Summary
אנו מתארים מודל של הטרוהנושא השתלת לב הבטן בחולדות, רומז שינויים של אסטרטגיות נוכחיות, אשר להוביל גישה כירורגית פשוטה. בנוסף, אנו מתארים מודל דחייה הרומן על-ידי הזרקה באוזן של תאים חיוניים שרירי הלב, המאפשר ניתוח נוסף השתלת אימונולוגיים בחולדות.
Abstract
הטרוטופית לב השתלת חולדות כבר מודל נפוץ למחקרים אימונולוגיים שונים עבור יותר מ 50 שנים. מספר שינויים דווחו מאז התיאור הראשון ב 1964. לאחר 30 שנים של ביצוע הטרולפית לב השתלת חולדות, פיתחנו גישה כירורגית פשוטה, אשר ניתן ללמד בקלות ולבצע ללא הכשרה כירורגית נוספת או רקע.
לאחר הניתוח של העורקים העולה ואת עורק הריאות והארכה של זה מעולה ונחותים ורידים ריאתי, הלב התורם הוא נקצרו ולאחר מכן מושם עם תמיסת מלח קר מלוחים בתוספת הפארין. לאחר הלקריש ולצמצם את כלי הבטן של המטופל, התורם עולה העורקים הריאתי ואת עורק הריאות הם מאוהים לאבי העורקים הבטן המטופל והבנה לבנה הנחותה, בהתאמה, באמצעות תפרים ריצה רציפה.
בהתאם שילובים שונים של הנמען התורם, מודל זה מאפשר ניתוח של דחייה חריפה או כרונית של allografts. המשמעות החיסונית של מודל זה משופרת עוד על ידי גישה הרומן של הזרקה באוזן של תאים חיוניים שריר הלב וניתוח הבאים של ניקוז רקמת הלימפה צוואר הרחם.
Introduction
הטרוטופית לב השתלת הוא מודל ניסיוני נפוץ לחקירות שונות לגבי סובלנות השתלת, דחייה כרונית השתלת, reperfusion פציעה, מחשב זלוף או לב שיפוץ. בין היתר, ניתן לנטר את תפקוד השתל באופן בלתי פולשני על ידי מישוש וכישלון השתל אינו מוביל לפגיעה חיונית של המטופל בניגוד לאיברים אחרים, כגון כליות או כבדים.
ב 1964, אבוט ואח ' תיאר בתחילה הטרוסקסואלים השתלת לב הבטן בחולדות1. מאוחר יותר, ב-1966, הטכניקה הסופית של האנסטוסים תוארה על ידי Tomita et al.2. היסודות עבור הדגם המשמש כיום דווחו על ידי אונו ולינדזי ב 19693. במהלך העשורים האחרונים, מספר שינויים פורסמו כדי ליצור סוגים שונים של פרוק, טעון באופן חלקי או טעון שמאלי חדרית הלב המוח4כולל הטרוסקסואליםמשולב לב הטרולפית 4,5,6. עבור מנתח אימונולוגיים השתלת שתל הלב שאינו טעון באמצעי האחסון מבוצע בדרך כלל. במקרה זה, זרימת הדם נכנסת למצב של התורם בעלייה העורקים ולאחר מכן את העורקים הכליליים. ניקוז הורידים מתרחש לאורך הסינוס הכלילי לתוך האטריום הימני והחדר (איור 1A-B). לפיכך, החדר השמאלי אינו נכלל בזרימת הדם, מלבד כמויות שוליים של דם מתוך ורידים של טסיאן. זה גם עושה את זה מודל שימושי עבור לימוד מנגנונים pathפיזילוגיים במהלך שמאל חדרית לסייע לטיפול במכשיר7.
השתלת לב הטרולפית בוצעה במינים שונים, כולל עכברים, ארנבים, חזירים והוא אפילו שימש מכשיר סיוע חד או בדיוני בבני אדם8,9,10,11. החולדה עדיין מייצגת בעל חיים ניסיוני פופולרי עבור דגמי השתלה, במיוחד מאז זמני ההישרדות של השתל עבור שילובים שונים של מאמץ חולדה הוגדרו היטב בעבר ומספר רב של ריאגנטים אימונולוגיים נגישים12,13. בניגוד לעכברים, חולדות גדולות יותר לעשות ניתוח וגישה לרקמת הלימפה לניתוח אימונולוגיים יותר12. יתר על כן, המבוא של טכנולוגיות שיבוט מסחרי בחולדות בשנים האחרונות יהיה כנראה להוביל לעניין חוזר במודלים חולדה ניסיוני14.
באופן כללי, הטרולנושא שתלי לב יכול להיות מחובר כלי המטופל או על ידי ביצוע ההשקה צוואר הרחם או הבטן. עם זאת, מספר מחקרים מראים כי השקה הירך מקלה על ניטור משופר עקב גישה טובה יותר עבור מישוש ידני או העברה הירך ובכך מאפשר זיהוי מדויק יותר של כשל השתל15,16.
הוכח כי אין הבדל לגבי זמן פעולה, שיעור סיבוך, התוצאה ואת זמן הישרדות השתל בין שתי טכניקות ההשקה17. ברור, הזמינות של מספר מספיק של בלוטות הלימפה ניקוז חייב להיות מוזכר כיתרון של ההשקה הצווארי; עם זאת, יש צורך בתקופות אימונים ארוכות יותר. לעומת זאת, החיבור הבטן הוא פחות מסובך וחשוב באותה מידה עבור חקירות אימונולוגיים, במיוחד כאשר בשילוב עם תוצאות מתוך שיטה הרומן של הזרקה באוזן של תאי שריר הלב allogenic וlymphadenectomy צוואר הרחם העוקבים. שילוב של שני הדגמים מציע ספקטרום רחב של ניתוחים אימונולוגיים שלאחר התערבותית.
הפרוטוקול הבא מתייחס לפעול בזוגות של מנתחים כדי להפחית את הזמן של איסכמיה. עם זאת, ניתן לבצע את כל הניסויים על ידי אדם אחד. הכיוונון של כלים וחומרים להסבר לב והשרשה מוצג באיור 2A-B.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל החוויות בעלי החיים בוצעו על פי ההנחיות של הוועדה המקומית לסקירת בעלי חיים של הרשויות האזוריות להגנת הצרכן ובטיחות המזון של סקסוניה התחתונה (LAVES, אולנבורג, גרמניה) עם מזהי אישור 12/0768 ו 17/2472.
1. הסבר לב ופרזיה
הערה: כאשר השתל תורמים, נשים או חולדות גברים בגיל של 7-22 שבועות שימשו.
- השתיל את עכברוש התורמים על ידי אינהלציה של השאיפה (האינדוקציה ב-5% ואחזקה ב -3% עם זרימה או2 של 1 ל'/דקה). להזריק 5 מ"ג של Carprofen תת-עורי לכל ק ג של משקל הגוף עבור כאבים הפריביות ולבדוק את העדר של הבוהן קמצוץ נסיגה רפלקס.
- החלת סיכה העין ולהסיר את הבטן ואת הפרווה החזה באמצעות קוצץ מכני.
- מניחים את התורם בתנוחה פרקדן, לתקן את האיברים בבסיס של הטבלה פעולה עם להקות אלסטיים ולעקר את העור עם 70% אתנול או אחרת מספיק חלופה.
- מעבר העור בכיוון האורך ולאחר יישום של הרדמה מקומית (למשל, לידוקאין 0.2%) בצע כריתת אונה חציון באמצעות מספריים.
- הכנס מחדש, להניע את המעי משמאל לתורם, ולחשוף את המוטה הנחותים עם מטליות כותנה מעוקר.
- לצורך אנטיקרישה, הכנס 500 I.U. של הפארין מומס 1 מ ל של הקרח קר איזוטוניק תמיסת מלוחים באופן פנימי על ידי שתיל את הווריד הנחותים. הפסיקו את הדימום באתר הניקוב באמצעות דחיסת אור בעזרת ספוגית כותנה לאחר הנסיגה של המחט (איור 3א).
- מעבר לסרעפת ומבצע כריתת. אונה צדדית לשני צידי התורם
- הצמד את הקיר הגלוח של החזה אל שולחן המבצעים.
- הסירו את קרום הלב ואת העצב התועה על ידי הכנה קהה באמצעות שני מחזיקי מיקרו-מחט.
- בצעו חתך של כלי הבטן כדי לדימום את התורם ולפרוק את הלב.
- הכנס את הענף הקהה של מספריים בדיקה הצביע לתוך הסינוס של הדלקת קרום הלב והפרד את העורקים העולה ואת עורק הריאתי ככל האפשר תחת המתיחה הקלה caudal של הלב עם לדחוס (איור 3ב).
- מניחים ליגטורה יחידה 5-0 סביב המטה העליון והמטה-קאווה הנחותים והורידים הריאתי והדקו אותו באותה הדרך ככל האפשר (איור 3ג).
- לנתק את הרקמה מהראש לקשירה ולחלץ את הלב (איור 3ד).
- מבשם לב ההסבר בצינורית של 18 גר' מקטטר ורידי דרך העורקים העולה ועורק הריאות עם 30 מ ל של קרח קר, תמיסת מלוחים איזוטון בתוספת 1000 I.U. של הפארין ומניחים את הלב בצינור 15 מ"ל מלא בתמיסת מלח על הקרח (איור 3E-F).
2. השתלת לב
הערה: כנמענים, שימשו בשנת 10-14 שבועות עכברושים של נשים או גברים. תורמים ומטופלים היו בעלי משקל כלשהו.
- לבצע הרדמה של עכברוש המטופל על ידי שימוש גם באינהלציה isofלאנה (אינדוקציה 5% ותחזוקה ב 1.5-2% עם זרימה O2 של 1 L/min). להזריק 5 מ"ג של Carprofen תת-עורי לכל ק ג של משקל הגוף עבור כאבים הפריביות ולבדוק את העדר של הבוהן צביטה לנסיגה רפלקס.
- החלת סיכה העין, להסיר את פרוות הבטן, לתקן את הגפיים ולעקר את העור באופן שולי לקראת הכנת התורם. לתוצאת הניתוח האופטימלי, בצע את הפעולה על מחצלת חימום כדי למנוע היפותרמיה בין-מבצעיות.
- לאחר חתך האורך של העור, להחיל הרדמה מקומית, כגון לידוקאין (0.2%), על fascia הבטן. פתח את חלל הבטן על ידי להפרוטומיה החציוני והכנס מחדש.
- הגבר את המעי לצדו השמאלי העליון של המטופל והניחו אותו בדחיסה חמה ומועלת.
- לאחר הגיוס התריסריון והאבוג'נום הבית, בהתאמה, באמצעות מיקרוסקופ כירורגי (או משקפיים מגדלת) עם הגדלה של 5-7x, לחשוף את העורקים הבטני ואת האובלה הנחותים על ידי הכנה קהה עם מטליות כותנה. אין להפריד את כלי הבטן.
- העלה את כלי הבטן באמצעות שני מחזיקי מחט מיקרו מבלי לפגוע בורידים המותני ולמקם את המלחציים קולי וסקולרית (איור 4א).
- נקב בכלי הבטן בעזרת צינורית מקומרת ב30-45 מעלות 27 גר' (איור 4ב').
- להגדיל את האתר ניקוב באמצעות מספריים פוטס כדי ליצור חתך האורך המתאים לגודל של לומן כלי התורם (איור 4C-D) ומבשם כלי הנמען עם פתרון מלוחים כדי להסיר קרישי דם ולמנוע פקקת פוסט-אופרטיבית.
- הניחו את השתל בתוך הסיטוס והפכו את התורם לעולה לאבי העורקים הבטני של המטופל על ידי שני תפרים מופרשים פשוטים (8-0 תפר מונופינט שאינו נספג בתפרים) בפינת הגולגולת והקודל של חתך האורך (איור 4E).
- Anastomose העולה על אבי העורקים של התורם עם העורקים הבטני של המטופל על ידי ריצה 8-0 תפר מונופינט בשני צעדים: ראשית, הצב את השתל מימין לכלי הקיבול ובצע את המחצית הראשונה של ההשקה (איור 4E). לאחר מכן, הצב את השתל משמאל לכלי הקיבול ובצע את המחצית השניה של ההשקה (איור 4F).
- העתק את עורק הריאות של התורם לaortal הורד הנחותים לחיבור החיבור (8-0 תפר מונופינט לא נספג. תפר את המחצית הראשונה של החיבור הורידים מהצד intraluminal של הכלי (איור 4G-H).
- ריקון האנסטוסים עם תמיסת מלח ישירות לפני הידוק הקשרים כדי למנוע תסחיף היקפי.
- מניחים גזה הומוסטטי סביב שני anaoses ולשחרר בזהירות את המלחציים קולי כלי הדם כך reperfusion של השתל יכול להתחיל. טיפול בדימום לאורך האנסטוסים על ידי דחיסת אור עם מטליות כותנה מעוקר.
הערה: השתל צריך להתחיל לפעום אחרי סביב 60 s. - להחליף את המעי בצורה כמו אופנה. יש לוודא כי אין סיבובים של בסיס מצע כדי למנוע נמק מעיים או חסימה מכנית.
- לסגור את שרירי הבטן/fascia ואת העור בנפרד באמצעות רציף 3-0 פוליפילמנט פועל התפר.
3. טיפול פוסט-פעיל
- עבור כאבים בניתוח, לספק את הנמענים עם הזרקה תת עורית נוספת של 5 מ ג של Carprofen לכל ק ג של משקל גוף ביום postאופרטי1 (POD). בנוסף, להוסיף 1 גרם של Metamizol כדי 500 mL של מי שתייה עד התרמיל השלישי.
- התחל לעקוב אחר תפקוד שתל הלב על ידי מישוש הבטן היומית על התרמיל השלישי.
הערה: במקרה של כשל השתל לפני ה-POD השלישי, יש לשקול ניתוח במקום כישלון חיסולוגי. עם זאת, זה כמובן תלוי בשילוב הזנים שנבחרו ואת המודל האימונוולוגי בהתאמה (למשל, דחייה יתר על כן לאחר חיסון קודם). - בעקבות דחיית השתל, לחלץ את הרקמות כמו בלוטות לימפה הניקוז מרוקן את הגולגולת של anastomoses, את הטחול, את הדם, את התימוס ואת השתל לניתוחים אימונולוגיים נוספים באמצעות הזרמת cy, או אימונוהיסטוכימיה.
4. העיכול האנזימטי של הלב וההזרקה התת-עורית של תאי הלב באוזן
- בצעו הסבר לב והפרזיה להשתלה הטרוטופית לב (ראה שלב 1).
- לגרוס את הלב בשלושה מ"מ x 3 מ מ בלוקים באמצעות מספריים אזמל סטרילי או סטרילי ו דגירה אותו 30 דקות ב 37 ° צ' בינונית התרבות המכילה 0.5 mg/mL הקולגן.
הערה: חשוב להשתמש במדיום התרבותי המכיל פניצילין, סטרפטומיצין ו גלוטמין ללא סרום עגל עוברי (FCS) במיוחד כמו FCS מעכב את העיכול קולגן. - להוסיף את הרקמה מתעכל על מסננת גדול, תוך הסרת בינוני התרבות והמאייד ביסודיות כדי לקבל השעיה של תאים חיוניים לשריר הלב, בעיקר מתים בודדים לב התאים ותאי הדם הנותרים. תשטוף את ההשעיה הסלולרית פעמיים. עם תמיסת מלח איזוטוניק סטרילית
הערה: הגדרות צנטריפוגה: 10 דקות, 200 x g, 20 ° צ' - לסנן את ההשעיה באמצעות מסננת תא 40 יקרומטר ולאסוף את התא החיוני congeries ידי שטיפה מסננת התא עם 5-10 mL של תמיסת מלוחים איזוטוניקה.
- לאחר צנטריפוגה, השהה מחדש את תאי שריר הלב בתמיסה מלוחים הומס בריכוז של 5x105 תאים/mL ולצייר את הפתרון התא עד מזרק 1 mL.
- בצע הרדמה באופן מבוקר לפרוטוקול המתואר עבור הרדמה המטופל (ראה שלב 2) עבור השתלת לב הטרולפית.
- מניחים את המטופל בתנוחה צדדית ומסדרים את האוזן עם אצבע באמצעות קלטת כפולה (איור 5א).
- הכנס 20 μL של הפתרון של תא שרירי הלב (המכיל 1 x 104 תאים) באמצעות הצינורית של 27 גר' ספורטינג ראגה קרוב לכלי הקפילר החזותיים לתוך אוזנו של המטופל (איור 5ב).
- לאחר תקופת התבוננות מוגדרת (בהתאם לשילוב הזנים הנבחר וכוח של דחייה), לחלץ את בלוטות ניקוז הלימפה בצוואר הרחם ולבצע ניתוחים נוספים כגון הזרמת cy, או שיתוף תרבויות (איור 5ג).
הערה: בנוסף, ניתוח היסטולוגית של הפינה ניתן לבצע כדי לקבוע חדירת תאים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
בעבר, בעיות אימונולוגיים שונות טופלו על בסיס המודל, אשר אומת בקבוצת העבודה על ידי יותר מ 500 השתלות עם שיעור הישרדות של יותר מ 95%13,18,19,20,21,22,23,24. סה כ זמני הפעלה (כולל הסבר השתל והשרשה) בדרך כלל לא עלה על 60 דקות, ואילו משולב פעמים הקרים וחמים איסכמיה היו סביב 30 דקות. שילובי הזנים שהוחלו מבוססים בעיקר על רקע לואיס (לו). השתלות סינגניים שרדו עד 100 ימים ללא סימנים של כשל שתל, אבל משקל משמעותי הפחתת גודל על ההסבר שתל. לאחרונה, אנחנו ביצעו הטרוסקסואלים השתלת לב בשני שילובים שונים של מקבל תורם הדמיית מהירה ומודל דחייה ממושך: לו. 1a → לו מוביל לדחייה מהירה (מתכוון זמן ההישרדות של 7.4 ימים) ו לו. 1a-7B → לו. 1a המוביל דחייה ממושכתיותר (ממוצע זמן 42.5 ההישרדות של באופן מאקרואני, השתלים שנדחו הראו פקקת מלווה בצבע שינוי ונפיחות, בעוד שתלים שאינם דחויים מראים ניוון שונה, סביר להניח כתוצאה של חדר שמאלי שטרם פרוק. יתר על כן, אנחנו שלנו חלקים קריוסטט של לבבות מושתלים על מנת לזהות חדירת תאים באמצעות פוספספטאז אלקליין-antihatase בסיסי (השיטה) הצביעת שיטה. מסגרות בודדות עם הגדלה של 50x היו ממוזגות לתמונה מורכבת אחת, נותן סקירה של השתל המלא ואת התפלגות של תאים החדירה. ניתוח היסטולוגית הראה חדירה מוגברת של (למשל, CD4+, tcr+, או Nkr-P1A/B+) תאים חיסוניים בשתלים allogenic, ואילו שתלי syngenic היו במידה רבה ללא הסתננות תא (איור 7A-C).
Lymphadenectomy צוואר הרחם וגירוי מחדש של הצומת הלימפה תאים לאחר ההזרקה באוזן של תאים שרירים לב בצירופים למעלה שהוזכרו לעיל חשף תגובות החיסון ספציפי להתאמץ ספציפיים כלפי רקמת לב אלוגניים ומותר ניתוחים אימונולוגיים נוספים, כגון פרופיל ציטוקינים (איור 8A-C).
איור 1: הצגת סכמטית של האנסטוסים מהסוף לקצה וזרימת הדם הנוצרת דרך הלב. לאחר שהוא מאשר את התורם העולה לקצה העורקים הראשי של המטופל הבטן ומקבילים לעורק הריאתי של המטופל,כאשרזרימת הדם נכנסת לעורקים הכליליים דרך אבי העורקים העולים. ניקוז הורידים מתרחש באמצעות הסינוס הקורוריאריוס לתוך האטריום הימני והחדר ודרך עורק הריאתי לתוך הכניסה הנחותה של המטופל (B). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: כלי ניתוח וחומרים כירורגיים נדרשים. (א) הסבר: 1:להקת הגפייםהאלסטית, 2: retractors, 3:5-0 ליגטורה, 4: בדיקה מספריים הצביע, 5-6: מחזיקי מחט מיקרו, 7: מספריים, 8: מלקחיים כירורגי, 9: מלקחיים מיקרו, 10: חומר סיכה העין, 11: קומפרסים, 12: מטליות כותנה, 13 (ב) השרשה: 1: הלהקה הגפיים אלסטי, 2: retractors, 5-6: מחזיקי מחט מיקרו, 7: מספריים, 8: מלקחיים, 9: מלקחיים מיקרו, 10: סיכה העין, 11: קומפרסים, 12: כותנה, 15: מספריים מיקרו, 16: מלקחיים מיקרו, 17: פוטס מספריים, 18: מחזיק המחט, 21:8-0 התפרים מונופינט, 22: גזה הומוסטטי, 23:3-0 תפרים פוליפילמנט, 24: צלחת פטרי, 25: Carprofen (5 מ"ג/mL), 26: הרדמה מקומית (לידוקאין 0.2%), 27: תמיסת מלח. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: הסבר לב. לאחר המלחה (א), מבוצע כריתת האונה העורקים, והעורק הריאתי הראשי מנותקים ככל האפשר (ב). עם ריאות אחת לקשירה בודדת ושני הורידים הקהים מעורבבות (C) והלב מוסר מחלל בית החזה (D). (ה) מראה את הלב לפני ו (ו) לאחר זלוף עם פתרון מלוחים 30 מ ל המכילים הפארין. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: השתלת לב. לאחר התצוגה של כלי הבטן ומיקום של מהדק קולי וסקולרית (א) הכלים הם Cannulated (ב) וחתך האורך מבוצעת באמצעות מספריים פוטס (C-D). התרומה עולה אבי העורקים הוא מקובע עם קשר אחד כל אחד בפינה הגולגולת ואת caudal של החתך של המטופל הבטן החולים (e) ו ההשקה מבוצעת על ידי הפעלת תפרים ברציפות (e-F). שימו לב כי השתל ממוקם בצד ימין של הכלים למחצית הראשונה של החיבור (E) ולצד שמאל של כלי הקיבול למחצית השניה של החיבור (F) ולחיבור הורידים הבאים. המחצית הראשונה של החיבור הורידים מבוצעת על ידי תפר intraluminal (G). לאחר שסיים את המחצית השנייה של ההשקה הורידים, השתל מוכן לreperfusion (H). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: הזרקה באוזן של תאי שריר הלב האלוגניים. לאחר תיקון אוזנו של המטופל על אצבע באמצעות קלטת דו צדדית (א) אלוגניים תאי שריר הלב החיוניים מוזרק תת-עורי קרוב לכלי הדם החזותיים (B). לאחר תקופת התבוננות ניקוז בלוטות הלימפה צוואר הרחם (*) מופקים (ג). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 6: הישרדות הלב בשילובים שונים של התורמים לתורם והאלוגניים. ניתוח קפלן-מאייר מראה את הישרדות הסינגניים (n = 10 מודל דחייה מהיר; n = 5 מודל דחייה ממושך) ו שתלי אלוגניים (n = 11 מודל דחייה מהירה; n = 14 מודל דחייה ממושכת). במודל דחייה ממושך שש מתוך 14 הנמענים הגיעו לסיומו של תקופת התצפית (60 ימים) ללא כישלון השתל, המוביל הישרדות השתל ממושך בקבוצה זו. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 7: ניתוח היסטולוגית של שתלי לב סינגניים ואלוגניים. (A-B) מראים חדירה של CD4+ תאים באמצעות שיטת ה-הצביעת של השיטה הקיימת בשתל סינגניים (A) והשתל אלוגניים על דחיית (ב). (ג) מציג את הגידול של הסתננות תאים בשתלים אלוגניים בהשוואה שתלי syngenic (לשמש כקבוצה התייחסות) עבור תת מערכות שונות של תאים חיסוניים. הסיווג שהוחל על חדירת תאים בכמת השתנה מהירשבורגר ואח '25: 0 = הסתננות המקבילה לשתלים סינכגניים; 0.5 = גידול קל של תאים ויטראז ' במקטעים מבודדים של רקמה; 1 = הגדלת התאים המוכתמים הייחודיים על כל מקטע הרקמה; 1.5 = הגדלה של אשכולות תאים ויטראז ' בפריסה אחידה על כל מקטע הרקמה; 2 = חזק; 2.5 = חזק מאוד; 3 = הגברת החזקה ביותר של אשכולות תא מוכתם ברחבי כל מקטע הרקמה. הסעיפים היסטלוגיים של השתלים נותחו באמצעות הגדלה של 50x. חמש שתלי שתלים לכל קבוצה (סינגניים ואלוגניים, בהתאמה) נכללו בניתוח. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 8: ניתוח של ניקוז הלימפה תאים לאחר האוזן הזרקה של תאים השריר לב אלוגניים. הגירוי מחדש ספציפי (עם 2 x 105 הטחול של זן התורם המתאים) של 2 x 105 לימפוציטים שנקטפו או ניקוז בלוטות הלימפה או מצע (LN) של מהיר דחיית לו wt ודוחים ממושכת לו. 1a הנמענים הראו הפחתת משמעותית את התפשטות הניקוז של תאים בלוטות הלימפה בלו. 1a הנמענים (א), ואילו קיבולת ההתרבות בכלל היה עדיין נצפה לאחר גירוי מסוים עם CD3/CD28 נוגדן (ב). באופן מפתיע, פרופיל ציטוקינים חשף גידול של ציטוקינים דלקתיים בבלוטות הלימפה של הנמענים דוחה ממושך (C). תוצאות מוצגות כממוצע ± SEM של 4 בעלי חיים לפחות לכל קבוצה. המשמעות מצוינת עם * עבור p-ערכים ≤ 0.05 ו * * * * עבור ערכי p ≤ 0.0001. (נתון זה השתנה מבז ואח '24). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
השיטה שתוארה קודם לכן השתלת לב הטרופית בחולדות מבוססת בעיקר על התיאור של אונו ולינדזי ב 19693. מאז, הוכנסו מספר שינויים במינים שונים המובילים למגוון רחב של מודל זה. שילוב של כמה שינויים אלה ומציג את הניסיון שלנו כתוצאה מעל 30 שנים של ביצוע של השתלות לב הטרולפית במעבדה, יצרנו גישה כירורגית אפשרי, אשר אינו דורש תקופות אימונים ארוכות או רקע כירורגי. בדוגמה הבאה, נדון במגבלות כלליות של דגם זה ובקו תחתון שלבים קריטיים של הפרוטוקול. יתר על כן, אנו להדגיש את היתרונות של שילוב השתלת לב הטרולפית עם שיטה הרומן של הזרקה באוזן של תאים שריר הלב.
הרדמה וסיבוכים כלליים
למרות שדווח כי הרדמה isof, הוא מעולה הרדמה הזרקה לגבי הישרדות מוקדמת לאחר השתלת לב הטרולפית, דיכאון הנשימה הפנימי עדיין מייצג את אחד הסיבוכים השכיחים ביותר וכך דורש הרדמה זהיר לניהול26. במקום הסבר השתל הסדרתי והשרשה, בהתאמה, אנו מייעצים להתחיל את הכנת המטופל ואת כלי הבטן מיד לאחר הניתוח של החיה התורמת, במיוחד משום שזמני התפעול של פחות משעה משויכים לתוצאה טובה יותר בנוגע להשתלת השתל והנמען26,27. חוץ מזה כבר הזכיר סיבוכים כגון היפותרמיה עקב זמני הפעלה ארוכה מחצלות חימום חסר, נמק מעיים או מכשול על ידי מיקום לא פיסיולוגי של המעי, פרסיס של הגפיים מעכב מייצג סיבוך נוסף, אשר ניתן למנוע על ידי הסרת וסקולרית ושטיפה יסודית של חיבור כדי למנוע תסחיף היקפי28,29.
ליגטורה של ורידי הריאה והקאבל וסיבוכים מדממים
כדי להפחית את זמן האיסכמיה החמים, אנו משתמשים באחד הקשירה לשני הקאבל ולכל ארבעת הורידים הריאתי. כסיבוך אפשרי כתוצאה ממיקום מיותר מדי/הגחוני של הקשירה, השיבוש של זרימת הורידים על-ידי חסימה של הסינוס הקורואריוס צריך להיות מוזכר. במקרה של דימום חמור לאחר הסרת מהדק קולי והכאה גלויה של השתל, הקשירה צריכה להיבדק באופן מיידי. הבחנו בסוג זה של סיבוך במיוחד אם הניתוח של ורידים הריאתי בוצע קרוב מדי לקשירה תוך הסרת השתל מחלל החזה. אחרת, דימום חמור נגרם בעיקר על ידי אי ספיקה של האנסטוסים כלי הדם. בנוסף, עורק כלילי הפועל לאורך העורקים העולה שלעיתים קרובות קטוע במהלך ההסבר מתואר לגרום לדימום קטלני על reperfusion27.
הזמן והפרזיה של איסכמיה
ללא קשר למודל ההשתלה, זה תמיד חיוני להפחית את הזמן של איסכמיה, במיוחד כמו הלב נחשב איבר פגיע לגבי נזק איסכמיה. על-ידי ביצוע ניתוח עם שני מנתחים, אנחנו מסוגלים להשיג מינימום הזמן האיסכמי חם וקרים ולכן לוותר על השימוש של פתרונות קרדיואופריים כדי להפחית איסכמיה-reperfusion נזק30. באופן כללי, הפרזיה של השתל ממלאת תפקיד מפתח, והיא חיונית לצנן את השתל ולהסיר את תאי הדם, דבר שעלול לגרום לפקקת או תסחיף. בעוד לחצים זלוף נמוך להוביל זלוף מספיק ולכן להסרה לא מלאה של כדוריות הדם, לחצים זלוף גבוה יכול לגרום נזק אנדותל31,32. אנו מייעצים לפרזיה של עורק הפולאל, כמו גם את העורקים העולים עד שעורקי העורק הינם צלולים לעין.
חתך ספינות הנמען
צעד קריטי בפרוטוקול מהווה את החתך של כלי הקיבול מבלי לגרום נזק כלי הקיר האחורי: Schmid ואח ' תיאר את היתרון של aortotomy או ובקרה חיתוך רוחבי קטן ואחריו התרחבות האורך בכיוון הגולגולת, caudal, אשר מובילה עוד יותר שיעור היצרות נמוכה של aortal השקה33. במודל שלנו, כלי המקבל מנוקב באמצעות צינורית קטנה. לאחר מכן, אתר הניקוב מוגדל באמצעות מספריים פוטס כדי ליצור חתך האורך. לקבלת היתכנות טובה יותר, אנו ממליצים לכופף את קצה הצינורית לזווית של 30-45 ° המובילה לסיכון מופחת לפגיעה בכלי הקיר האחורי. לא שמנו לב לסטנזות בכלי הדם הרלוונטיים ביותר באף אחד מהנמענים. היתרונות הדומים לפתיחת כלי הקיבול של הנמען על-ידי העברת העורקים הבטני והאובקאווה הנחותים עם צינורית, תוארו על ידי שן ואח '.34.
מאסטרינג המודל של הטרוטופית לב השתלת
במהלך העשור האחרון, המודל בוצע על ידי חוקרים במחלקה עם רקע כירורגי קטן או לא. כאמור לעיל, אנו פועלים בזוגות של מנתחים, בעוד חוקר מנוסה יותר הוא אחראי על הבטחת ההצלחה של ההשתלה ובאותו ההדרגה לשפר את מערכת המיומנות של החוקר בלתי מנוסה. לאחר תקופת אימונים קצרה של כעשרה הסבר ומטעי בעלי חיים מתים, החוקר הבלתי מנוסה אחראי על ביצוע הסבר לב וסיוע להשתלת השתל בתוך כעשר חיות חיות. לאחר מכן, החוקר הבלתי מנוסה פועל באופן פעיל את האנסטוסים של כלי הדם, כך שלאחר כעשר שכונות נוספות, החוקר לשעבר שאינו מנוסה מסוגל בדרך כלל לבצע את כל הצעדים הקריטיים של המודל.
החלת קונספט זה הכשרה, פרסומים בעבר מהמחלקה שלנו באמצעות השתלת לב הטרוסקסואלים בחולדות הראה לא הבדלים לגבי תחלואה, תמותה או פונקציה שתל למרות מספר צוותים שונים של מנתחים13,18,19,20,21,22,23,24.
לתשומת לב, ביצוע האנסטוסים של כלי הדם מייצג את הצעד הקריטי ביותר בפרוטוקול זה ומודלים מוצקים להשתלת איברים באופן כללי. לפיכך, אנו ממליצים על תקופות הכשרה ממושכות באמצעות בעלי חיים מתים עד שהאנסטוסים יבוצעו בצורה מדויקת ומהירה, במיוחד אם חוקר מנוסה אינו זמין להדרכה בבעלי חיים חיים.
יתרונות כלליים וחסרונות של המודל
בעוד העמידות סובלנות ספונטנית מתוארת לעתים קרובות כתופעה השתלת כבד וגם נצפתה השתלת כליה, הלב נחשב כאיבר חיסוני למדי ובכך מאפשר דחייה אמינה במודלים להשתלות35,36. בניגוד ממצאים אלה, אנחנו יכולים גם להבחין הישרדות לטווח ארוך והעדר דחייה לאחר השתלת לב הטרולפית בצירופים מסוימים של התורמים לתורם למרות השלמות העיקריים מורכבות הבדלים מורכבים.
הביקורת המוזכרת לעתים קרובות של הטרוטופית הלב השתלת הוא הסובייקטיביות של ניטור השתל על ידי מישוש ידני. לכן, המודל הורחב לטכניקות העברת הירך על מנת להקל על הגישה למישוש ולהציג טכניקות ניטור נוספות כגון העברת אקו-הירך15,16. מצד שני, מוטרראם ואח ' הראה שניטור השתל באמצעות מישוש מתואם היטב עם מדידות אלקטרוקרדיוגרפיות37. כך, מישוש ידני בהשתלת לב הטרולפית נראה מספיק לניטור תפקוד השתל במודל דחייה חריפה.
כתוצאה מיקום הטרוטופית ופריקה חדרית שמאל, הלב אינו פועל תחת תנאים אנטומיים או פיסיולוגיים בהנחה כי זה לא משפיע על ניתוחים אימונולוגיים. בניגוד להנחה זו, זה היה הוכח כי שיפוץ לב כתוצאה שמאל פריקה החדרית במהלך שמאל חדרית לסייע לטיפול המכשיר מוביל ציטוקינים ירד שחרור38,39. לעומת זאת, טאנג-קוואן ואח ' תיאר את ההגדרה הטעונה כגישה מתאימה יותר לניתוח אימונוולוגי, מאז נזק לטווח ארוך של השתל הנובע הפרזיה עם דם מזיק חלקית במודל הטעון חדרית שמאל נצפתה40.
למרות מיקום הבטן של השתלים מציע הטבות כירורגי במונחים של יכולת מעשית, קשה לקצור מספר מספיק של בלוטות הלימפה כפוף ניקוז על דחיית השתל הפוגע ניתוח נוסף. מסיבה זו, הצגנו שיטה הרומן של הזרקה באוזן של תאי שריר הלב האלוגניים. שמקורם מחקר פרזיטולוגי, קונספט זה לא הוחל על ניתוחים אימונולוגיים בהשתלה, למרות הכדאיות שלה41,42. היתרון של מודל זה הוא האפשרות לזהות ולקצור מספר משמעותי של בלוטות הלימפה מרוקן, אשר מציעה את האפשרות של ביצוע ניתוחים אימונולוגיים מורכבים. של הערה, שני הדגמים יכולים להיות משולבים בנמען אחד מציע תובנות נוספות לתוך המנגנונים של דחייה וסובלנות בתא השתלת איברים בחולדות.
המודלים שלנו של לב חולדה השתלת תא שריר הלב מייצגים גישה מעשית ולמד היטב ניתן לבצע ללא הכשרה כירורגית נוספת או רקע. מול העובדה כי טכנולוגיות שיבוט חדשות עבור חולדות הוצגו ופותחו לאחרונה, מודלים אלה מציעים הזדמנויות רבות עבור חוקרים אימונולוגיים השתלה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
. למחברים אין מה לגלות
Acknowledgments
אנחנו רוצים להודות לברטה טראוטפיאה, קורין לבנברט ואינגריד מיידר על המחויבות שלהם.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anesthesia device (including isoflurane vaporizer) | Summit Anesthesia Solutions | No Catalog Number available | |
| Cannula (27 G) | BD Microlance | 302200 | |
| Carprofen | Pfizer | Rimadyl 50 mg/mL | |
| Cellstar Tubes (15 mL) | GreinerBioOne | 188271 | |
| Cell strainer (40 µm) | BD Falcon | 2271680 | |
| Collagenase Type CLSII | Biochrome | C2-22 | |
| Compresses 5x5 cm | Fuhrmann | 31501 | |
| Compresses 7.5x7.5 cm | Fuhrmann | 31505 | |
| Cotton swabs | Heinz Herenz Medizinalbedarf | 1032128 | |
| Dexpathenol (5 %) | Bayer | "Bepanthen" | |
| DPBS BioWhittaker | Lonza | 17-512F | |
| Forceps | B. Braun | Aesculap BD557R | |
| Forceps | B. Braun | Aesculap BD313R | |
| Forceps | B. Braun | Aesculap BD35 | |
| Heating mat | Gaymar Industries | "T/Pump" | |
| Hemostatic gauze | Ethicon | Tabotamp | |
| Heparin-Natrium 25 000 I.E. | Ratiopharm | No Catalog Number available | |
| Isofluran CP | CP-Pharma | No Catalog Number available | |
| Large-pored sieve (stainless steel) | Forschungswerkstätten Hannover Medical School | No Catalog Number available | |
| Lidocaine | Astra Zeneca | 2 % Xylocain | |
| Metamizol-Natrium | Ratiopharma | Novaminsulfon 500 mg/mL | |
| Micro forceps | B. Braun | Aesculap BD3361 | |
| Micro needle holder | Codman, Johnson & Johnson Medical | Codmann 80-2003 | |
| Micro needle holder | B. Braun | Aesculap BD336R | |
| Micro needle holder | B. Braun | Aesculap FD241R | |
| Micro scissors | B. Braun | Aesculap FD101R | |
| Micro scissors | B. Braun | Aesculap FM471R | |
| Needle holder | B. Braun | Aesculap BM221R | |
| Penicillin/Streptomycin/Glutamine (100x) | PAA | P11-010 | |
| Peripheral venous catheter (18 G) | B. Braun | 4268334B | |
| Peripheral venous catheter (22 G) | B. Braun | 4268091B | |
| Probe pointed scissors | B. Braun | Aesculap BC030R | |
| Retractors | Forschungswerkstätten Hannover Medical School | No Catalog Number available | |
| RPMI culture medium | Lonza | BE12-702F | |
| Saline solution (NaCl 0.9 %) | Baxter | No Catalog Number available | |
| Scissors | B. Braun | Aesculap BC414 | |
| Surgical microscope | Carl-Zeiss | OPMI-MDM | |
| Sutures (anastomoses) | Catgut | Mariderm 8-0 monofil | |
| Sutures (ligature) | Resorba | Silk 5-0 polyfil | |
| Sutures (skin, fascia) | Ethicon | Mersilene 3-0 | |
| Syringe (1 mL) | B. Braun | 9166017V | |
| Syringe (10 mL) | B. Braun | 4606108V | |
| Syringe (20 mL) | B. Braun | 4606205V | |
| Vascular clamp | B. Braun | Aesculap FB708R |
References
- Abbott, C. P., et al. A Technique for Heart Transplantation In the Rat. Archives of Surgery. 89 (4), 645-652 (1964).
- Tomita, F.
- Ono, K., Lindsey, E. S. Improved technique of heart transplantation in rats. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 57 (2), 225-229 (1969).
- Wen, P., et al. A simple technique for a new working heterotopic heart transplantation model in rats. Transplantation Proceedings. 45 (6), 2522-2526 (2013).
- Benke, K., et al. Heterotopic abdominal rat heart transplantation as a model to investigate volume dependency of myocardial remodeling. Transplantation. 101 (3), 498-505 (2017).
- Kearns, M. J., et al. Rat Heterotopic Abdominal Heart/Single-lung Transplantation in a Volume-loaded Configuration. Journal of Visualized Experiments. (99), 52418 (2015).
- Ibrahim, M., et al. Heterotopic abdominal heart transplantation in rats for functional studies of ventricular unloading. The Journal of Surgical Research. 179 (1), e31-e39 (2013).
- Liu, F., Kang, S. M.
- Lu, W., et al. A new simplified volume-loaded heterotopic rabbit heart transplant model with improved techniques and a standard operating procedure. Journal of Thoracic Disease. 7 (4), 653-661 (2015).
- Kitahara, H., et al. Heterotopic transplantation of a decellularized and recellularized whole porcine heart. Interactive Cardiovascular and Thoracic Surgery. 22 (5), 571-579 (2016).
- Kadner, A., et al. Heterotopic heart transplantation: experimental development and clinical experience. European Journal of Cardiothoracic Surgery. 17 (4), 474-481 (2000).
- Zinöcker, S., et al. Immune reconstitution and graft-versus-host reactions in rat models of allogeneic hematopoietic cell transplantation. Frontiers in Immunology. 3 (NOV), 1-12 (2012).
- Klempnauer, J., et al. Genetic control of rat heart allograft rejection: effect of different MHC and non-MHC incompatibilities. Immunogenetics. 30, 81-88 (1989).
- Huang, G., et al. Genetic manipulations in the rat: Progress and prospects. Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 20 (4), 391-399 (2011).
- Gordon, C. R., et al. Pulse doppler and M-mode to assess viability of cardiac allografts using heterotopic femoral heart transplantation in rats. Microsurgery. 27 (4), 240-244 (2007).
- Gordon, C. R., et al. A new modified technique for heterotopic femoral heart transplantation in rats. The Journal of Surgical Research. 139 (2), 157-163 (2007).
- Ma, Y., Wang, G. Comparison of 2 heterotopic heart transplant techniques in rats: cervical and abdominal heart. Experimental and Clinical Transplantation. 9 (2), 128-133 (2011).
- Bektas, H., et al. Differential effect of donor-specific blood transfusions after kidney, heart, pancreas, and skin transplantation in major histocompatibility complex-incompatible rats. Transfusion. 37 (2), 226-230 (1997).
- Saiho, K. O., et al. Long-term allograft acceptance induced by single dose anti-leukocyte common antigen (RT7) antibody in the rat. Transplantation. 71 (8), 1124-1131 (2001).
- Bektas, H., et al. Blood transfers infectious immunologic tolerance in MHC-incompatible heart transplantation in rats. Journal of Heart and Lung Transplantation. 24 (5), 614-617 (2005).
- Jäger, M. D., et al. Sirolimus promotes tolerance for donor and recipient antigens after MHC class II disparate bone marrow transplantation in rats. Experimental Hematology. 35 (1), 164-170 (2007).
- Timrott, K., et al. Application of allogeneic bone marrow cells in view of residual alloreactivity: Sirolimus but not cyclosporine evolves tolerogenic properties. PLoS ONE. 10 (4), 1-16 (2015).
- Hadamitzky, M., et al. Memory-updating abrogates extinction of learned immunosuppression. Brain, Behavior, and Immunity. 52, 40-48 (2016).
- Beetz, O., et al. Recipient natural killer cells alter the course of rejection of allogeneic heart grafts in rats. Plos One. 14 (8), e0220546 (2019).
- Hirschburger, M., et al. Nicotine Attenuates Macrophage Infiltration in Rat Lung Allografts. The Journal of Heart and Lung Transplantation. 28 (5), 493-500 (2009).
- Ruzza, A., et al. Heterotopic heart transplantation in rats: improved anesthetic and surgical technique. Transplantation Proceedings. 42 (9), 3828-3832 (2010).
- Wang, D., et al. A simplified technique for heart transplantation in rats: abdominal vessel branch-sparing and modified venotomy. Microsurgery. 26 (6), 470-472 (2006).
- Wang, C., et al. A modified method for heterotopic mouse heart transplantion. Journal of Visualized Experiments. (88), (2014).
- Al-Amran, F. G., Shahkolahi, M. M. Total arterial anastomosis heterotopic heart transplantation model. Transplantation Proceedings. 45 (2), 625-629 (2013).
- Hoerstrup, S. P., et al. Modified technique for heterotopic rat heart transplantation under cardioplegic arrest. Journal of Investigative Surgery. 13 (2), 73-77 (2000).
- Fry, D. L. Acute vascular endothelial changes associated with increased blood velocity gradients. Circulation Research. 22 (2), 165-197 (1968).
- Ahmadi, A. R., et al. Orthotopic Rat Kidney Transplantation: A Novel and Simplified Surgical Approach. Journal of Visualized Experiments. (147), (2019).
- Schmid, C., et al. Successful heterotopic heart transplantation in rat. Microsurgery. 15 (4), 279-281 (1994).
- Shan, J., et al. A modified technique for heterotopic heart transplantation in rats. Journal of Surgical Research. 164 (1), 155-161 (2010).
- Moris, D., et al.
- Bickerstaff, A. A., et al. Murine renal allografts: spontaneous acceptance is associated with regulated T cell-mediated immunity. Journal of Immunology. 167 (9), 4821-4827 (2001).
- Mottram, P. L., et al. Electrocardiographic monitoring of cardiac transplants in mice. Cardiovascular Research. 22 (5), 315-321 (1988).
- Torre-Amione, G., et al. Decreased expression of tumor necrosis factor-α in failing human myocardium after mechanical circulatory support: A potential mechanism for cardiac recovery. Circulation. 100 (11), 1189-1193 (1999).
- Goldstein, D. J., et al. Circulatory resuscitation with left ventricular assist device support reduces interleukins 6 and 8 levels. The Annals of Thoracic Surgery. 63 (4), 971-974 (1997).
- Tang-Quan, K. R., et al. Non-volume-loaded heart provides a more relevant heterotopic transplantation model. Transplant Immunology. 23 (1-2), 65-70 (2010).
- Lakhal-Naouar, I., et al. Transcutaneous immunization using SLA or rLACK skews the immune response towards a Th1 profile but fails to protect BALB/c mice against a Leishmania major challenge. Vaccine. 37 (3), 516-523 (2019).
- Sousa-Batista, A. J., et al. Novel and safe single-dose treatment of cutaneous leishmaniasis with implantable amphotericin B-loaded microparticles. International Journal for Parasitology: Drugs and Drug Resistance. , (2019).
