Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

בידוד מיו-בריאלס מבריות מביופסיות שריר השלד וקביעת תפקוד מתכווץ עם מתמר כוח רזולוציה ננו-ניוטון

Published: May 7, 2020 doi: 10.3791/61002
Automatic Translation
1, 1, 2, 1,3, 1
1Department of Physiology, Amsterdam UMC, 2Department of Kinesiology and Physical Education, Faculty of Education, McGill University, 3IONOptix BV

Summary

מוצג כאן פרוטוקול כדי להעריך את המאפיינים ההתכווצות של שרירים מחוסנים myofibrils עם רזולוציית ננו ניוטון. הפרוטוקול משתמש בהתקנה עם גשוש כוח אופטי מבוסס אינטרפרומטריה. הגדרה זו יוצרת נתונים עם יחס אות לרעש גבוה ומאפשרת הערכה של קינטיקה מתכוובת של myofibrils.

Abstract

תאי שריר מחוסנים הם הכרחיים לפעילות של בני אדם ובעלי חיים. סיבי שריר יחיד מורכבים myofibrils, אשר מורכבים סרקומרים מקושרים באופן סדרתי, יחידות כיווץ הקטן ביותר בשריר. תפקוד סרקומרי תורם חולשת שרירים בחולים עם מוטציות בקידוד גנים עבור חלבונים סרקומריים. המחקר של מכניקה myofibril מאפשר הערכה של אינטראקציות actin-מיוסין ללא השפעות מבלבלות פוטנציאליות של מיו-בריאן פגום, סמוך בעת מדידת ההתכווצות של סיבי שריר יחיד. נזק אולטרה-סטרו-סטרו-סטריאלי ואי-יישור של מיו-בריאן עשויים לתרום להתכווצות לקויה. אם קיים נזק מבני ב myofibrils, הם צפויים לשבור במהלך הליך הבידוד או במהלך הניסוי. יתר על כן, מחקרים ב myofibrils לספק את ההערכה של אינטראקציות actin-מיוסין בנוכחות האילוצים הגיאומטריים של הסרקומרים. לדוגמה, מדידות ב myofibrils יכול להאיר אם תפקוד myofibrillar היא ההשפעה העיקרית של מוטציה בחלבון סרקומרי. בנוסף, עירוי עם פתרונות סידן או תרכובות הוא כמעט מיידי בשל הקוטר הקטן של myofibril. זה עושה myofibrils מתאים במידה רבה כדי למדוד את שיעורי ההפעלה והרפיה במהלך ייצור כוח. הפרוטוקול המתואר במאמר זה משתמש בבדיקה של כוח אופטי המבוססת על העיקרון של אינטרפרומטר Fabry-Pérot המסוגל למדוד כוחות בטווח ננו-ניוטון, בשילוב מנוע אורך piezo ומערכת התזת צעד מהירה. הגדרה זו מאפשרת את המחקר של מכניקה myofibril עם מדידות כוח ברזולוציה גבוהה.

Introduction

תאי שריר מחוסנים הם הכרחיים עבור פעילויות חיי היומיום. תנועת גפיים, תפקוד נשימתי, ותנועת שאיבה של הלב להסתמך על הכוח שנוצר על ידי תאי שריר. שריר השלד מורכב fascicles שריר המכיל חבילות של סיבי שריר יחיד(איור 1A). סיבי שריר אלה מורכבים myofibrils, אשר נוצרים על ידי סרקומרים מקושרים באופן סדרתי (איור 1B,D). הסרקומרים מכילים נבטים דקים ועבים. אלה מורכבים בעיקר משרשראות של מולקולות אקין ומיוסין, בהתאמה(איור 1B). אינטראקציות Actin-מיויסין אחראים על יכולת ייצור כוח של שריר. חולים עם מוטציות בגנים קידוד חלבונים סרקומריים, כגון ערפילין, א-אקטין, וטרופונין T, סובלים חולשת שרירים עקב תפקודלקוי 1.

את איכות התכווצויות השרירים ניתן ללמוד ברמות שונות של הארגון, החל בשרירים שלמים vivo כדי אינטראקציות actin-myosin במבחנה motility אומר. במהלך העשורים האחרונים פיתחו מספר קבוצות מחקר הגדרות כדי לקבוע את ההתכווצות של myofibrilsבודדים 2, 3,4,,55,6,7,8,9,10. הגדרות אלה מבוססות על זיהוי של שינויים בהטיית לייזר מ cantilever (כלומר, סטיית קרן אופטית) הנגרמת על ידי התכווצות myofibril (לפרטים, ראה Labuda ואח'11). למרות קביעת הפונקציה ההתכווצות של myofibrils יש כמה מגבלות (למשל, הדינמיקה של תהליכי צימוד התכווצות-התכווצות הדרה כי הם במעלה הזרם של myofibrils חסרים), ישנם יתרונות מרובים לגישה זו. אלה כוללים: 1) את היכולת להעריך אינטראקציות actin-myosin בנוכחות האילוצים הגיאומטריים של הסרקומרים; 2) היכולת להעריך אינטראקציות actin-myosin ללא השפעות מבלבלות פוטנציאליות של מיופילים פגומים, סמוכים (בעת מדידת ההתכווצות של סיבי שריר יחיד נזק אולטרסטרוקטואלי ויישור של myofibrils עשוי לתרום להתכווצות לקויה) (איור 1D); 3) הקוטר הקטן של myofibrils (~ 1 μm, איור 2A)וחוסר קרום לאפשר דיפוזיה סידן כמעט מיידית לתוך הסרקומרים. יתר על כן, אם נזק מבני קיים ב myofibrils, הם צפויים לשבור במהלך הבידוד שלהם או במהלך הניסוי. לפיכך, הערכת התכווצות myofibril היא שיטה אלגנטית ללמוד את המנגנונים הבסיסיים של התכווצות שרירים ולהבין אם אינטראקציות א-אקטין-מיויסין מופרעות הן הגורם העיקרי למחלת שרירים הנגרמת על ידי מוטציות בחלבונים סרקומריים.

פרוטוקול זה מציג התקנה חדשה שפותחה כדי לקבוע את ההתכווצות של myofibrils המשלבת בדיקה כוח cantilever עם רזולוציית ננו-ניוטון (כלומר, Optiforce). גשוש כוח זה מבוסס על עקרון האינטרפרומטריה. אינטרפרומטריה מאפשרת שימוש בטילברים נוקשים יחסית. זה מאפשר למדוד כוח עם הסטה קטנה של cantilever, מתקרב התכווצויות איזומטריות של myofibril. הגשושית מאפשרת הערכה של כוחות פסיביים ופעילים נמוכים המיוצרים על ידי מיופיל אחד מבודד מבריופסיות שרירים שונות, כולל אלה של בני אדם, עם יחס אות לרעש גבוה. הגשושית האופטית של כוח cantilever המשולבת בהתקנה זו מבוססת על אינטרפרומטר Fabry-Pérot12. האינטרפרומטר מזהה תזוזות קטנות בין סיב אופטי לבין קטילבר מצופה זהב המותקן על פרול(איור 3). הפער בין הסיב האופטי לבין ה-cantilever נקרא חלל פברי-פרוט. Myofibrils מותקנים בין הגשוש מנוע piezo באמצעות שני סיבי זכוכית מצופה דבק הרכבה. הכוח המיוצר על ידי myofibril יכול להיות נגזר מתמטית מנתוני interferometer. אינטרפרומטריה מבוססת על מיקום העל או הפרעה של שני גלים או יותר (בהתקנה זו שלושה גלי אור). אור לייזר עם אורך גל בין 1,528.77-1,563.85 ננומטר נפלט מהאינטרפרומטר ונשלח דרך הסיב האופטי. בגשוש, האור משתקף 1) בממשק בין הסיב האופטי למדיום(איור 3A); 2) בממשק של המדיום ואת cantilever (איור 3B); ו 3) בממשק בין ציפוי מתכת וזהב של cantilever (איור 3C). ההשתקפות בממשק A ו- B תלויה במדד שבירה (n) של המדיום שבו הגשוש שקוע. האור, המורכב משלוש ההשתקפויות על-ידי, חוזר לפוטודיודה באינטרפרומטר. הפוטודיודה מודדת את עוצמת האור, שהיא תוצאה של דפוס ההפרעה של שלוש ההשתקפויות המודחות. כאשר כוח מתכווץ נוצר על ידי הפעלה או מתיחה myofibril, myofibril מושך על cantilever. תנועה זו משנה את גודל החלל(ד) וכתוצאה מכך, את מספר אורכי הגל המתאימים לחלל. האור הממוקם ב-cantilever יהיה שלב אחר, וכתוצאה מכך דפוס הפרעה שונה. הפוטודיודה מתעדת את השינוי הזה בעוצמת תבנית ההפרעה כשינוי בוולטס. לאחר מכן, דור כוח myofibril מחושב משינוי זה, תוך מתן בחשבון את נוקשות cantilever. גשושית הכוח מכוילת על ידי היצרן על ידי דחיפת קצה מחט ההרכבה, מחובר לקצה ההצמדה החופשי של cantilever, נגד סולם שקילה תוך שמירה על כיפוף של cantilever שווה כפול של אורך הגל של לייזר קריאה13. לכן, אינטרפרומטריה היא שיטה רגישה מאוד לזיהוי שינויים קטנים במרחק, המאפשר מדידה של כוחות עם רזולוציית ננו-ניוטון. החלטה זו מאפשרת הערכה של ייצור כוח myofibrillar עם יחס אות לרעש גבוה. בעוד אינטרפרומטריה מסורתית מגבילה את טווח המידות לחלק הליניארי של עקומת ההפרעה, באמצעות מגברים נעילה ואפנן של אורך גל הלייזר מתגבר עלמגבלה זו 14. הדבר מוסבר ביתר פירוט בסעיף הדיון.

כדי למדוד את המתח הפעיל myofibril, מערכת התזת צעד מהיר שולבה כדי לחשוף את myofibril לפתרונותסידן (איור 4A). מערכת ההתמהמה המהירה מאפשרת שינויי פתרון להתרחש בתוך 10 ms. בגלל הקוטר הקטן שלהם, דיפוזיה סידן לתוך myofibrils הוא כמעט מיידי. לפיכך, מערכת זו מתאימה במיוחד למדידת שיעורי כריכת actin-myosin במהלך ההפעלה ושחרור במהלך הרפיה. ניתן לקבוע את קצב ההפעלה (kACT)ואת ההרפיה (kREL)מהקימורים להרפיה של ההפעלה. כמו כן, על ידי חשיפת myofibrils לפתרונות סידן של הגדלת הריכוז, יחסי כוח סידן ורגישות סידן ניתן לקבוע.

יתר על כן, מנוע אורך piezo מאפשר מתיחות וקיצור מהיר של myofibril. זה מציע את האפשרות ללמוד את המאפיינים ויסולסטי (כלומר, מתח פסיבי) של myofibril, כמו גם ביצוע קיצור מהיר של מיופיל כדי לקבוע את קצב פיתוח מחדש מתח (kTR). הפרמטרים שאוחזרו מניסווני מתח אקטיביים ופסיביים יכולים להשתנות על ידי מוטציות גנטיות בחלבון סרקומרי.

התקנה זו שנבנתה בהתאמה אישית שימשה כדי למדוד את המאפיינים האקטיביים והפסיביים של myofibrils מבודדים משריר בריא של אדם, מטופל ושרד עכבר.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

הפרוטוקול לקבלת ביופסיות אנושיות אושר על ידי ועדת הביקורת המוסדית במרכז הרפואי של אוניברסיטת VU (#2014/396) והתקבלה הסכמה מדעת בכתב מהנבדקים. הפרוטוקול לקבלת ביופסיות שריר בעלי חיים אושר על ידי הוועדה המקומית לאתיקה של בעלי חיים באוניברסיטת VU (AVD114002016501)

1. הכנה ובידוד מיו-פיבריל

הערה: השתמש בשיטות שתוארו קודם לכן כדי גליצרין ביופסיות, להכין אתפתרונות ריכוזסידן שונים (pCa) 7,16,17, ולבודד myofibrils2,18.

  1. להפשיר את מרגיע (pCa 9.0, Rx) והפעלה (pCa 4.5, Act) פתרונות, כמו גם את המעכבים (1 M E64, 1 M DTT, 1 M leupeptin, 1 M PMSF), אשר מאוחסנים ב -80 °C.
  2. קח חתיכה גליצרית של ביופסיית שרירים משוריע של כ 1מ"מ 3 ולמקם אותו בצלחת פטרי קטנה עם 1:1 Rx / גליצרול (v / v) פתרון ולמקם את צלחת פטרי על צלחת קרה ב 4 מעלות צלזיוס.
  3. לנתח את פיסת השריר באמצעות מיקרוסקופ פעולה ומלקות, הפרדת סיבי שריר יחיד מבלי לבודד אותם מחתיכת שריר.
    הערה: להסיר כמה שיותר רקמת שומן וחיבור ככל האפשר כדי למנוע את הזיהום של השעיית myofibril.
  4. להעביר את פיסת הרקמה החתוכה לצינור 5 מ"ל עם 1.5 מ"ל של פתרון מרגיע עם מעכבים (1 μL/mL E-64, 1 μL/mL leupeptin, 1 μL/mL DTT, ו 125 μL/mL PMSF). מאפשרים לרקמות להתמתן בכ-4°C למשך שעה אחת.
  5. במהלך הדגירה, אתחל את שני המחשבים, הפעל את ההתקנים ופתח את התוכנה המשויכת (ראה טבלת חומרים).
  6. לשקוע גשושית הכוח במים אולטרה פורים בצלחת פטרי ולכייל את הגשוש.
    1. לחץ על 'אשף ההפעלה' באינטרפרומטר ובצע את ההוראות שעל המסך. לאחר לחיצה על כיול, הקש על שלב המיקרוסקופ.
      הערה: הקשה על שלב המיקרוסקופ תגרום לחיידק להסיט ולעבור דרך השוליים. הדבר מאפשר כיול הגשוש.
    2. השאירו את הגשוש שקוע במים האפורים במיוחד בצלחת פטרי לאחר הכיול.
  7. לאתחל את המיקום מנוע piezo. כך, בצע את אחד השלבים המפורטים להלן.
    1. כאשר מנוע piezo ישמש עבור מתח kTR, להגדיר את האורך 0 μm.
      ניתן למצוא הגדרות מחולל אותות בטבלה 1, איור 5A.
    2. כאשר מנוע piezo ישמש למתח פסיבי, להגדיר את האורך 50 μm.
      ניתן למצוא הגדרות מחולל אותות בטבלה 1.
      הערה: ההבדל בין השלבים הוא המיקום הראשוני של מנוע אורך piezo. כדי למתוח את myofibril, מנוע piezo צריך למשוך כדי להגדיל את המרחק בין מחטים הרכבה כדי להאריך את myofibril. כדי לרפף את myofibril, מנוע piezo צריך לדחוף כדי להקטין את המרחק בין מחטי הרכבה ולקצר את myofibril.
  8. הכן מגלשת מיקרוסקופ. פיפטה 150 μL של polyhydroxyethylhacrylate (פולי-HEMA) פתרון (5% פולי-HEMA ב 95% אתנול, w / v) על שקופית מיקרוסקופ ולהפיץ אותו על פני השקופית כך הכל מכוסה.
    הערה: אם מתלה myofibril הוא pipetted על שקופית מיקרוסקופ לא מצופים, myofibrils לשקוע לתחתית ייצמד לשקופית מיקרוסקופ ולא ניתן יהיה להדביק אותם.
  9. מלא מזרקים בפתרונות pCa (ראה איור 4A)וראש מערכת ההתבות.
    הערה: בשלבים אלה כל הצינורות ממולאים מראש עם הפתרון המתאים כדי לוודא שכל בועות האוויר מוסרות מהצינורות.
    1. מלא את צינורות הזרימה של זרימת הרקע של תא הזרימה (איור 3, 4A) עם Rx.
    2. בעת שימוש, לשטוף את הסעפת עם מים אולטרה פורים כדי להסיר את האוויר. כך, חבר את המזרק עם מים אולטרה-תכליתיים לשקע ושטוף אותו בכיוון ההפוך. חסום את היציאות שאינן נמצאות בהן סעפת.
    3. אפשר לכל מזרק pCa למלא את הצינורות שלהם בהתאמה עם פתרון pCa. לאחר מכן, חבר אותם לסעפת Ɵ הזאת.
    4. שסתומים פתוחים 1 ו-6 עם תוכנת לוח רכישת הנתונים (ראה טבלת חומרים)על-ידי בדיקת הלחצן '1+6' (איור 6A) כדי למלא את Ɵ-זכוכית עם מרגיע (pCa 9.0) והפעלה (4.5) פתרונות וסתומים סגורים כאשר Ɵ זכוכית מלאה(איור 6B).

2. הרכבת מיו-פיבריל

  1. ציפוי שקופית מיקרוסקופ עם פולי-HEMA כדי למנוע myofibrils להיצמד לזכוכית.
  2. הכינו את ההומוגניזר (ראה טבלת חומרים)להומוגניזציה של רקמות. נקה את מוט הרוטור הפנימי עם נייר טישו נקי, להרכיב את homogenizer, ולסובב 1x עבור 15 s באלכוהול ו שלוש פעמים עבור 15 s כל במים אולטרה טהורים. לשטוף מראש את homogenizer בתמיסה מרגיעה 1 x עבור 15 s על קרח.
  3. מניחים את מוט homogenizer בצינור המכיל את רקמת השריר כמתואר בשלב 1.4, תוך שמירה על הצינור על קרח, לסובב את הרוטור עבור 15 s על מהירות 5 לקרוע את רקמת השריר ולקבל מתלה myofibril.
  4. פיפט ~ 50 μL של מתלה myofibril ו ~ 250 μL של הפתרון המרגיע על שקופית מיקרוסקופ מצופה פולי-HEMA באמבט רקמות. זה יגבש טיפה נוזלית. מכסים את האמבטיה במכסה כדי להגן מפני אבק והמתינו 5-10 דקות כדי לאפשר למיו-פיברילים לשקוע לתחתית.
    הערה: היחס בין המתלים לפתרון המרגיע תלוי באיכות הבידוד, ולכן, מותאם בהתאם. לדוגמה, אם התשואה myofibril הוא נמוך וכמה myofibrils מתאים נוכחים השעיה, להוסיף יותר השעיה myofibril ולדלל עם פתרון פחות מרגיע (למשל, 75 μL של השעיה myofibril ו 225 μL של פתרון מרגיע). קל לזהות רקמת שריר הלב והשלד בשל דפוס ההתפתלות שלו. באמצעות מטרה 10x או 40x, דפוס זה גלוי גם מיו-פיבריל יחיד. במקרה רקמה אחרת נמצאת בהשעיה, myofibrils ניתן לבחור חזותית. אחד יכול לדלג על 5 - 10 דקות לחכות. עם זאת, זה מגביר את הקושי של ההבקת מיו-בריאן.
  5. מעיל הרכבה מחטים עם דבק (shellac + אתנול; 120 shellac מ"ג ב 2 מ"ל של 70% אתנול). כך, מחממים את הדבק ב-65°C ל-30-60 שניות ופיפטה ~ 6 μL על מגלשת זכוכית חדשה שאינה מצופים. טובלים את קצה כל מחט הרכבה בדבק וחוזרים על הפעולה עד ששכבת דבק נראית לעין. להזיז את הגשוש ואת piezo למעלה אנכית עם micromanipulators כדי לפנות מקום למקם את אמבט הרקמות על שלב המיקרוסקופ. הסר את מגלשת הזכוכית המכילה את הדבק.
  6. הרכבת המיו-פיברילים
    1. מניחים את אמבט הרקמות עם מגלשת המיקרוסקופ מצופה פולי-HEMA המכיל את מתלי myofibril על שלב המיקרוסקופ. השתמש בבמה כדי למצוא מיו-פיבריל מתאים עם המטרה 40x. במידת הצורך, להזיז ולסובב את אמבט הרקמות כדי להעביר את myofibril לעמדה הניתנת להרכבה.
      הערה: חפש myofibrils עם תבנית ההתלה הנראה כי הם כ 30 μm ארוך. כפי שמתואר בפירוט בשלבים 3.1 ו 3.2.1 ניתן לבדוק אורך ואורך sarcomere לפני ההתגלות myofibril. אין להדביק myofibrils קרוע, כי אלה צפויים לשבור במהלך התכווצות.
    2. החלק את תא הזרימה למקומו ישירות מעל הטיפה הנוזלית המכילה את המיו-פיבריל באמבט הרקמה (מקטר על המגלשה בשלב 2.4) והנמך אותה. עצור לפני שהוא פוגע בטיפה הנוזלית.
    3. מנמיך את מחט ההרכבה piezo ולחץ אותו בקצה התחתון של myofibril. הרם אותו מעט כדי לבדוק אם myofibril מחובר למחט.
    4. הנמך את תא הזרימה מספיק רחוק כדי שהמחט ההרכבה של הגשוש תגיע לתחתית מבלי שהגשוש ייגע בתא הזרימה.
    5. לחץ על מחט ההרכבה של הגשוש בקצה העליון של המיו-פיבריל. הרם אותו מעט כדי לבדוק אם myofibril מחובר למחט.
    6. הרם את המיו-פיבריל מתחתית האמבטיה ככל האפשר מבלי לאבד את היכולת להתמקד מבלי שהמטרה נוגעת בתחתית הזכוכית.

3. אתחול ניסוי

  1. השתמש micromanipulators, מצלמה, ותוכנה בקר מערכת (איור 7A, ראה טבלת חומרים) כדי למדוד את אורך sarcomere. להזיז את הפאיזו ו /או לכפות בדיקה כדי להגדיר את אורך sarcomere הראשוני של myofibril ל 2.5 μm.
    הערה: אורך סרקומר של 2.5 μm מבטיח חפיפה אופטימלית בין ראשי מיו-רין ו- actin.
  2. באמצעות פונקציית כלי השיט של תוכנת בקר המערכת למדוד את האורך והרוחב myofibril(איור 7B,C).
    הערה: בעת סיבוב המצלמה, היא עשויה להטות אופקית ו/או אנכית. כדי לבדוק את יישור המצלמה, ניתן להשתמש ברמת רוח כדי לוודא שהמצלמה מסתובבת ולא מוטה.
    1. מקם את המיו-פיבריל במרכז תמונת הווידאו באמצעות שלב המיקרוסקופ.
    2. צייר ריבוע מצד אחד של המיופיבריל לצד השני. לאורך, הקפד לכלול את הקצה הכהה שלטיפות הדבק (איור 2A)בריבוע מכיוון שעיבוד התמונה מבוסס על ניגודיות.
    3. התחל להקליט את הנתונים בתוכנה של בקר המערכת (ראה טבלת חומרים)על-ידי הקשה על 'התחל' ולאחר 5 שניות השהה את הקלטת נתוני התוכנה של בקר המערכת על-ידי לחיצה עללחצן' השהה'. האורך נרשם כעת בנתונים.
    4. עבור הרוחב סובב תחילה את המצלמה ב- 90° (ראה טבלת חומרים)ולאחר מכן השתמש בחדות הקצה של המיו-פיבריל עצמו.
    5. התחל להקליט את הנתונים בתוכנה של בקר המערכת (ראה טבלת חומרים)על-ידי הקשה על 'התחל' ולאחר 5 שניות השהה את הקלטת נתוני התוכנה של בקר המערכת על-ידי לחיצה עללחצן 'השהה'. הרוחב נרשם כעת בנתונים.
  3. אם יש לקבוע מתח פעיל של המיו-פיבריל, יש להשתמש בהגדרת ההתזות. אם כן, המשך לשלב 3.4. אם רק ייקבע מתח פסיבי, דלג על שלבים 3.4-4.1.3.7 והמשך בשלב 4.2.
  4. מקם ואותחל את כיוונון ההתזה.
    הערה: הדבר נחוץ רק לדור של כוח פעיל. המשך לשלב 4.2 בעת ביצוע ניסויי מתח פסיבי.
    1. הגדר את מיקום המנוע המהיר ב- 4 V(איור 5B).
    2. החלק את מעמד התוכונת על הטבלה כדי ליישר את הפינה השמאלית התחתונה של מעמד עם הקלטת על השולחן.
      הערה: היזהר לא להכות את הגשוש כוח או מנוע piezo.
    3. השתמש במניפולטור כדי למקם Ɵ בעין.
    4. הסתכלו דרך העינית והזיזו בזהירות את Ɵ התריס לכיוון המיו-פיבריל באמצעות המניפולטור.
    5. ישר את הערוץ העליון של Ɵ-זכוכית עם myofibril באמצעות מניפולטור ולבדוק את המיקום על ידי ביצוע שלב מהיר (הגדרות מחולל אותות ניתן למצוא בטבלה 1)עם תוכנת בקר המערכת (איור 2B–C, ראה טבלת חומרים).
      הערה: ודא כי הערוץ התחתון יהיה מיושר עם myofibril במהלך שלב ההפעלה של השלב המהיר (איור 2B–C).
  5. הפעל את זרימת הרקע של Rx (איור 4A) כדי ליצור זרימת רקע למינאר בתא הזרימה.
    הערה: זרימת הרקע נחוצה כדי למנוע זרימה סוערת כתוצאה מזרם פתרון pCa Ɵ ה-13.
    1. הפעל זרימה של תא זרימה עם ידית שסתום Luer.
      1. שלח את הפרמטרים הבאים למשאבת הזרימה כדי להתחיל לרוקן את תא הזרימה ולמנוע הצפה של תאהזרימה (איור 9):שסתום = שסתום אמבטיה (2); מצב מיקרו-צעד = מיקרו; יעד בוכנה = 48,000; מהירות בוכנה = 38-40 (שרירותי).
        הערה: ודא כי רמת הנוזלים יציבה בכל עת. המיו-פיבריל לא צריך להתייבש וגם לא ה-cantilever. עדיף שיהיה קצת יותר מדי הצפה מאשר זרימה קטנה מדי.
  6. כדי להגדיר את הטמפרטורה לערך הרצוי עם בקר טמפרטורה תרמואלקטרי(איור 8, ראה טבלת חומרים), הזן את הטמפרטורה הרצויה ולחץ 'התחל'. המתן עד שהטמפרטורה הרצויה תותוזמן על-ידי בדיקת הגרף בתוכנה של בקר טמפרטורה תרמואלקטרית והמשך.
    הערה: בעת ביצוע ניסויים בטמפרטורת החדר, אין להשתמש בבקר הטמפרטורה התרמואלקטרית.

4. פרוטוקולים ניסיוניים

  1. החלט אילו פרוטוקולי כוח פעילים יש לבצע.
    הערה: בהתאם לנתונים הדרושים למחקר, ניתן לבצע סוגים מרובים של ניסויי כוח פעיל: שלב 4.1.1, מדידה של הכוח המרבי ברוויה [Ca2+ +2]; שלב 4.1.2, קבלת עקומת Force-pCa כדי לקבוע את רגישות הסידן בנוסף לשלב 4.1.1; שלב 4.1.3, קביעת קצב ההתפתחות מחדש של המתח על-ידי ביצוע פרוטוקול קיצור-restretch בנוסף לשלב 4.1.1 או 4.1.2.
    1. למדוד כוח פעיל מקסימלי.
      1. התחל להקליט את הנתונים בתוכנה של בקר המערכת (ראה טבלת חומרים) על-ידיהקשה על 'התחל'.
      2. שסתומים פתוחים 1 ו- 6 עם לוח רכישת נתונים (ראה טבלת חומרים)תוכנה על ידי בדיקת הכפתור '1+6' כדי להתחיל זרימת Ɵ זכוכית של הפתרון מרגיע והפעלת פתרון באמצעות Ɵ -glass (איור 6A).
      3. אפס את טווח האינטרפרומטר כך שכוח הבסיס יהיה 0 V על-ידי בחירה והקשה על 'טווחאיפוס ' באינטרפרומטר (ראה טבלת חומרים).
      4. כאשר מעקב הכוח יציב, בצע את השלב המהיר Ɵ זכוכית (גודל שלב = 100 μm).
        ניתן למצוא הגדרות מחולל אותות בטבלה 1 (איור 5C). מעקב הרפיה-הפעלה הדומה איור 4D יירשם וגלוי בתוכנה בקר המערכת.
      5. השהה את הקלטת נתוני התוכנה של בקר המערכת על-ידי לחיצה עללחצן' השהה'.
      6. אם לא יבוצעו הפעלות נוספות, סגור את השסתומים 1 ו- 6 כדי לעצור את זרימת הזכוכית Ɵ על-ידי ביטול הסימון של הלחצן '1+6' (איור 6B), הפסקאת משאבת המזרק ( איור 9 , ראהטבלת חומרים )על-ידי לחיצה על 'סיום', ולעצור את זרימת הרקע על-ידי סגירת שסתום Luer.
    2. עקומת כוח-pCa
      הערה: הדבר דומה לשלב 4.1.1 כדי להשיג את הכוח הפעיל המקסימלי, אך עם הפעלות מרובות באמצעות פתרונות pCa שונים.
      1. התחל להקליט את הנתונים בתוכנה של בקר המערכת על-ידי הקשה על'התחל'.
      2. שסתומים פתוחים 1 ו-2 עם תוכנת לוח רכישת הנתונים כדי להתחיל את הזרימה של פתרון מרגיע וpCa 6.2 דרך Ɵ זכוכית.
      3. אפס את טווח האינטרפרומטר כך שהכוח הבסיסי יהיה 0 V על-ידי בחירה והקשה על 'טווח איפוס' באינטרפרומטר.
      4. כאשר מעקב הכוח יציב, בצע את השלב המהיר Ɵ זכוכית (גודל שלב = 100 μm).
        ניתן למצוא הגדרות מחולל אותות בטבלה 1.
      5. השהה את תוכנת בקר המערכת על-ידי לחיצה עללחצן' השהה'.
      6. חזור על שלבים 4.1.2.1-4.1.2.4 עבור שסתומים 1 ו- 3 (pCa 5.8), שסתומים 1 ו- 4 (pCa 5.6), שסתומים 1 ו- 5 (pCa 5.4) ושסתומים 1 ו- 6 (pCa 4.5).
      7. אם לא יבוצעו הפעלות נוספות, סגור את השסתומים 1 ו- 6 כדי לעצור את זרימת Ɵ-glass על-ידי ביטול הסימון של הלחצן '1+6'(איור 6A), עצוראת משאבת המזרק (איור 9) על-ידי לחיצה על 'סיום', ועצור את זרימת הרקע על-ידי סגירת שסתום Luer.
    3. למדוד את קצב הפיתוח מחדש של מתח (kTR).
      הערה: הדבר דומה לשלב 4.1.1 עבור כוח פעיל ממקסם אך עם כמה שינויים וצעדים נוספים.
      1. לחשב את תנועת piezo הדרוש כדי רפוי myofibril 15% ולהזין ערך זה במחולל אותות(איור 5D, טבלה 1).
      2. התחל להקליט את הנתונים בתוכנה של בקר המערכת על-ידי הקשה על 'התחל'.
      3. שסתומים פתוחים 1 ו-6 עם לוח רכישת נתונים (איור 6A) תוכנה כדי להתחיל זרימה של הפתרון המרגיע pCa 4.5 דרך Ɵ זכוכית.
      4. אפס את טווח האינטרפרומטר כך שהכוח הבסיסי יהיה 0 V על-ידי בחירה והקשה על 'טווח איפוס' באינטרפרומטר.
      5. כאשר מעקב הכוח יציב, בצע את השלב המהיר Ɵ זכוכית (גודל שלב = 100 μm).
        ניתן למצוא הגדרות מחולל אותות בטבלה 1.
      6. כאשר רמת הכוח מגיעה, בצע את הקיצור-restretch עם piezo.
        ניתן למצוא הגדרות מחולל אותות ב (איור 5D, טבלה 1). מעקב הרפיה של הפעלה הדומה לא איור 4E יירשם ויהיה גלוי בתוכנה של בקר המערכת.
        הערה: ניתן להשתמש בפרוטוקול מותאם אישית כדי להפוך את השלבים לעיל לאוטומטיים.
      7. השהה את תוכנת בקר המערכת על-ידי לחיצה עללחצן' השהה'.
      8. אם לא יבוצעו הפעלות נוספות, סגור את השסתומים 1 ו- 6 כדי לעצור את זרימת Ɵ-glass על-ידי ביטול הסימון של הלחצן '1+6' (איור 6B), להפסיק את משאבת המזרק (איור 9) על-ידי לחיצה על 'סיום', ולעצור את זרימת הרקע על-ידי סגירת שסתום Luer.
  2. בצע מדידות כוח פסיביות.
    1. לבצע מתיחה רציפה.
      1. לחשב את תנועת piezo הדרוש כדי למתוח את myofibril ולהזין ערך זה במחולל האות(טבלה 1).
        הערה: אלה הגדרות לדוגמה. חשב את כמות המתיחה והזמן של מתיחה ביחס לאורך sarcomere. הגדרות אלה נחוצות כדי להבטיח כי מהירות המתיחה לכל sarcomere נשאר שווה על פני myofibrils.
      2. התחל להקליט את הנתונים בתוכנה של בקר המערכת על-ידי הקשה על 'התחל'.
      3. אפס את טווח האינטרפרומטר כך שהכוח הבסיסי יהיה 0 V על-ידי בחירה והקשה על 'טווח איפוס' באינטרפרומטר.
      4. לבצע מתיחה רציפה עם מחולל האות בתוכנה בקר המערכת כדי להפעיל את piezo. ניתן למצוא הגדרות מחולל אותות לדוגמה בטבלה 1.
      5. לקצר את myofibril כדי רפוי אורך עם piezo לאחר המתיחה הסתיימה(טבלה 1).
    2. לבצע מתיחה צעד צעד.
      1. התחל להקליט את הנתונים בתוכנה של בקר המערכת על-ידי הקשה על 'התחל'.
      2. אפס את טווח האינטרפרומטר כך שהכוח הבסיסי יהיה 0 V על-ידי בחירה והקשה על 'טווח איפוס' באינטרפרומטר.
      3. לבצע מתיחה צעד צעד עם מחולל האותות בתוכנה בקר המערכת כדי להפעיל את piezo. ניתן למצוא הגדרות מחולל אותות לדוגמה בטבלה 1 (איור 5E).
    3. לקצר את myofibril כדי רפוי אורך עם piezo לאחר המתיחה הסתיימה. ניתן למצוא הגדרות מחולל אותות לדוגמה בטבלה 1.
  3. השהה את תוכנת בקר המערכת על-ידי לחיצה עללחצן' השהה'.
  4. הפסק את הקלטת הנתונים על-ידי לחיצהעללחצן ' עצור' בתוכנה של בקר המערכת.
  5. שמור את הנתונים על-ידיהקשה על' קובץ ' ו -שמורנתונים ' בתוכנה של בקר המערכת.

5. ניקוי

  1. הסר את המיו-פיבריל המדוד והתכונן ל myofibril הבא.
    1. כדי לעשות זאת, בזהירות לקרוע את myofibril תוך הסתכלות דרך ה עינית עם המטרה 40x.
    2. תקדם את הגשוש והפאיזו. הזיזו Ɵ ה-10 00:00:00,000-&10:00,000-&10:00,000-&0 ואז לזוז למעלה ולהחליק משם את תא הזרימה. הסר את אמבטיית הרקמות.
    3. כדי לנקות את מחט ההרכבה, להביא אותו לפוקוס באמצעות 10x ואת ה עינית. טובלים את המברשת באתנול ומברישים בזהירות ומסירים את הדבק מהמחט.
      הערה: זכור כי ייתכן שאקח זמן עד שהדבק יורד.
    4. יש לשטוף את תא הזרימה ואת אמבט הרקמות במים אולטרה-תכליתיים.
    5. מניחים את הגשוש בצלחת פטרי קטנה מלאה במים אולטרה-תוחמים. ודא שהגשוש שקוע לחלוטין.
  2. לאחר סיום הניסויים, נקה את ההתקנה כאמור לעיל ובצע את השלבים הנוספים הבאים.
    1. רוקן את הצינורות מאמבטיית הזרימה. שלח את הפרמטרים למשאבת מזרק הזרימה (ראה טבלת חומרים , איור 9). שסתום = שסתום אמבטיה (2); מצב מיקרו-צעד = רגיל; יעד בוכנה = 0; מהירות בוכנה = 30.
      הערה: סיים את הפקודה כאשר הצינורות ריקים.
    2. לאתחל את המשאבה מספר פעמים (איור 9B).
    3. תרוקן את המזרקים. כדי לעשות זאת, לסגור את כל שסתומי Luer, לפתוח את כל השסתומים, להסיר את הצינורות מהמחט של המזרק, להחזיק את הצינור של pCa ספציפי מתחת למחט, ולפתוח את שסתום Luer. השתמש בתקעי הלחץ כדי להאיץ את התהליך.
    4. לחבר מחדש את הצינורות למחט של המזרק. מלא מזרקים עם ~ 5 מ"ל של מים אולטרה-תכליתיים. מניחים מתחת Ɵ הזאת. פתח את כל השסתומים ופתח את שסתום הלחץ כדי לשטוף את המערכת.
    5. כבה את המערכת. כבה את המחשב, האינטרפרומטר ובקר Piezo בלוק חשמל.

6. ניתוח נתונים

  1. יצא עקבות נתונים מהתוכנה של בקר המערכת (ראה טבלת חומרים)לתוכנית או ללוח של גיליון אלקטרוני על-ידי פתיחת קובץ הנתונים ובחירה במקטע הרצוי. העקבות המוצגות ייוצאים (לדוגמה, כוח גולמי, אורך סרקומר ומיקום פיזו).
  2. בצע ניתוח עם התוכנה של בחירה (למשל, MATLAB).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

מעקבי נתונים נרשמו ונפתחו באמצעות תוכנת בקר המערכת (ראה טבלת חומרים). מעקבים מלאים או מקטעים נבחרים יוצאו ללוח או לקובץ הטקסט לצורך ניתוח נוסף עם תוכנה רצויה. שסתומים לשליטה בזרימה של הפתרונות השונים הוחלפו עם תוכנה מותאמת אישית או באופן ידני. סקריפט MATLAB מותאם אישית שימש לניתוח שיעורי ההפעלה, פיתוח מחדש של מתחים והרפיה. הכוח הפעיל המרבי והשיא והכוח המיושט של ניסויי הכוח הפסיבי נלקחו ישירות ממשיק כוח התוכנה של בקר המערכת. לאחר הרכבת מיו-פיבריל(איור 2),נבחר הפרוטוקול הרצוי.

כוח פעיל מרבי וסידן-רגישות הכוח ב-myofibrils מבודד ביופסיות שריר השלד והעכבר האנושי
באות 4א מתוארת ההתקנה הניסיונית המשמשת לניסואי כוח פעילים באופן סכמטי. עקבות כוח של ניסוי כוח פעיל עם מיופיבריל מבודד משריר ארבע ראשי אנושי בריא מוצגים. myofibril הופעל 5 פעמים עם פתרונות עם pCa משתנה (pCa 6.2, 5.8, 5.6, 5.4, 4.5; נתונים המוצגים איור 4B). הכוח המרבי הממוצע של כל myofibrils בניסוי זה היה ~ 123 mN / מ"מ2. עקומת כוח-pCa נבנתה מהכוחות המישור הגיע במהלך כל הפעלה בכל אחד מחמשת פתרונות סידן. התוצאות מוצגות באות 4C. מתוך עקומה זו חושב ה-pCa ב-50% מייצור הכוח המרבי (pCa50). ב מיו-פיבריל הזה,הפי-סי-סי-50 היה 5.75.

בנוסף, תרכובות אחד או מרובות ניתן להוסיף לפתרון חדור כדי למדוד את השפעתו על הכוח המיוצר על ידי myofibril. בדמות 4D, ההשפעה של N-בנזיל-p-טולואן sulphonamide (BTS), שריר עוויתות מהיר (סוג II) מעכב שרשרת כבדה מיואוזן II (MHCII), מאויר. 19 מיופיבריל הופעל ראשון עם פתרון pCa 5.6, ולאחר מכן עם pCa 5.6 + פתרון BTS. במהלך ההפעלה השנייה פחות כוח הופק, המציין כי זה היה מיו-פיבריל שהכיל MHCII. ישנן מוטציות בחלבונים כי הם קיימים אך ורק בסוגי שרירים ספציפיים, ולכן להשפיע רק myofibrils מסוג שריר ספציפי זה. במקרה זה, 'הקלדת' myofibrils חשוב להבחין את ההשפעה מוטציה על סוגי השרירים השונים. כמו כן, דוגמה זו ממחישה את האפשרות לבדיקת היעילות של תרכובות טיפוליות ב myofibrils.

איור 4E מראה עקבות כוח פעיל של מיו-פיבריל בודד המבודד רקמת שריר סוליה של השלד העכבר. myofibril היה רכוב בהתקנה וחדור עם פתרון מרגיע (pCa 9.0), ואחריו עירוי עם פתרון הפעלה (pCa 4.5, ~ 0.032 mM סידן). בו זמנית הקלטנו את הכוח ואת אורך הסרקום. זה היה התכווצות איזומטרית כמעט, כמו הסטה cantilever היה ~ 0.5 μm, אשר היה כ 1% של אורך רפוי של myofibril (~ 50 μm). באיור 4E בוצע פרוטוקול קיצור מהיר במהלך התכווצות פעילה כדי להעריך את קצב הפיתוח מחדש של המתח (kTR, קו מקווקו צהוב). KTR הוא מדד של קינטיות רכיבה על אופניים חוצי גשר. כמו כן, עקומות ההפעלה וההרפיה הותקנו כדי לקבוע את קצב ההפעלה (kACT, קו מקווקו אדום) והרפיה (kREL, קו מקווקו ירוק), בהתאמה. איור 4 מציג תצוגה מפורטת יותר של שלב ההרפיה המודגש בדמות 4F. שני שלבים התבהרו: 1) שלב איטי ראשוני של הרפיה (נשלט על ידי ניתוק גשר חוצה) ו 2) שלב מהיר של הרפיה (נשלט על ידי ניתוק גשר חוצה וסידן-דיסוציאציה)20.

כוח פסיבי ב myofibrils מבודד מבריופסיה שריר השלד האנושי
איור 10 מראה עקבות של ניסוי כוח פסיבי עם מיו-פיבריל מבודד רקמת שריר אנושית בריאה. הפרוטוקול הראשון כלל מתיחות פסיביות אחת או מרובות כדי לקבוע את המאפיינים צמיגים של הסרקומרים. איור 10 מראה עקבות כוח של מתיחה רציפה של myofibril (למתוח מאורך sarcomere 2.2–3.0 μm). במהלך המתיחה, myofibrils הציגו מאפיינים צמיגיים ואלסטיים. הדבר ניכר מהעקומה המוצגת באות 10A. הפסגה החדה מייצגת את שני המאפיינים, בעוד שכוח הרמה הוא מדד של גמישות. צמיגות מתנגדת למתח באופן ליניארי. כך, הכוח נפל לאחר הסרת הזן. איור 10B מדגיש את המתיחה עצמה וממחיש את יחס האות לרעש הגבוה. שים לב שעקבות כוח אינן מסונות.

Figure 1
איור 1: תיאור סכמטי ותמונות מיקרוסקופיות אלקטרונים של שריר השלד ומורפולוגיה שלו. (A)מראה את המבנה של שריר השלד ו -(ב)מראה את המבנה של sarcomere, יחידת ההתכווצות הקטנה ביותר. תמונות סכמטיות אלה מותאמות לאמנות הרפואית Servier. (ג)מראה תמונה של סיבי שריר יחיד ו -(D)מראה תמונה מיקרוסקופית אלקטרונים של סיבי שריר החושפת נזק myofibrillar, כמו גם אולטרה מבנה מיובריילר משומר. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 2
איור 2: תמונות המציגות מיו-פיבריל רכוב, Ɵ זכוכית מזכוכית ומחט הרכבה לפיזו. (א)myofibril רכוב באורך רפוי בין מחטי סיבי זכוכית מצופה shellac כפי שניתן לראות דרך יעד 40x. (ב)תמונות של המיקום של Ɵ ה-10 ביחס מיופיבריל (מודגש עם אליפסות לבנות) כפי שניתן לראות דרך מטרה 10x. (למעלה) אני לא יודע. מיושר לערוץ העליון (פתרון מרגיע, pCa 9.0); (למטה) אני לא יודע. מיושר לערוץ התחתון (הפעלת פתרון, pCa 4.5) כדי להסתפר מיו-פיבריל עם סידן ו לגרום להתכווצות. (ג)תיאורים סכמטיים של מיקום Ɵ זכוכית יחסית למיופיבריל. (למעלה) אני לא יודע. מיושר עם הערוץ העליון (פתרון מרגיע, pCa 9.0); (למטה) אני לא יודע. מיושר עם הערוץ התחתון (פתרון ההפעלה, pCa 4.5) כדי להסתפר מיו-פיבריל עם סידן ו לגרום להתכווצות. (ד)מחט הרכבה המחוברת למוט הפחמן של מחזיק הפאיזו. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 3
איור 3: ייצוג סכמטי של התא ההקמה והסוף של תא זרימת הרקמה. בכחול כהה תא זרימת הרקמות עשוי מאלומיניום, ובלבן החלל שבו גשושית הכוח Ɵ זכוכית מוצגים בעמדה; (מרכז) אני לא יודע. מיופיבריל מחובר בין שתי מחטי הרכבה סיבי זכוכית המחוברים לבדיקה כוח מנוע אורך piezo. ה Ɵ התותן מיושרת עם המיו-פיבריל. ה Ɵ ה-10 00:00:00,000 ----------------------------יתההההההההההההההההההההההה (מימין) אני לא יודע. תקריב של הגשוש של כוח ה"קטילבר". מצוין גודל החלל (או חלל Fabry-Pérot, d); ממשקי השתקפות A, B ו- C; ותו לא, לא, לא, לא, לא, לא, לא, לא, לא, לא, לא, לא, לא, לא, לא, לא, לא, לא, לא, לא, לא, לא, הקנטילבר מותקן על כתפו של הגלגל. הסיב שנושא את הלייזר מהאינטרפרומטר יוצא מהפרול בקצה הנוהר. סיב זכוכית הרכבה קבוע על cantilever באמצעות שעווה. (למעלה משמאל) האינטרפרומטר מנתח את אות האינטרפרומטר המשודר לתוכנה של בקר המערכת. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 4
איור 4: התקנה ניסיונית ונתונים מניסווי מתח פעילים. (א)ייצוג סכמטי של כיוונון ההתעוות והפתרונות המשמשים. שים לב כי הצינורות הראשונים וההאחרונים (כחול בהיר) מכילים פתרון ללא סידן (כלומר, פתרון מרגיע). (ב)עקבות כוח לדוגמה של ניסוי מתח פעיל עם מיו-פיבריל מבודד רקמת שריר השלד האנושי מראה חמש הפעלות מפתרון מרגיע (pCa 9.0) לפתרונות הפעלה מרובים (pCa 6.2 – 4.5). עקומתסידן כוח; רמות הכוח ברמות בלוח ( B )היומנורמלים וSumed נגד רמות הסידן שלהם בהתאמה. (ד)סימן כוח לדוגמה של סוג II (עווית מהירה) מיו-פיבריל מבודד משריר השלד האנושי מופעל עם פתרון pCa 5.6 (כחול) ולאחר מכן עם pCa 5.6 + BTS (מעכב חוצה גשר ספציפי סוג II, אדום). (ה)סימן נתונים לדוגמה של ניסוי מתח פעיל עם myofibrils מבודד רקמת שריר השלד סוליית העכבר עם פרוטוקול קיצור-restretch מהיר במהלך ההפעלה כדי לקבוע את קצב של פיתוח מחדש מתח (kTR, קו מקווקו צהוב). כמו כן, עקומת ההפעלה וההרפיה הותקנו כדי לקבוע את קצב ההפעלה (kACT, קו מקווקו אדום) והרפיה (kREL, קו מקווקו ירוק), בהתאמה. (F)זום של שלב ההרפיה (למעלה משמאל), מודגש ב (E). האות המוטורי המהיר (למטה משמאל) הצביע על נקודת הזמן שבה הפתרון השתנה מפתרון הפעלה (pCa 4.5) לפתרון מרגיע (pCa 9.0). שלב ההרפיה כלל שלב ליניארי ואיטי (מימין למעלה) ושלב אקספוננציאלי ומהיר (מימין למטה). לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 5
איור 5: הגדרת דוגמה עבור מחולל האותות בתוכנה לבקרת המערכת. (ראה טבלת חומרים). 1) מציין את הלחצן לביצוע פקודות שהוזנו במחולל האותות. (א)הגדרת מנוע אורך piezo. (ב)הגדרת מנוע צעד מהיר. (ג)ביצוע שלב מהיר להפעלת מיו-פיבריל למשך זמן של 5שניות (D)ביצוע קיצור מהיר של מיו-פיבריל כדי לקבוע את ה-kTR. (ה)ביצוע קטע צעד צעד של מיופיבריל כדי לקבוע את המאפיינים צמיגתי. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 6
איור 6: תוכנת בקר שסתום כדרך למחשב. (א)הכפתור המשמש לפתיחה שסתומים 1 (Rx) ו- 6 (מעשה). (ב)מצב הכפתורים כאשר כל השסתומים סגורים. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 7
איור 7: מדידת אורך sarcomere, אורך myofibril, ורוחב myofibril עם תוכנת בקר המערכת. סרגל משמש כדוגמה. (א)מדידת אורך sarcomere: הקופסה הסגולה ממוקמת סביב myofibril ואת אורך sarcomere מוצג (1). (ב)מדידת האורך: תיבת ציאן ממוקמת מתחילתו ועד סופו של myofibril. (ג)רוחב מדידה: לאחר סיבוב המצלמה 90°, תיבת ציאן ממוקמת מצד אחד של myofibril לצד השני. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 8
איור 8: תוכנת בקר טמפרטורה תרמואלקטרית. (A)צור חיבור עם בקר הטמפרטורה התרמואלקטרית. (ב)הרחב את הגדרות הטמפרטורה. (ג)הגדר את הטמפרטורה הרצויה, במקרה זה: 15 °C.(D)הפעל בקר טמפרטורה תרמואלקטרית ושלח מתח למודול קריר תרמואלקטרי פלטייה. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 9
איור 9: הגדרות עבור משאבת הזרימה של המזרק. (א)פתח את החיבור למשאבה על-ידי לחיצה (1). (ב)התחל את המשאבה עם הגדרות מוגדרות מראש על ידי לחיצה (2). (ג)התחל שאיבת זרימה על-ידי הגדרת 'פקודות שסתום' ל 'שסתום אמבטיה' (2) והזנת 'פרמטרים של הגדרת הפקודה' כפיצג. בצע את הפקודה על-ידי הקשה (3). ניתן לסיים פקודות על-ידי הקשה (4). לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 10
איור 10: דוגמה לנתוני עקבות של ניסוי מתח פסיבי עם מיו-פיברילים מבודדים רקמת שריר השלד האנושית. (א)הקלטה של הכוח (עליון) ואורך sarcomere (נמוך) במהלך פרוטוקול מתיחה ושחרור. (ב)זום של (A) מראה את הכוח (עליון) ואורך sarcomere במהלך שלב המתיחה של myofibril. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 11
איור 11: התקנה ניסיונית ונתונים מניסויים בקדם הפעלה של סידן קרדיומיוציט. (א)ייצוג סכמטי של כיוונון ההתעוות. שים לב כי הצינור האחרון (כחול בהיר) מכיל פתרון ללא סידן (פתרון מרגיע). (ב)עקומות על-תקלות של הפעלה של קרדיומיוציט ללא (כחול בהיר) ועם (כחול כהה) לפני הפעלת סידן, עם ריכוזי סידן של 1 מיליליון ו 80 מילי"מ, בהתאמה. (ג)השוואה של פעילות סידן בסוג בר (WT) ו RBM20 הטרוזיגים (HET) cardiomyocytes מבודד ים שמאלי חולדה. נתון זה שונה מ- Najafi ואח'21. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.

שלב התקן תיאור צורה הראשונית
1.7.1. פיזו (11 מתח פסיבי לאתחול קבוע 51.6 μm
1.7.2. פיזו (11 מתח פעיל לאתחול קבוע 0 μm
שלב התקן תיאור צורה הראשונית עיכוב נציגי רמת עיכוב רמת עיכוב
3.4.4. / 4.1.1.4. / 4.1.2.4. שלב מהיר בדיקת ɵ זכוכית / הפעלה של מיו-פיבריל הדופק 4 וולט 1 שניות 1 x 3 V --3 5 שניות 4 וולט 1 שניות
4.1.3.4. שלב מהיר הפעלת מיו-פיבריל (כולל kTR) הדופק 4 וולט 1 שניות 1 x 3 V --3 10s של 10 4 וולט 1 שניות
שלב התקן תיאור צורה הראשונית עיכוב נציגי רמת רמפה משך רמפה עיכוב רמת רמפה משך רמפה עיכוב
4.1.3.1. / 4.1.3.6. פיזו (11 קיצור-רטש עבור kTR טרפז 0 μm 0.5 שניות 1 x 0 + 0.15 * L0 = __ μm 0.01 שניות 0.01 שניות 0 μm 0.01 שניות 1 שניות
4.2.1.1. / 4.2.1.4. פיזו (11 ממשיך למתוח טרפז 51.6 μm 2 שניות 1 x 51.6 - 0.30 * L0 = __ μm 2 שניות 0 שניות 51.6 - 0.30 * L0 = __ μm 0 שניות 1 שניות
4.2.1.4. פיזו (11 להחזיר myofibril לאורך רפוי טרפז 1.6 μm 2 שניות 1 x 51.6 μm 5 שניות 0 שניות 51.6 μm 0 שניות 1 שניות
4.2.2.3. פיזו (11 מתיחה צעד אחורה טרפז 51.6 μm 2 שניות 10 x 51.6 - 5 μm 0.5 שניות 10 שניות 51.6 - 5 μm 0 שניות 0 שניות
4.2.3. פיזו (11 להחזיר myofibril לאורך רפוי טרפז 1.6 μm 2 שניות 1 x 51.6 μm 5 שניות 0 שניות 51.6 μm 0 שניות 0 שניות

טבלה 1: טבלה המתארת את הגדרות מחולל האותות השונות המשמשות בתוכנה של בקר המערכת להפעלת מנוע אורך piezo ומנוע צעד מהיר.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

מתואר הוא פרוטוקול כדי להעריך את הפונקציה ההתכווצות של myofibrils מבודד מרקמות שריר השלד אדם או בעלי חיים. פתרון הכוח של התקנה זו תואר בעבר על ידי Chavan ואח '12. בקיצור, הוא נקבע על ידי תנודות אקראיות של אורך חלל Fabry-Pérot שנוצר בין סיבי הזיהוי cantilever, אשר מייצרים את החלק הדומיננטי של הרעש בתפוקה של הקריאה (לידי ביטוי V) כי, מוכפל על ידי רגישות הסטה (בא לידי ביטוי m / V) ועל ידי קבוע האביב של cantilever (בא לידי ביטוי N / מ), מספק את רעש הכוח. עבור ההתקנה שלנו, ממוצע השורש מרובע (rms) רעש באוויר בפלט של הקריאה, שנדגמו ב 1,000 נקודות נתונים / s (מדגם / s), הוא כ 2 mV. למדידה מיו-פריבריל טיפוסית, נעשה שימוש בבדיקה עם ראש ferrule עם קבוע אביב של ~ 0.7 N/m (רגישות הסטה ∼300 נק'/V). ערך rms זה תואם לרזולוציית הסטה cantilever של 0.6 נה"מ, אשר מתורגם רגישות כוח של ~ 0.37 nN. גשושית הכוח מכוילת על ידי דחיפת קצה המחט הרכבה נגד סולם שקילה תוך שמירה על כיפוף של cantilever שווה כפול של אורך הגל של לייזר קריאה13. שיטה זו של כיול כרוכה הן cantilever ונוקשות מחט הרכבה, כמו גם וריאציות אפשריות במון של cantilever ומחט הרכבה בשל מהירות וגודל של התכווצות myofibril. כיום, התקנה להערכת התכווצות myofibril זמינה, אשר מבוסס על זיהוי של לייזר סטה מן cantilever, כלומר, סטיית קרן אופטית (1,700 A; ~ 1 nN רזולוציית כוח). מערכת זו פותחה על ידי Labuda ואח '. באמצעות פריסקופ אופטי כדי להנחות אור לייזר לכיוון והרחק cantilever בתצורותמגבילות 11. במערכת זו, מיו-פיבריל מותקן בין הכוח האטומי קנטילבר ומחט זכוכית נוקשה. יתרון של המערכת המתוארת כאן הוא רגישות כוח גבוהה יותר ויחס אות לרעש. יתר על כן, בהתקנה זו, cantilevers נוקשה יחסית ניתן להשתמש, מה שתוצאות הסטה cantilever קטן כאשר כוח myofibrillar מוחל. זה חשוב, כפי שהוא מאפשר מדידות כוח באורך סרקום כמעט קבוע. לבסוף, בהשוואה למערכת המתוארת על ידי Labuda ואח', המערכת כאן משתמשת בשיטות דומות או זהות כדי לשלוט בטמפרטורה, כדי לגרום לשינויים באורך על myofibril, ולשנות את פתרונות ההזנה באמצעות מנוע Ɵ-זכוכית וצעד מהיר. היתרון של המערכת המתוארת על ידי Labuda ואח ' הוא כי שינוי הרכב הפתרון (בין cantilever פריסקופ אופטי) אינו משפיע על פלט האות. במערכת המתוארת כאן, הרכב הפתרון בין cantilever סיבים אופטיים חייב להישאר קבוע. הפתרון למגבלה זו מתואר בפירוט רב יותר להלן.

אופטימיזציה
גשושית הכוח האופטי בשילוב עם מערכת ההתכוננים המהירה הובילה לסיבוכים. ההבדל במאפיינים אופטיים בין פתרונות Ca2+ בריכוז נמוך וגבר מפריע למדידות הכוח. כדי למנוע זרימה האחורית של תמיסת סידן גבוהה, תא זרימה מותאם אישית הונדס(איור 3). זרימת רקע קבועה של תמיסה ללא סידן מושרה מימין לשמאל כדי לשמור על הפתרון קבוע בין החלק העליון של הסיב האופטי לבין cantilever(איור 3D).

כדי לשלוט בטמפרטורה, אלמנט פלטייה עם קירור נוזלי מותקן על תא הזרימה. תא זרימה זה הוא תרמית לא מקוטב מהמיקרוסקופ על ידי הרכבתו על מתאם פלסטיק. עם אלמנט פלטייה, הנשלט על ידי מערכת TEC, ניתן לשלוט בטמפרטורת הפתרון לאורך זמן עם דיוק של 0.1°C. הטמפרטורה מנוטרת על ידי חיישן טמפרטורה המותקן על תא הזרימה. יציבות הטמפרטורה חשובה בשל אופיו של מתמר הכוח. Cantilever מורכב רצועת זכוכית מצופה זהב, ביעילות מה שהופך אותו מדחום. לכן, cantilever מתכופף עם שינויי טמפרטורה.

ההתקנה משתמשת במערכת עירוי מהירה (ראה טבלת חומרים)כדי לשלוט בתנועה של Ɵ התמונה. מערכת זו מאפשרת מתגי עירוי בתוך 10 ms. שילוב השיטה של בקרת טמפרטורה ומיתוג פתרונות הופך את המערכת הזו מתאימה במיוחד כדי למדוד את הקינטיות של התכווצות sarcomere (כלומר, שיעורי פיתוח כוח, פיתוח מחדש מתח, והרפיה) ב myofibrils.

בתחילה, החסרונות של שימוש אינטרפרומטריה היה הטווח שושש קטן בשל הצורך להשתמש בחלק הליניארי של עקומת ההפרעה (ω/8, עם ω להיות אורך הגל של הלייזר). עם זאת, החידושים האחרונים ביטלו את הצורך הזה על ידי שילוב אפנון אורך גל עם מעלי נעילה. לכן, המערכת אינה מוגבלת לחלק ליניארי יחיד של עקומת ההפרעה. פעולה זו מאפשרת מדידה של הסטה אינסופית של cantilever14. לכן, הטווח של הקריאה הטיה cantilever של מערכת זו מוגדל מאוד בהשוואה interferometry המסורתי. בנוסף, בדיקות הכוח המתוארות קל להחליף ויש cantilevers רבים זמינים, עם נוקשות החל 0.5 N/m כדי >20 N/m. לכן, ניתן לשנות במהירות בין cantilevers ולבחור את הנוקשות המתאימה ביותר לניסוי שנערך.

אתגרים
המערכת הנוכחית היא אב טיפוס המבוסס על מערכת מדידה cardiomyocyte (ראה טבלת חומרים). ניתן לשפר מספר רכיבים כדי לספק חוויית משתמש טובה יותר ונתונים באיכות גבוהה יותר. ראשית, עקב הרחבות למערכת, רטט ותהודה יכול להיות בעיה שתוסיף רעש לאות. כמו כן, Ɵ זכוכית ושיטת חיבור מנוע צעד מהיר ניתן לשפר כדי להפוך אותו פחות נוטה רטט.

שנית, רצוי להחליף את המנוע בשלב מהיר במפעל אורך piezo כדי להגביר את המהירות של החלפת פתרונות ולקבל תנועה עקבית יותר.

שלישית, פתרונות הסידן שהשתמשנו בהם בעבר להפעלת סיבי שריר חד-סרניים כללו חומצה פרופונית, אך פתרונות אלה סופגים אור אינפרא אדום כמעט, ומפריעים למדידות הכוח. סידן כלוריד שימש כדי לחסל את הצורך בחומצה propionic, אשר הפחיתו מאוד את ההשפעה. בעיה זו טבועה במערכת המבוססת על אינטרפרומטריה ולא קיימת בעת שימוש בסטייה של קרן אופטית.

רביעית, אמבט זרימה מותאם אישית הונדס כדי ליצור זרימת למינאר, כדי להתאים את זרימת Ɵ הדם. פעולה זו מונעת זרימה האחורית עקב מערבולות של הפתרון עשיר בסידן. לכן, הפתרון בין קצה הסיב האופטי לבין cantilever נשאר קבוע. כיסוי עם myofibrils יכול לנוע בחופשיות מתחת לתא הזרימה ולכן, מבחר של myofibrils מתאים אינו מוגבל לאזור הקטן של תא הזרימה.

יכולת רבייה והשתנות
ישנם מספר רכיבים של המערכת והפרוטוקול החשובים לדרגת הרבייה והשונות של הנתונים שהתקבלו.

ראשית, איכות המדידות תלויה מאוד באיכות הבידוד המיו-פיבריל. פרוטוקולים זהים מניבים תכונות וכמויות שונות של מיו-בריתות מבריופסיות שונות. במקרים מסוימים, ביופסיות בקושי מניבות מיו-פיברילים שמינים או בכלל לא. הקונצנזוס המשותף הוא כי myofibrils פגום יהיה לשבור במהלך התכווצות ולכן לא בחשבון בתוצאות.

שנית, קיימת אי ודאות בקביעת האזור החוצה את האזור המיו-פיבריל. בשל אילוצים טכניים, ניתן למדוד את רוחב המיו-פיבריל במטוס אחד בלבד. לכן, כדי לחשב את האזור חוצה המקטעים אנו מניחים כי הרוחב והעומק שווים. כאשר הכוח מנורמל לאזור חוצה חתך כדי לחשב מתח פעיל מקסימלי, יש להיות מודע להנחה זו.

הרכבה של myofibrils בשל זווית הרכבה myofibril, מיקום, ואת שלמות הדבק.
למרות זווית הרכבה ומיקום יכול להיות נשלט במידה רבה חזותית, וריאציות קטנות בין myofibrils עשוי להיות קיים. שלמות הדבק לא נחקרה בהרחבה. עם זאת, ניתן לאמת את שלמות הדבק על-ידי ניטור אורך sarcomere ב myofibril לפני ואחרי ההפעלה. כאשר יותר סרקומרים הם בין הדבק לאחר פרוטוקול, זה מצביע על כך שהחליק של myofibril בדבק התרחשה. כתוצאה מכך, מיו-פיבריל זה צריך להיות לא נכלל ב- dataset.

יישומים אחרים של ההתקנה: קדם פעילות סידן בקרדיומיוציטים מבודדים מלימת שמאל חולדה
בנוסף להערכת תפקוד ההתכווצות של myofibrils, המערכת יכולה לשמש גם כדי למדוד מכניקה cardiomyocyte. לדוגמה, איור 11 ממחיש את השימוש בממברנה-permeabilized יחיד cardiomyocytes מבודד חולדה השמאלית21. בניגוד לניסויים המתוארים לעיל, הפתרון המרגיע השתנה והפעלת הפתרון נשמרה קבועה. כל cardiomyocyte עבר חמישה סטים של הפעלות, חושף אותו לתמיסת סידן 2 μM חינם עבור 1 s. אילוץ הזמן של 1 s נבחר לחקות את האופי המוגבל בזמן של התכווצויות לב, שבו החשיפה לפתרונות ריכוז סידן נמוך מחקה את השלב הdiastolic ואת החשיפה לפתרונות ריכוז סידן גבוהה מחקה את השלב הסיסטולי של התכווצות שריר הלב (איור 11א). עבור כל אחת מחמש המערכות סידן דיסטולי היה מגוון (1, 80, 160, 250 ו 400 nM סידן), בעוד סידן סיסטולי נשאר קבוע(איור 11A). סט כלל שני סטים של שלושה מחזורי הרפיה הפעלה ב 1.8 μm לעומת 2.0 μm ו 2.0 μm לעומת 2.2 μm עבור קבוצות ניסיוניות שונות. כוח שיא נמדד ב 1 s מן המתג של פיפטה בממוצע עבור סט של שלושה מחזורי הרפיה הפעלה. יחס האות לרעש הגבוה והטווח הדינמי הגבוה של מתמר כוח זה אפשרו לנו למדוד הן את השינויים הקטנים בכוח הדיאסולי והן את הכוחות ה סיסטוליים גדוליםבהרבה (איור 11B). הגדלת סידן דיאסטולי הביאה לכוח גבוה יותר ב 2 μM סידן יחסית להפעלה הראשונה (איור 11B). WT חולדה cardiomyocytes הושוו עם הטרוזיגים (HET) RMB20 חולדה cardiomyocytes. בשל שחבור חלופי, חולדות HET יש חלבון טיטין תואם יותר בהשוואה חולדות WT. ההשפעה הייתה מוגזמת בקרדיומיוציטים HET ב 80 ו 160 μM סידן (איור 11C).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

מיכאל הלמס הוא בעל מניות ובעלים משותף של IONOptix Inc.

Acknowledgments

פרויקט זה מומן על ידי AFM-Telethon וקרן בניין כוח עבור מיופתיה Nemaline. המחברים רוצים להכיר את היוצר של המוצרים המוזכרים במאמר זה, IONOptix Inc.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bio Spec Products, Inc. 985370-XL To isolate myofibrils
Custom coded Matlab
Custom fabricated Includes Labview program to control over serial connection; To control valves
Custom fabricated To cool the Peltier module
Custom fabricated
Custom fabricated Aluminum tissue chamber
Custom fabricated To control the valves; Includes PC software to control over USB
IonOptix System controller software: data recording software with advanced signal generator for piezo and fast-step
IonOptix MCS100 To record sarcomere length
IonOptix Includes: Optiforce (interferometer), Micromanipulators, Signal interface, Piezo motor and controller. Based on the MyoStretcher
IonOptix Force probe
Koolance ADT-EX004S
Koolance EX2-755 To cool the Peltier module
Microsoft Data registration
Olympus IX71
Olympus TH4-200
Sigma-Aldrich 529265 Poly(2-hydroxyethyl methacrylate); Coating for microscope slides to prevent sticking of tissue
Sigma-Aldrich 78471 Crystals to dissolve in ethanol resulting in glue
TE Technology, Inc. TE-63-1.0-1.3 To cool the tissue flow chamber
TE Technology, Inc. TC-720 Includes PC software to control over USB
Tecan Trading AG 20736652
Tecan Trading AG 20739263 Syringe pump to induce backgroundflow together with fast-step perfusion system; Outflow from tissue flow chamber
Thermo scientific 2441081
Warner Instruments (Harvard Bioscience, Inc.) Discontinued Alternative: SF-77CST/VCS-77CSP
Warner Instruments (Harvard Bioscience, Inc.) TG150-4 To perfuse the tissue
1 PC for IonWizard and 1 PC for other software

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Winter, J. M., Ottenheijm, C. A. C. Sarcomere Dysfunction in Nemaline Myopathy. J. Neuromuscular. Disease. 4, 99-113 (2017).
  2. Colomo, F., Piroddi, N., Poggesi, C., te Kronnie, G., Tesi, C. Active and passive forces of isolated myofibrils from cardiac and fast skeletal muscle of the frog. Journal of Physiology. 500, Pt 2 535-548 (1997).
  3. Kulke, M., et al. a major source of myofibrillar stiffness in Drosophila indirect flight muscle. Journal of Cell Biology. 154, 1045-1057 (2001).
  4. Stehle, R., et al. Isometric force kinetics upon rapid activation and relaxation of mouse, guinea pig and human heart muscle studied on the subcellular myofibrillar level. Basic Research in Cardiology. 97, Suppl 1 127-135 (2002).
  5. Iorga, B., et al. Micromechanical function of myofibrils isolated from skeletal and cardiac muscles of the zebrafish. Journal of General Physiology. 137, 255-270 (2011).
  6. Ribeiro, P. A. B., et al. Contractility of myofibrils from the heart and diaphragm muscles measured with atomic force cantilevers: Effects of heart-specific deletion of arginyl-tRNA-protein transferase. International Journal of Cardiology. 168, 3564-3571 (2013).
  7. Joureau, B., et al. Dysfunctional sarcomere contractility contributes to muscle weakness in ACTA1-related nemaline myopathy (NEM3). Annals of Neurology. 83, 269-282 (2018).
  8. de Souza Leite, F., Minozzo, F. C., Altman, D., Rassier, D. E. Microfluidic perfusion shows intersarcomere dynamics within single skeletal muscle myofibrils. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114, 8794-8799 (2017).
  9. Shalabi, N., Cornachione, A., de Souza Leite, F., Vengallatore, S., Rassier, D. E. Residual force enhancement is regulated by titin in skeletal and cardiac myofibrils. Journal of Physiology. 595, 2085-2098 (2017).
  10. Cornachione, A. S., Leite, F., Bagni, M. A., Rassier, D. E. The increase in non-cross-bridge forces after stretch of activated striated muscle is related to titin isoforms. American Journal of Physiology - Cell Physiology. 310, 19-26 (2016).
  11. Labuda, A., Brastaviceanu, T., Pavlov, I., Paul, W., Rassier, D. E. Optical detection system for probing cantilever deflections parallel to a sample surface. Review of Scientific Instruments. 82, 013701 (2011).
  12. Chavan, D., et al. Ferrule-top nanoindenter: an optomechanical fiber sensor for nanoindentation. Review of Scientific Instruments. 83, 115110 (2012).
  13. Beekmans, S. V., Iannuzzi, D. A metrological approach for the calibration of force transducers with interferometric readout. Surface Topography: Metrology and Properties. 3, (2015).
  14. van Hoorn, H., Kurniawan, N. A., Koenderink, G. H., Iannuzzi, D. Local dynamic mechanical analysis for heterogeneous soft matter using ferrule-top indentation. Soft Matter. 12, 3066-3073 (2016).
  15. Winter, J. M., et al. KBTBD13 is an actin-binding protein that modulates muscle kinetics. Journal of Clinical Investigation. , (2019).
  16. Winter, J. M., et al. Mutation-specific effects on thin filament length in thin filament myopathy. Annals of Neurology. 79, 959-969 (2016).
  17. Ottenheijm, C. A. C., et al. Deleting exon 55 from the nebulin gene induces severe muscle weakness in a mouse model for nemaline myopathy. Brain. 136, 1718-1731 (2013).
  18. Ribeiro, P. A., et al. Contractility of myofibrils from the heart and diaphragm muscles measured with atomic force cantilevers: effects of heart-specific deletion of arginyl-tRNA-protein transferase. International Journal of Cardiology. 168, 3564-3571 (2013).
  19. Pinniger, G. J., Bruton, J. D., Westerblad, H., Ranatunga, K. W. Effects of a Myosin-II Inhibitor (N-benzyl-p-toluene Sulphonamide, BTS) on Contractile Characteristics of Intact Fast-twitch Mammalian Muscle Fibres. Journal of Muscle Research and Cell Motililty. 26, 135-141 (2005).
  20. Stehle, R., Krüger, M., Pfitzer, G. Force kinetics and individual sarcomere dynamics in cardiac myofibrils after rapid Ca(2+) changes. Biophysics Journal. 83, 2152-2161 (2002).
  21. Najafi, A., et al. End-diastolic force pre-activates cardiomyocytes and determines contractile force: role of titin and calcium. Journal of Physiology. 597, 4521-4531 (2019).

Tags

ביולוגיה גיליון 159 שריר השלד קינטיקה סרקומר מכניקה מיופיל כיווץ סידן גשושית כוח ננו-ניוטון cantilever
בידוד מיו-בריאלס מבריות מביופסיות שריר השלד וקביעת תפקוד מתכווץ עם מתמר כוח רזולוציה ננו-ניוטון
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

van de Locht, M., de Winter, J. M.,… More

van de Locht, M., de Winter, J. M., Rassier, D. E., Helmes, M. H. B., Ottenheijm, C. A. C. Isolating Myofibrils from Skeletal Muscle Biopsies and Determining Contractile Function with a Nano-Newton Resolution Force Transducer. J. Vis. Exp. (159), e61002, doi:10.3791/61002 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter