Summary
Aquí se presenta un protocolo para evaluar las propiedades contráctiles de los miofibriles musculares estriados con resolución nano-Newton. El protocolo emplea una configuración con una sonda de fuerza óptica basada en interferometría. Esta configuración genera datos con una alta relación señal-ruido y permite la evaluación de la cinética contráctil de myofibrils.
Abstract
Las células musculares estriadas son indispensables para la actividad de los seres humanos y los animales. Las fibras musculares individuales se componen de miofibrils, que consisten en sarcomeres ligados en serie, las unidades contráctiles más pequeñas en el músculo. La disfunción sarcomerica contribuye a la debilidad muscular en pacientes con mutaciones en genes que codifican para proteínas sarcoméricas. El estudio de la mecánica de myofibril permite la evaluación de las interacciones actin-miosina sin posibles efectos confusos de myofibriles dañados, adyacentes al medir la contractilidad de fibras musculares individuales. El daño ultraestructural y la desalineación de los myofibrils podrían contribuir a la contractilidad deteriorada. Si hay daños estructurales en los miofibrils, es probable que se rompan durante el procedimiento de aislamiento o durante el experimento. Además, los estudios en miofibrils proporcionan la evaluación de las interacciones actin-miosina en presencia de las limitaciones geométricas de los sarcomeres. Por ejemplo, las mediciones en miofibrils pueden dilucidar si la disfunción miofibrilar es el efecto principal de una mutación en una proteína sarcomérica. Además, la perfusión con soluciones de calcio o compuestos es casi instantánea debido al pequeño diámetro del myofibril. Esto hace que las miofibriles sean eminentemente adecuadas para medir las tasas de activación y relajación durante la producción de fuerza. El protocolo descrito en este artículo emplea una sonda de fuerza óptica basada en el principio de un interferómetro Fabry-Pérot capaz de medir fuerzas en el rango nano-Newton, acoplado a un motor de longitud piezoeléctrica y un sistema de perfusión de paso rápido. Esta configuración permite el estudio de la mecánica myofibril con mediciones de fuerza de alta resolución.
Introduction
Las células musculares estriadas son indispensables para las actividades de la vida diaria. El movimiento de las extremidades, la función respiratoria y el movimiento de bombeo del corazón dependen de la fuerza generada por las células musculares. El músculo esquelético consiste en fascículos musculares que contienen haces de fibras musculares individuales (Figura 1A). Estas fibras musculares se componen de miofibrils, que están formados por sarcomeres conectados en serie (Figura 1B,D). Los sarcomeres contienen filamentos delgados y gruesos. Estos consisten principalmente en cadenas de moléculas de actina y miosina, respectivamente (Figura 1B). Las interacciones actin-miosina son responsables de la capacidad de generación de fuerza del músculo. Los pacientes con mutaciones en genes que codifican proteínas sarcoméricas, como la neblina, la actina y la troponina T, sufren de debilidad muscular debido a la disfunción contráctil1.
La calidad de la contractilidad muscular se puede estudiar en varios niveles de organización, que van desde músculos enteros in vivo a interacciones actina-miosina en ensayos de motilidad in vitro. Durante las últimas décadas, varios grupos de investigación han desarrollado configuraciones para determinar la contractilidad de las miofibrils individuales2,3,4,5,6,7,8,9,10. Estas configuraciones se basan en la detección de cambios en la desviación láser de un voladizo (es decir, desviación de haz óptico) causada por la contracción del myofibril (para más detalles, véase Labuda et al.11). Aunque la determinación de la función contráctil de myofibrils tiene algunas limitaciones (por ejemplo, la dinámica de los procesos de acoplamiento de excitación-contracción que están aguas arriba de los miofibrils son faltantes), hay múltiples ventajas a este enfoque. Estos incluyen: 1) la capacidad de evaluar las interacciones actin-miosina en presencia de las limitaciones geométricas de los sarcomeres; 2) la capacidad de evaluar las interacciones entre la actina y la miosina sin posibles efectos confusos de los miofibriles adyacentes dañados (al medir la contractilidad de las fibras musculares individuales daño ultraestructural y la desalineación de myofibrils podría contribuir a la contractilidad deteriorada) (Figura 1D); 3) el pequeño diámetro de las miofibriles (1 m, Figura 2A)y la falta de membranas permiten la difusión casi instantánea del calcio en los sarcomeres. Además, si hay daños estructurales en los miofibrils, es probable que se rompan durante su aislamiento o durante el experimento. Por lo tanto, evaluar la contractilidad de myofibril es un método elegante para estudiar los mecanismos básicos de la contracción muscular y para entender si las interacciones alteradas actina-miosina son la causa principal de la enfermedad muscular causada por mutaciones en proteínas sarcoméricas.
Este protocolo presenta una nueva configuración para determinar la contractilidad de los myofibrils que incorporan una sonda de fuerza en voladizo con resolución nano-Newton (es decir, Optiforce). Esta sonda de fuerza se basa en el principio de interferometría. La interferometría permite el uso de voladizos relativamente rígidos. Esto hace posible medir la fuerza con poca desviación del voladizo, acercándose a las contracciones isométricas del miofibril. La sonda permite la evaluación de fuerzas pasivas y activas bajas producidas por un solo miofibril aislado de diferentes biopsias musculares, incluidas las de sujetos humanos, con una alta relación señal-ruido. La sonda de fuerza en voladizo óptico incorporada en esta configuración se basa en un interferómetro Fabry-Pérot12. El interferómetro detecta pequeños desplazamientos entre una fibra óptica y un voladizo recubierto de oro montado en una férula (Figura 3). La brecha entre la fibra óptica y el voladizo se llama la cavidad Fabry-Pérot. Las miofibrils se montan entre la sonda y el motor piezoeléctrico utilizando dos fibras de montaje de vidrio recubiertas de pegamento. La fuerza producida por el myofibril puede derivarse matemáticamente de los datos del interferómetro. La interferometría se basa en la superposición o interferencia de dos o más ondas (en esta configuración tres ondas de luz). La luz láser con una longitud de onda entre 1.528.77–1.563.85 nm se emite desde el interferómetro y se envía a través de la fibra óptica. En la sonda, la luz se refleja 1) en la interfaz entre la fibra óptica y el medio (Figura 3A); 2) en la interfaz del medio y el voladizo (Figura 3B); y 3) en la interfaz entre el revestimiento metálico y dorado del voladizo(Figura 3C). La reflexión en la interfaz A y B depende del índice de refracción (n) del medio en el que se sumerge la sonda. La luz, que consta de los tres reflejos superpuestos, vuelve a un fotodiodo en el interferómetro. El fotodiodo mide la intensidad de la luz, que es el resultado del patrón de interferencia de los tres reflejos superpuestos. Cuando la fuerza contráctil se genera activando o estirando un miofibril, el miofibril tira del voladizo. Este movimiento cambia el tamaño de la cavidad (d) y, en consecuencia, el número de longitudes de onda que caben en la cavidad. La luz reflejada en el voladizo tendrá una fase diferente, lo que resulta en un patrón de interferencia diferente. El fotodiodo registra este cambio de la intensidad del patrón de interferencia como un cambio en Voltios. Posteriormente, la generación de la fuerza miofibril se calcula a partir de este cambio, teniendo en cuenta la rigidez en voladizo. La sonda de fuerza es calibrada por el fabricante empujando la punta de la aguja de montaje, unida al extremo de entrega libre del voladizo, contra una báscula de pesaje manteniendo la flexión del voladizo igual a un múltiplo de la longitud de onda del láser de lectura13. Por lo tanto, la interferometría es un método altamente sensible para detectar pequeños cambios en la distancia, lo que permite medir las fuerzas con resolución nano-Newton. Esta resolución permite evaluar la producción de fuerza miofibrilar con una alta relación señal-ruido. Mientras que la interferometría tradicional limita el rango de mediciones a la parte lineal de la curva de interferencia, el uso de un amplificador de bloqueo y la modulación de la longitud de onda láser supera esta limitación14. Esto se explica con más detalle en la sección de discusión.
Para medir la tensión activa de myofibril, se incorporó un sistema de perfusión de paso rápido para exponer el myofibril a soluciones de calcio (Figura 4A). El sistema de perfusión de paso rápido permite que se produzcan cambios en la solución en un plazo de 10 ms. Debido a su pequeño diámetro, la difusión de calcio en los miofibrils es casi instantánea. Por lo tanto, este sistema es particularmente adecuado para medir las tasas de unión actin-miosina durante la activación y liberación durante la relajación. La velocidad de activación (kACT) y la relajación (kREL) se pueden determinar a partir de las curvas de activación-relajación. Además, al exponer los miofibrils a soluciones de calcio de concentración creciente, se puede determinar la relación fuerza-calcio y la sensibilidad al calcio.
Además, un motor de longitud piezoeléctrica permite un rápido estiramiento y acortamiento del myofibril. Esto ofrece la posibilidad de estudiar las propiedades viscoelásticas (es decir, la tensión pasiva) del myofibril, así como realizar un rápido acortamiento y desarme de la miofibril para determinar la tasa de reurbanización de tensión (kTR). Los parámetros recuperados de experimentos de tensión activa y pasiva pueden ser alterados por mutaciones genéticas en una proteína sarcomerica.
Esta configuración personalizada se utilizó para medir las características contráctiles activas y pasivas de los myofibrils aislados del músculo esquelético humano, paciente y ratón sano.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
El protocolo para la obtención de biopsias humanas fue aprobado por la junta de revisión institucional del Centro Médico de la Universidad VU (#2014/396) y se obtuvo el consentimiento informado por escrito de los sujetos. El protocolo para la obtención de biopsias musculares animales fue aprobado por el comité local de ética animal de la Universidad VU (AVD114002016501)
1. Preparación y aislamiento miofibril
NOTA: Utilice métodos previamente descritos para glicerinas, preparar las diferentes soluciones de concentración de calcio (pCa)7,16,17, y aislar myofibrils2,18.
- Descongelar las soluciones relajantes (pCa 9.0, Rx) y activación (pCa 4.5, Act), así como los inhibidores (1 M E64, 1 M TDT, 1 M leupeptina, 1 M PMSF), que se almacenan a -80 oC.
- Tome una pieza glicerinada de biopsia muscular estriada de aproximadamente 1 mm3 y colóquela en una pequeña placa Petri con 1:1 solución Rx/glicerol (v/v) y coloque el plato Petri en una placa fría a 4 oC.
- Disecciona la pieza del músculo usando microscopio de disección y fórceps, separando fibras musculares individuales sin aislarlas de la pieza de músculo.
NOTA: Retire tanto tejido graso y conectivo como sea posible para evitar la contaminación de la suspensión de myofibril. - Transfiera la pieza de tejido diseccionado a un tubo de 5 ml con 1,5 ml de solución relajante con inhibidores (1 l/ml de E-64, leupeptina de 1 l/ml, TDT de 1 l/ml y PMSF de 125 l/ml). Deje que el tejido se atempere aproximadamente a 4 oC durante 1 h.
- Durante la incubación, arranque ambos PC, encienda los dispositivos y abra el software asociado (consulte Tabla de materiales).
- Sumerja la sonda de fuerza en agua ultrapura en un plato Petri y calibrar la sonda.
- Pulse el 'Asistente de inicio' en el interferómetro y siga las instrucciones en pantalla. Después de pulsar Calibrar, toque en la etapa del microscopio.
NOTA: Al tocar en la etapa del microscopio, el voladizo se desviará y pasará a través de los flecos. Esto permite la calibración de la sonda. - Deje la sonda sumergida en el agua ultrapura en el plato Petri después de la calibración.
- Pulse el 'Asistente de inicio' en el interferómetro y siga las instrucciones en pantalla. Después de pulsar Calibrar, toque en la etapa del microscopio.
- Inicializar la posición del motor piezoeléctrico. Para ello, siga uno de los pasos que se detallan a continuación.
- Cuando el motor piezoeléctrico se utilice para la tensión kTR, ajuste la longitud a 0 m.
La configuración del generador de señales se puede encontrar en la Tabla 1, Figura 5A. - Cuando el motor piezoeléctrico se utilice para la tensión pasiva, ajuste la longitud a 50 m.
La configuración del generador de señales se puede encontrar en la Tabla 1.
NOTA: La diferencia entre los pasos es la posición inicial del motor de longitud piezoeléctrica. Para estirar el miofibril, el motor piezoeléctrico necesita tirar para aumentar la distancia entre ambas agujas de montaje y alargar el myofibril. Para aflojar el myofibril, el motor piezoeléctrico necesita empujar para disminuir la distancia entre ambas agujas de montaje y acortar el myofibril.
- Cuando el motor piezoeléctrico se utilice para la tensión kTR, ajuste la longitud a 0 m.
- Prepare una diapositiva del microscopio. Pipetear 150 l de solución de polihidroxietitilmetacrilato (poli-HEMA) (5% poli-HEMA en 95% etanol, p/v) en un portaobjetos y extenderlo a través de la diapositiva para que esté todo cubierto.
NOTA: Si una suspensión myofibril se canaliza en un portaobjetos de microscopio sin recubrimiento, las myofibrils que se hunden en la parte inferior se pegarán a la diapositiva del microscopio y no será posible pegarlos. - Llene las jeringas con soluciones pCa (ver Figura 4A)y retire el sistema de perfusión.
NOTA: En estos pasos, todos los tubos se rellenan previamente con la solución adecuada para asegurarse de que todas las burbujas de aire se eliminan de la tubería.- Llene el tubo de entrada del flujo de fondo de la cámara de flujo (Figura 3, 4A) con Rx.
- Cuando se utilice, enjuague el colector con agua ultrapura para eliminar el aire. Para ello, conecte la jeringa con agua ultrapura a la salida y enjuague en ella en la dirección inversa. Bloquee los puertos no utilizados del colector.
- Permita que cada jeringa pCa llene sus respectivos tubos con solución pCa. A continuación, conéctelos al colector y al Ɵ cristal.
- Abra las válvulas 1 y 6 con el software del panel de adquisición de datos (consulte Tabla de materiales) marcando el botón '1+6' (Figura 6A) para llenar el Ɵ-vidrio con las soluciones relajantes (pCa 9.0) y activación (4.5) y cierre las válvulas cuando se llena el Ɵ vidrio (Figura 6B).
2. Montaje de un myofibril
- Recubrir un portaobjetos con poli-HEMA para evitar que los myofibrils se peguen al vidrio.
- Preparar el homogeneizador (ver Tabla de Materiales) para la homogeneización del tejido. Limpie la varilla interna del rotor con papel tisú limpio, ensamble el homogeneizador y gire 1x durante 15 s en alcohol y tres veces durante 15 s cada uno en agua ultrapura. Enjuague el homogeneizador en solución relajante 1 x para 15 s sobre hielo.
- Coloque la varilla homogeneizadora en el tubo que contiene el tejido muscular como se describe en el paso 1.4 y, mientras mantiene el tubo sobre hielo, gire el rotor durante 15 s a la velocidad 5 para desgarrar el tejido muscular y obtener una suspensión myofibril.
- Pipetear 50 l de la suspensión de myofibril y 250 ml de la solución relajante en el portaobjetos del microscopio recubierto con poli-HEMA en el baño de tejido. Esto formará una gota líquida. Cubra el baño con una tapa para protegerse del polvo y espere de 5 a 10 minutos para permitir que las miofiblas se hundan hasta el fondo.
NOTA: La relación entre la suspensión y la solución relajante depende de la calidad del aislamiento, por lo tanto, ajustar en consecuencia. Por ejemplo, si el rendimiento de myofibril es bajo y hay pocos miofibriles adecuados en la suspensión, agregue más suspensión de myofibril y diluya con una solución menos relajante (p. ej., 75 l de suspensión de myofibril y 225 l de solución relajante). El tejido muscular esquelético y del corazón es fácil de reconocer debido a su patrón de estriación. Usando un objetivo de 10x o 40x, este patrón también es visible en un solo myofibril. En caso de que haya otro tejido en la suspensión, los myofibrils se pueden seleccionar visualmente. Uno puede saltarse la espera de 5-10 minutos. Sin embargo, Esto aumenta la dificultad de pegar un myofibril. - Agujas de montaje de abrigo con pegamento (shellac + etanol; 120 mg de shellac en 2 ml de 70% de etanol). Para ello, calienta el pegamento a 65oC durante 30–60 s y pipetea a 6 l en un nuevo portaobjetos de vidrio sin recubrimiento. Sumerja la punta de cada aguja de montaje en el pegamento y repita hasta que una capa de pegamento sea visible. Mueva la sonda y el piezo hacia arriba verticalmente con los micromanipuladores para hacer espacio para colocar el baño de tejido en la etapa del microscopio. Retire la corredera de vidrio que contiene el pegamento.
- Montaje de las miofibrils
- Coloque el baño de tejido con el portaobjetos del microscopio recubierto con poli-HEMA que contiene la suspensión miofibril en la etapa del microscopio. Utilice el escenario para encontrar un myofibril adecuado con el objetivo 40x. Si es necesario, mueva y gire el baño de tejido para mover el myofibril a una posición montable.
NOTA: Busque myofibrils con un patrón de estriación visible de aproximadamente 30 m de largo. Como se describe en detalle en los pasos 3.1 y 3.2.1 es posible comprobar la longitud y la longitud de los sarcomos antes de pegar el myofibril. No pegue los miofibriles rotos, porque es probable que se rompan durante la contracción. - Deslice la cámara de flujo en su lugar directamente por encima de la gota de líquido que contiene las miofibrinas en el baño de tejido (entubado en el portaobjetos en el paso 2.4) y tíquela. Deténgase antes de que golpee la gota líquida.
- Baje la aguja de montaje piezoeléctrica y presiónelo en la punta inferior del myofibril. Levante ligeramente para comprobar si el myofibril está unido a la aguja.
- Baje la cámara de flujo lo suficientemente lejos como para que la aguja de montaje de la sonda llegue a la parte inferior sin que la sonda toque la cámara de flujo.
- Presione la aguja de montaje de la sonda en la punta superior del myofibril. Levante ligeramente para comprobar si el myofibril está unido a la aguja.
- Levante el myofibril desde la parte inferior del baño en la medida de lo posible sin perder la capacidad de enfocar sin que el objetivo toque la parte inferior del vidrio.
- Coloque el baño de tejido con el portaobjetos del microscopio recubierto con poli-HEMA que contiene la suspensión miofibril en la etapa del microscopio. Utilice el escenario para encontrar un myofibril adecuado con el objetivo 40x. Si es necesario, mueva y gire el baño de tejido para mover el myofibril a una posición montable.
3. Inicialización del experimento
- Utilice los micromanipuladores, la cámara y el software del controlador del sistema (Figura 7A, consulte Tabla de materiales) para medir la longitud de los sarcomeres. Mueva el piezo y/o la sonda de fuerza para ajustar la longitud inicial de la sarcomere del myofibril a 2,5 m.
NOTA: Una longitud de sarcomere de 2,5 m garantiza una superposición óptima entre los cabezales de miosina y la actina. - Utilizando la función de recipiente del software del controlador del sistema, mida la longitud y la anchura del myofibril(Figura 7B,C).
NOTA: Al girar la cámara, puede inclinarse horizontal y/o verticalmente. Para comprobar la alineación de la cámara, se puede utilizar un nivel de espíritu para verificar que la cámara está girada y no inclinada.- Coloque el myofibril en el centro de la imagen de vídeo utilizando la etapa del microscopio.
- Dibuja un cuadrado de un lado del miofibril al otro. Para la longitud, asegúrese de incluir el borde oscuro de las gotas de pegamento (Figura 2A) en el cuadrado porque el procesamiento de la imagen se basa en el contraste.
- Comience a grabar los datos en el software del controlador del sistema (consulte Tabla de materiales) pulsando 'Inicio' y después de 5 s pausar la grabación de datos del software del controlador del sistema pulsando el botón 'Pausa'. La longitud ahora se registra en los datos.
- Para la anchura, gire primero la cámara 90o (consulte Tabla de materiales)y, a continuación, utilice el contraste del borde del propio myofibril.
- Comience a grabar los datos en el software del controlador del sistema (consulte Tabla de materiales) pulsando'Iniciar'y después de 5 s pausar la grabación de datos del software del controlador del sistema pulsando el botón'Pausa'. El ancho ahora se registra en los datos.
- Si es necesario determinar la tensión activa del miofibril, es necesario utilizar la configuración de perfusión. Si es así, continúe con el paso 3.4. Si solo se determina la tensión pasiva, omita los pasos 3.4–4.1.3.7 y continúe en el paso 4.2.
- Coloque e inicialice la configuración de perfusión.
NOTA: Esto sólo es necesario para la generación de fuerza activa. Continúe con el paso 4.2 al realizar experimentos de tensión pasiva.- Ajuste la posición del motor de paso rápido a 4 V(Figura 5B).
- Deslice el soporte de perfusión sobre la mesa para alinear la esquina inferior izquierda del soporte con la cinta en la mesa.
NOTA: Tenga cuidado de no golpear la sonda de fuerza o el motor piezoeléctrico. - Utilice el manipulador para colocar aproximadamente el Ɵ vidrio por ojo.
- Mira a través del ocular y mueve cuidadosamente el vidrio de Ɵ hacia el myofibril usando el manipulador.
- Alinee el canal superior del Ɵ vidrio con el myofibril utilizando el manipulador y compruebe la posición realizando un paso rápido (la configuración del generador de señales se puede encontrar en la Tabla 1) con el software del controlador del sistema (Figura 2B–C, ver Tabla de materiales).
NOTA: Asegúrese de que el canal inferior se alineará con el myofibril durante la fase de activación del paso rápido (Figura 2B–C).
- Active el flujo de fondo de Rx (Figura 4A) para crear un flujo de fondo laminar en la cámara de flujo.
NOTA: El flujo de fondo es necesario para evitar el flujo turbulento como resultado del flujo de solución pCa desde el vidrio Ɵ.- Encienda la cámara de flujo con una palanca de válvula Luer.
- Envíe los siguientes parámetros a la bomba de salida para empezar a drenar la cámara de flujo y evitar el desbordamiento de la cámara de flujo (Figura 9): Válvula de baño (2); Modo de micropaso - Micro; Objetivo de émbolo: 48.000; Velocidad del émbolo 38–40 (arbitrario).
NOTA: Asegúrese de que el nivel de fluido es estable en todo momento. El myofibril no debe secarse y tampoco debe el voladizo. Es mejor tener un poco de desbordamiento que un flujo demasiado pequeño.
- Envíe los siguientes parámetros a la bomba de salida para empezar a drenar la cámara de flujo y evitar el desbordamiento de la cámara de flujo (Figura 9): Válvula de baño (2); Modo de micropaso - Micro; Objetivo de émbolo: 48.000; Velocidad del émbolo 38–40 (arbitrario).
- Encienda la cámara de flujo con una palanca de válvula Luer.
- Para ajustar la temperatura a un valor deseado con el controlador de temperatura termoeléctrico (Figura 8, ver Tabla de materiales), introduzca la temperatura deseada y pulse 'Iniciar'. Espere hasta que se alcance la temperatura deseada comprobando el gráfico en el software del controlador de temperatura termoeléctrico y continúe.
NOTA: Al realizar experimentos a temperatura ambiente, no es necesario utilizar el controlador de temperatura termoeléctrico.
4. Protocolo(s) experimental(es)
- Decida qué protocolos de fuerza activa deben realizarse.
NOTA: Dependiendo de los datos necesarios para el estudio, se pueden realizar varios tipos de experimentos de fuerza activa: paso 4.1.1, medición de la fuerza máxima en saturación [Ca2+]; paso 4.1.2, obteniendo una curva Force-pCa para determinar la sensibilidad al calcio además del paso 4.1.1; paso 4.1.3, determinar la tasa de reurbanización de tensión mediante un protocolo de acortamiento-restretch además de los pasos 4.1.1 o 4.1.2.- Mida la fuerza activa máxima.
- Comience a registrar los datos en el software del controlador del sistema (consulte Tabla de materiales) pulsando 'Iniciar'.
- Abra las válvulas 1 y 6 con el software del panel de adquisición de datos (ver Tabla de materiales) marcando el botón '1+6' para iniciar el flujo de vidrio Ɵ de la solución relajante y activando la solución a través del Ɵ-vidrio (Figura 6A).
- Restablezca el rango del interferómetro de modo que la fuerza de línea base sea 0 V seleccionando y presionando 'Reset Range' en el interferómetro (consulte Tabla de materiales).
- Cuando la traza de fuerza es estable, realice el paso rápido de Ɵ vidrio (tamaño de paso de 100 m).
La configuración del generador de señales se puede encontrar en la Tabla 1 (Figura 5C). Se registrará un seguimiento de activación-relajación similar a la Figura 4D y será visible en el software del controlador del sistema. - Detenga la grabación de datos del software del controlador del sistema pulsando el botón 'Pausa'.
- Si no se van a realizar más activaciones, cierre las válvulas 1 y 6 para detener el flujo de vidrio Ɵ desmarcando el botón '1+6' (Figura 6B), detenga la bomba de la jeringa (Figura 9, consulte Tabla de materiales) pulsando 'Terminar', y detenga el flujo de fondo cerrando la válvula Luer.
- Curva Force-pCa
NOTA: Esto es similar al paso 4.1.1 para obtener la fuerza activa máxima, pero con múltiples activaciones utilizando diferentes soluciones pCa.- Inicie la grabación de los datos en el software del controlador del sistema pulsando'Iniciar'.
- Abra las válvulas 1 y 2 con el software del panel de adquisición de datos para iniciar el flujo de solución relajante y pCa 6.2 a través del vidrio Ɵ.
- Restablecer el rango del interferómetro de modo que la fuerza de línea base sea 0 V seleccionando y presionando 'Reset Range' en el interferómetro.
- Cuando la traza de fuerza es estable, realice el paso rápido de Ɵ vidrio (tamaño de paso de 100 m).
La configuración del generador de señales se puede encontrar en la Tabla 1. - Detenga el software del controlador del sistema pulsando el botón'Pausa'.
- Repita los pasos 4.1.2.1–4.1.2.4 para las válvulas 1 y 3 (pCa 5.8), las válvulas 1 y 4 (pCa 5.6), las válvulas 1 y 5 (pCa 5.4) y las válvulas 1 y 6 (pCa 4.5).
- Si no se van a realizar más activaciones, cierre las válvulas 1 y 6 para detener Ɵ flujo de vidrio desmarcando el botón '1+6' (Figura 6A), detenga la bomba de la jeringa (Figura 9) pulsando 'Terminar', y detenga el flujo de fondo cerrando la válvula Luer.
- Medir la tasa de reurbanización de tensión (kTR).
NOTA: Esto es similar al paso 4.1.1 para la fuerza activa máxima, pero con algunos cambios y pasos añadidos.- Calcular el movimiento piezoeléctrico necesario para aflojar el miofibril 15% e introducir este valor en el generador de señal (Figura 5D, Tabla 1).
- Comience a grabar los datos en el software del controlador del sistema pulsando 'Iniciar'.
- Abra las válvulas 1 y 6 con el software del panel de adquisición de datos (Figura 6A) para iniciar el flujo de la solución relajante y pCa 4.5 a través del vidrio Ɵ.
- Restablecer el rango del interferómetro de modo que la fuerza de línea base sea 0 V seleccionando y presionando 'Reset Range' en el interferómetro.
- Cuando la traza de fuerza es estable, realice el paso rápido de Ɵ vidrio (tamaño de paso de 100 m).
La configuración del generador de señales se puede encontrar en la Tabla 1. - Cuando se alcance la meseta de fuerza, realice el acortamiento-restretch con el piezo.
La configuración del generador de señales se puede encontrar en (Figura 5D, Tabla 1). Se registrará un seguimiento de activación-relajación similar a la Figura 4E y será visible en el software del controlador del sistema.
NOTA: Se puede hacer un protocolo personalizado para automatizar los pasos anteriores. - Detenga el software del controlador del sistema pulsando el botón'Pausa'.
- Si no se van a realizar más activaciones, cierre las válvulas 1 y 6 para detener Ɵ flujo de vidrio desmarcando el botón '1+6' (Figura 6B), detenga la bomba de la jeringa (Figura 9) pulsando 'Terminar', y detenga el flujo de fondo cerrando la válvula Luer.
- Mida la fuerza activa máxima.
- Realice mediciones de fuerza pasivas.
- Realice un estiramiento continuo.
- Calcular el movimiento piezoeléctrico necesario para estirar el myofibril e introducir este valor en el generador de señal (Tabla 1).
NOTA: Estos son ajustes de ejemplo. Calcular la cantidad de estiramiento y el tiempo de estiramiento en relación con la longitud de la sarcomere. Estos ajustes son necesarios para garantizar que la velocidad de estiramiento por sarcomere sigue siendo igual a través de myofibrils. - Comience a grabar los datos en el software del controlador del sistema pulsando 'Iniciar'.
- Restablecer el rango del interferómetro de modo que la fuerza de línea base sea 0 V seleccionando y presionando 'Reset Range' en el interferómetro.
- Realice un estiramiento continuo con el generador de señal en el software del controlador del sistema para operar el piezo. Ejemplo de configuración del generador de señal se puede encontrar en la Tabla 1.
- Acortar el myofibril a la longitud holgada con el piezo después de que el estiramiento haya terminado (Tabla 1).
- Calcular el movimiento piezoeléctrico necesario para estirar el myofibril e introducir este valor en el generador de señal (Tabla 1).
- Realice un estiramiento escalonado.
- Comience a grabar los datos en el software del controlador del sistema pulsando 'Iniciar'.
- Restablecer el rango del interferómetro de modo que la fuerza de línea base sea 0 V seleccionando y presionando 'Reset Range' en el interferómetro.
- Realice un estiramiento escalonado con el generador de señal en el software del controlador del sistema para operar el piezo. Ejemplo de configuración del generador de señal se puede encontrar en la Tabla 1 (Figura 5E).
- Acortar el myofibril a la longitud holgada con el piezo después de que el estiramiento está terminado. Ejemplo de configuración del generador de señal se puede encontrar en la Tabla 1.
- Realice un estiramiento continuo.
- Detenga el software del controlador del sistema pulsando el botón'Pausa'.
- Detenga la grabación de datos pulsando el botón 'Stop'en el software del controlador del sistema.
- Guarde los datos pulsando 'Archivo' y 'Guardar datos' en el software del controlador del sistema.
5. Limpieza
- Retire el miofibril medido y prepárese para el próximo miofibril.
- Para ello, desgarre cuidadosamente el myofibril mientras mira a través del ocular con el objetivo 40x.
- Sube la sonda de fuerza y el piezo. Sube el cristal Ɵ hasta arriba, a la derecha y a la parte posterior. A continuación, muévase hacia arriba y deslice la cámara de flujo. Retire el baño de tejido.
- Para limpiar la aguja de montaje, enfójela con el 10x y el ocular. Sumerja el cepillo en etanol y cepille cuidadosamente y retire el pegamento de la aguja.
NOTA: Tenga en cuenta que puede tomar algún tiempo antes de que el pegamento se despete. - Enjuague la cámara de flujo y el baño de tejido con agua ultrapura.
- Coloque la sonda en un plato pequeño de Petri lleno de agua ultrapura. Asegúrese de que la sonda esté completamente sumergida.
- Cuando finalicen los experimentos, limpie la configuración como se indica anteriormente y realice los siguientes pasos adicionales.
- Vacíe el tubo del baño de flujo. Envíe los parámetros a la bomba de la jeringa de salida (ver Tabla de materiales, Figura 9). Válvula - Válvula de baño (2); Modo de micropaso: Normal; Objetivo del émbolo: 0; Velocidad del émbolo 30.
NOTA: Termine el comando cuando el tubo esté vacío. - Inicializar la bomba varias veces(Figura 9B).
- Escurra las jeringas. Para ello, cierre todas las válvulas Luer, abra todas las válvulas, retire el tubo de la aguja de la jeringa, sostenga el tubo de pCa específico debajo de la aguja y abra la válvula Luer. Utilice los tapones de presión para acelerar el proceso.
- Vuelva a colocar el tubo en la aguja de la jeringa. Llene las jeringas con 5 ml de agua ultrapura. Coloque una taza debajo del Ɵ de cristal. Abra todas las válvulas y abra la válvula de presión para vaciar el sistema.
- Apague el sistema. Apague el PC, el interferómetro y el bloque de alimentación del controlador piezoeléctrico.
- Vacíe el tubo del baño de flujo. Envíe los parámetros a la bomba de la jeringa de salida (ver Tabla de materiales, Figura 9). Válvula - Válvula de baño (2); Modo de micropaso: Normal; Objetivo del émbolo: 0; Velocidad del émbolo 30.
6. Análisis de datos
- Exporte trazas de datos desde el software del controlador del sistema (consulte Tabla de materiales) a un programa de software de hoja de cálculo o portapapeles abriendo el archivo de datos y seleccionando el segmento deseado. Los rastros mostrados se exportarán (por ejemplo, fuerza bruta, longitud de sarcomere y posición piezoeléctrica).
- Realice análisis con el software de su elección (por ejemplo, MATLAB).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Los seguimientos de datos se registraron y se abrieron con el software del controlador del sistema (consulte Tabla de materiales). Las trazas completas o los segmentos seleccionados se exportaron al portapapeles o al archivo de texto para su posterior análisis con el software deseado. Las válvulas para controlar el flujo de las diferentes soluciones se cambiaron con software personalizado o manualmente. Se utilizó un script MATLAB personalizado para analizar las tasas de activación, reurbanización de tensión y relajación. La fuerza activa máxima y el pico y la fuerza de meseta de los experimentos de fuerza pasiva se tomaron directamente de la traza de fuerza de software del controlador del sistema. Después de montar un myofibril (Figura 2), se seleccionó el protocolo deseado.
Máxima fuerza activa y calcio- sensibilidad de la fuerza enmyofibrils aislados de biopsias de ratón y músculo esquelético humano
En la Figura 4A, la configuración experimental utilizada para los experimentos de fuerza activa se representa esquemáticamente. Se muestran trazas de fuerza de un experimento de fuerza activa con un miofibril aislado del músculo de cuádriceps humanos sanos. El myofibril se activó 5 veces con soluciones con diferentes pCa (pCa 6.2, 5.8, 5.6, 5.4, 4.5; datos mostrados en la Figura 4B). La fuerza máxima media de todos los miofibrils en este experimento fue de 123 mN/mm2. Se construyó una curva de fuerza-pCa a partir de las fuerzas de la meseta alcanzadas durante cada activación en cada una de las cinco soluciones de calcio. Los resultados se muestran en la Figura 4C. A partir de esta curva se calculó la pCa al 50% de la producción máxima de fuerza (pCa50). En este miofibril, el pCa50 era 5.75.
Además, uno o varios compuestos podrían añadirse a la solución perfundida para medir su efecto sobre la fuerza producida por el myofibril. En la Figura 4D, se ilustra el efecto de la sulfonamida de N-benzyl-p-tolueno (BTS), un inhibidor de la cadena pesada de miosina de tipo II (MHCII) de músculo de contracción rápida (tipo II). 19 Un myofibril se activó primero con una solución pCa 5.6, y posteriormente con una solución pCa 5.6 + BTS. Durante la segunda activación se produjo menos fuerza, lo que indica que se trataba de un miofibril que contenía MHCII. Hay mutaciones en proteínas que están presentes exclusivamente en tipos de músculo específicos, y por lo tanto sólo afectan a las miofibrils de ese tipo muscular específico. En ese caso, 'escribir' los miofibrils es importante discernir el efecto de mutación en los diversos tipos de músculo. Además, este ejemplo ilustra la posibilidad de probar la eficacia de los compuestos terapéuticos en myofibrils.
La Figura 4E muestra un rastro de fuerza activa de un solo miofibril aislado del tejido muscular del soleus esquelético del ratón. El myofibril se montó en la configuración y se perfundió con solución relajante (pCa 9.0), seguido de perfusión con solución activador (pCa 4.5, 0,032 mM de calcio). Al mismo tiempo registramos la fuerza y la longitud de los sarcomeres. Se trataba de una contracción casi isométrica, ya que la desviación del voladizo era de 0,5 m, que era aproximadamente el 1% de la longitud floja del myofibril (50 m). En la Figura 4E se realizó un protocolo de acortamiento rápido-restretch durante la contracción activa para evaluar la tasa de reurbanización de tensión (kTR,línea amarilla discontinua). El kTR es una medida de cinética ciclista de puente cruzado. Además, se ajustaron las curvas de activación y relajación para determinar la velocidad de activación (kACT,línea discontinua roja) y la relajación (kREL,línea verde discontinua), respectivamente. La Figura 4 muestra una visión más detallada de la fase de relajación resaltada en la Figura 4F. Dos fases se hicieron evidentes: 1) una fase lenta inicial de relajación (dominada por el desprendimiento de puentes cruzados) y 2) una fase rápida de relajación (dominada por el desprendimiento de puentes cruzados y la disociación de calcio)20.
Fuerza pasiva en miofibrils aislados de una biopsia muscular esquelética humana
La Figura 10 muestra un rastro de un experimento de fuerza pasiva con un miofibril aislado del tejido muscular de diafragma humano sano. El primer protocolo implicaba uno o varios estiramientos pasivos para determinar las propiedades viscoelásticas de los sarcomeres. La Figura 10 muestra un rastro de fuerza de un tramo continuo de un miofibril (estiramiento de la longitud de la sarcomere 2.2–3.0 m). Durante el tramo, las miofibrils mostraban características viscosas y elásticas. Esto es evidente a partir de la curva que se muestra en la Figura 10A. El pico agudo representa ambas características, mientras que la fuerza de la meseta es una medida de elasticidad. La viscosidad resiste la tensión linealmente. Por lo tanto, la fuerza cayó después de que se retiró la cepa. La Figura 10B resalta el estiramiento en sí e ilustra la alta relación señal-ruido. Tenga en cuenta que los seguimientos de fuerza no se filtran.
Figura 1: Representación esquemática e imágenes de microscopía electrónica de un músculo esquelético y su morfología. (A) Muestra la estructura del músculo esquelético y (B) muestra la estructura de la sarcomere, la unidad contráctil más pequeña. Estas imágenes esquemáticas están adaptadas de Servier Medical Art. (C) Muestra una imagen de una sola fibra muscular y (D) muestra una imagen de microscopía electrónica de una fibra muscular que revela daño miofibrilar, así como una ultraestructura miofibrilar preservada. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Imágenes que muestran un myofibril montado, Ɵ de vidrio y aguja de montaje piezoeléctrico. (A) Un miofibril montado a una longitud holgada entre las agujas de fibra de vidrio recubiertas con shellac como se ve a través de un objetivo de 40x. (B) Imágenes de la posición del vidrio Ɵ en relación con el myofibril (resaltado con los óvalos blancos) visto a través de un objetivo de 10x. (Arriba) Alineado con el canal superior (solución relajante, pCa 9.0); (Abajo) Alineado con el canal inferior (solución activador, pCa 4.5) para perfumar el myofibril con calcio e inducir la contracción. (C) Representaciones esquemáticas de la posición del vidrio Ɵ en relación con el myofibril. (Arriba) Alineado con el canal superior (solución relajante, pCa 9.0); (Abajo) Alineado con el canal inferior (solución activador, pCa 4.5) para perfumar el myofibril con calcio e inducir la contracción. (D) Aguja de montaje unida a la varilla de carbono del soporte piezoeléctrico. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Representación esquemática de la configuración y parte final de la cámara de flujo de tejido. En azul oscuro la cámara de flujo de tejido hecha de aluminio, y en blanco la cavidad en la que la sonda de fuerza y Ɵ vidrio se muestran en su posición; (Centro) Myofibril unido entre dos agujas de montaje de fibra de vidrio unidas a la sonda de fuerza y el motor de longitud piezoeléctrica. El vidrio de Ɵ está alineado con el myofibril. El vidrio Ɵ puede moverse hacia arriba y hacia abajo para exponer el myofibril a la solución de calcio. (Derecha) Primer plano de la sonda de fuerza en voladizo. Se indican el tamaño de la cavidad (o cavidad Fabry-Pérot, d); interfaces de reflexión A, B y C; y un ejemplo de una onda de luz emitida por el láser (rojo). El voladizo está montado en el hombro de la férula. La fibra que lleva el láser del interferómetro sale de la férula en la punta del voladizo. Una fibra de montaje de vidrio se fija en el voladizo usando cera. (Arriba a la izquierda) El interferómetro analiza la señal de interferómetro transmitida al software del controlador del sistema. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Configuración experimental y datos de experimentos de tensión activos. (A) Representación esquemática de la configuración de perfusión y las soluciones utilizadas. Tenga en cuenta que el primer y el último tubo (azul claro) contienen solución libre de calcio (es decir, solución relajante). (B) Ejemplo de la fuerza trazas de un experimento de tensión activa con un myofibril aislado del tejido muscular esquelético humano que muestra cinco activaciones desde la solución relajante (pCa 9.0) hasta múltiples soluciones de activación (pCa 6.2 – 4.5). (C) Una curva fuerza-calcio; los niveles de fuerza en las mesetas del panel (B) se normalizaron y se trazaron contra sus respectivos niveles de calcio. (D) Ejemplo de la fuerza traza de un tipo II (contracción rápida) myofibril aislado del músculo esquelético humano activado con solución pCa 5.6 (azul) y posteriormente con pCa 5.6 + BTS (un puente cross-inhibitor específico de tipo II, rojo). (E) Ejemplo de traza de datos de un experimento de tensión activa con myofibrils aislados del tejido muscular esquelético soleus del ratón con un protocolo de acortamiento rápido-restretch durante la activación para determinar la tasa de reurbanización de tensión (kTR,línea discontinua amarilla). Además, se ajustaron la curva de activación y relajación para determinar la velocidad de activación (kACT,línea roja discontinua) y la relajación (kREL,línea verde discontinua), respectivamente. (F) Un zoom de la fase de relajación (Arriba a la izquierda), resaltado en (E). La señal del motor de paso rápido (inferior izquierda) indicaba el punto de tiempo en el que la solución cambió de una solución de activación (pCa 4.5) a una solución relajante (pCa 9.0). La fase de relajación consistió en una fase lineal y lenta (arriba a la derecha) y una fase exponencial y rápida (abajo a la derecha). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Configuración de ejemplo para el generador de señal en el software de control del sistema. (véase Tabla de materiales). 1) Indica el botón para ejecutar los comandos introducidos en el generador de señal. (A) Configuración del motor de longitud piezoeléctrica. (B) Configuración del motor de paso rápido. (C) Realizar un paso rápido para activar un myofibril durante una duración de 5 s. (D) Realizar un rápido acortamiento-restretch de un myofibril para determinar el kTR. (E) Realizar un tramo escalonado de un myofibril para determinar las propiedades viscoelásticas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: Software del controlador de válvulas tal como se utiliza en el PC. (A) El botón utilizado para abrir las válvulas 1 (Rx) y 6 (Ley). (B) El estado de los botones cuando todas las válvulas están cerradas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 7: Medición de la longitud del sarcomere, la longitud de myofibril y la anchura de myofibril con el software del controlador del sistema. Una regla se utiliza como ejemplo. (A) Medición de la longitud de la sarcomere: la caja púrpura se coloca alrededor del myofibril y la longitud de la sarcomere se muestra en (1). (B) Medición de la longitud: La caja cian se coloca de principio a fin del myofibril. (C) Anchura de medición: Después de girar la cámara 90o, la caja de cian se coloca de un lado del myofibril al otro. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 8: Software de controlador de temperatura termoeléctrico. (A) Establecer conexión con el controlador de temperatura termoeléctrico. (B) Expanda los ajustes de temperatura. (C) Ajuste la temperatura deseada, en este caso: 15 oC. (D) Encienda el controlador de temperatura termoeléctrico y envíe la tensión al módulo termoeléctrico Peltier. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 9: Ajustes de la bomba de salida de la jeringa. (A) Abra la conexión a la bomba pulsando (1). (B) Inicie la bomba con ajustes predefinidos pulsando (2). (C) Inicie el bombeo de salida ajustando los 'Comandos de válvula' a ' Válvula debaño' (2) e introduciendo el 'Parámetros del conjunto de comandos' como se muestra. Ejecute el comando pulsando (3). Los comandos se pueden terminar pulsando (4). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 10: Ejemplo de rastro de datos de un experimento de tensión pasiva con miofibriles aislados del tejido muscular esquelético humano. (A) Grabación de la fuerza (superior) y la longitud de la sarcomere (inferior) durante un protocolo de estiramiento y liberación. (B) Zoom de (A) que muestra la fuerza (superior) y la longitud de la sarcomere durante la fase de estiramiento del myofibril. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 11: Configuración experimental y datos de experimentos de preactivación de calcio cardiomiocitos. (A) Representación esquemática de la configuración de perfusión. Tenga en cuenta que el último tubo (azul claro) contiene solución libre de calcio (solución relajante). (B) Curvas superpuestas de activación de un cardiomiocitos sin preactivación de calcio (azul claro) y con (azul oscuro), con concentraciones de calcio de 1 nM y 80 nM, respectivamente. (C) Comparación de la preactivación del calcio en el tipo salvaje (WT) y los cardiomiocitos heterocigotos RBM20 (HET) aislados del ventrículo izquierdo de la rata. Esta cifra ha sido modificada de Najafi et al.21. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Paso | Dispositivo | Descripción | Forma | Inicial | ||||||||
| 1.7.1. | Piezoeléctrico | Tensión pasiva de inicialización | Fijo | 51,6 m | ||||||||
| 1.7.2. | Piezoeléctrico | Tensión activa de inicialización | Fijo | 0 m | ||||||||
| Paso | Dispositivo | Descripción | Forma | Inicial | Retraso | Representantes | Nivel | Retraso | Nivel | Retraso | ||
| 3.4.4. / 4.1.1.4. / 4.1.2.4. | Paso rápido | Prueba de la posición de ɵ vidrio / Activación de myofibril | Pulso | 4 V | 1 s | 1 x | 3 V | 5 s | 4 V | 1 s | ||
| 4.1.3.4. | Paso rápido | Activación de myofibril (incluye kTR) | Pulso | 4 V | 1 s | 1 x | 3 V | 10s | 4 V | 1 s | ||
| Paso | Dispositivo | Descripción | Forma | Inicial | Retraso | Representantes | Nivel de rampa | Duración de la rampa | Retraso | Nivel de rampa | Duración de la rampa | Retraso |
| 4.1.3.1. / 4.1.3.6. | Piezoeléctrico | Acortamiento-Restretch para kTR | Trapezoide | 0 m | 0.5 s | 1 x | 0 + 0,15 * L0 á __ m | 0.01 s | 0.01 s | 0 m | 0.01 s | 1 s |
| 4.2.1.1. / 4.2.1.4. | Piezoeléctrico | Continúa el estiramiento | Trapezoide | 51,6 m | 2 s | 1 x | 51.6 - 0.30 * L0 á __ m | 2 s | 0 s | 51.6 - 0.30 * L0 á __ m | 0 s | 1 s |
| 4.2.1.4. | Piezoeléctrico | Devolver myofibril a la longitud floja | Trapezoide | 1,6 m | 2 s | 1 x | 51,6 m | 5 s | 0 s | 51,6 m | 0 s | 1 s |
| 4.2.2.3. | Piezoeléctrico | Estiramiento escalonado | Trapezoide | 51,6 m | 2 s | 10 x | 51,6 - 5 m | 0.5 s | 10 s | 51,6 - 5 m | 0 s | 0 s |
| 4.2.3. | Piezoeléctrico | Devolver myofibril a la longitud floja | Trapezoide | 1,6 m | 2 s | 1 x | 51,6 m | 5 s | 0 s | 51,6 m | 0 s | 0 s |
Tabla 1: Tabla que describe los diversos ajustes del generador de señal utilizados en el software del controlador del sistema para operar el motor de longitud piezoeléctrica y el motor de paso rápido.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Descrito es un protocolo para evaluar la función contráctil de los miofibrils aislados de los tejidos musculares esqueléticos humanos o animales. La resolución de fuerza de esta configuración ha sido descrita anteriormente por Chavan et al.12. En resumen, está determinada por las fluctuaciones aleatorias de la longitud de la cavidad Fabry-Pérot formada entre la fibra de detección y el voladizo, que producen la parte dominante del ruido a la salida de la lectura (expresada en V) que, multiplicada por la sensibilidad de desviación (expresada en m/V) y por la constante de resorte del voladizo (expresado en N/m), proporciona el ruido de fuerza. Para nuestra configuración, el ruido cuadrado medio de la raíz (rms) en el aire a la salida de la lectura, muestreado en un 1.000 puntos de datos/s (muestra/s), es de aproximadamente 2 mV. Para una medición típica de myofibril, se utiliza una sonda de casquillo superior con una constante de resorte de 0,7 N/m (sensibilidad de desviación ∼300 nm/V). Este valor rms corresponde a una resolución de desviación en voladizo de 0,6 nm, lo que se traduce en una sensibilidad de fuerza de 0,37 nN. La sonda de fuerza se calibra empujando la punta de la aguja de montaje contra una báscula de pesaje mientras mantiene la flexión del voladizo igual a un múltiplo de la longitud de onda del láser de lectura13. Este método de calibración implica tanto la rigidez del voladizo y la aguja de montaje, así como las posibles variaciones en el par del voladizo y la aguja de montaje debido a la velocidad y magnitud de la contracción de myofibril. Actualmente, está disponible una configuración para evaluar la contractilidad de myofibril, que se basa en la detección de un láser desviado del voladizo, es decir, la desviación del haz óptico (1.700 A; resolución de fuerza de 1 nN). Este sistema fue desarrollado por Labuda et al. utilizando un periscopio óptico para guiar una luz láser hacia y lejos del voladizo en configuraciones restrictivas11. En este sistema, un myofibril se monta entre la fuerza atómica voladizo y una aguja de vidrio rígido. Una ventaja del sistema descrito aquí es la mayor sensibilidad a la fuerza y la relación señal-ruido. Además, en esta configuración, se pueden utilizar voladizos relativamente rígidos, lo que resulta en una pequeña desviación en voladizo cuando se aplica la fuerza miofibrilar. Esto es importante, ya que permite mediciones de fuerza a una longitud de sarcomere casi constante. Por último, en comparación con el sistema descrito por Labuda et al., el sistema aquí utiliza métodos similares o idénticos para controlar la temperatura, para inducir cambios de longitud en el miofibril, y para cambiar las soluciones de perfusión utilizando un motor de vidrio Ɵ y paso rápido. La ventaja del sistema descrito por Labuda et al. es que un cambio en la composición de la solución (entre voladizo y periscopio óptico) no afecta a la salida de la señal. En el sistema descrito aquí, la composición de la solución entre el voladizo y la fibra óptica debe permanecer constante. La solución a esta limitación se describe con más detalle a continuación.
Optimización
La sonda de fuerza óptica en combinación con el sistema de perfusión de paso rápido dio lugar a complicaciones. La diferencia en las propiedades ópticas entre las soluciones Ca2+ de baja y alta concentración interfiere con las mediciones de fuerza. Para evitar el flujo de fondo de la solución de alto calcio, se diseñó una cámara de flujo personalizada (Figura 3). Se induce un flujo de fondo constante de la solución libre de calcio de derecha a izquierda para mantener la solución constante entre la parte superior de la fibra óptica y el voladizo (Figura 3D).
Para controlar la temperatura, se monta un elemento Peltier con refrigeración líquida en la cámara de flujo. Esta cámara de flujo se desacopla térmicamente del microscopio al montarla en un adaptador de plástico. Con el elemento Peltier, controlado por un sistema TEC, es posible controlar la temperatura de la solución a lo largo del tiempo con una precisión de 0,1 oC. La temperatura es monitoreada por un sensor de temperatura montado en la cámara de flujo. La estabilidad de la temperatura es importante debido a la naturaleza del transductor de fuerza. El voladizo consiste en una tira de vidrio recubierta de oro, por lo que es efectivamente un termómetro. Por lo tanto, el voladizo se dobla con los cambios de temperatura.
La configuración utiliza un sistema de perfusión de paso rápido (consulte Tabla de materiales) para controlar el movimiento del Ɵ vidrio. Este sistema permite interruptores de perfusión en un radio de 10 ms. La combinación del método de control de temperatura y conmutación de soluciones hace que este sistema sea particularmente adecuado para medir la cinética de la contractilidad de la sarcomere (es decir, las tasas de desarrollo de la fuerza, la reurbanización de tensión y la relajación) en los miofibrils.
Inicialmente, la desventaja de usar interferometría era el pequeño rango utilizable debido a la necesidad de utilizar la parte lineal de la curva de interferencia (o/8, siendo la longitud de onda del láser). Sin embargo, las innovaciones recientes eliminaron esta necesidad al combinar la modulación de longitud de onda con un amplificador de bloqueo. Por lo tanto, el sistema no se limita a una sola parte lineal de la curva de interferencia. Esto permite la medición de la desviación infinita del voladizo14. Por lo tanto, el rango de lectura de desviación en voladizo de este sistema se agranda en gran medida en comparación con la interferometría tradicional. Además, las sondas de fuerza descritas son fáciles de reemplazar y hay muchos voladizos disponibles, con rigidezes que van desde 0.5 N/m hasta >20 N/m. Por lo tanto, es posible cambiar rápidamente entre voladizos y seleccionar la rigidez más adecuada para el experimento realizado.
Desafíos
El sistema actual es un prototipo basado en un sistema de medición de cardiomiocitos (ver Tabla de Materiales). Se pueden mejorar varios componentes para proporcionar una mejor experiencia de usuario y datos de mayor calidad. En primer lugar, debido a los complementos al sistema, la vibración y la resonancia pueden ser un problema que añadirá ruido a la señal. Además, el soporte de vidrio Ɵ y el método de fijación del motor de paso rápido podrían mejorarse para hacerlo menos propenso a las vibraciones.
En segundo lugar, es deseable reemplazar el motor de paso rápido con un actuador de longitud piezoeléctrica para aumentar la velocidad de conmutación de la solución y obtener un movimiento más consistente.
En tercer lugar, las soluciones de calcio que utilizamos anteriormente para activar fibras musculares estriadas individuales incluían ácido propiónico, pero estas soluciones absorben la luz casi infrarroja, interfiriendo con las mediciones de fuerza. Cloruro de calcio se utilizó para eliminar la necesidad de ácido propiónico, que redujo en gran medida este efecto. Este problema es inherente a un sistema basado en interferometría y no presente cuando se utiliza la desviación del haz óptico.
En cuarto lugar, se diseñó un baño de flujo personalizado para crear un flujo laminar, para que coincida con el flujo del Ɵ vidrio. Esto evita el flujo de espalda debido a la turbulencia de la solución rica en calcio. Por lo tanto, la solución entre la punta de la fibra óptica y el voladizo permanece constante. El cubreobjetos con los miofibrils puede moverse libremente debajo de la cámara de flujo y, por lo tanto, la selección de miofibrils adecuados no se limita a la pequeña área de la cámara de flujo.
Reproducibilidad y variabilidad
Hay varios elementos del sistema y protocolo que son importantes para el grado de reproducibilidad y variabilidad de los datos obtenidos.
En primer lugar, la calidad de las mediciones depende en gran medida de la calidad del aislamiento miofibril. Los protocolos idénticos producen diferentes cualidades y cantidades de miofibrils de diferentes biopsias. En algunos casos, las biopsias apenas producen miofibrils utilizables o ninguno en absoluto. El consenso común es que los miofibrils dañados se romperán durante la contracción y por lo tanto no se tienen en cuenta en los resultados.
En segundo lugar, hay incertidumbre en la determinación de la zona transversal del miofibril. Debido a las restricciones técnicas, es posible medir la anchura del myofibril en un solo plano. Por lo tanto, para calcular el área transversal suponemos que la anchura y la profundidad son iguales. Cuando la fuerza se normaliza a un área transversal para calcular la tensión activa máxima, uno debe ser consciente de esta suposición.
Montaje de myofibrils debido al ángulo de montaje myofibril, la posición y la integridad del pegamento.
Aunque el ángulo de montaje y la posición se pueden controlar visualmente visualmente, pueden estar presentes pequeñas variaciones entre las miofibrils. La integridad del pegamento no se ha investigado exhaustivamente. Sin embargo, la integridad del pegamento se puede verificar mediante el seguimiento de la longitud de sarcomere en el miofibril antes y después de la activación. Cuando hay más sarcomeres entre el pegamento después de un protocolo, esto sugiere que se ha producido un deslizamiento del miofibril en el pegamento. Por lo tanto, este myofibril debe excluirse del conjunto de datos.
Otras aplicaciones de la configuración: Preactivación de calcio en cardiomiocitos aislados del ventrículo izquierdo de rata
Además de evaluar la función contráctil de los miofibriles, el sistema también se puede utilizar para medir la mecánica de los cardiomiocitos. Por ejemplo, la Figura 11 ilustra el uso de cardiomiocitos individuales permeabilizados por membrana aislados del ventrículo izquierdo de rata21. Contrariamente a los experimentos descritos anteriormente, se cambió la solución relajante y la solución de activación se mantuvo constante. Cada cardiomiocitos se sometió a cinco conjuntos de activaciones, exponiéndolo a una solución de calcio libre de 2 m para 1 s. La restricción de tiempo de 1 s se elige para imitar la naturaleza limitada en el tiempo de las contracciones cardíacas, donde la exposición a soluciones de baja concentración de calcio imita la fase diastólica y la exposición a soluciones de alta concentración de calcio imita la fase sistólica de la contracción muscular cardíaca (Figura 11A). Para cada uno de los cinco conjuntos de calcio diastólico fue variado (1, 80, 160, 250 y 400 nM de calcio), mientras que el calcio sistólico se mantuvo constante (Figura 11A). Un conjunto consistió en dos conjuntos de tres ciclos de activación-relajación a 1,8 m frente a 2,0 m y 2,0 m frente a 2,2 m para diferentes grupos experimentales. La fuerza máxima se midió a 1 s del interruptor de la pipeta y se promedió para el conjunto de tres ciclos de activación-relajación. La alta relación señal-ruido y el alto rango dinámico de este transductor de fuerza nos permitieron medir tanto los pequeños cambios en la fuerza diastólica como las fuerzas sistólicas mucho más grandes (Figura 11B). El aumento del calcio diastólico dio lugar a una mayor fuerza con un nivel de calcio de 2 oM en relación con la primera activación(Figura 11B). Los cardiomiocitos de rata WT se compararon con cardiomiocitos de ratas RMB20 heterocigotos (HET). Debido al empalme alternativo, las ratas HET tienen una proteína titina más compatible en comparación con las ratas WT. El efecto fue exagerado en los cardiomiocitos HET a 80 y 160 m de calcio(Figura 11C).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Michiel Helmes es accionista y copropietario de IONOptix Inc.
Acknowledgments
Este proyecto fue financiado por AFM-Telethon y A Foundation Building Strength for Nemaline Myopathies. Los autores desean reconocer al creador de los productos mencionados en este artículo, IONOptix Inc.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bio Spec Products, Inc. | 985370-XL | To isolate myofibrils | |
| Custom coded | Matlab | ||
| Custom fabricated | Includes Labview program to control over serial connection; To control valves | ||
| Custom fabricated | To cool the Peltier module | ||
| Custom fabricated | |||
| Custom fabricated | Aluminum tissue chamber | ||
| Custom fabricated | To control the valves; Includes PC software to control over USB | ||
| IonOptix | System controller software: data recording software with advanced signal generator for piezo and fast-step | ||
| IonOptix | MCS100 | To record sarcomere length | |
| IonOptix | Includes: Optiforce (interferometer), Micromanipulators, Signal interface, Piezo motor and controller. Based on the MyoStretcher | ||
| IonOptix | Force probe | ||
| Koolance | ADT-EX004S | ||
| Koolance | EX2-755 | To cool the Peltier module | |
| Microsoft | Data registration | ||
| Olympus | IX71 | ||
| Olympus | TH4-200 | ||
| Sigma-Aldrich | 529265 | Poly(2-hydroxyethyl methacrylate); Coating for microscope slides to prevent sticking of tissue | |
| Sigma-Aldrich | 78471 | Crystals to dissolve in ethanol resulting in glue | |
| TE Technology, Inc. | TE-63-1.0-1.3 | To cool the tissue flow chamber | |
| TE Technology, Inc. | TC-720 | Includes PC software to control over USB | |
| Tecan Trading AG | 20736652 | ||
| Tecan Trading AG | 20739263 | Syringe pump to induce backgroundflow together with fast-step perfusion system; Outflow from tissue flow chamber | |
| Thermo scientific | 2441081 | ||
| Warner Instruments (Harvard Bioscience, Inc.) | Discontinued | Alternative: SF-77CST/VCS-77CSP | |
| Warner Instruments (Harvard Bioscience, Inc.) | TG150-4 | To perfuse the tissue | |
| 1 PC for IonWizard and 1 PC for other software |
References
- Winter, J. M., Ottenheijm, C. A. C.
- Colomo, F., Piroddi, N., Poggesi, C., te Kronnie, G., Tesi, C. Active and passive forces of isolated myofibrils from cardiac and fast skeletal muscle of the frog. Journal of Physiology. 500, Pt 2 535-548 (1997).
- Kulke, M., et al. a major source of myofibrillar stiffness in Drosophila indirect flight muscle. Journal of Cell Biology. 154, 1045-1057 (2001).
- Stehle, R., et al. Isometric force kinetics upon rapid activation and relaxation of mouse, guinea pig and human heart muscle studied on the subcellular myofibrillar level. Basic Research in Cardiology. 97, Suppl 1 127-135 (2002).
- Iorga, B., et al. Micromechanical function of myofibrils isolated from skeletal and cardiac muscles of the zebrafish. Journal of General Physiology. 137, 255-270 (2011).
- Ribeiro, P. A. B., et al. Contractility of myofibrils from the heart and diaphragm muscles measured with atomic force cantilevers: Effects of heart-specific deletion of arginyl-tRNA-protein transferase. International Journal of Cardiology. 168, 3564-3571 (2013).
- Joureau, B., et al. Dysfunctional sarcomere contractility contributes to muscle weakness in ACTA1-related nemaline myopathy (NEM3). Annals of Neurology. 83, 269-282 (2018).
- de Souza Leite, F., Minozzo, F. C., Altman, D., Rassier, D. E. Microfluidic perfusion shows intersarcomere dynamics within single skeletal muscle myofibrils. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114, 8794-8799 (2017).
- Shalabi, N., Cornachione, A., de Souza Leite, F., Vengallatore, S., Rassier, D. E. Residual force enhancement is regulated by titin in skeletal and cardiac myofibrils. Journal of Physiology. 595, 2085-2098 (2017).
- Cornachione, A. S., Leite, F., Bagni, M. A., Rassier, D. E. The increase in non-cross-bridge forces after stretch of activated striated muscle is related to titin isoforms. American Journal of Physiology - Cell Physiology. 310, 19-26 (2016).
- Labuda, A., Brastaviceanu, T., Pavlov, I., Paul, W., Rassier, D. E. Optical detection system for probing cantilever deflections parallel to a sample surface. Review of Scientific Instruments. 82, 013701 (2011).
- Chavan, D., et al. Ferrule-top nanoindenter: an optomechanical fiber sensor for nanoindentation. Review of Scientific Instruments. 83, 115110 (2012).
- Beekmans, S. V., Iannuzzi, D. A metrological approach for the calibration of force transducers with interferometric readout. Surface Topography: Metrology and Properties. 3, (2015).
- van Hoorn, H., Kurniawan, N. A., Koenderink, G. H., Iannuzzi, D. Local dynamic mechanical analysis for heterogeneous soft matter using ferrule-top indentation. Soft Matter. 12, 3066-3073 (2016).
- Winter, J. M., et al. KBTBD13 is an actin-binding protein that modulates muscle kinetics. Journal of Clinical Investigation. , (2019).
- Winter, J. M., et al. Mutation-specific effects on thin filament length in thin filament myopathy. Annals of Neurology. 79, 959-969 (2016).
- Ottenheijm, C. A. C., et al. Deleting exon 55 from the nebulin gene induces severe muscle weakness in a mouse model for nemaline myopathy. Brain. 136, 1718-1731 (2013).
- Ribeiro, P. A., et al. Contractility of myofibrils from the heart and diaphragm muscles measured with atomic force cantilevers: effects of heart-specific deletion of arginyl-tRNA-protein transferase. International Journal of Cardiology. 168, 3564-3571 (2013).
- Pinniger, G. J., Bruton, J. D., Westerblad, H., Ranatunga, K. W. Effects of a Myosin-II Inhibitor (N-benzyl-p-toluene Sulphonamide, BTS) on Contractile Characteristics of Intact Fast-twitch Mammalian Muscle Fibres. Journal of Muscle Research and Cell Motililty. 26, 135-141 (2005).
- Stehle, R., Krüger, M., Pfitzer, G. Force kinetics and individual sarcomere dynamics in cardiac myofibrils after rapid Ca(2+) changes. Biophysics Journal. 83, 2152-2161 (2002).
- Najafi, A., et al. End-diastolic force pre-activates cardiomyocytes and determines contractile force: role of titin and calcium. Journal of Physiology. 597, 4521-4531 (2019).
