Summary
Præsenteret her er en protokol til at vurdere kontraktile egenskaber af striated muskel myofibrils med nano-Newton opløsning. Protokollen anvender en opsætning med en interferometribaseret, optisk kraftsonde. Denne opsætning genererer data med et højt signal-støj-forhold og gør det muligt at vurdere myofibrils kontraktile kinetik.
Abstract
Nedstribede muskelceller er uundværlige for aktiviteten af mennesker og dyr. Enkelt muskelfibre består af myofibrils, som består af serielt forbundet sarcomeres, de mindste kontraktile enheder i muskler. Sarkomerisk dysfunktion bidrager til muskelsvaghed hos patienter med mutationer i gener, der kodning for sarkomeriske proteiner. Undersøgelsen af myofibril mekanik giver mulighed for vurdering af actin-myosin interaktioner uden potentielle forstyrrende virkninger af beskadigede, tilstødende myofibrils når man måler kontraktilitet af enkelt muskelfibre. Ultrastrukturelle skader og forskydning af myofibrils kan bidrage til nedsat kontraktilitet. Hvis strukturelle skader er til stede i myofibrils, de sandsynligvis pause under isolationsproceduren eller under forsøget. Desuden viser undersøgelser i myofibrils en vurdering af aktin-myosin interaktioner i overværelse af de geometriske begrænsninger af sarcomeres. For eksempel kan målinger i myofibrils belyse, om myofibrillar dysfunktion er den primære effekt af en mutation i et sarkomisk protein. Desuden perfusion med calcium opløsninger eller forbindelser er næsten øjeblikkeligt på grund af den lille diameter af myofibril. Dette gør myofibrils særdeles velegnet til at måle satserne for aktivering og afslapning under kraftproduktion. Den protokol, der er beskrevet i dette papir, anvender en optisk kraftsonde baseret på princippet om et Fabry-Pérot interferometer, der kan måle kræfter i nano-Newton-området, koblet til en piezo-længdemotor og et hurtigt perfusionssystem. Dette setup gør det muligt at studere myofibril mekanik med høj opløsning kraftmålinger.
Introduction
Nedstribede muskelceller er uundværlige for dagligdagen aktiviteter. Lemmer bevægelse, respiratorisk funktion, og pumpe bevægelse af hjertet stole på den kraft, der genereres af muskelceller. Skeletmuskulatur består af muskelfacukkler indeholdende bundter af enkelt muskelfibre (Figur 1A). Disse muskelfibre består af myofibrils, som er dannet af serielt forbundne sarcomeres(Figur 1B,D). Sarcomeres indeholder tynde og tykke filamenter. Disse består primært af kæder af actin og myosin molekyler, henholdsvis (Figur 1B). Actin-myosin interaktioner er ansvarlige for den kraft-genererende kapacitet af muskler. Patienter med mutationer i gener kodning for sarkomeriske proteiner, såsom nebulin, actin, og troponin T, lider af muskelsvaghed på grund af kontraktile dysfunktion1.
Kvaliteten af muskel kontraktilitet kan studeres på forskellige niveauer af organisationen, lige fra in vivo hele muskler til actin-myosin interaktioner i in vitro motility assays. I løbet af de seneste årtier har flere forskningsgrupper udviklet opsætninger til at bestemme kontraktilitet af de enkelte myofibrils2,3,4,5,6,7,8,9,10. Disse opsætninger er baseret på påvisning af ændringer i laserafbøjning fra en cantilever (dvs. optisk stråleafbøjning) forårsaget af sammentrækning af myofibril (for detaljer, se Labuda et al.11). Selv om bestemmelse af kontraktile funktion myofibrils har nogle begrænsninger (f.eks dynamikken i excitation-sammentrækning kobling processer, der er opstrøms for myofibrils mangler), der er flere fordele ved denne tilgang. Disse omfatter: 1) evnen til at vurdere actin-myosin interaktioner i overværelse af de geometriske begrænsninger af sarcomeres; 2) evnen til at vurdere actin-myosin interaktioner uden potentielle konfunderende virkninger af beskadigede, tilstødende myofibrils (ved måling af kontraktilitet af enkelt muskelfibre ultrastrukturelle skader og forskydning af myofibrils kan bidrage til nedsat kontraktilitet) (Figur 1D); 3) den lille diameter myofibrils (~ 1 μm, figur 2A) og manglen på membraner giver mulighed for næsten øjeblikkelig calcium diffusion i sarcomeres. Desuden, hvis strukturelle skader er til stede i myofibrils, de sandsynligvis pause under deres isolation eller under forsøget. Derfor, vurdering myofibril kontraktilitet er en elegant metode til at studere de grundlæggende mekanismer i muskelsammentrækning og til at forstå, om forstyrret actin-myosin interaktioner er den primære årsag til muskelsygdom forårsaget af mutationer i sarkomiske proteiner.
Denne protokol præsenterer en nyudviklet opsætning til at bestemme kontraktilitet myofibrils indarbejde en cantilever kraft sonde med nano-Newton opløsning (dvs. Optiforce). Denne kraftsonde er baseret på princippet om interferometri. Interferometri muliggør brug af relativt stive cantilevers. Dette gør det muligt at måle kraft med lidt afbøjning af cantilever, nærmer isometriske sammentrækninger af myofibril. Sonden giver mulighed for vurdering af lav passive og aktive kræfter, der er produceret af en enkelt myofibril isoleret fra forskellige muskelbiopsier, herunder dem fra mennesker, med et højt signal-støj-forhold. Den optiske cantilever force sonde indarbejdet i denne opsætning er baseret på en Fabry-Pérot interferometer12. Interferometeret registrerer små forskydninger mellem en optisk fiber og en guldbelagt cantilever monteret på en ferrule (Figur 3). Kløften mellem den optiske fiber og cantilever kaldes Fabry-Pérot hulrum. Myofibrils er monteret mellem sonden og piezomotoren ved hjælp af to limbelagte glasmonteringsfibre. Den kraft, der produceres af myofibril, kan matematisk udledes af interferometerdataene. Interferometri er baseret på overlejring eller interferens af to eller flere bølger (i denne opsætning tre lysbølger). Laserlys med en bølgelængde mellem 1.528,77-1.563,85 nm udsendes fra interferometeret og sendes gennem den optiske fiber. I sonden reflekteres lyset 1) ved grænsefladen mellem den optiske fiber og mediet (Figur 3A); 2) på grænsefladen af mediet og cantilever (Figur 3B); og 3) på grænsefladen mellem metal og guld belægning af cantilever (Figur 3C). Refleksionen ved grænseflade A og B afhænger af brydningsindekset (n) for det medium, hvori sonden er nedsænket. Lyset, der består af de tre overlejrede refleksioner, vender tilbage til en fotodiode i interferometeret. Fotodioden måler lysets intensitet, hvilket er resultatet af interferensmønsteret af de tre overlejrede refleksioner. Når kontraktile kraft genereres ved at aktivere eller strække en myofibril, myofibril trækker på cantilever. Denne bevægelse ændrer hulrummets størrelse(d) og dermed antallet af bølgelængder, der passer ind i hulrummet. Lyset reflekteres ved cantilever vil have en anden fase, hvilket resulterer i et andet interferensmønster. Fotodioden registrerer denne ændring af interferensmønsterintensiteten som en ændring i Volts. Efterfølgende beregnes myofibril kraftgenerering ud fra denne ændring under hensyntagen til den cantilever stivhed. Kraftsonden kalibreres af fabrikanten ved at skubbe spidsen af monteringsnålen, der er fastgjort til den frie håndslut af cantilever, mod en vægtskala, samtidig med at udkrævningen af cantileveren er lig med et multiplum af bølgelængden på udlæsningslaseren13. Således interferometri er en meget følsom metode til at opdage små ændringer i afstand, giver mulighed for måling af kræfter med nano-Newton opløsning. Denne beslutning gør det muligt at vurdere myofibrillar kraftproduktion med et højt signal-støj-forhold. Mens traditionel interferometri begrænser måleområdet til den lineære del af interferenskurven, overvinder denne begrænsning ved hjælp af en indlåsningsforstærker og modulering af laserbølgelængden denne begrænsning14. Dette forklares mere detaljeret i diskussionsafsnittet.
For at måle myofibril aktiv spænding, en hurtig-trins perfusion system blev indarbejdet for at udsætte myofibril til calcium opløsninger (Figur 4A). Det hurtige perfusionssystem gør det muligt at foretage løsningsændringer inden for 10 ms. På grund af deres lille diameter, calcium diffusion i myofibrils er næsten øjeblikkelig. Derfor er dette system er særligt velegnet til måling af satserne for actin-myosin bindende under aktivering og frigivelse under afslapning. Aktiveringshastigheden (kACT)og afslapning (kREL)kan bestemmes ud fra aktiveringsafslapningskurverne. Også, ved at udsætte myofibrils til calcium opløsninger af stigende koncentration, kan kraft-calcium forholdet og calcium følsomhed bestemmes.
Desuden en piezo længde motor muliggør hurtig strækning og afkortning af myofibril. Dette giver mulighed for at studere de viskoelastiske egenskaber (dvs. passiv spænding) af myofibril, samt udføre en hurtig afkortning og restretch af myofibril at bestemme hastigheden af spænding sanering (kTR). De parametre, der hentes fra både aktive og passive spændingsforsøg, kan ændres ved genmutationer i et sarcomerisk protein.
Denne specialbyggede opsætning blev brugt til at måle de aktive og passive kontraktile egenskaber myofibrils isoleret fra sunde mennesker, patient, og mus skeletmuskulatur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Protokollen for opnåelse af humane biopsier blev godkendt af den institutionelle review board på VU University Medical Center (#2014/396) og skriftligt informeret samtykke blev indhentet fra forsøgspersonerne. Protokollen for opnåelse af dyremuskelbiopsier blev godkendt af den lokale dyreetikkomité ved VU University (AVD114002016501)
1. Forberedelse og myofibril isolation
BEMÆRK: Brug tidligere beskrevne metoder til glycerinering af biopsier, klargør de forskellige calciumkoncentrationsopløsninger (pCa)7,16,17, og isoler myofibrils2,18.
- Tø de afslappende (pCa 9.0, Rx) og aktivering (pCa 4.5, Act) løsninger samt inhibitorer (1 M E64, 1 M DTT, 1 M leupeptin, 1 M PMSF), som opbevares ved -80 °C.
- Tag et glycereret stykke striated muskelbiopsi på ca. 1 mm3 og læg det i en lille petriskål med 1:1 Rx/glycerol (v/v) opløsning og læg petriskålen på en kold plade ved 4 °C.
- Dissekere det stykke muskel ved hjælp af dissektion mikroskop og scer, adskille enkelt muskelfibre uden at isolere dem fra det stykke muskel.
BEMÆRK: Fjern så meget fedt- og bindevæv som muligt for at forhindre kontaminering af myofibrilaffuspensionen. - Det dissekerede væv overføres til et 5 ml rør med 1,5 ml afslappende opløsning med inhibitorer (1 μL/ml E-64, 1 μL/mL leupeptin, 1 μL/ml DTT og 125 μL/ml PMSF). Vævet hærdes ved ca. 4 °C i 1 time.
- Under inkubationen skal du starte begge pc'er op, tænde enhederne og åbne den tilhørende software (se Tabel over materialer).
- Nedsænk kraftsonden i ultrarent vand i en petriskål, og kalibrer sonden.
- Tryk på 'Start guiden' på interferometeret, og følg vejledningen på skærmen. Tryk på mikroskopstadiet,når du har trykket på Kalibrer, og tryk på mikroskopstadiet.
BEMÆRK: Hvis du trykker på mikroskopstadiet, vil det få cantilever til at afbøje og passere gennem frynser. Dette muliggør kalibrering af sonden. - Lad sonden nedsænket i ultrarent vand i petriskålen efter kalibrering.
- Tryk på 'Start guiden' på interferometeret, og følg vejledningen på skærmen. Tryk på mikroskopstadiet,når du har trykket på Kalibrer, og tryk på mikroskopstadiet.
- Initialiser piezomotorens position. Det kan du gøre ved at følge et af nedenstående trin.
- Når piezomotoren skal bruges til kTR-spænding, indstilles længden til 0 μm.
Indstillinger for signalgenerator findes i tabel 1, Figur 5A. - Når piezomotoren skal bruges til passiv spænding, indstilles længden til 50 μm.
Indstillinger for signalgenerator findes i tabel 1.
BEMÆRK: Forskellen mellem trin er den oprindelige position af piezo længde motor. For at strække myofibril skal piezomotoren trække for at øge afstanden mellem begge monteringsnåle og forlænge myofibril. For at slække myofibril skal piezomotoren skubbe for at mindske afstanden mellem begge monteringsnåle og forkorte myofibril.
- Når piezomotoren skal bruges til kTR-spænding, indstilles længden til 0 μm.
- Forbered et mikroskop dias. Pipette 150 μL polyhydroxyethylmethacrylatopløsning (poly-HEMA) (5% poly-HEMA i 95% ethanol, w/v) på et mikroskopskreds og spred det over diasset, så det hele er dækket.
BEMÆRK: Hvis en myofibril suspension er pipettet på en ubestrøget mikroskop dias, myofibrils at synke til bunden vil holde sig til mikroskop dias, og det vil ikke være muligt at lime dem. - Fyld sprøjterne med pCa-opløsninger (se figur 4A) og prime perfusionssystemet.
BEMÆRK: I disse trin fyldes alle rør på forhånd med den rette opløsning for at sikre, at alle luftbobler fjernes fra slangen.- Fyld indstrømsslangen i flowkammerets baggrundsstrøm (Figur 3, 4A) indstrømning med Rx.
- Når det bruges, skylles manifolden med ultrarent vand for at fjerne luft. For at gøre dette skal sprøjten sluttes med ultrarent vand til stikkontakten og skylles i den i modsat retning. Bloker de ubrugte porte i mangfoldigheden.
- Gør det muligt for hver pCa-sprøjte at fylde deres respektive rør med pCa-opløsning. Derefter forbinde dem til manifold og Ɵ-glas.
- Åbn ventil 1 og 6 med dataopkøbspanelets software (se Materialetabel)ved at kontrollere knappen '1+6' (Figur 6A) for at fylde Ɵ-glasset med de afslappende (pCa 9.0) og aktiveringsopløsninger (4.5) og lukkeventiler, når Ɵ glasset er fyldt (Figur 6B).
2. Montering af en myofibril
- Coat et mikroskop dias med poly-HEMA for at forhindre myofibrils fra at holde sig til glasset.
- Homogenisatoren (se Materialetabel) forberedestil vævshomogenisering. Rengør den indvendige rotorstang med rent silkepapir, saml homogenisatoren, og drej 1x i 15 s i alkohol og tre gange i 15 s hver i ultrarent vand. Prerinse homogenisatoren i afslappende opløsning 1 x for 15 s på is.
- Placer homogenisatorstangen i det rør, der indeholder muskelvævet som beskrevet i trin 1.4, og mens du holder røret på is, drejes rotoren i 15 s på hastighed 5 for at rive muskelvævet i stykker og opnå en myofibril suspension.
- Pipette ~ 50 μL af myofibril suspension og ~ 250 μL af den afslappende opløsning på mikroskop dias belagt med poly-HEMA i vævsbadet. Dette vil danne en væskedråbe. Dæk badet med et låg for at beskytte mod støv og vent 5-10 minutter for at tillade myofibrils at synke til bunden.
BEMÆRK: Forholdet mellem affjedringen og den afslappende løsning afhænger af isoleringens kvalitet, og juster derfor i overensstemmelse hermed. For eksempel, hvis myofibril udbyttet er lavt, og få egnede myofibrils er til stede i suspensionen, tilsæt mere myofibril suspension og fortyndes med mindre afslappende opløsning (f.eks 75 μL myofibril suspension og 225 μL afslappende opløsning). Hjerte og skelet muskelvæv er let at genkende på grund af sin rilling mønster. Ved hjælp af en 10x eller 40x mål, dette mønster er også synlig i en enkelt myofibril. Hvis andet væv er til stede i suspensionen, myofibrils kan vælges visuelt. Man kan springe 5-10 min vente. Men dette øger vanskeligheden ved at lime en myofibril. - Coat montering nåle med lim (shellac + ethanol; 120 mg shellak i 2 ml 70% ethanol). For at gøre dette opvarmes limen ved 65 °C i 30-60 s og pipette ~6 μL på en ny ubestrøget glasrutsjebane. Dyp spidsen af hver monteringsnål i limen og gentag indtil et lag lim er synligt. Flyt sonden og piezo op lodret med mikromanipulatorerne for at gøre plads til at placere vævsbadet på mikroskopstadiet. Fjern glasdiasen med limen.
- Montering af myofibrils
- Placer vævsbadet med mikroskopslid belagt med poly-HEMA, der indeholder myofibrilaffingen, på mikroskopstadiet. Brug scenen til at finde en passende myofibril med 40x mål. Hvis det er nødvendigt, flytte og rotere væv badet til at flytte myofibril til en monterbar position.
BEMÆRK: Kig efter myofibrils med et synligt rillemønster, der er ca. 30 μm langt. Som beskrevet i detaljer i trin 3.1 og 3.2.1 er det muligt at kontrollere længde og sarcomere længde før limning af myofibril. Lim ikke revet myofibrils, fordi disse er tilbøjelige til at bryde under sammentrækning. - Skub flowkammeret på plads direkte over væskefaldet, der indeholder myofibrils i vævsbadet (pipetted på diaset i trin 2.4) og sænk det. Stop, før den rammer væsken dråbe.
- Sænk piezo monteringsnålen og tryk den på den nederste spids af myofibril. Løft den lidt for at kontrollere, om myofibril er fastgjort til nålen.
- Sænk strømningskammeret langt nok til, at sondens monteringsnål kan nå bunden, uden at sonden rører flowkammeret.
- Tryk på sondens monteringsnål på den øverste spids af myofibril. Løft den lidt for at kontrollere, om myofibril er fastgjort til nålen.
- Løft myofibril fra bunden af badet så vidt muligt uden at miste evnen til at fokusere uden målet at røre bunden af glasset.
- Placer vævsbadet med mikroskopslid belagt med poly-HEMA, der indeholder myofibrilaffingen, på mikroskopstadiet. Brug scenen til at finde en passende myofibril med 40x mål. Hvis det er nødvendigt, flytte og rotere væv badet til at flytte myofibril til en monterbar position.
3. Initialisering af eksperiment
- Brug mikromanipulatorerne, kamera- og systemcontrollersoftwaren (Figur 7A, se Tabel over materialer) til at måle sarkomlængden. Flyt piezo- og/eller kraftsonden for at indstille den oprindelige sarcomerelængde af myofibril til 2,5 μm.
BEMÆRK: En sarkomerlængde på 2,5 μm sikrer optimal overlapning mellem myosinhoveder og actin. - Ved hjælp af systemcontrollerens karfunktion måles myofibrillængden og -bredden (Figur 7B,C).
BEMÆRK: Når kameraet roteres, kan det vippe vandret og/eller lodret. For at kontrollere justeringen af kameraet kan et hældningsniveau bruges til at kontrollere, at kameraet roteres og ikke vippes.- Placer myofibril i midten af videobilledet ved hjælp af mikroskopfasen.
- Tegn en firkant fra den ene side af myofibril til den anden. For længden skal du sørge for at medtage den mørke kant af limpi dråberne (Figur 2A) i firkanten, fordi billedbehandlingen er baseret på kontrast.
- Begynd at registrere dataene i systemcontrollersoftwaren (se Materialetabel) ved at trykke på 'Start' og efter 5 s pause skal systemcontrollerens softwaredataoptagelse stoppes ved attrykke påknappen ' Pause '. Længden registreres nu i dataene.
- For bredden først rotere kameraet 90 ° (se Tabel af materialer) og derefter bruge kontrasten af kanten af myofibril selv.
- Begynd at registrere dataene i systemcontrollersoftwaren (se Materialetabel)ved at trykke på'Start'og efter 5 s pause systemcontrollerens softwaredataregistrering ved attrykke på knappen 'Pause'. Bredden registreres nu i dataene.
- Hvis aktiv spænding af myofibril skal bestemmes, perfusion setup skal anvendes. Hvis det er tilfældet, skal du fortsætte til trin 3.4. Hvis kun passiv spænding vil blive bestemt, springe trin 3.4-4.1.3.7 og fortsætte på trin 4.2.
- Placer og initialiser perfusionsopsætningen.
BEMÆRK: Dette er kun nødvendigt for generering af aktiv kraft. Fortsæt til trin 4.2, når der udføres passive spændingseksperimenter.- Indstil den hurtige motorposition ved 4 V (Figur 5B).
- Skub perfusionsstanden på bordet for at justere det venstre nederste hjørne af stativet med båndet på bordet.
BEMÆRK: Pas på ikke at ramme kraftsonden eller piezomotoren. - Brug manipulatoren til groft at placere Ɵ-glas ved øjet.
- Kig gennem okularet og forsigtigt flytte Ɵ-glas mod myofibril ved hjælp af manipulator.
- Juster den øverste kanal i Ɵ-glasset med myofibril ved hjælp af manipulatoren, og kontroller positionen ved at udføre et hurtigt trin (signalgeneratorindstillinger kan findes i tabel 1) med systemcontrollersoftwaren (Figur 2B-C, se Materialetabel).
BEMÆRK: Sørg for, at den nederste kanal vil blive justeret med myofibril under aktiveringsfasen af det hurtige trin(Figur 2B-C).
- Tænd for baggrundsstrømmen af Rx (Figur 4A) for at skabe et laminar baggrundsflow i strømningskammeret.
BEMÆRK: Baggrundsstrømmen er nødvendigt for at forhindre turbulent flow som følge af pCa-opløsningsstrømmen fra Ɵ-glas.- Tænd for tilstrømningen af flowkammer med et Luer ventilhåndtag.
- Send følgende parametre til udstrømningspumpen for at begynde at dræne strømningskammeret og forhindre overløb af strømningskammeret (Figur 9): Ventil = Badeventil (2); Microstep mode = Micro; Stemplet mål = 48.000; Stemplets hastighed = 38-40 (vilkårlig).
BEMÆRK: Sørg for, at væskeniveauet altid er stabilt. Den myofibril bør ikke løbe tør, og heller ikke bør cantilever. Det er bedre at have lidt overløb end for lidt flow.
- Send følgende parametre til udstrømningspumpen for at begynde at dræne strømningskammeret og forhindre overløb af strømningskammeret (Figur 9): Ventil = Badeventil (2); Microstep mode = Micro; Stemplet mål = 48.000; Stemplets hastighed = 38-40 (vilkårlig).
- Tænd for tilstrømningen af flowkammer med et Luer ventilhåndtag.
- For at indstille temperaturen til en ønsket værdi med den termoelektriske temperaturregulator (Figur 8, se Materialetabel), skal du indtaste den ønskede temperatur ogtrykke på ' Start'. Vent, indtil den ønskede temperatur er nået, ved at kontrollere grafen i den termoelektriske temperaturregulatorsoftware, og fortsæt.
BEMÆRK: Når der udføres forsøg ved stuetemperatur, behøver den termoelektriske temperaturregulator ikke at blive brugt.
4. Eksperimentelle protokoller
- Beslut, hvilke aktive kraftprotokoller der skal udføres.
BEMÆRK: Afhængigt af de data, der er nødvendige for undersøgelsen, kan der udføres flere typer aktive kraftforsøg: trin 4.1.1, måling af den maksimale kraft ved mætning [Ca.2.]; trin 4.1.2, opnåelse af en Force-pCa-kurve til bestemmelse af calciumfølsomhed ud over trin 4.1.1 trin 4.1.3, der bestemmer spændingsforbygningen ved at lave en afkortningsprotokol ud over trin 4.1.1 eller 4.1.2.- Mål maksimal aktiv kraft.
- Begynd at registrere dataene i systemcontrollersoftwaren (se Materialetabel) vedat trykke på 'Start'.
- Åbn ventil 1 og 6 med dataopekøbspanelet (se Materialetabel)ved at kontrollere knappen '1+6' for at starte Ɵ-glasflow af den afslappende løsning og aktivere opløsningen gennem Ɵ-glasset (Figur 6A).
- Nulstil interferometerets område, så grundkraften er 0 V, ved at vælge og trykke på 'Nulstil område' på interferometeret (se Materialetabel).
- Når kraftsporet er stabilt, udføres Ɵ-glas-trins -trin (trinstørrelse = 100 μm).
Indstillinger for signalgenerator findes i tabel 1 (Figur 5C). En aktiveringsafslapningsspor svarende til figur 4D registreres og ses i systemcontrollersoftwaren. - Sæt systemcontrollerens softwaredataoptagelse på pause ved at trykkepå knappen Pause.
- Hvis der ikke skal udføres flere aktiveringer, skal ventil 1 og 6 lukkes for at standse Ɵ-glasflowet ved at fjerne markeringen af knappen '1+6'(Figur 6B), stoppe sprøjtepumpen (Figur 9, se materialetabel) ved at trykke på 'Terminate' og stoppe baggrundsstrømmen ved at lukke Luerventilen.
- Force-pCa-kurve
BEMÆRK: Dette svarer til trin 4.1.1 for at opnå den maksimale aktive kraft, men med flere aktiveringer ved hjælp af forskellige pCa-løsninger.- Begynd at registrere dataene i systemcontrollersoftwaren ved at trykke på"Start".
- Åbn ventiler 1 og 2 med data erhvervelse panel software til at starte strømmen af afslappende løsning og pCa 6.2 gennem Ɵ-glas.
- Nulstil interferometerets område, så grundkraften er 0 V ved at vælge og trykke på 'Nulstil område'på interferometeret.
- Når kraftsporet er stabilt, udføres Ɵ-glas-trins -trin (trinstørrelse = 100 μm).
Indstillinger for signalgenerator findes i tabel 1. - Sæt systemcontrollersoftwaren på pause ved at trykkepå knappen "Pause".
- Trin 4.1.2.1–4.1.2.4 gentages for ventil 1 og 3 (pCa 5.8), ventil 1 og 4 (pCa 5.6), ventil 1 og 5 (pCa 5.4) og ventil 1 og 6 (pCa 4.5).
- Hvis der ikke skal udføres flere aktiveringer, skal du lukke ventil 1 og 6 for at stoppe Ɵ-glasflowet ved at fjerne markeringen af knappen '1+6'(Figur 6A), stoppe sprøjtepumpen (Figur 9) ved at trykke på 'Terminate' og stoppe baggrundsstrømmen ved at lukke Luerventilen.
- Mål spændingsforbygningen (kTR).
BEMÆRK: Dette svarer til trin 4.1.1 for maksimal aktiv kraft, men med nogle ændringer og tilføjede trin.- Beregn den piezobevægelse, der er nødvendig for at slække myofibril 15% og indtast denne værdi i signalgeneratoren (Figur 5D, Tabel 1).
- Begynd at registrere dataene i systemcontrollersoftwaren ved at trykke på 'Start'.
- Åbn ventil 1 og 6 med dataopekøbspanelet (Figur 6A)software til at starte strømmen af den afslappende løsning og pCa 4.5 gennem Ɵ-glas.
- Nulstil interferometerets område, så grundkraften er 0 V ved at vælge og trykke på 'Nulstil område'på interferometeret.
- Når kraftsporet er stabilt, udføres Ɵ-glas-trins -trin (trinstørrelse = 100 μm).
Indstillinger for signalgenerator findes i tabel 1. - Når kraftplateauet er nået, skal du udføre afkortnings-restretch med piezoen.
Indstillinger for signalgenerator findes i (Figur 5D, Tabel 1). En aktiveringsafslapningsspor svarende til figur 4E registreres og ses i systemcontrollersoftwaren.
BEMÆRK: Der kan oprettes en brugerdefineret protokol til automatisering af ovenstående trin. - Sæt systemcontrollersoftwaren på pause ved at trykkepå knappen "Pause".
- Hvis der ikke skal udføres flere aktiveringer, skal ventil 1 og 6 lukkes for at standse Ɵ-glasflowet ved at fjerne markeringen af knappen '1+6'(Figur 6B), stoppe sprøjtepumpen (Figur 9) ved at trykke på 'Terminate' og stoppe baggrundsstrømmen ved at lukke Luerventilen.
- Mål maksimal aktiv kraft.
- Udfør passiv kraftmålinger.
- Udfør en kontinuerlig strækning.
- Den piezobevægelse, der er nødvendig for at strække myofibril,og indtast denne værdi i signalgeneratoren (tabel 1).
BEMÆRK: Disse er eksempelindstillinger. Beregn mængden af strækning og tid af stretch i forhold til sarcomere længde. Disse indstillinger er nødvendige for at sikre, at hastigheden af stretch per sarcomere forbliver lige på tværs myofibrils. - Begynd at registrere dataene i systemcontrollersoftwaren ved at trykke på 'Start'.
- Nulstil interferometerets område, så grundkraften er 0 V ved at vælge og trykke på 'Nulstil område'på interferometeret.
- Udfør kontinuerlig strækning med signalgeneratoren i systemcontrollersoftwaren for at betjene piezoen. Eksempel på indstillinger for signalgenerator findes i tabel 1.
- Afkort myofibril at slap længde med piezo efter strækningen er færdig(Tabel 1).
- Den piezobevægelse, der er nødvendig for at strække myofibril,og indtast denne værdi i signalgeneratoren (tabel 1).
- Udfør en trinvis strækning.
- Begynd at registrere dataene i systemcontrollersoftwaren ved at trykke på 'Start'.
- Nulstil interferometerets område, så grundkraften er 0 V ved at vælge og trykke på 'Nulstil område'på interferometeret.
- Udfør en trinvis strækning med signalgeneratoren i systemcontrollersoftwaren for at betjene piezoen. Eksempel signalgenerator indstillinger kan findes i tabel 1 (Figur 5E).
- Forkorte myofibril at slap længde med piezo efter strækningen er færdig. Eksempel på indstillinger for signalgenerator findes i tabel 1.
- Udfør en kontinuerlig strækning.
- Sæt systemcontrollersoftwaren på pause ved at trykkepå knappen "Pause".
- Stop optagelsen af data ved at trykke påknappenStop i systemcontrollersoftwaren.
- Gem dataene ved at trykke på 'File' og 'Gem data' i systemcontrollersoftwaren.
5. Rengøring
- Fjern den målte myofibril og forberede den næste myofibril.
- For at gøre dette, omhyggeligt rive myofibril mens man ser gennem okulær med 40x mål.
- Flyt kraftsonden og piezoen op. Flyt Ɵ højglas hele vejen op, til højre og bagpå. Flyt derefter op og skub væk flowkammeret. Fjern vævsbadet.
- For at rengøre monteringsnålen skal du bringe den i fokus ved hjælp af 10x og okulær. Dyp børsten i ethanol og forsigtigt børste ud og fjern limen fra nålen.
BEMÆRK: Husk, at det kan tage lidt tid, før limen kommer af. - Skyl flowkammeret og vævsbadet med ultrarent vand.
- Placer sonden i små en petriskål fyldt med ultrarent vand. Sørg for, at sonden er helt neddykket.
- Når forsøgene er færdige, skal du rense opsætningen som ovenfor og udføre følgende yderligere trin.
- Tøm slangen fra flowbadet. Send parametrene til udstrømningssprøjtepumpen (se Materialetabel, Figur 9). Ventil = Badeventil (2); Microstep mode = Normal; Stemplets mål = 0; Stemplets hastighed = 30.
BEMÆRK: Afslut kommandoen, når slangen er tom. - Initialiser pumpen flere gange (Figur 9B).
- Hæld vandet fra sprøjterne. For at gøre dette skal du lukke alle Luer ventilerne, åbne alle ventilerne, fjerne slangen fra kanylen af sprøjten, holde røret af specifikke pCa under nålen, og åbne Luer ventilen. Brug trykstikket til at fremskynde processen.
- Sæt slangen på kanylen på sprøjten. Fyld sprøjter med ~ 5 ml ultrarent vand. Placer en kop under Ɵ-glas. Åbn alle ventilerne og åbn trykventilen for at skylle systemet.
- Luk systemet. Sluk for pc'en, interferometeret og piezocontrolleren.
- Tøm slangen fra flowbadet. Send parametrene til udstrømningssprøjtepumpen (se Materialetabel, Figur 9). Ventil = Badeventil (2); Microstep mode = Normal; Stemplets mål = 0; Stemplets hastighed = 30.
6. Dataanalyse
- Eksportér datasporinger fra systemcontrollersoftwaren (se Materialetabel)til et regnearkssoftwareprogram eller udklipsholder ved at åbne datafilen og vælge det ønskede segment. De viste spor eksporteres (f.eks. rå kraft, sarcomerelængde og piezoposition).
- Udfør analyse med den tekniske software (f.eks.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dataspor blev registreret og åbnet med systemcontrollersoftwaren (se Materialetabel). Komplette sporinger eller udvalgte segmenter blev eksporteret til Udklipsholder eller tekstfil til yderligere analyse med en ønsket software. Ventiler til at styre strømmen af de forskellige løsninger blev skiftet med brugerdefineret software eller manuelt. En brugerdefineret MATLAB script blev brugt til at analysere satserne for aktivering, spænding sanering, og afslapning. Den maksimale aktive kraft og toppen og plateaukraften af passivkrafteksperimenterne blev taget direkte fra systemcontrollerens softwarekraftsporing. Efter montering af en myofibril( Figur 2), den ønskede protokol blev valgt.
Maksimal aktiv kraft og calcium- følsomhed af kraft imyofibrils isoleret fra mus og menneskelige skeletmuskulatur biopsier
I figur 4A afbildes den eksperimentelle opsætning, der anvendes til de aktive kraftforsøg, skematisk. Force spor af en aktiv kraft eksperiment med en myofibril isoleret fra sunde menneskelige quadriceps muskel er vist. Den myofibril blev aktiveret 5 gange med opløsninger med varierende pCa (pCa 6,2, 5,8, 5,6, 5,4, 4,5; data vist i figur 4B). Den gennemsnitlige maksimale kraft af alle myofibrils i dette eksperiment var ~ 123 mN/mm2. En kraft-pCa kurve blev konstrueret fra plateauet kræfter nået under hver aktivering i hver af de fem calcium opløsninger. Resultaterne er vist i figur 4C. Fra denne kurve blev pCa ved 50% af den maksimale kraftproduktion (pCa50)beregnet. I denne myofibril, pCa50 var 5,75.
Derudover kan der tilsættes en eller flere forbindelser til perfundaerede opløsning for at måle dens virkning på den kraft, der produceres af myofibril. I figur 4Dillustreres effekten af N-benzyl-p-toluen sulfonamid (BTS), en hurtig spjætmuskel (type II) myosintung kæde II (MHCII) inhibitor. 19 En myofibril blev aktiveret først med en pCa 5.6 opløsning, og efterfølgende med en pCa 5.6 + BTS opløsning. Under den anden aktivering mindre kraft blev produceret, hvilket indikerer, at dette var en myofibril, der indeholdt MHCII. Der er mutationer i proteiner, der er til stede udelukkende i specifikke muskeltyper, og dermed kun påvirke myofibrils fra denne specifikke muskeltype. I så fald er det vigtigt at skrive myofibrils for at skelne mutationseffekten på de forskellige muskeltyper. Også, dette eksempel illustrerer muligheden for at teste effekten af terapeutiske forbindelser i myofibrils.
Figur 4E viser en aktiv kraft spor af en enkelt myofibril isoleret fra mus skelet soleus muskelvæv. Den myofibril blev monteret i opsætningen og perfunderes med afslappende opløsning (pCa 9.0), efterfulgt af perfusion med aktiverende opløsning (pCa 4,5, ~ 0,032 mM calcium). Vi registrerede samtidig kraften og sarkomeret længde. Dette var en næsten isometrisk sammentrækning, da den cantilever afbøjning var ~ 0,5 μm, hvilket var ca 1% af myofibril's slap længde (~ 50 μm). I figur 4E blev der udført en hurtig afkortningsprotokol under aktiv sammentrækning for at vurdere spændingsforbygningen (kTR, gul stiplet linje). KTR er et mål for cross-bridge cykling kinetik. Også aktivering og afslapning kurver blev monteret for at bestemme aktiveringshastigheden (kACT,rød stiplede linje) og afslapning (kREL, grøn stiplede linje), henholdsvis. Figur 4 viser en mere detaljeret visning af afslapningsfasen , der er fremhævet i figur 4F. To faser blev klart: 1) en indledende langsom fase af afslapning (domineret af cross-bro udstationering) og 2) en hurtig fase af afslapning (domineret af cross-bro løsrivelse og calcium-dissociation)20.
Passiv kraft i myofibrils isoleret fra en human skeletmuskulatur biopsi
Figur 10 viser et spor af et passivt krafteksperiment med en myofibril isoleret fra sundt humant membranmuskelvæv. Den første protokol omfattede en eller flere passive strækninger for at bestemme sarkomiske somares viskoelastiske egenskaber. Figur 10 viser et kraftspor af en kontinuerlig strækning af en myofibril (strækning fra sarkomisk længde 2,2-3,0 μm). Under strækningen viste myofibrils både tyktflydende og elastiske egenskaber. Dette fremgår af kurven i figur 10A. Den skarpe top repræsenterer begge egenskaber, mens plateaukraften er et mål for elasticitet. Viskositet modstår stamme lineært. Således faldt kraften efter stammen blev fjernet. Figur 10B fremhæver selve strækningen og illustrerer det høje signal-støj-forhold. Bemærk, at tvangssporinger ikke er filtreret.
Figur 1: Skematisk skildring og elektronmikroskopi billeder af en skeletmuskulatur og dens morfologi. (A) Viser strukturen af skeletmuskulatur og(B)viser strukturen af sarcomere, den mindste kontraktile enhed. Disse skematiske billeder er tilpasset fra Servier Medical Art. (C) Viser et billede af en enkelt muskelfiber og(D)viser en elektron mikroskopi billede af en muskel fiber afslører myofibrillar skader samt bevaret myofibrillar ultrastruktur. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Billeder, der viser en monteret myofibril, Ɵ-glas justering, og piezo montering nål. (A)En myofibril monteret på slap længde mellem glasfiber nåle belagt med shellak set gennem en 40x mål. (B)Billeder af placeringen af Ɵ-glas i forhold til myofibril (fremhævet med de hvide ovaler) set gennem en 10x mål. (Øverst) Justeret til den øverste kanal (afslappende løsning, pCa 9.0); (Nederst) Justeret til den nederste kanal (aktiverende opløsning, pCa 4.5) for at gennemgå myofibril med calcium og fremkalde sammentrækning. (C) Skematiske skildringer af placeringen af Ɵ-glas i forhold til myofibril. (Øverst) På linje med den øverste kanal (afslappende opløsning, pCa 9.0); (Nederst) På linje med den nederste kanal (aktiverende opløsning, pCa 4.5) for at gennemgå myofibril med calcium og fremkalde sammentrækning. D) Monteringsnål fastgjort til piezoholderens kulstofstang. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Skematisk repræsentation af opsætningen og slutdelen af vævsstrømningskammeret. I mørkeblå væv flow kammer lavet af aluminium, og i hvid hulrummet, hvor kraft sonden og Ɵ-glas er vist på plads; (I midten) Myofibril fastgjort mellem to glasfiber montering nåle fastgjort til kraft sonden og piezo længde motor. Den Ɵ-glas er på linje med myofibril. Den Ɵ-glas kan bevæge sig op og ned for at udsætte myofibril til calcium opløsning. (Højre) Nært hold af den udkragede kraftsonde. Det angivne hulrumsstørrelse (eller Fabry-Pérot-hulrummet, d); refleksionsgrænsefladerne A, B og C; og et eksempel på en lysbølge, der udsendes af laseren (rød). Den cantilever er monteret på skulderen af ferrule. Fiberen, der bærer laseren fra interferometeret, forlader ferrule på spidsen af cantilever. Et glas monteringsfiber er fastgjort på cantilever ved hjælp af voks. (Øverst til venstre) Interferometeret analyserer det interferometersignal, der sendes til systemcontrollersoftwaren. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Eksperimentel opsætning og data fra aktive spændingseksperimenter. aA) Skematisk repræsentation af perfusionsopsætningen og de anvendte løsninger. Bemærk, at det første og sidste rør (lyseblå) indeholder calciumfri opløsning (dvs. afslappende opløsning). (B)Eksempel kraft spor af en aktiv spænding eksperiment med en myofibril isoleret fra humane skeletmuskulatur væv viser fem aktiveringer fra afslappende opløsning (pCa 9.0) til flere aktiveringsløsninger (pCa 6.2 til 4.5). c) en kraft-calcium kurve; kraftniveauer på plateauerne i panel (B) blev normaliseret og afbildet mod deres respektive calciumniveauer. (D) Eksempel kraft spor af en type II (hurtig spjæt) myofibril isoleret fra humane skeletmuskulatur aktiveret med pCa 5.6 opløsning (blå) og efterfølgende med pCa 5,6 + BTS (en type II specifik cross-bro hæmmer, rød). (E)Eksempel data spor af en aktiv spænding eksperiment med myofibrils isoleret fra mus soleus skeletmuskulatur væv med en hurtig afkortning-restretch protokol under aktivering til at bestemme hastigheden af spænding sanering (kTR, gul stiplede linje). Også aktivering og afslapning kurve blev monteret for at bestemme aktiveringshastigheden (kACT,rød stiplede linje) og afslapning (kREL, grøn stiplede linje), henholdsvis. (F) En zoom af afslapning fase (øverst til venstre), fremhævet i (E). Det hurtige motorsignal (nederst til venstre) indikerede det tidspunkt, hvor opløsningen skiftede fra en aktiveringsløsning (pCa 4.5) til en afslappende opløsning (pCa 9.0). Afslapningsfasen bestod af en lineær, langsom fase (øverst til højre) og en eksponentiel, hurtig fase (nederst til højre). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: Eksempelindstilling for signalgeneratoren i systemkontrolsoftwaren. (se Tabel over materialer). 1) Angiver knappen for at udføre kommandoer indtastet i signalgeneratoren. (A) Opsætning af piezo længde motor. (B) Opsætning af den hurtige motor. (C) Udførelse af en hurtig-trin for at aktivere en myofibril for en varighed på 5 s. (D) Udfører en hurtig afkortning-restretch af en myofibril at bestemme kTR. (E)Udførelse af en trinvis strækning af en myofibril at bestemme viskoelastiske egenskaber. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6: Ventilcontrollersoftware, der bruges på pc'en. (A) Den knap, der bruges til at åbne ventiler 1 (Rx) og 6 (Lov). (B) Knappernes tilstand, når alle ventiler er lukket. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 7: Måling af sarcomere længde, myofibril længde, og myofibril bredde med systemet controller software. En lineal bruges som eksempel. (A) Måling af sarcomere længde: den lilla boks er placeret omkring myofibril og sarcomere længde er vist i (1). (B) Måling af længden: Cyan boksen er placeret fra start til af myofibril. (C) Målebredde: Efter rotation af kameraet 90°, er cyan boksen placeret fra den ene side af myofibril til den anden. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 8: Termoelektrisk temperaturregulatorsoftware. AA) Opret forbindelse til den termoelektriske temperaturregulator. (B) Udvid temperaturindstillinger. (C) Indstil den ønskede temperatur, i dette tilfælde: 15 °C.(D)Tænd for termoelektrisk temperaturregulator og send spænding til Peltier termoelektrisk kølemodul. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 9: Indstillinger for sprøjteudstrømningspumpen. (A) Åbn forbindelsen til pumpen ved at trykke på (1). (B) Start pumpen med foruddefinerede indstillinger ved at trykke på (2). (C) Start udstrømningspumpen ved at indstille 'Valve Commands' til 'Bath Valve' (2) og indtaste 'Kommandosætparametre 'som vist. Udfør kommandoen ved at trykke på (3). Kommandoer kan afsluttes ved at trykke på (4). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 10: Eksempel data spor af en passiv spænding eksperiment med myofibrils isoleret fra humane skeletmuskulatur væv. (A) Optagelse af kraften (Øvre) og sarcomere længde (Lavere) under en strækning og frigivelse protokol. (B) Zoom af (A) viser kraften (Øvre) og sarcomere længde i strækningen fase af myofibril. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 11: Eksperimentel opsætning og data fra cardiomyocyt calciumforaktiveringsforsøg. (A) Skematisk repræsentation af perfusion setup. Bemærk, at det sidste rør (lyseblå) indeholder calciumfri opløsning (afslappende opløsning). b) Overlejret aktiveringskurver for en kardiomyocyt uden (lyseblå) og med (mørkeblå) calciumforaktivering med calciumkoncentrationer på henholdsvis 1 nM og 80 nM. c) Sammenligning af calciumforaktivering i vild type (WT) og heterozygot RBM20 (HET) kardiomyocyter isoleret fra rotte venstre ventrikel. Dette tal er blevet ændret fra Najafi et al.21. Klik her for at se en større version af dette tal.
| Trin | Enhed | Beskrivelse | Form | Første | ||||||||
| 1.7.1. | Piezo | Initialisering af passiv spænding | Fast | 51,6 μm | ||||||||
| 1.7.2. | Piezo | Initialisering aktiv spænding | Fast | 0 μm | ||||||||
| Trin | Enhed | Beskrivelse | Form | Første | Forsinkelse | Reps | Niveau | Forsinkelse | Niveau | Forsinkelse | ||
| 3.4.4. / 4.1.1.4. / 4.1.2.4. | Hurtigt skridt | Test ɵ-glas position / Aktivering af myofibril | Puls | 4 V | 1 s | 1 x | 3 V | 5 kr. | 4 V | 1 s | ||
| 4.1.3.4. | Hurtigt skridt | Aktivering af myofibril(inkluderk TR ) | Puls | 4 V | 1 s | 1 x | 3 V | 10'erne | 4 V | 1 s | ||
| Trin | Enhed | Beskrivelse | Form | Første | Forsinkelse | Reps | Rampeniveau | Rampe varighed | Forsinkelse | Rampeniveau | Rampe varighed | Forsinkelse |
| 4.1.3.1. / 4.1.3.6. | Piezo | Afkortning-Restretch for kTR | Trapez | 0 μm | 0,5 kr. | 1 x | 0 + 0,15 * L0 = __ μm | 0,01 kr. | 0,01 kr. | 0 μm | 0,01 kr. | 1 s |
| 4.2.1.1. / 4.2.1.4. | Piezo | Fortsætter stretch | Trapez | 51,6 μm | 2 s | 1 x | 51,6 - 0,30 * L0 = __ μm | 2 s | kr. | 51,6 - 0,30 * L0 = __ μm | kr. | 1 s |
| 4.2.1.4. | Piezo | Retur myofibril til slap længde | Trapez | 1,6 μm | 2 s | 1 x | 51,6 μm | 5 kr. | kr. | 51,6 μm | kr. | 1 s |
| 4.2.2.3. | Piezo | Trinvis strækning | Trapez | 51,6 μm | 2 s | 10 x | 51,6 - 5 μm | 0,5 kr. | 10 s | 51,6 - 5 μm | kr. | kr. |
| 4.2.3. | Piezo | Retur myofibril til slap længde | Trapez | 1,6 μm | 2 s | 1 x | 51,6 μm | 5 kr. | kr. | 51,6 μm | kr. | kr. |
Tabel 1: Tabel, der beskriver de forskellige signalgeneratorindstillinger, der anvendes i systemcontrollersoftwaren til at betjene piezolængdemotoren og hurtigtrinsmotoren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Beskrevet er en protokol til vurdering af kontraktile funktion myofibrils isoleret fra menneskelige eller animalske skeletmuskulatur væv. Kraftopløsningen af denne opsætning er tidligere blevet beskrevet af Chavan et al.12. Kort sagt bestemmes det af de tilfældige udsving i længden af Fabry-Pérot-hulrummet mellem detektionsfiberen og den udkrøje, der producerer den dominerende del af støjen ved udlæsningens output (udtrykt i V), der ganget med afbøjningsfølsomhed (udtrykt i m/V) og af udkredsens forårskonstant (udtrykt i N/m) giver kraftstøjen. For vores opsætning er rod gennemsnitlige kvadrat (rms) støj i luften ved udgangen af udlæsningen, udtaget ved en 1.000 datapunkter / s (prøve / s), ca 2 mV. Til en typisk myofibrilmåling anvendes en ferrule-top sonde med en fjederkonstant på ~0,7 N/m (afbøjningsfølsomhed ∼300 nm/V). Denne rms værdi svarer til en cantilever afbøjningsopløsning på 0,6 nm, hvilket svarer til en kraftfølsomhed på ~ 0,37 nN. Kraftsonden kalibreres ved at skubbe spidsen af monteringsnålen mod en vejeskala, samtidig med at kantileverens bøjning er lig med et multiplum af bølgelængden på udlæsningslaseren13. Denne kalibreringsmetode indebærer både cantilever og montering nål stivhed samt mulige variationer i drejningsmoment af cantilever og montering nål på grund af hastighed og størrelsesorden myofibril sammentrækning. I øjeblikket er en opsætning til vurdering af myofibril kontraktilitet tilgængelig, som er baseret på påvisning af en laser afbøjet fra cantilever, dvs optisk stråleafbøjning (1.700 A; ~ 1 nN kraft opløsning). Dette system blev udviklet af Labuda et al. ved hjælp af et optisk periskop til at guide et laserlys mod og væk fra cantilever i begrænsende konfigurationer11. I dette system er en myofibril monteret mellem atomkraften cantilever og en stiv glasnål. En fordel ved det system, der er beskrevet her, er den højere kraft følsomhed og signal-støj forhold. Desuden kan der i dette setup anvendes relativt stive cantilevers, hvilket resulterer i små cantilever-afbøjning, når myofibrillarkraft påføres. Dette er vigtigt, da det giver mulighed for kraftmålinger ved næsten konstant sarcomere længde. Endelig, sammenlignet med det system, der er beskrevet af Labuda et al., systemet her udnytter lignende eller identiske metoder til at styre temperaturen, at fremkalde længde ændringer på myofibril, og at ændre perfusion løsninger ved hjælp af en Ɵ-glas og hurtig-trins motor. Fordelen ved det system, der er beskrevet af Labuda et al. er, at en ændring af opløsningsammensætning (mellem cantilever og optisk periskop) ikke påvirker signaludgangen. I det system, der er beskrevet her, skal opløsningen sammensætning mellem cantilever og optisk fiber forblive konstant. Løsningen på denne begrænsning er beskrevet mere detaljeret nedenfor.
Optimering
Den optiske kraftsonde i kombination med det hurtige perfusionssystem førte til komplikationer. Forskellen i optiske egenskaber mellem lav og høj koncentration Ca2+ opløsninger forstyrrer kraftmålingerne. For at forhindre tilbageløb af den høje calciumopløsning blev der udviklet et brugerdefineret flowkammer (Figur 3). En konstant baggrundsstrøm af calciumfri opløsning induceres fra højre mod venstre for at holde opløsningen konstant mellem toppen af den optiske fiber og cantilever (Figur 3D).
For at styre temperaturen monteres et Peltier-element med væskekøling på strømningskammeret. Dette flowkammer er termisk afkoblet fra mikroskopet ved at montere det på en plastikadapter. Med Peltier-elementet, der styres af et TEC-system, er det muligt at styre opløsningens temperatur over tid med 0,1 °C præcision. Temperaturen overvåges af en temperatursensor monteret på strømningskammeret. Temperaturstabilitet er vigtig på grund af krafttransducerens art. Den cantilever består af en guld-belagt glas strimmel, effektivt gør det til et termometer. Således cantilever bøjninger med temperaturændringer.
Opsætningen bruger et hurtigt-trins perfusionssystem (se Tabel over materialer)til at styre bevægelsen af Ɵ-glas. Dette system giver mulighed for perfusion afbrydere inden for 10 ms. Ved at kombinere metoden til temperaturkontrol og løsningsskift er dette system særligt velegnet til at måle kinetik af sarcomere kontraktilitet (dvs. satser for styrkeudvikling, spændingsforbygning og afslapning) i myofibrils.
I første omgang var ulempen ved at bruge interferometri det lille anvendelige område på grund af nødvendigheden af at bruge den lineære del af interferenskurven (λ/8, hvor λ var laserens bølgelængde). Men de seneste innovationer elimineret dette behov ved at kombinere bølgelængde graduering med en lock-in forstærker. Systemet er derfor ikke begrænset til en enkelt lineær del af interferenskurven. Dette gør det muligt at måle uendelig afbøjning af cantilever14. Således er rækken af cantilever afbøjning udlæsning af dette system er stærkt udvidet i forhold til traditionelle interferometri. Derudover er de beskrevne kraftsonder nemme at udskifte, og der er mange cantilevers til rådighed, med stivheder fra 0,5 N/m til > 20 N/m. Derfor er det muligt hurtigt at skifte mellem cantilevers og vælge den stivhed, der passer bedst til det udførte eksperiment.
Udfordringer
Det nuværende system er en prototype baseret på et kardiomyocytmålesystem (se Materialetabel). Flere komponenter kan forbedres for at give en bedre brugeroplevelse og data af højere kvalitet. For det første kan vibrationer og resonans på grund af tilføjelser til systemet være et problem, der vil tilføje støj til signalet. Også, Ɵ-glas holder og hurtig-trins motortilbehør metode kunne forbedres for at gøre det mindre tilbøjelige til vibrationer.
For det andet er det ønskeligt at udskifte den hurtige motor med en piezo længde aktuator for at øge hastigheden af opløsningsskift og for at opnå en mere ensartet bevægelse.
For det tredje, calcium løsninger, vi tidligere brugte til at aktivere enkelt striated muskelfibre inkluderet propionsyre, men disse løsninger absorbere nær-infrarødt lys, forstyrrer kraft målinger. Calciumchlorid blev brugt til at fjerne behovet for propionsyre, som i høj grad reduceret denne effekt. Dette problem er uløseligt forbundet med et system baseret på interferometri og ikke til stede, når du bruger optisk stråleafbøjning.
For det fjerde, en brugerdefineret flow bad blev manipuleret til at skabe en laminar flow, til at matche strømmen af Ɵ-glas. Dette forhindrer tilbageløb på grund af turbulens af calcium-rige opløsning. Derfor er løsningen mellem spidsen af den optiske fiber og cantilever forbliver konstant. Dækslet med myofibrils kan bevæge sig frit under strømningskammeret, og derfor er udvælgelsen af egnede myofibrils ikke begrænset til det lille område af flowkammeret.
Reproducerbarhed og variation
Der er flere elementer i systemet og protokollen, der er vigtige for graden af reproducerbarhed og variabilitet af de opnåede data.
For det første afhænger kvaliteten af målingerne stærkt af kvaliteten af myofibril isolation. Identiske protokoller giver forskellige kvaliteter og mængder af myofibrils fra forskellige biopsier. I nogle tilfælde, biopsier næppe give brugbare myofibrils eller slet ingen. Fælles konsensus er, at beskadigede myofibrils vil bryde under sammentrækning og dermed ikke er tegnede sig for i resultaterne.
For det andet er der usikkerhed i fastsættelsen af tværsnitsområdet i myofibril. På grund af tekniske begrænsninger, er det muligt at måle bredden af myofibril i kun ét plan. Derfor antager vi for at beregne tværsnitsområdet, at bredden og dybden er ens. Når kraft er normaliseret til et tværsnitsområde for at beregne maksimal aktiv spænding, bør man være opmærksom på denne antagelse.
Montering af myofibrils på grund af myofibril monteringsvinkel, position, og integriteten af limen.
Selv om montering vinkel og position i vid udstrækning kan styres visuelt, små variationer mellem myofibrils kan være til stede. Lim integritet er ikke blevet undersøgt grundigt. Limintegriteten kan dog verificeres ved at overvåge sarkomlængden i myofibril før og efter aktivering. Når der er flere sarkomere mellem limen efter en protokol, tyder dette på, at der er sket en forsinkelse af myofibril i limen. Derfor bør denne myofibril udelukkes fra datasættet.
Andre anvendelser af opsætningen: Calcium preactivation i kardiomyocytter isoleret fra rotte venstre ventrikel
Ud over at vurdere kontraktile funktion myofibrils, kan systemet også bruges til at måle cardiomyocyte mekanik. For eksempel illustrerer figur 11 brugen af membran-permeabiliserede enkelt kardiomyocytter isoleret fra rotte venstre ventrikel21. I modsætning til de ovenfor beskrevne eksperimenter blev afslappende løsning ændret, og aktiveringsopløsningen blev holdt konstant. Hver kardiomyocyt gennemgik fem sæt aktiveringer og udsætter den for en 2 μM fri calciumopløsning til 1 s. Den 1 s tidsbegrænsning er valgt til at efterligne den tidsbegrænsede karakter af hjertesammentrækninger, hvor eksponeringen for lav calcium koncentrationsopløsninger efterligner den diastoliske fase og eksponering for høj calcium koncentration løsninger efterligner den systoliske fase af hjertemuskelsammentrækning (Figur 11A). For hver af de fem sæt diastolisk calcium var varieret (1, 80, 160, 250 og 400 nM calcium), mens systolisk calcium forblev konstant (Figur 11A). Et sæt bestod af to sæt af tre aktiveringsafslapningscyklusser ved 1,8 μm versus 2,0 μm og 2,0 μm versus 2,2 μm for forskellige forsøgsgrupper. Peak kraft blev målt ved 1 s fra kontakten af pipetten og i gennemsnit for sættet af tre aktivering-afslapning cykler. Det høje signal-støj-forhold og denne krafttransducers høje dynamiske område gjorde det muligt for os at måle både de små ændringer i diastolisk kraft og de meget større systoliske kræfter (Figur 11B). Forøgelse af diastolisk calcium resulterede i en højere kraft ved 2 μM calcium i forhold til den første aktivering (Figur 11B). WT rotte kardiomyocytter blev sammenlignet med heterozygot (HET) RMB20 rotte kardiomyocytter. På grund af alternativ splejsning har HET-rotter et mere kompatibelt titinprotein sammenlignet med WT-rotterne. Effekten var overdrevet i HET-kardiomyocytter ved 80 og 160 μM calcium (Figur 11C).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Michiel Helmes er aktionær og medejer af IONOptix Inc.
Acknowledgments
Dette projekt blev finansieret af AFM-Telethon og A Foundation Building Strength for Nemaline Myopathies. Forfatterne ønsker at anerkende skaberen af de produkter, der er nævnt i denne artikel, IONOptix Inc.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bio Spec Products, Inc. | 985370-XL | To isolate myofibrils | |
| Custom coded | Matlab | ||
| Custom fabricated | Includes Labview program to control over serial connection; To control valves | ||
| Custom fabricated | To cool the Peltier module | ||
| Custom fabricated | |||
| Custom fabricated | Aluminum tissue chamber | ||
| Custom fabricated | To control the valves; Includes PC software to control over USB | ||
| IonOptix | System controller software: data recording software with advanced signal generator for piezo and fast-step | ||
| IonOptix | MCS100 | To record sarcomere length | |
| IonOptix | Includes: Optiforce (interferometer), Micromanipulators, Signal interface, Piezo motor and controller. Based on the MyoStretcher | ||
| IonOptix | Force probe | ||
| Koolance | ADT-EX004S | ||
| Koolance | EX2-755 | To cool the Peltier module | |
| Microsoft | Data registration | ||
| Olympus | IX71 | ||
| Olympus | TH4-200 | ||
| Sigma-Aldrich | 529265 | Poly(2-hydroxyethyl methacrylate); Coating for microscope slides to prevent sticking of tissue | |
| Sigma-Aldrich | 78471 | Crystals to dissolve in ethanol resulting in glue | |
| TE Technology, Inc. | TE-63-1.0-1.3 | To cool the tissue flow chamber | |
| TE Technology, Inc. | TC-720 | Includes PC software to control over USB | |
| Tecan Trading AG | 20736652 | ||
| Tecan Trading AG | 20739263 | Syringe pump to induce backgroundflow together with fast-step perfusion system; Outflow from tissue flow chamber | |
| Thermo scientific | 2441081 | ||
| Warner Instruments (Harvard Bioscience, Inc.) | Discontinued | Alternative: SF-77CST/VCS-77CSP | |
| Warner Instruments (Harvard Bioscience, Inc.) | TG150-4 | To perfuse the tissue | |
| 1 PC for IonWizard and 1 PC for other software |
References
- Winter, J. M., Ottenheijm, C. A. C. Sarcomere Dysfunction in Nemaline Myopathy. J. Neuromuscular. Disease. 4, 99-113 (2017).
- Colomo, F., Piroddi, N., Poggesi, C., te Kronnie, G., Tesi, C. Active and passive forces of isolated myofibrils from cardiac and fast skeletal muscle of the frog. Journal of Physiology. 500, Pt 2 535-548 (1997).
- Kulke, M., et al. a major source of myofibrillar stiffness in Drosophila indirect flight muscle. Journal of Cell Biology. 154, 1045-1057 (2001).
- Stehle, R., et al. Isometric force kinetics upon rapid activation and relaxation of mouse, guinea pig and human heart muscle studied on the subcellular myofibrillar level. Basic Research in Cardiology. 97, Suppl 1 127-135 (2002).
- Iorga, B., et al. Micromechanical function of myofibrils isolated from skeletal and cardiac muscles of the zebrafish. Journal of General Physiology. 137, 255-270 (2011).
- Ribeiro, P. A. B., et al. Contractility of myofibrils from the heart and diaphragm muscles measured with atomic force cantilevers: Effects of heart-specific deletion of arginyl-tRNA-protein transferase. International Journal of Cardiology. 168, 3564-3571 (2013).
- Joureau, B., et al. Dysfunctional sarcomere contractility contributes to muscle weakness in ACTA1-related nemaline myopathy (NEM3). Annals of Neurology. 83, 269-282 (2018).
- de Souza Leite, F., Minozzo, F. C., Altman, D., Rassier, D. E. Microfluidic perfusion shows intersarcomere dynamics within single skeletal muscle myofibrils. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114, 8794-8799 (2017).
- Shalabi, N., Cornachione, A., de Souza Leite, F., Vengallatore, S., Rassier, D. E. Residual force enhancement is regulated by titin in skeletal and cardiac myofibrils. Journal of Physiology. 595, 2085-2098 (2017).
- Cornachione, A. S., Leite, F., Bagni, M. A., Rassier, D. E. The increase in non-cross-bridge forces after stretch of activated striated muscle is related to titin isoforms. American Journal of Physiology - Cell Physiology. 310, 19-26 (2016).
- Labuda, A., Brastaviceanu, T., Pavlov, I., Paul, W., Rassier, D. E. Optical detection system for probing cantilever deflections parallel to a sample surface. Review of Scientific Instruments. 82, 013701 (2011).
- Chavan, D., et al. Ferrule-top nanoindenter: an optomechanical fiber sensor for nanoindentation. Review of Scientific Instruments. 83, 115110 (2012).
- Beekmans, S. V., Iannuzzi, D. A metrological approach for the calibration of force transducers with interferometric readout. Surface Topography: Metrology and Properties. 3, (2015).
- van Hoorn, H., Kurniawan, N. A., Koenderink, G. H., Iannuzzi, D. Local dynamic mechanical analysis for heterogeneous soft matter using ferrule-top indentation. Soft Matter. 12, 3066-3073 (2016).
- Winter, J. M., et al. KBTBD13 is an actin-binding protein that modulates muscle kinetics. Journal of Clinical Investigation. , (2019).
- Winter, J. M., et al. Mutation-specific effects on thin filament length in thin filament myopathy. Annals of Neurology. 79, 959-969 (2016).
- Ottenheijm, C. A. C., et al. Deleting exon 55 from the nebulin gene induces severe muscle weakness in a mouse model for nemaline myopathy. Brain. 136, 1718-1731 (2013).
- Ribeiro, P. A., et al. Contractility of myofibrils from the heart and diaphragm muscles measured with atomic force cantilevers: effects of heart-specific deletion of arginyl-tRNA-protein transferase. International Journal of Cardiology. 168, 3564-3571 (2013).
- Pinniger, G. J., Bruton, J. D., Westerblad, H., Ranatunga, K. W. Effects of a Myosin-II Inhibitor (N-benzyl-p-toluene Sulphonamide, BTS) on Contractile Characteristics of Intact Fast-twitch Mammalian Muscle Fibres. Journal of Muscle Research and Cell Motililty. 26, 135-141 (2005).
- Stehle, R., Krüger, M., Pfitzer, G. Force kinetics and individual sarcomere dynamics in cardiac myofibrils after rapid Ca(2+) changes. Biophysics Journal. 83, 2152-2161 (2002).
- Najafi, A., et al. End-diastolic force pre-activates cardiomyocytes and determines contractile force: role of titin and calcium. Journal of Physiology. 597, 4521-4531 (2019).
