanning electron microscopy. Applied Immunohistochemistry & Molecular Morphology. 9 (4), 346-351 (2001).
- Hobro, A. J., Smith, N. I. An evaluation of fixation methods: Spatial and compositional cellular changes observed by Raman imaging. Vibrational Spectroscopy. 91, 31-45 (2017).
- Li, Y. W., et al. Direct labeling and visualization of blood vessels with lipophilic carbocyanine dye DiI. Nature Protocols. 3 (11), 1703-1708 (2008).
- Wittbrodt, J., Shima, A., Schartl, M. Medaka--a model organism from the far East. Nature Review Genetic. 3 (1), 53-64 (2002).
- Fontaine, R., Hodne, K., Weltzien, F. A. Healthy Brain-pituitary Slices for Electrophysiological Investigations of Pituitary Cells in Teleost Fish. Journal of Visual Experiments. (138), 57790 (2018).
- Ager-Wick, E., et al. Preparation of a High-quality Primary Cell Culture from Fish Pituitaries. Journal of Visual Experiments. (138), 58159 (2018).
- Hildahl, J., et al. Developmental tracing of luteinizing hormone beta-subunit gene expression using green fluorescent protein transgenic medaka (Oryzias latipes) reveals a putative novel developmental function. Developmental Dynamics. 241 (11), 1665-1677 (2012).
- Schmid, B., Schindelin, J., Cardona, A., Longair, M., Heisenberg, M. A high-level 3D visualization API for Java and ImageJ. BMC Bioinformatics. 11, 274 (2010).
- Honig, M. G., Hume, R. I. Dil and diO: versatile fluorescent dyes for neuronal labelling and pathway tracing. Trends Neurosciences. 12 (9), 333-335 (1989).
- Fontaine, R., et al. Dopaminergic Neurons Controlling Anterior Pituitary Functions: Anatomy and Ontogenesis in Zebrafish. Endocrinology. 156 (8), 2934-2948 (2015).
