Summary
ここで提示されるプロトコルは、ナノニュートン分解能を有する線条筋筋筋線維の収縮特性を評価する。このプロトコルは、干渉法ベースの光学力プローブを用いたセットアップを採用しています。この設定は、高い信号対雑音比を持つデータを生成し、myofibrilsの収縮運動の評価を可能にします。
Abstract
ヒトや動物の活動には、線条筋細胞が不可欠です。単一の筋線維は、筋の中で最も小さい収縮ユニットである連続的に連結されたサルコメアで構成される筋線維で構成される。肉体機能障害は、肉体タンパク質をコードする遺伝子の変異を有する患者の筋力低下に寄与する。筋線維力学の研究は、単一の筋線維の収縮性を測定する際に損傷を受けた隣接する筋線維の潜在的な交位効果なしにアクチンとミオシン相互作用の評価を可能にする。筋線維の超構造的損傷および不整列は収縮性の障害に寄与する可能性がある。筋細動体に構造的損傷が存在する場合、分離手順中または実験中に壊れる可能性が高い。さらに、myofibrilsの研究は、サルコメアの幾何学的制約の存在下でのアクチンとミオシン相互作用の評価を提供する。例えば、筋線維の測定は、筋膜機能不全が肉体タンパク質の突然変異の主な効果であるかどうかを解明することができる。さらに、カルシウム溶液または化合物の灌流は、ミオフィブリルの小径のためにほぼ瞬時に行われる。これは、筋線維は、力の生産中に活性化および弛緩の速度を測定するために非常に適しています。本論文に記載されたプロトコルは、ナノニュートンの範囲で力を測定することができるファブリー・ペロ干渉計の原理に基づく光学力プローブを採用し、ピエゾ長モータと高速ステップ灌流システムと組み合わせる。このセットアップは、高分解能測定で筋知見力学の研究を可能にする。
Introduction
線条筋細胞は日常生活に欠かせないものです。四肢の動き、呼吸機能、心臓のポンピング運動は、筋肉細胞によって生成される力に依存する。骨格筋は、単筋線維の束を含む筋の筋線維からなる(図1A)。これらの筋線維は、連続的に連結されたサルコメアによって形成される筋線維で構成される(図1B,D)。サルコメアには薄くて厚いフィラメントが含まれています。これらは主にアクチン分子とミオシン分子の鎖から成り、それぞれ(図1B)。アクチンとミオシンの相互作用は、筋肉の力を発生させる能力を担っています.肉リン、アクチン、トロポニンTなどの肉体タンパク質をコードする遺伝子の変異を有する患者は、収縮性機能不全1による筋力低下に苦しんでいる。
筋肉の収縮の質は、生体内の筋肉全体からインビトロ運動アッセイにおけるアクチンミオシン相互作用に至るまで、組織の様々なレベルで研究することができます。過去数十年の間に、いくつかの研究グループは、個々のmyofibrils,,,,,22、3、4、5、6、7、8、9、103,4の契約性を決定するためのセットアップ9を10開発しました。5678これらの設定は、ミオフィブリルの収縮によって引き起こされるカンチレバーからのレーザー偏向(すなわち、光ビーム偏向)の変化の検出に基づいている(詳細については、Labudaら11参照)。myofibrilsの収縮機能を決定することはいくつかの制限を有するが(例えば、筋原線維の上流にある励起収縮結合過程のダイナミクスが欠けている)、このアプローチには複数の利点がある。これらには、1)サルコメアの幾何学的制約の存在下でアクチンとミオシンの相互作用を評価する能力が含まれる。2)損傷の潜在的な交交効果なしにアクチンミオシン相互作用を評価する能力、隣接する筋線維(単一の筋線維の収縮性を測定する場合、筋線維の超構造的損傷およびミスアライメントが収縮障害に寄与する可能性がある)(図1D);3)筋線維の小径(〜1μm、図2A)および膜の欠如は、サルコメアへのほぼ瞬時のカルシウム拡散を可能にする。さらに、筋細柱に構造的な損傷が存在する場合、それらは孤立中または実験中に壊れる可能性が高い。したがって、筋線維性収縮性を評価することは、筋肉収縮の基本的なメカニズムを研究し、障害のあるアクチンとミオシンの相互作用が肉体タンパク質の突然変異によって引き起こされる筋肉疾患の主な原因であるかどうかを理解するためのエレガントな方法です。
このプロトコルは、ナノニュートン分解能(すなわちOptiforce)を用いたカンチレバー力プローブを組み込んだmyofibrilsの収縮性を決定するために新しく開発されたセットアップを提示する。この力プローブは、干渉法の原理に基づいています。干渉測定は比較的堅い片持ち面の使用を可能にする。これにより、カンチレバーの偏向が少なく、ミソフィブリルの等方体収縮に近づく力を測定することが可能になる。このプローブは、人間の被験者を含む異なる筋肉生検から分離された単一の筋線維性によって生成される低受動および活動的な力を高いシグナル対雑音比で評価することを可能にする。このセットアップに組み込まれた光学カンチレバー力プローブは、ファブリ・ペロ干渉計12に基づいています。干渉計は、フェルールに取り付けられた光ファイバと金被覆のカンチレバーとの間の小さな変位を検出する(図3)。光ファイバーとカンチレバーの間のギャップは、ファブリ・ペロキャビティと呼ばれます。Myofibrilsは2つの接着剤コーティングされたガラス取り付け繊維を使用して、プローブとピエゾモーターの間に取り付けられます。ミオフィブリルによって生じる力は、干渉計データから数学的に導き出すことができる。干渉法は、2つ以上の波の重ね合わせまたは干渉に基づいています(このセットアップでは3つの光波)。波長が1,528.77~1,563.85nmのレーザー光は干渉計から放射され、光ファイバを通して送られます。プローブでは、光は光ファイバと媒体の間の界面で反射される(図3A)。2)媒体およびカンチレバーのインターフェイスで(図3B);3)カンチレバーの金属と金のコーティングの間の界面で(図3C)。インターフェイス A および B での反射は、プローブが沈み込む媒体の屈折率(n)に依存します。3つの重ね合わせ反射からなる光は、干渉計のフォトダイオードに戻ります。フォトダイオードは、光の強度を測定し、これは3つの重畳反射の干渉パターンの結果である。収縮力が筋炎を活性化または伸ばすことによって生成されると、ミオフィブリルはカンチレバーを引っ張る。この動きは、キャビティサイズ(d) を変更し、その結果、空洞に収まる波長の数を変更します。片持ち面で反射した光は相が異なり、異なる干渉パターンが生じます。フォトダイオードは、この干渉パターンの強度の変化をボルトの変化として記録します。続いて、ミオブリル力の生成は、片持ち剛性を考慮して、この変化から計算される。力プローブは、取り付け針の先端を押し、片持ちの自由手渡し端に取り付け、カンチレバーの曲げを読み出しレーザー13の波長の倍数に保ちながら計量スケールに対して製造業者によって較正される。したがって、干渉法は、ナノニュートン分解能で力の測定を可能にする、距離の小さな変化を検出する非常に敏感な方法です。この分解能により、高い信号対雑音比を持つ筋線維力の評価が可能になります。従来の干渉法では、測定範囲が干渉曲線の線形部分に制限されますが、ロックインアンプとレーザー波長の変調を使用すると、この制限を克服します14。これについては、ディスカッションのセクションで詳しく説明します。
ミオフィブリル活性緊張を測定するために、高速ステップ灌流システムを組み込んで、ミオフィブリルをカルシウム溶液に曝露した(図4A)。高速ステップ灌流システムは10 msの範囲内で起こる解決の変更を可能にする。その小さな直径のために、マイフィブリルへのカルシウム拡散はほぼ瞬時です。したがって、このシステムは、活性化および弛緩中の放出中のアクチン-ミオシン結合の速度を測定するのに特に適している。活性化率(kACT)および弛緩(kREL)は、活性化緩和曲線から決定することができる。また、濃度を高めるカルシウム溶液にミオブイブリルを曝露することにより、力とカルシウムの関係とカルシウム感受性を決定することができる。
さらに、ピエゾ長モーターは、筋形筋の速い伸縮および短縮を可能にする。これは、筋線維性の粘弾性特性(すなわち、受動的緊張)を研究する可能性を提供するとともに、筋線維の急速な短縮および再伸縮を行い、緊張再発達率(kTR)を決定する。活性および受動緊張実験の両方から得られるパラメーターは、肉体タンパク質の遺伝子変異によって変化させることができる。
このカスタム構築されたセットアップは、健康な人間、患者、およびマウス骨格筋から分離されたmyofibrilsのアクティブおよび受動的な収縮特性を測定するために使用されました。
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Protocol
ヒト生検を得るための議定書は、VU大学医療センター(#2014/396)の機関審査委員会によって承認され、被験者から書面によるインフォームド・コンセントが得られた。動物の筋肉の生検を得るためのプロトコルは、VU大学の地元の動物倫理委員会によって承認されました (AVD114002016501)
1. 準備と筋整ブリルの分離
注:生検をグリセリン化する、異なるカルシウム濃度(pCa)溶液7、16、1716,17を調製し、筋線維722、1818を分離する前に説明した方法を使用します。
- リラックス(pCa 9.0、Rx)および活性化(pCa 4.5、Act)溶液ならびに阻害剤(1 M E64、1 M DTT、1 Mロイペプチン、1 M PMSF)を解凍し、-80°Cで保存する。
- 約1mm3 の縞状筋生検のグリセリン片を取り、1:1 Rx /グリセロール(v/v)溶液で小さなペトリ皿に入れ、ペトリ皿を4°Cの冷たいプレートに置きます。
- 解剖顕微鏡と鉗子を使用して筋肉の一部を解剖し、単一の筋線維を筋肉の部分から分離せずに分離する。
注:できるだけ多くの脂肪と結合組織を除去して、マイオブリル懸濁液の汚染を防ぎます。 - 解剖した組織の一部を、1.5 mLの抑制剤(1μL/mL E-64、1 μL/mLロイペプチン、1 μL/mL DTT、125 μL/mL PMSF)のリラックス液を含む5 mLチューブに移します。組織を約4°Cで1時間焼き戻す。
- インキュベーション中に、両方の PC を起動し、デバイスの電源を入れ、関連するソフトウェアを開きます ( 資料一覧を参照)。
- ペトリ皿に超純水に力プローブを沈め、プローブを較正します。
- 干渉計の [スタート ウィザード] を押して、画面の指示に従います。 キャリブレーションを押した後、顕微鏡のステージをタップします。
注:顕微鏡のステージをタップすると、片持ちが偏向し、フリンジを通過します。これにより、プローブのキャリブレーションが可能になります。 - キャリブレーション後、ペトリ皿の超純水にプローブを水没させます。
- 干渉計の [スタート ウィザード] を押して、画面の指示に従います。 キャリブレーションを押した後、顕微鏡のステージをタップします。
- ピエゾモーターの位置を初期化します。これを行うには、以下の手順のいずれかに従います。
- ピエゾモーターをkTR 張力に使用する場合は、長さを0μmに設定します。
信号発生器の設定は、表1、図5Aにあります。 - 圧電モーターを受動的な張力に使用する場合は、長さを50μmに設定します。
信号発生器の設定は 、表1にあります。
注:ステップ間の違いは、ピエゾ長モーターの初期位置です。筋形筋を伸ばすために、ピエゾモーターは両方の取り付け針間の距離を増加させ、筋形筋を長くするために引っ張る必要があります。筋形筋を緩めるために、ピエゾモーターは両方の取り付け針間の距離を短くし、筋形筋を短くするために押す必要があります。
- ピエゾモーターをkTR 張力に使用する場合は、長さを0μmに設定します。
- 顕微鏡スライドを準備します。ピペット150 μLのポリヒドロキセチルメタクリレート(ポリヘマ)溶液(95%エタノールで5%ポリHEMA、w/v)を顕微鏡スライドにスライドさせてスライド全体に広げ、すべてを覆います。
注:ミオブリルサスペンションがコーティングされていない顕微鏡スライドにピペットとして入っている場合、底に沈む筋細BRILSは顕微鏡スライドに貼り付け、接着することはできません。 - スポイジをpCa溶液( 図4A参照)で充填し、灌流システムをプライムします。
注:これらの手順では、すべてのチューブは、すべての気泡がチューブから取り除かれ確認するために適切なソリューションで事前に充填されています。- フローチャンババックグラウンドフローの流入管(図3、4A)をRxで埋めます。
- 使用する場合は、空気を除去するために超純水でマニホールドを洗い流します。これを行うには、超純水とのシリンジを出口に接続し、逆方向にフラッシュします。マニホールドの未使用ポートをブロックします。
- 各pCaシリンジを有効にして、それぞれのチューブをpCa溶液で満たします。次に、マニホールドとƟガラスに接続します。
- データ取得パネルソフトウェア (表を参照) でバルブ 1 と 6 を開き、ボタン '1+6' (図 6A) をチェックして、Ɵガラスが充填されたときに Ɵ ガラスをリラックス (pCa 9.0) およびアクティブ化 (4.5) のソリューションと閉じたバルブで満たします (図 6B)。
2. ミオブリルの取り付け
- 顕微鏡スライドにポリHEMAを塗布して、マイオブリブリルがガラスに付着するのを防ぎます。
- 組織均質化のためにホモジナイザー( 材料表を参照)を準備します。内部ローターロッドをきれいなティッシュペーパーで洗浄し、ホモジナイザーを組み立て、15sのアルコールで1倍回転し、超純水でそれぞれ15s回転させます。ホモジナイザーをリラックス液1 xで氷上15sにプリリンスする。
- ステップ1.4に記載されているように、筋肉組織を含むチューブにホモジナイザーロッドを入れ、チューブを氷上に保ちながら、ローターをスピード5で15s回転させ、筋肉組織を引き裂き、筋肥線維懸濁液を得る。
- ピペットは、組織浴中にポリHEMAでコーティングされた顕微鏡スライド上のミオフィブリル懸濁液と〜250μLの緩和溶液のピペットを含む。これは液体の低下を形成します。ほこりから保護するために蓋でお風呂を覆い、5〜10分待って、myofibrilsが底に沈むのを待ちます。
注:サスペンションとリラックスした溶液の比率は、分離の品質に依存するため、それに応じて調整されます。例えば、ミオフィブリル収率が低く、懸濁液に適切なミオフィブリルが少ない場合は、ミオフィブリル懸濁液を追加し、リラックス性の溶液(例えば、75μLのミオフィブリル懸濁液および225μLのリラックス液)で希釈する。心臓および骨格筋組織は、その線条体パターンのために認識しやすいです。10xまたは40xの目的を使用して、このパターンは単一のミオフィブリルでも見える。他の組織が懸濁液中に存在する場合、筋線維は視覚的に選択することができる。5~10分の待ち時間をスキップできます。しかし、これはミオブリルを接着する難しさを増加させます。 - 接着剤(シェラック+エタノール;70%エタノールの2 mLで120mgのシェラック)を取り付ける針をコーティングします。これを行うには、接着剤を65°Cで30~60秒、ピペットを6μLの新しいコーティングされていないガラススライドに加熱します。接着剤の各取り付け針の先端を浸し、接着剤の層が見えるまで繰り返します。顕微鏡のステージ上に組織浴を置くスペースを作るためにマイクロマニピュレーターと垂直にプローブとピエゾを上に移動します。接着剤が入っているガラススライドを取り外します。
- マイフィブリルの取り付け
- ミヒブリ懸濁液を含むポリHEMAでコーティングされた顕微鏡スライドを顕微鏡ステージに置いて組織浴を置きます。ステージを使用して、40xの目的を持つ適切なミオブリルを見つけてください。必要に応じて、組織浴を移動して回転させて、ミオブリルを取り付け可能な位置に移動させます。
注:約30μmの目に見える線種パターンを持つmyofibrilsを探してください。ステップ3.1および3.2.1の詳細に説明するように、筋の溶出前に長さとサルコメアの長さを確認することが可能である。これらは収縮中に壊れる可能性があるので、引き裂かれた筋線維を接着しないでください。 - フローチャンバーを組織浴内のmyofibrilsを含む液体ドロップのすぐ上の位置にスライドさせ(ステップ2.4でスライドにピペット化)し、下げます。それが液体の落下に当たる前に停止します。
- ピエゾ取り付け針を下げ、ミオフィブリルの下端に押します。ミオブリルが針に取り付けられているかどうかを確認するために少し持ち上げます。
- プローブがフローチャンバーに触れることなく、プローブの取り付け針が底に到達するのに十分な距離を流れチャンバーを下げます。
- ミヒブリルの上端にあるプローブの取り付け針を押します。ミオブリルが針に取り付けられているかどうかを確認するために少し持ち上げます。
- 目的がガラスの底に触れることなく焦点を合わせることなく、可能な限りお風呂の底からミオフィブリルを持ち上げます。
- ミヒブリ懸濁液を含むポリHEMAでコーティングされた顕微鏡スライドを顕微鏡ステージに置いて組織浴を置きます。ステージを使用して、40xの目的を持つ適切なミオブリルを見つけてください。必要に応じて、組織浴を移動して回転させて、ミオブリルを取り付け可能な位置に移動させます。
3. 実験の初期化
- マイクロマニピュレータ、カメラ、およびシステムコントローラソフトウェアを使用して (図7A、 材料表を参照)、サルコメアの長さを測定します。ピエゾまたはフォースプローブを動かして、ミオフィブリルの初期サルコメア長さを2.5μmに設定します。
注意:2.5 μmのサルコメア長は、ミオシンヘッドとアクチンの間で最適なオーバーラップを保証します。 - システムコントローラソフトウェアの容器機能を使用して、ミオフィブリルの長さと幅を測定する(図7B、C)。C
メモ:カメラを回転させると、水平または垂直に傾くことがあります。カメラの位置合わせを確認するために、カメラが回転し、傾いていないことを確認するために、精神レベルを使用することができます。- 顕微鏡ステージを使用して、ビデオ画像の中央にミオブリルを配置します。
- ミオブリルの片側からもう一方の側に正方形を描きます。画像処理はコントラストに基づいているため、長さについては、必ず、接着剤の液滴の暗いエッジ (図 2A)を正方形に含めます。
- システム コントローラ ソフトウェアのデータの記録を開始し(一覧表を参照)、システムコントローラのソフトウェア データ記録を 5 時間中断して [一時停止] ボタンを押します。これで、長さがデータに記録されます。
- 幅については、まずカメラを 90° 回転させて (「 表」を参照) してから、ミオブリル自体のエッジのコントラストを使用します。
- システム コントローラ ソフトウェアのデータの記録を開始し( 一覧表を参照)、開始ボタンを押して、5 s の後にシステム コントローラ ソフトウェアのデータ記録を一時停止 します。これで、幅がデータに記録されます。
- 筋のアクティブな張力を決定する必要がある場合は、灌流のセットアップを使用する必要があります。その場合は、ステップ 3.4 に進みます。受動テンションだけが決定される場合は、ステップ 3.4 ~ 4.1.3.7 をスキップして、ステップ 4.2 に進みます。
- 灌流セットアップを配置し、初期化します。
注: これは、アクティブな力を生成する場合にのみ必要です。受動テンション実験を行う場合は、ステップ4.2に進みます。- 高速ステップモーター位置を4 Vに設定します(図5B)。
- テーブルの上にペフュージョンスタンドをスライドさせて、スタンドの左下隅をテーブルの上のテープに合わせます。
注:フォースプローブやピエゾモーターに当たらないように注意してください。 - マニピュレータを使用して、Ɵガラスを目で大まかに配置します。
- 接眼を見て、マニピュレータを使用してƟガラスをミオフィブリルに向かって慎重に動かします。
- Ɵガラスの上部チャネルをマニピュレータを使用してmyofibrilと位置合わせし、高速ステップ(信号発生器の設定は表1)をシステムコントローラソフトウェアで実行して位置を確認します(図2B–C、表を参照)。
注: ファストステップのアクティベーションフェーズ中に、ボトムチャネルが myofibril と一致していることを確認します (図 2B–C)。
- Rx (図 4A)のバックグラウンド フローをオンにして、流れチャンバ内に層状のバックグラウンド フローを作成します。
注: バックグラウンド フローは、Ɵ ガラスからの pCa 溶液の流れの結果として乱流を防ぐために必要です。- ルーアーバルブレバーで流れチャンバの流入をオンにします。
- 流れチャンバの排水を開始し、フローチャンバーのオーバーフローを防ぐために流出ポンプに次のパラメータを送信します(図9):バルブ = バスバルブ(2)。マイクロステップモード=マイクロ;プランジャーターゲット = 48,000;プランジャ速度 = 38-40 (任意)。
注: 常に流体レベルが安定していることを確認してください。ミオブリルは乾燥して走るべきではありませんし、カンチレバーもしないでください。流れが少なすぎるよりも、少しオーバーフローする方が良いです。
- 流れチャンバの排水を開始し、フローチャンバーのオーバーフローを防ぐために流出ポンプに次のパラメータを送信します(図9):バルブ = バスバルブ(2)。マイクロステップモード=マイクロ;プランジャーターゲット = 48,000;プランジャ速度 = 38-40 (任意)。
- ルーアーバルブレバーで流れチャンバの流入をオンにします。
- 熱電温度コントローラで温度を希望の値に設定するには(図8、材料表を参照)、希望する温度を入力し、Start'を押します。熱電温度コントローラソフトウェアのグラフを確認して希望の温度に達するまで待ち、続けてください。
メモ:室温で実験を行う場合、熱電温度コントローラを使用する必要はありません。
4. 実験プロトコル
- どのアクティブな強制プロトコルを実行する必要があるかを決定します。
注:研究に必要なデータに応じて、複数のタイプのアクティブフォース実験を行うことができます:ステップ4.1.1、飽和時の最大力の測定[Ca2+];ステップ 4.1.2, ステップ 4.1.1 に加えてカルシウム感受性を決定する Force-pCa 曲線を取得します;;ステップ 4.1.3, ステップ 4.1.1 または 4.1.2 に加えて短縮再伸縮プロトコルを行うことによって、テンション再開発の速度を決定します。- 最大の活性力を測定します。
- システム コントローラ ソフトウェアでデータの記録を開始します ( 資料表を参照) をクリックして、 '開始' を押します。
- データ取得パネルでバルブ 1 と 6 を開き (材料表を参照)、ボタンをチェックしてボタン '1+6' をチェックして、リラックスした溶液のƟガラスの流れを開始し、Ɵガラスを通してソリューションを活性化します (図 6A)。
- 干渉計の上で [ 範囲のリセット ] を選択して押して、基線力が 0 V になるように干渉計の範囲をリセットします ( 材料表を参照)。
- 力のトレースが安定したら、Ɵガラスのファストステップ(ステップサイズ= 100 μm)を実行します。
信号発生器の設定は、表1(図5C)にあります。図4Dに類似した活性化緩和トレースが記録され、システムコントローラソフトウェアに表示されます。 - [一時停止] ボタンを押して、システム コントローラ のソフトウェア データの記録を一時停止します。
- これ以上の活性化を行わない場合は、バルブ 1 と 6 を閉じてボタンのチェックを外してƟガラスの流れを止めます (図9、 材料表) を押して終了'を押してバックグラウンドフローを停止します。
- フォース-pCa曲線
注:これは、ステップ4.1.1に似ていますが、異なるpCaソリューションを使用して複数のアクティベーションを行う場合は、最大のアクティブフォースを得ます。- システム コントローラ ソフトウェアでデータの記録を開始するには、 Startを押します。
- データ取得パネルソフトウェアでバルブ1と2を開き、Ɵガラスを通してリラックスした溶液とpCa 6.2の流れを開始します。
- 干渉計の 「範囲をリセット」を選択して押すことで、干渉計の範囲をリセットして、ベースラインの力が 0 V になるようにします。
- 力のトレースが安定したら、Ɵガラスのファストステップ(ステップサイズ= 100 μm)を実行します。
信号発生器の設定は 、表1にあります。 - [一時停止] ボタンを押して、システム コントローラ ソフトウェアを一時停止します。
- バルブ 1 と 3 (pCa 5.8)、バルブ 1 と 4 (pCa 5.6)、バルブ 1 と 5 (pCa 5.4)、バルブ 1 および 6 (pCa 4.5) について、ステップ 4.1.2.1 ~4.1.2.4 を繰り返します。
- これ以上の活性化を行わない場合は、バルブ1と6を閉じて、ボタンのチェックを外してƟガラスの流れを止めます(図9)を押してシリンジポンプ(図9)を止め、Luerバルブを閉じてバックグラウンドフローを停止します。
- 緊張再開発の測定率 (kTR).
注: これは、最大アクティブフォースのステップ 4.1.1 に似ていますが、いくつかの変更と追加のステップがあります。- ミオフィブリルを15%緩めるために必要なピエゾ運動を計算し、この値を信号発生器に入力する(図5D、表1)。
- 'Start'を押して、システム コントローラ ソフトウェアでデータの記録を開始します。
- データ取得パネル(図6A)でバルブ1と6を開き、リラックスした溶液とpCa 4.5の流れをƟガラスを通して流れ始める。
- 干渉計の 「範囲をリセット」を選択して押すことで、干渉計の範囲をリセットして、ベースラインの力が 0 V になるようにします。
- 力のトレースが安定したら、Ɵガラスのファストステップ(ステップサイズ= 100 μm)を実行します。
信号発生器の設定は 、表1にあります。 - 力高原に達したら、ピエゾで短縮再伸縮を行う。
信号発生器の設定は(図5D、表1)にあります。図 4Eに類似した活性化緩和トレースが記録され、システム・コントローラー・ソフトウェアに表示されます。
注: カスタム プロトコルを作成して、上記の手順を自動化できます。 - [一時停止] ボタンを押して、システム コントローラ ソフトウェアを一時停止します。
- これ以上の活性化を行わない場合は、バルブ1と6を閉じて、ボタンのチェックを外してƟガラスの流れを止めます(図9)を押してシリンジポンプを停止し、LuerバルブをTerminate閉じてバックグラウンドフローを停止します。
- 最大の活性力を測定します。
- 受動力測定を行います。
- 連続的なストレッチを実行します。
- ミオフィブリルを伸ばすために必要なピエゾ運動を計算し、この値を信号発生器に入力する(表1)。
注: 設定の例を示します。サルコメアの長さに対するストレッチの量とストレッチ時間を計算します。これらの設定は、サルコメア当たりの伸張速度がmyofibrils全体で等しく保たれるようにするために必要です。 - 'Start'を押して、システム コントローラ ソフトウェアでデータの記録を開始します。
- 干渉計の 「範囲をリセット」を選択して押すことで、干渉計の範囲をリセットして、ベースラインの力が 0 V になるようにします。
- ピエゾを操作するには、システムコントローラソフトウェアの信号発生器で連続ストレッチを実行します。信号発生器の設定例は 、表1にあります。
- ストレッチが終了した後、ピエゾで筋の長さにミオフィブリルを短くする(表1)。
- ミオフィブリルを伸ばすために必要なピエゾ運動を計算し、この値を信号発生器に入力する(表1)。
- 段階的なストレッチを実行します。
- 'Start'を押して、システム コントローラ ソフトウェアでデータの記録を開始します。
- 干渉計の 「範囲をリセット」を選択して押すことで、干渉計の範囲をリセットして、ベースラインの力が 0 V になるようにします。
- システムコントローラソフトウェアで信号発生器を使用して段階的にストレッチを実行し、piezoを操作します。信号発生器の設定例は、表1(図5E)にあります。
- ストレッチが終了した後、ピエゾで筋炎の長さにミオフィブリルを短くします。信号発生器の設定例は 、表1にあります。
- 連続的なストレッチを実行します。
- [一時停止] ボタンを押して、システム コントローラ ソフトウェアを一時停止します。
- システム コントローラ ソフトウェアの [停止] ボタンを押して、データの記録を停止します。
- システム コントローラ ソフトウェアで [ファイル] および [ データの保存 ] を押して、データを保存します。
5. クリーニング
- 測定したミオブリルを取り除き、次のミオブリルに備えます。
- これを行うには、慎重に40xの目的で眼を見ながら、myofibrilを引き裂きます。
- フォースプローブとピエゾを上に移動します。Ɵガラスを上に、右に、そして後ろに移動します。その後、上に移動し、フローチャンバーを離れてスライドします。ティッシュバスを取り除きます。
- 取り付け針をきれいにするには、10xと眼を使用して焦点を合わせます。ブラシをエタノールに浸し、慎重にブラシを切り落とし、針から接着剤を取り除きます。
注: 接着剤が外れるまでには、しばらく時間がかかる場合がありますのでご注意ください。 - 流れチャンバーとティッシュバスを超純水ですすいでください。
- 超純水で満たされた小さなペトリ皿にプローブを置きます。プローブが完全に水中に入っていることを確認します。
- 実験が完了したら、上記の手順でセットアップをクリーニングし、次の追加手順を実行します。
- フローバスからチューブを空にします。パラメータを流出シリンジポンプに送信します( 材料表、 図9を参照)。バルブ=バスバルブ(2);マイクロステップモード = ノーマル;プランジャーターゲット = 0;プランジャー速度 = 30.
注: チューブが空の場合は、コマンドを終了します。 - ポンプを数回初期化します (図 9B)。
- 注射器を水切りします。これを行うには、すべてのルアーバルブを閉じ、すべてのバルブを開き、注射器の針からチューブを取り出し、特定のpCaのチューブを針の下に保持し、Luerバルブを開きます。圧力プラグを使用してプロセスをスピードアップします。
- チューブを注射器の針に取り付け直します。注射器に約5mLの超純水を充填します。Ɵガラスの下にカップを置きます。すべてのバルブを開き、圧力バルブを開いてシステムをフラッシュします。
- システムをシャットダウンします。PC、干渉計、および圧電コントローラの電源ブロックをオフにします。
- フローバスからチューブを空にします。パラメータを流出シリンジポンプに送信します( 材料表、 図9を参照)。バルブ=バスバルブ(2);マイクロステップモード = ノーマル;プランジャーターゲット = 0;プランジャー速度 = 30.
6. データ分析
- データ ファイルを開き、目的のセグメントを選択して、システム コントローラ ソフトウェア ( 材料表を参照) からスプレッドシート ソフトウェア プログラムまたはクリップボードにデータ トレースをエクスポートします。表示されるトレースはエクスポートされます (例: 生の力、サルコメアの長さ、ピエゾ位置)。
- 選択したソフトウェア(MATLABなど)で解析を実行します。
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Representative Results
データ トレースは、システム コントローラ ソフトウェアで記録され、開かれました ( 資料一覧を参照)。完全なトレースまたは選択したセグメントは、目的のソフトウェアでさらなる分析のためにクリップボードまたはテキストファイルにエクスポートされました。異なるソリューションの流れを制御するためのバルブは、カスタムソフトウェアまたは手動で切り替えられました。カスタム MATLAB スクリプトを使用して、活性化、テンション再開発、および緩和の速度を分析しました。受動力実験の最大活性力とピーク及び高原力を、システムコントローラソフトウェア力トレースから直接採取した。myofibrilを取り付けた後(図2)、目的のプロトコルを選択しました。
最大の活性力とカルシウム-マウスおよびヒト骨格筋生検から分離されたマイオフィブリル中の力の感受性
図4Aでは、活性力実験に用いる実験用セットアップが模式的に描かれている。健康なヒト四頭筋から分離された筋炎を用いた活動力実験の力痕跡が示されている。myofibrilは、さまざまなpCa(pCa 6.2、5.8、5.6、5.4、4.5;図4Bに示すデータ)のソリューションで5回活性化された。この実験における全マイオブイブリルの平均最大力は、〜123 mN/mm2であった。25つのカルシウム溶液のそれぞれで各活性化の間に達したプラトー力から力-pCa曲線を構成した。結果を図 4Cに示します。この曲線から最大力生産の50%でpCa(pCa50)を算出した。このミオブリルでは、pCa50は5.75であった。
さらに、1つまたは複数の化合物を浸透液に添加して、ミオフィブリルによって産生される力に対するその影響を測定することができる。 図4Dにおいて、N-ベンジルp-トルエンスルホンアミド(BTS)の効果を、速い筋(II型)ミオシン重鎖II(MHCII)阻害剤に、例示する。19 ミオブリルは、pCa 5.6溶液で最初に活性化され、その後、pCa 5.6 + BTS溶液で活性化された。2回目の活性化中に少ない力が産生され、これがMHCIIを含むミオブリルであることを示す。特定の筋肉型に排他的に存在するタンパク質の突然変異があり、したがって、その特定の筋肉型からの筋線維にのみ影響を与えます。その場合、様々な筋肉型に対する突然変異効果を識別するために、myofibrilsを「タイピング」することが重要である。また、この例は、myofibrilsにおける治療化合物の有効性を試験する可能性を示す。
図4Eは、マウス骨格ソレウス筋組織から単一の筋線維性を単一に分離した能動力トレースを示す。ミオフィブリルはセットアップに取り付けられ、リラックスした溶液(pCa 9.0)を灌流し、続いて活性化溶液(pCa 4.5、〜0.032 mMカルシウム)を灌流した。我々は同時に力とサルコメアの長さを記録した。カンチレバーの偏向は約0.5μmで、ミオフィブリルの緩み長さ(〜50μm)の約1%であったため、これはほぼ等角収縮でした。図4Eでは、緊張再発生率を評価するために、アクティブな収縮の間に急速な短縮リストレッチプロトコルを実施した(kTR、黄色の破線)。kTRは、クロスブリッジサイクリングキネティクスの尺度です。また、活性化および緩和曲線をそれぞれ活性化率(kACT、赤破線)および弛緩(kREL、緑破線)を決定するために取り付けた。図4は、図4Fで強調された緩和フェーズのより詳細な図を示しています。2つの段階が明らかになった:1)緩和の初期遅い段階(クロスブリッジ剥離によって支配される)および2)緩和の速い段階(クロスブリッジ剥離およびカルシウム解離によって支配される)20。
ヒト骨格筋生検から分離された筋原線維における受動力
図10 は、健康なヒト横隔膜筋組織から分離された筋形筋を用いた受動的な力実験の痕跡を示す。最初のプロトコルは、サルコメアの粘弾性特性を決定するために1つまたは複数の受動的ストレッチを含んでいました。 図10 は、ミオフィブリルの連続的なストレッチ(サルコメア長さ2.2~3.0μmからのストレッチ)の力痕を示しています。ストレッチ中、筋線維は粘性と弾性特性の両方を示した。これは 図 10Aに示す曲線から明らかです。鋭いピークは両方の特性を表し、プラトー力は弾性の尺度です。粘度は直線的にひずみに抵抗する。これにより、歪が除去された後に力が落ちた。 図10B はストレッチ自体を強調し、高い信号対雑音比を示しています。強制トレースはフィルタ処理されない点に注意してください。
図1:骨格筋とその形態の模式図と電子顕微鏡画像(A)骨格筋の構造を示し、(B)はサルコメアの構造、最小の収縮単位を示す。これらの模式画像は、セルヴィエ医療技術から適応され、(C)単一の筋線維の画像を示し、(D)は筋線維の電子顕微鏡画像を示し、筋細動の損傷と保存された筋細動性の超構造を明らかにする。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:取り付けられたミオフィブリル、Ɵガラスのアライメント、ピエゾ取り付け針を示す画像。(A) 40倍の目的を通して見たように、シェラックでコーティングされたガラス繊維針の間に緩い長さで取り付けられた筋形リブリル。(B) 10x の目的を通して見た、ミオフィブリル(白い楕円形で強調表示されている)に対するƟガラスの位置の画像。(トップ)トップチャンネル(リラックスソリューション、pCa 9.0)に整列。(下)下のチャネル(活性化溶液、pCa 4.5)に整列して、ミオフィブリルをカルシウムと浸透させ、収縮を誘導する。(C) ミオブリルに対するƟガラスの位置の概略描写。(トップ)トップチャンネル(リラックスソリューション、pCa 9.0)に合わせて配置します。(下)下のチャネル(活性化溶液、pCa 4.5)と一致して、ミオフィブリルをカルシウムと浸透させ、収縮を誘導する。(D)ピエゾホルダーのカーボンロッドに取り付けられた取り付け針。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:組織フローチャンバのセットアップと終了部分の概略表現。ダークブルーでは、アルミニウムから作られた組織フローチャンバー、および白色で力プローブとƟガラスが位置に示されている空洞。(中央)力プローブとピエゾ長モータに取り付けられた2本のガラス繊維取り付け針の間に取り付けられた筋形リベリル。Ɵガラスは筋形筋と一致している。Ɵガラスは、ミオブリルをカルシウム溶液にさらすために上下に移動することができます。(右)カンチレバー力プローブのクローズアップ。キャビティサイズ(またはファブリー・ペロキャビティ 、d)が示されています。リフレクション インターフェイス A、B、および C;レーザー(赤)から放射される光波の例を示します。片持ちはフェルールの肩に取り付けられています。干渉計からレーザーを運ぶ繊維は、カンチレバーの先端にフェルールを出ます。ガラス製の取り付け繊維はワックスを使用して片持ち面に固定されています。(左上)干渉計はシステムコントローラソフトウェアに送信される干渉計信号を分析します。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:実験的なセットアップとアクティブテンション実験からのデータ(A) 使用する灌流セットアップとソリューションの概略図。なお、第1及び最後のチューブ(水色)には、カルシウムを含まない溶液(すなわち、リラックス液)が含まれている。(B) ミオフィブリルをヒト骨格筋組織から分離した活性緊張実験の例は、リラックス溶液(pCa 9.0)から複数の活性化溶液(pCa 6.2 -4.5)への5つの活性化を示す。(C) 力カルシウム曲線;パネルの高原(B)における力レベルを正規化し、それぞれのカルシウムレベルに対してプロットした。(D) pCa 5.6溶液(青色)で活性化されたヒト骨格筋から分離されたII型(高速けいれん)筋の筋の力痕跡の例(pCa 5.6+BTS(タイプII特異的架橋阻害剤、赤)。(E)活性化中に急速な短縮再伸縮プロトコルを用いてマウスソレウス骨格筋組織から分離された筋膜を用いたアクティブテンション実験の例データトレース(kTR、黄色の破線)を決定する。また、活性化および緩和曲線をそれぞれ、活性化速度(kACT、赤破線)および弛緩(kREL、緑破線)を決定するために取り付けた。(F) 緩和フェーズのズーム(左上)で強調表示(E)高速ステップモーター信号(左下)は、活性化溶液(pCa 4.5)からリラックスした溶液(pCa 9.0)に溶液が変化した時点を示した。緩和フェーズは、線形の遅いフェーズ(右上)と指数関数的で速いフェーズ(右下)で構成されていました。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図5:システム制御ソフトウェアにおける信号発生器の設定例( 資料一覧を参照)。1) 信号発生器に入力されたコマンドを実行するボタンを示します。(A)ピエゾ長モーターの設定(B) 高速ステップモーターの設定(C) 5 sの期間の間、ミオブリルを活性化するための高速ステップを行う(D) 筋知有効の急速な短縮リストレッチを行ってkTRを決定する。(E) 筋線維性の段階的なストレッチを行い、粘弾性特性を決定する。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図6:PCで使用されているバルブコントローラソフトウェア(A)バルブ1(Rx)と6(アクト)を開くために使用されるボタン。(B)すべてのバルブが閉じられるときのボタンの状態。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図7:システムコントローラソフトウェアによるサルコメア長さ、筋知向きの長さ、およびミオブリル幅の測定ルーラーは例として使用されます。(A)サルコメアの長さを測定する:紫色の箱がミオフィブリルの周りに置かれ、サルコメアの長さが(1)に示されている。(B)長さを測定する:シアンボックスは、ミヒブリルの最初から最後まで配置されます。(C)測定幅:カメラを90°回転させた後、シアンボックスは、ミオブリルの片側から他方に配置されます。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 8: 熱電温度コントローラソフトウェア(A) 熱電温度コントローラとの接続を確立します。(B) 温度設定の拡張(C)希望温度を設定し、この場合:15 °C(D)熱電温度コントローラをオンにし、ペルチェ熱電冷却器モジュールに電圧を送信します。Dこの図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図9:シリンジ流出ポンプの設定(A)を押してポンプへの接続を開く(1)。(B)(2)を押して、事前定義された設定でポンプを開始します。(C) 「バルブコマンド」を「バスバルブ」(2)に設定し、図のように「コマンドセットパラメータ」を入力して、流出ポンプを開始します。(3)を押してコマンドを実行します。コマンドは、(4)を押すと終了できます。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図10:ヒト骨格筋組織から隔離された筋線維を用いた受動的緊張実験のデータトレース例。(A)ストレッチおよびリリースプロトコル中の力(上)とサルコメアの長さ(下)の記録。(B) ミオブリルのストレッチ段階での力(上)とサルコメアの長さを示す(A)のズーム。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図11:心筋細胞カルシウムの事前活性化実験からの実験セットアップおよびデータ。(A) 灌流セットアップの概略図。なお、最後のチューブ(水色)にはカルシウムフリーの溶液(リラックス液)が含まれています。(B)心筋細胞の活性化の曲線(水色)と(濃い青色)カルシウムの予活を伴い、カルシウム濃度はそれぞれ1nMおよび80nMである。(C)ラット左心室から分離した野生型(WT)とヘテロ接合性RBM20(HET)心筋細胞におけるカルシウム予活の比較この図は、ナジャフィら21から変更されています。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
| ステップ | デバイス | 説明 | 形状 | 初期 | ||||||||
| 1.7.1. | 圧電 | 初期化パッシブテンション | 固定 | 51.6 μm | ||||||||
| 1.7.2. | 圧電 | 初期化アクティブテンション | 固定 | 0 μm | ||||||||
| ステップ | デバイス | 説明 | 形状 | 初期 | 遅延 | 担当者 | レベル | 遅延 | レベル | 遅延 | ||
| 3.4.4. / 4.1.1.4./ 4.1.2.4. | 高速ステップ | ɵガラス位置の試験/マイオブリベリの活性化 | パルス | 4 V | 1 s | 1 x | 3 V | 5 s | 4 V | 1 s | ||
| 4.1.3.4. | 高速ステップ | ミオブリルの活性化(kTRを含む) | パルス | 4 V | 1 s | 1 x | 3 V | 10年代 | 4 V | 1 s | ||
| ステップ | デバイス | 説明 | 形状 | 初期 | 遅延 | 担当者 | ランプレベル | ランプの継続時間 | 遅延 | ランプレベル | ランプの継続時間 | 遅延 |
| 4.1.3.1. / 4.1.3.6. | 圧電 | kTRのための短縮-リストレッチ | 台形 | 0 μm | 0.5 s | 1 x | 0 + 0.15 * L0 = __ μm | 0.01 s | 0.01 s | 0 μm | 0.01 s | 1 s |
| 4.2.1.1. / 4.2.1.4. | 圧電 | ストレッチを続ける | 台形 | 51.6 μm | 2 s | 1 x | 51.6 - 0.30 * L0 = __ μm | 2 s | 0 s | 51.6 - 0.30 * L0 = __ μm | 0 s | 1 s |
| 4.2.1.4. | 圧電 | ミオブリルを緩い長さに戻す | 台形 | 1.6 μm | 2 s | 1 x | 51.6 μm | 5 s | 0 s | 51.6 μm | 0 s | 1 s |
| 4.2.2.3. | 圧電 | 段階的ストレッチ | 台形 | 51.6 μm | 2 s | 10 x | 51.6 - 5 μm | 0.5 s | 10 s | 51.6 - 5 μm | 0 s | 0 s |
| 4.2.3. | 圧電 | ミオブリルを緩い長さに戻す | 台形 | 1.6 μm | 2 s | 1 x | 51.6 μm | 5 s | 0 s | 51.6 μm | 0 s | 0 s |
表1:ピエゾ長モータと高速ステップモータを操作するためにシステムコントローラソフトウェアで使用される各種信号発生器設定を説明する表
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Discussion
記載は、ヒトまたは動物骨格筋組織から分離された筋原線維の収縮機能を評価するプロトコルである。このセットアップの力の分解能は、以前にChavanらら12によって説明されています。要するに、検出繊維とカンチレバーの間に形成されたファブリ・ペロ空洞の長さのランダムな変動によって決定され、読み出しの出力(Vで表される)の出力でノイズの支配的な部分を生成し、偏向感度(m/Vで表される)とカンチレバーのばね定数(N/mで表される)によって、ノイズを与えます。セットアップでは、1,000 データポイント/s (サンプル/s) でサンプリングされた読み出しの出力での空気中の二乗平均平方根(rms)ノイズは約 2 mV です。典型的なミオフィブリル測定では、フェルールトッププローブを使用し、スプリング定数は〜0.7 N/m(偏向感度〜300 nm/V)です。この rms 値は、0.6 nm のカンチレバー偏向解像度に対応し、これは約 0.37 nN の力の感度に変換されます。力プローブは、読み出しレーザ13の波長の倍数に等しいカンチレバーの曲げを維持しながら、取り付け針の先端を計量スケールに押し付けることで較正される。このキャリブレーション方法は、カンチレバーと取り付け針の剛性の両方と、筋形筋の収縮の速度と大きさによるカンチレバーと取り付け針のトルクの可能な変動を伴います。現在、ミオフィブリル収縮性を評価するためのセットアップが利用可能であり、これはカンチレバーから偏向したレーザーの検出、すなわち光ビーム偏向(1,700 A;〜1nn力分解能)に基づいている。このシステムは、Labudaらによって開発され、レーザー光をカンチレバーに向かって導き、構成11に近い方向に導く光学ペリスコープを使用した。このシステムでは、原子力の片持ち体と硬質ガラス針の間にミオブリルが取り付けられる。ここで説明するシステムの利点は、高い力感度と信号対雑音比です。さらに、この設定では、比較的硬いカンチレバーを使用することができ、これはmyofibrillar力が適用されると小さなカンチレバー偏向をもたらす。サルコメアの長さはほぼ一定の力で測定できるため、これは重要です。最後に、Labudaららによって記述されたシステムと比較して、ここでのシステムは、温度を制御し、筋形筋の長さの変化を誘発し、そしてƟガラスおよび速いステップモーターを用いて灌流液を変えるために類似または同一の方法を利用する。Labudaらによって説明されるシステムの利点は、溶液組成(カンチレバーと光学ペリスコープの間)の変化が信号出力に影響を与えない点である。ここで説明するシステムにおいて、カンチレバーと光ファイバの間の溶液組成は一定のままでなければならない。この制限の解決策については、以下で詳しく説明します。
最適化
高速ステップ灌流システムと組み合わせた光学力プローブは合併症を引き起こした。低濃度と高濃度のCa2+溶液の間の光学特性の違いは、力の測定を妨げる。高カルシウム溶液の逆流を防ぐために、カスタムフローチャンバを設計した(図3)。カルシウムフリー溶液の一定の背景流れは、右から左に誘導され、光ファイバの上部と片持ちレバーの間の溶液を一定に保つ(図3D)。
温度を制御するために、液体冷却を有するペルチェ素子が流れチャンバに取り付けられる。この流れチャンバはプラスチックアダプターに取付けることによって顕微鏡から熱的に結合されない。TECシステムによって制御されるペルチェ要素を使用すると、0.1°Cの精度で溶液の温度を時間をかけて制御することが可能です。温度は流れチャンバに取付けられた温度センサーによって監視される。温度安定性は、力トランスデューサの性質上重要です。カンチレバーは金で塗られたガラスストリップから成り、温度計に効果的にする。したがって、カンチレバーは温度変化に伴って曲がる。
セットアップでは、Ɵガラスの動きを制御するために、高速ステップの灌流システム( 材料表を参照)を使用します。このシステムは10 msの内の潅流スイッチを可能にする。温度制御と溶液切り替えの方法を組み合わせることで、このシステムは、筋線維におけるサルコメア収縮性(すなわち、力の発達率、緊張再開発、および緩和)の運動を測定するのに特に適しています。
当初、干渉測定を使用することの欠点は、干渉曲線の線形部分を使用する必要性(λ/8、λがレーザーの波長である)の使用が必要なため、使用可能な小さな範囲でした。しかし、最近の技術革新により、波長変調とロックインアンプを組み合わせることで、この必要性が排除されました。したがって、システムは、干渉曲線の単一の線形部分に限定されない。これにより、カンチレバー14の無限偏向の測定が可能になる。従って、このシステムのカンチレバー偏向読み出しの範囲は、従来の干渉法に比べて大きく拡大される。さらに、説明した力プローブは交換が容易で、0.5 N/mから>20 N/mの範囲の剛性を持つ多くの片持ち体があります。従って、カンチレバー間を素早く変化させ、実施した実験に最も適した剛性を選択することができる。
課題
現在のシステムは、心筋細胞測定システムをベースとしたプロトタイプです( 材料表を参照)。いくつかのコンポーネントを改善して、より優れたユーザー エクスペリエンスと高品質のデータを提供できます。まず、システムへのアドオンのために、振動と共振は、信号にノイズを追加する問題になる可能性があります。また、Ɵガラスホルダーと高速ステップモーター取り付け方法を改善し、振動を起こしにくいようにすることもできます。
第2に、速いステップモーターをピエゾ長アクチュエータに置き換えて、溶液切り替えの速度を上げ、より一貫した運動を得ることが望ましい。
第三に、我々は、単一の縞状筋線維を活性化するために使用したカルシウム溶液は、プロピオン酸を含んでいたが、これらの溶液は、力の測定を妨げ、近赤外光を吸収する。塩化カルシウムはプロピオン酸の必要性を排除するために使用され、この効果を大幅に減少させた。この問題は、干渉法に基づくシステムに固有のものであり、光ビーム偏向を利用する場合には存在しません。
第4に、カスタムフローバスを、Ɵガラスの流れに合わせて層流を作成するように設計した。これはカルシウムが豊富な溶液の乱流による逆流を防ぐ。従って、光ファイバと片持ち体の先端との間の溶液は一定のままである。myofibrilsとのカバースリップは流れチャンバーの下で自由に動くことができるので、適切なマイフィブリルの選択は流れチャンバの小さい区域に限定されない。
再現性と変動性
取得したデータの再現性と変動性の程度に重要なシステムおよびプロトコルのいくつかの要素があります。
まず、測定の品質は、ミオブリルの分離の品質に強く依存します。同一のプロトコルは異なる生検から異なる品質と量のmyofibrilsを生成します。場合によっては、生検はかろうじて使用できるマイオブリブリルを生み出すか、まったく何も得ない。一般的なコンセンサスは、損傷したマイオブリブリルが収縮中に壊れるため、結果には考慮されないということです。
第2に、ミオブリルの断面積の決定に不確実性がある。技術的な制約により、1面のみでミオブリルの幅を測定することが可能です。したがって、断面面積を計算するには、幅と深さが等しいと仮定します。力が最大のアクティブテンションを計算するために断面積に正規化される場合、この仮定に注意する必要があります。
myofibrilの取り付け角度、位置、および接着剤の完全性によるミヒブリルの取り付け。
取り付け角と位置は、主に視覚的に制御することができますが、myofibrils間の小さな変動が存在する可能性があります。接着剤の完全性は広範囲に調査されていません。しかし、活性の前後に筋のサルコメア長さを監視することで、接着剤の完全性を検証することができます。プロトコルの後に接着剤の間にサルコメアが多い場合、これは接着剤中の筋知見性の滑りが起こったことを示唆している。したがって、この myofibril はデータセットから除外する必要があります。
セットアップの他の用途:ラット左心室から分離された心筋細胞におけるカルシウムの前駆出
筋原線維の収縮機能を評価することに加えて、このシステムは心筋細胞力学の測定にも使用できる。例えば、図11は、ラット左心室21から単離された膜透過性単一心筋細胞の使用を示す。上記の実験とは対照的に、リラックス溶液を変化させ、活性化溶液を一定に保った。各心筋細胞は5組の活性化を受け、1秒の2μMのカルシウム溶液に曝露した。1 s 時間制約は、低カルシウム濃度溶液への暴露が拡張期を模倣し、高カルシウム濃度溶液への暴露が心筋収縮の収縮期を模倣する、限られた心臓収縮の性質を模倣するために選択される(図11A)。5組の拡張カルシウムのそれぞれについて変化した(1、80、160、250、および400nMカルシウム)、収縮期カルシウムは一定のままであった(図11A)。セットは、1.8 μm対2.0 μm、2.0 μm対2.0 μmの2組の3つの活性化緩和サイクルから構成され、異なる実験グループで2.2μmになります。ピーク力をピペットのスイッチから1sで測定し、3つの活性化緩和サイクルのセットについて平均した。高い信号対雑音比とこの力トランスデューサの高いダイナミックレンジにより、拡張期力の小さな変化とはるかに大きな収縮力の両方を測定することができました(図11B)。拡張期カルシウムの増加は、最初の活性化に対して2μMのカルシウムでより高い力をもたらした(図11B)。WTラット心筋細胞をヘテロ接合(HET)RMB20ラット心筋細胞と比較した。代替スプライシングのために、HETラットはWTラットと比較してより適合性の高いティチンタンパク質を有する。80および160μMのカルシウムでHET心筋細胞において効果が誇張された(図11C)。
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Disclosures
ミシエル・ヘルメスは、IONOptix Inc.の株主兼共同オーナーです。
Acknowledgments
このプロジェクトは、AFMテレソンとネマリンミオパシーのための財団の建物の強さによって資金提供されました。著者は、この記事で言及されている製品の作成者を認めてほしいと考えています, IONOptix Inc. .
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bio Spec Products, Inc. | 985370-XL | To isolate myofibrils | |
| Custom coded | Matlab | ||
| Custom fabricated | Includes Labview program to control over serial connection; To control valves | ||
| Custom fabricated | To cool the Peltier module | ||
| Custom fabricated | |||
| Custom fabricated | Aluminum tissue chamber | ||
| Custom fabricated | To control the valves; Includes PC software to control over USB | ||
| IonOptix | System controller software: data recording software with advanced signal generator for piezo and fast-step | ||
| IonOptix | MCS100 | To record sarcomere length | |
| IonOptix | Includes: Optiforce (interferometer), Micromanipulators, Signal interface, Piezo motor and controller. Based on the MyoStretcher | ||
| IonOptix | Force probe | ||
| Koolance | ADT-EX004S | ||
| Koolance | EX2-755 | To cool the Peltier module | |
| Microsoft | Data registration | ||
| Olympus | IX71 | ||
| Olympus | TH4-200 | ||
| Sigma-Aldrich | 529265 | Poly(2-hydroxyethyl methacrylate); Coating for microscope slides to prevent sticking of tissue | |
| Sigma-Aldrich | 78471 | Crystals to dissolve in ethanol resulting in glue | |
| TE Technology, Inc. | TE-63-1.0-1.3 | To cool the tissue flow chamber | |
| TE Technology, Inc. | TC-720 | Includes PC software to control over USB | |
| Tecan Trading AG | 20736652 | ||
| Tecan Trading AG | 20739263 | Syringe pump to induce backgroundflow together with fast-step perfusion system; Outflow from tissue flow chamber | |
| Thermo scientific | 2441081 | ||
| Warner Instruments (Harvard Bioscience, Inc.) | Discontinued | Alternative: SF-77CST/VCS-77CSP | |
| Warner Instruments (Harvard Bioscience, Inc.) | TG150-4 | To perfuse the tissue | |
| 1 PC for IonWizard and 1 PC for other software |
References
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