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Neuroscience

अक्षुण्ण माउस और ज़ेब्राफ़िश मस्तिष्क में गहरे ऊतक तीन फोटॉन प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी

Published: January 13, 2022 doi: 10.3791/63213
Automatic Translation
*1, *1, 2, 1,3, 1,4, 1, 1, 1, 2, 1
1School of Applied and Engineering Physics, Cornell University, 2Department of Neurobiology and Behavior, Cornell University, 3College of Veterinary Medicine, Cornell University, 4Meinig School of Biomedical Engineering, Cornell University
* These authors contributed equally

Summary

तीन-फोटॉन माइक्रोस्कोपी उच्च-विपरीत प्रतिदीप्ति इमेजिंग को जीवित जैविक ऊतकों में गहराई से सक्षम बनाता है, जैसे कि माउस और ज़ेब्राफ़िश दिमाग, उच्च स्पैटिओटेम्पोरल रिज़ॉल्यूशन के साथ।

Abstract

मल्टीफोटॉन माइक्रोस्कोपी तकनीक, जैसे कि दो-फोटॉन माइक्रोस्कोपी (2 PM) और तीन-फोटॉन माइक्रोस्कोपी (3PM), उपकोशिकीय रिज़ॉल्यूशन के साथ विवो इमेजिंग में गहरे ऊतक के लिए शक्तिशाली उपकरण हैं। 3PM में 2PM पर गहरे ऊतक इमेजिंग के लिए दो प्रमुख फायदे हैं जो जीव विज्ञान प्रयोगशालाओं में व्यापक रूप से उपयोग किए जाते हैं: (i) ~ 1,300 एनएम या ~ 1,700 एनएम उत्तेजना लेजर को नियोजित करके बिखरने वाले ऊतकों में लंबी क्षीणन लंबाई; (ii) उच्च-क्रम अरेखीय उत्तेजना के कारण कम पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति उत्पादन। नतीजतन, 3PM उच्च-विपरीत संरचनात्मक और कार्यात्मक इमेजिंग को प्रकीर्णन ऊतकों के भीतर गहराई से अनुमति देता है जैसे कि कॉर्टिकल परतों से हिप्पोकैम्पस तक बरकरार माउस मस्तिष्क और वयस्क ज़ेब्राफ़िश के पूरे अग्रमस्तिष्क।

आज, 3PM के लिए उपयुक्त लेजर स्रोत व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं, जो मौजूदा दो-फोटॉन (2P) इमेजिंग सिस्टम को तीन-फोटॉन (3P) सिस्टम में परिवर्तित करने में सक्षम बनाता है। इसके अतिरिक्त, कई वाणिज्यिक 3 पी माइक्रोस्कोप उपलब्ध हैं, जो इस तकनीक को जीव विज्ञान अनुसंधान प्रयोगशालाओं के लिए आसानी से उपलब्ध कराता है। यह पेपर एक विशिष्ट 3PM सेटअप के अनुकूलन को दिखाता है, विशेष रूप से जीव विज्ञान समूहों को लक्षित करता है जिनके पास पहले से ही 2P सेटअप है, और बरकरार माउस और वयस्क ज़ेब्राफ़िश दिमाग में इंट्रावाइटल 3 डी इमेजिंग प्रदर्शित करता है। इस प्रोटोकॉल में माइक्रोस्कोप संरेखण, ~ 1,300 और ~ 1,700 एनएम लेजर दालों, पशु तैयारी, और इंट्रावाइटल 3 पी प्रतिदीप्ति इमेजिंग वयस्क ज़ेब्राफ़िश और माउस दिमाग में गहरी इंट्रावाइटल 3 पी प्रतिदीप्ति इमेजिंग सहित 3 पी इमेजिंग की पूरी प्रयोगात्मक प्रक्रिया शामिल है।

Introduction

जीवन विज्ञान में, मल्टीफोटॉन माइक्रोस्कोपी (एमपीएम) तकनीक, जैसे कि 2PM और 3PM, उच्च स्पैटिओटेम्पोरल रिज़ॉल्यूशन और बिखरने वाले ऊतकों में उच्च विपरीत के साथ विवो इमेजिंग में गहरे के लिए शक्तिशाली उपकरण रहे हैं। इसके अतिरिक्त, ये विधियां एक-फोटॉन कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी 1,2,3,4 की तुलना में कम फोटोब्लीचिंग का कारण बनती हैं। दो प्रमुख विशेषताओं के कारण 2PM की तुलना में 3PM गहरे ऊतक इमेजिंग के लिए फायदेमंद है: (i) लंबी तरंग दैर्ध्य उत्तेजना (~ 1,300 एनएम या ~ 1,700 एनएम) का रोजगार ऊतक प्रकीर्णन को कम करता है, और (ii) उच्च-क्रम उत्तेजना प्रक्रिया (यानी, प्रतिदीप्ति संकेत 2PM में उत्तेजना शक्ति के वर्ग के बजाय 3PM में उत्तेजना शक्ति के घन पर निर्भर करता है) जो अवांछित पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति3 को दबादेता है . नतीजतन, 3PM जीवित ऊतकों में गहरे क्षेत्रों में उच्च-विपरीत इमेजिंग को सक्षम बनाता है जैसे कि एक बरकरार वयस्क माउस मस्तिष्क में हिप्पोकैम्पस 3,5,6,7,8,9,10,11 और वयस्क ज़ेब्राफ़िश12 के पूरे अग्रमस्तिष्क, जिसमें Ca2 + भी शामिल है। गतिविधि रिकॉर्डिंग और बहुरंगी टिप्पणियों. इसके अलावा, माउस और वयस्क ज़ेब्राफ़िश12,13 की बरकरार खोपड़ी के माध्यम से 3PM के साथ उच्च-विपरीत छवियों को प्राप्त किया गया है।

आज, ~ 1,300 और ~ 1,700 एनएम पर 3P उत्तेजना (3PE) के लिए उपयुक्त उत्तेजना लेजर स्रोत व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं। चूंकि लेजर स्कैनिंग सिस्टम अनिवार्य रूप से 2PM और 3PM के लिए समान है, इसलिए मौजूदा 2P सेटअप को 3P सेटअप में परिवर्तित करना जीव विज्ञान प्रयोगशालाओं में 3PE के लिए व्यावसायिक रूप से उपलब्ध लेजर की स्थापना के साथ संभव है। 3P प्रतिदीप्ति संकेत लेजर शक्ति, नाड़ी अवधि, लेजर पुनरावृत्ति दर, और उद्देश्य लेंस के संख्यात्मक एपर्चर (एनए) पर निर्भर करता है। एक विवर्तन-सीमित फोकस मानते हुए (यानी, उद्देश्य लेंस का बैक एपर्चर उत्तेजना बीम द्वारा ओवरफिल किया जाता है), Eq (1) 3PE के परिणामस्वरूप फोकल वॉल्यूम से समय-औसत प्रतिदीप्ति फोटॉन फ्लक्स का वर्णन करता है।

Equation 1 (1)

जहां f लेजर पुनरावृत्ति दर है, π लेजर पल्स अवधि (आधे अधिकतम पर पूर्ण चौड़ाई) है, φ सिस्टम संग्रह दक्षता है, η प्रतिदीप्ति क्वांटम दक्षता है, σ3P अवशोषण क्रॉस-सेक्शन है, C फ्लोरोफोर एकाग्रता है, n0 नमूना माध्यम का प्रतिबिंबित सूचकांक है (उदाहरण के लिए, पानी), π निर्वात में उत्तेजना तरंग दैर्ध्य है, एनए उद्देश्य लेंस का संख्यात्मक एपर्चर है, ए3 फोकल वॉल्यूम का स्थानिक एकीकरण स्थिरांक है, Equation 1 उद्देश्य लेंस के नीचे समय-औसत उत्तेजना फोटॉन फ्लक्स (फोटॉन / एस) है, जेड छविदार गहराई है, और ईएएल प्रभावी क्षीणन लंबाई14 है। यहां हमने मान लिया है कि ईएएल (आमतौर पर > 100 μm) माइक्रोस्कोप के अक्षीय रिज़ॉल्यूशन (आमतौर पर 10 μm <) की तुलना में बहुत अधिक है। पराक्षीय सन्निकटन के तहत, एक3 28.114 के बराबर है। gp(3) उत्तेजना स्रोत का 3rd-order temporal coherence है, और gp(3) क्रमशः हाइपरबोलिक-secant-squared दालों और गाऊसी दालों के लिए 0.41 और 0.51 है। φ संग्रह दक्षता उद्देश्य लेंस द्वारा प्रतिदीप्ति संग्रह पर विचार करके अनुमान लगाया जा सकता है, उद्देश्य लेंस के संचरण, dichroic दर्पण की परावर्तकता, फिल्टर के संचरण, और डिटेक्टर का पता लगाने की दक्षता (जैसे, photomultiplier ट्यूब, या PMT)। चूंकि 3P प्रतिदीप्ति तीव्रता विभिन्न मापदंडों पर अत्यधिक निर्भर है, इसलिए 3P प्रतिदीप्ति संकेतों को अधिकतम करने के लिए 3P सेटअप का अनुकूलन आवश्यक है।

यह प्रोटोकॉल एक विशिष्ट 3 पी सेटअप की अनुकूलन प्रक्रिया को दर्शाता है, जो विशेष रूप से जीव विज्ञान प्रयोगशालाओं के लिए उपयोगी होगा, जिनके पास 2 पी सेटअप है और 3 पी इमेजिंग के लिए अपनी क्षमता का विस्तार करने या इष्टतम प्रदर्शन पर अपने वाणिज्यिक 3 पी सेटअप को बनाए रखने की योजना है। यह वीडियो लेख जीवित जानवरों के दिमाग में गहरे ऊतक 3 पी इमेजिंग को भी दर्शाता है। पहला खंड व्यावसायिक रूप से उपलब्ध लेजर स्रोत और मल्टीफोटॉन माइक्रोस्कोप के साथ एक विशिष्ट 3 पी सेटअप के अनुकूलन को संबोधित करता है। दूसरे और तीसरे खंड ों में क्रमशः न्यूरोनल संरचनाओं और गतिविधियों के 3PM के लिए ज़ेबराफ़िश और माउस तैयारी का वर्णन किया गया है। माउस क्रैनियोटॉमी सर्जरी को पहले प्रोटोकॉल पेपरों में भी15,16,17 की सूचना दी गई थी। चौथा खंड ज़ेबराफ़िश और माउस दिमाग में इंट्रावाइटल 3 पी इमेजिंग को दर्शाता है।

Protocol

जेब्राफ़िश और चूहों के लिए सभी पशु प्रयोग और आवास प्रक्रियाओं को कॉर्नेल विश्वविद्यालय संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (आईएसीयूसी) मार्गदर्शन के अनुसार अनुमोदित और आयोजित किया गया था। Zebrafish और चूहों को प्रयोग के बाद क्रमशः उच्च सांद्रता ट्राइकेन समाधान और कार्बन डाइऑक्साइड श्वासावरोध द्वारा euthanized किया गया था।

1. तीन फोटॉन माइक्रोस्कोपी सेटअप का अनुकूलन

नोट: आंखों की सुरक्षा के लिए लेजर सुरक्षा चश्मा पहनें। एक बीम ब्लॉकर के साथ लेजर बीम को ब्लॉक करें जब प्रकाशिकी को रखा जाता है या स्थानांतरित किया जाता है। लेजर की कल्पना करने के लिए, एक अवरक्त दर्शक या एक अवरक्त डिटेक्टर कार्ड का उपयोग करें।

  1. लेजर को चालू करें और गैर-संरेख ऑप्टिकल पैरामीट्रिक एम्पलीफायर (एनओपीए) के आइडलर आउटपुट के केंद्र तरंग दैर्ध्य को ~ 1,300 एनएम या ~ 1,700 एनएम पर सेट करें।
  2. NOPA के सिग्नल पोर्ट (यानी, ~ 700-900 एनएम) से बीमलाइन पर एक पतली कवर ग्लास रखें ताकि ट्रिगरिंग सिग्नल प्राप्त करने के लिए एक Si फोटोडायोड के लिए लेजर बीम के एक छोटे से अंश को प्रतिबिंबित किया जा सके (चित्रा 1)। कवर ग्लास के संचरण पथ में एक बीम अवरोधक रखें।
  3. 3PM के लिए पल्स अवधि का अनुकूलन करने के लिए femtosecond लेजर prechirp करने के लिए प्रकाश पथ पर पल्स कंप्रेसर जगह. ~ 1,300 एनएम बीम के लिए, एक प्रिज्म-जोड़ी कंप्रेसर 18,19 (जैसे, एन-एसएफ 11 प्रिज्म जोड़े) रखें। ~ 1,700 एनएम लेजर के लिए, मोटाई20 में ~ 3 मिमी की एक सी प्लेट रखें। लेजर संचरण को अधिकतम करने के लिए Brewster के कोण (~ 1,700 एनएम के लिए ~ 73.9 ° ) पर Si प्लेट और लेजर पथ के बीच के कोण सेट करें। प्रतिबिंब को कम करके ब्रूस्टर के कोण को प्राप्त करने के लिए सी प्लेट को घुमाएं।
  4. प्लेस फ्लिपर दर्पण ~ 1,300 एनएम और ~ 1,700 एनएम बीम लाइनों के बीच सुविधाजनक स्विचिंग को सक्षम करने के लिए।
  5. लेजर की तीव्रता को नियंत्रित करने के लिए एक रोटेशन चरण और एक ध्रुवीकरण बीम विभाजक (पीबीएस) पर घुड़सवार एक आधा वेवप्लेट (उदाहरण के लिए, ~ 1,300 और ~ 1,700 एनएम) के लिए उपयुक्त एक आधा वेवप्लेट रखें। PBS के परावर्तन पथ में एक बीम अवरोधक रखें।
    नोट: लेजर को एक उच्च विलुप्त होने के अनुपात को प्राप्त करने के लिए लंबवत रूप से पीबीएस के माध्यम से पारित करने की आवश्यकता होती है। 3PM के लिए लेजर शक्ति आधे waveplate घूर्णन द्वारा नियंत्रित किया जाता है.
  6. पावर कंट्रोलर के बाद और ऑप्टिकल शटर से पहले प्रकाश पथ में एक पतली कवर ग्लास रखें ताकि लेजर बीम के एक छोटे से अंश को पावर मीटर पर प्रतिबिंबित किया जा सके। इमेजिंग के दौरान उद्देश्य के तहत लेजर पावर की गणना करने के लिए 'संदर्भ पावर मीटर' के रूप में पावर मीटर का उपयोग करें (चरण 1.12 देखें)।
  7. 3PM सिस्टम में बीम का प्रचार करने के लिए दर्पण को समायोजित करके लेजर पथ संरेखित करें।
  8. एक अनुवाद चरण और एक बिजली मीटर पर चाकू के किनारे का उपयोग करके उद्देश्य के पीछे एपर्चर की स्थिति में बीम आकार को मापें। सुनिश्चित करें कि बीम का आकार बहुत छोटा या बहुत बड़ा नहीं है।
    नोट: आमतौर पर, बीम गहरे ऊतक इमेजिंग के लिए उच्च शक्ति थ्रूपुट प्राप्त करने के लिए उच्च एनए उद्देश्य लेंस को थोड़ा कम करता है। उदाहरण के लिए, ओलंपस उद्देश्य (~ 15 मिमी बैक एपर्चर व्यास) के पीछे एपर्चर पर ~ 10-13 मिमी (1/e2) का एक बीम आकार ~ 0.7-0.9 के प्रभावी एनए को प्राप्त करने में मदद करता है। जब बीम का आकार बहुत छोटा होता है, तो 3 पी सिग्नल कमजोर हो जाता है, और कम प्रभावी एनए के कारण स्थानिक रिज़ॉल्यूशन खराब हो जाता है। जब बीम का आकार बहुत बड़ा होता है, तो उद्देश्य के पीछे एपर्चर पर बिजली की हानि के कारण उद्देश्य के तहत अधिकतम उपलब्ध उत्तेजना शक्ति कमजोर हो जाती है। गहरे ऊतक इमेजिंग के लिए, सीमांत किरणों को भी ऊतक में लंबे पथ के कारण उच्च नुकसान का सामना करना पड़ता है।
  9. यदि उद्देश्य के पीछे एपर्चर पर बीम आकार उचित नहीं है, तो बीम आकार को समायोजित करने के लिए लेजर बीम पथ में उत्तल लेंस जैसे उपयुक्त ऑप्टिकल तत्वों को रखें।
    नोट:: सुनिश्चित करें कि लेजर बीम अनावश्यक बिजली की हानि को रोकने के लिए galvo दर्पण से बड़ा नहीं है।
  10. 3PM सेटअप पर उद्देश्य लेंस रखें।
  11. एक autocorrelator का उपयोग कर उद्देश्य के बाद नाड़ी अवधि को मापें। पल्स की अवधि बहुत लंबी है (उदाहरण के लिए, >70 fs) है, तो कम दालों को प्राप्त करने के लिए पल्स कंप्रेसर समायोजित करें। 3PM के लिए ~ 50-70 fs दालों का उपयोग करें और लेजर और autocorrelation माप के लिए देरी प्रदान करने के उद्देश्य के बीच रखा एक मिशेलसन interferometer.
    नोट: एक उचित वर्णक्रमीय प्रतिक्रिया के साथ एक फोटोडायोड (उदाहरण के लिए, 1,200 एनएम से अधिक तरंग दैर्ध्य के लिए एक सिलिकॉन फोटोडायोड) उद्देश्य के फोकस पर रखा गया है, आसानी से एक nonlinear डिटेक्टर के रूप में सेवा कर सकता है, और फोटोडायोड से दो-फोटॉन फोटोकरंट का उपयोग ऑटोकोरिलेशन ट्रेस20 प्राप्त करने के लिए किया जा सकता है। ~ 1,300 एनएम के लिए प्रिज्म-जोड़ी कंप्रेसर को दो तरीकों से समायोजित किया जा सकता है: (1) दो प्रिज्म के बीच की दूरी को बदलना; (2) प्रिज्म ग्लास में लेजर बीम के पथलेंथ को प्रिज्म (ओं) को प्रिज्म की आधार रेखा पर लंबवत रूप से स्थानांतरित करके बदलना। ~ 1,700 एनएम के लिए Si प्लेट कंप्रेसर एक मोटी या पतली सी प्लेट के साथ Si प्लेट की जगह द्वारा समायोजित किया जा सकता है।
  12. उद्देश्य लेंस के आउटपुट पर एक पावर मीटर रखें। उद्देश्य के तहत लेजर शक्ति को मापें और संदर्भ पावर मीटर के मूल्य को पढ़ें (चरण 1.6 से)। उद्देश्य के तहत और संदर्भ पावर मीटर पर बिजली के अनुपात की गणना करें।
    नोट: इमेजिंग के दौरान, उद्देश्य के तहत वास्तविक लेजर पावर की गणना पावर अनुपात और संदर्भ पावर मीटर के मूल्य से की जा सकती है।
  13. उद्देश्य के तहत से बिजली मीटर निकालें।
  14. [वैकल्पिक] इमेजिंग सिस्टम के फोटॉन शॉट-शोर सीमित प्रदर्शन को सत्यापित करें
    नोट: इस कार्य को करने के लिए, निम्नलिखित तत्वों की आवश्यकता होती है: 1) एक फ्लोरोसीन या टेक्सास रेड डाई पूल (जैसे, ~ 10 μM), 2) एक फोटॉन काउंटर, और 3) एक ऑसिलोस्कोप।
    1. 3PM उद्देश्य लेंस के तहत डाई पूल नमूना जगह.
    2. डाई पूल पर उद्देश्य लेंस को सावधानीपूर्वक कम करें जब तक कि दूरी उद्देश्य लेंस की काम करने की दूरी से कम न हो।
    3. लेंस और डाई पूल के कवर ग्लास के बीच पानी रखें।
    4. डाई पूल की सतह का पता लगाने के लिए माइक्रोस्कोप की आउटपुट पावर को एक छोटी राशि (उदाहरण के लिए, <1 mW के साथ ~ 1 MHz पल्स पुनरावृत्ति दर) पर सेट करें।
    5. माइक्रोस्कोप का लाइव सत्र प्रारंभ करें और z स्थान को शून्य पर सेट करें.
    6. डाई पूल के शीर्ष तक पहुंचने के लिए धीरे-धीरे उद्देश्य को नमूने से दूर ले जाएं (जैसा कि कवर ग्लास द्वारा उत्पादित तीसरी हार्मोनिक पीढ़ी (टीएचजी) द्वारा इंगित किया गया है)।
    7. कवर ग्लास की स्थिति पर z स्थान को शून्य पर सेट करें।
    8. उद्देश्य को थोड़ा कम करें जब तक कि प्रतिदीप्ति चैनल में एक स्पष्ट प्रतिदीप्ति संकेत दिखाई न दे।
    9. PMT के आउटपुट को BNC विभाजक से कनेक्ट करें. विभाजक के आउटपुट को फोटॉन काउंटर और छवि अधिग्रहण प्रणाली से कनेक्ट करें।
    10. लेजर शक्ति को एक ऐसे मूल्य पर सेट करें जहां प्रति सेकंड फोटॉन की गिनती लेजर पुनरावृत्ति दर के 5% से कम होती है (उदाहरण के लिए, Equation 31 मेगाहर्ट्ज लेजर का उपयोग किए जाने पर 50,000 फोटॉन / एस)।
    11. सॉफ़्टवेयर के साथ न्यूनतम संभव तक दृश्य के क्षेत्र को कम करें और सुनिश्चित करें कि चमक छवि में समान है।
    12. फ़्रेम दर को प्रति सेकंड 1.0 फ़्रेम पर सेट करें.
    13. फोटॉन काउंटर की अधिग्रहण अवधि को t = पिक्सेल निवास समय और एक उपयुक्त भेदभावपूर्ण स्तर × प्रति फ्रेम पिक्सेल की संख्या पर सेट करें।
    14. फोटॉन गिनती और पिक्सेल गिनती एक समतुल्य अवधि के लिए एक साथ ले लीजिए। पिक्सेल गणना प्राप्त करने के लिए, संपूर्ण छवि के औसत पिक्सेल मानों के साथ-साथ माध्य और मानक विचलन मान भी एकत्र करें.
    15. चरण 1.14.14 को दोहराएं, अंधेरे फोटॉन गिनती और पिक्सेल गिनती प्राप्त करने के लिए उत्तेजना लेजर को अवरुद्ध करें।
    16. सॉफ़्टवेयर के लाइव अधिग्रहण को रोकें.
    17. फोटॉन गणना (चरण 1.14.14 में प्राप्त) और कुल पिक्सेल गणना (चरण 1.14.14 में प्राप्त) से डार्क काउंट (चरण 1.14.15 में प्राप्त) घटाएं।
    18. अंधेरे-घटाए गए कुल पिक्सेल गिनती को अंधेरे-घटाए गए फोटॉन गिनती (चरण 1.14.17 में प्राप्त) से विभाजित करें। प्राप्त मान का उपयोग 'रूपांतरण कारक' (यानी, पिक्सेल मान/फोटॉन) के रूप में पिक्सेल मान से फोटॉन गणना तक करें.
    19. पिक्सेल गिनती (चरण 1.14.14 में प्राप्त) के माध्य और मानक विचलन को फोटॉन गणना में कनवर्ट करें, यानी, उन्हें 'रूपांतरण कारक' (चरण 1.14.18 में प्राप्त) द्वारा विभाजित करें। फोटॉन गिनती के माध्य और मानक विचलन की तुलना करें। सुनिश्चित करें कि मानक विचलन फोटॉन गिनती के माध्य के वर्ग मूल के लगभग बराबर है यदि इमेजिंग सिस्टम का प्रदर्शन शॉट-शोर सीमा के करीब है।
  15. [वैकल्पिक] माइक्रोस्कोप की सिग्नल डिटेक्शन दक्षता सत्यापित करें।
    1. माइक्रोस्कोप प्रदर्शन और सिग्नल डिटेक्शन दक्षता का परीक्षण करने के लिए, फोटॉन गणना प्राप्त करने के लिए चरण 1.14.1-1.14.17 का पालन करें। चरण 1.14.15 के लिए, डाई के लिए विलायक से बना एक खाली नमूना बनाएँ और लेजर के साथ खाली नमूने के लिए फोटॉन गिनती प्राप्त करें और डाई पूल के लिए एक ही शक्ति पर। प्रतिदीप्ति फोटॉन गिनती प्राप्त करने के लिए डाई पूल से फोटॉन गिनती से रिक्त गिनती घटाएं।
    2. अपेक्षित फोटॉन गिनती की गणना करने के लिए फ्लोरोसीन या टेक्सास रेड10,22 और Eq. (1) (बैक एपर्चर भरने के लिए एक प्रभावी एनए के साथ) के ज्ञात 3P क्रॉस-सेक्शन का उपयोग करें और फिर प्रयोगात्मक रूप से मापे गए फोटॉन गिनती के साथ गणना किए गए मूल्य की तुलना करें। भविष्य के संदर्भों के लिए माइक्रोस्कोप के लिए परीक्षण परिणामों के रूप में प्रयोगशाला नोटबुक में दोनों फोटॉन गिनती रिकॉर्ड करें।
      नोट:: सुनिश्चित करें कि परिकलित और मापा मान एक दूसरे के करीब हैं (उदाहरण के लिए, 2 के एक कारक के भीतर)। सिस्टम के इस तरह के मात्रात्मक परीक्षण समय के साथ लगातार इमेजिंग प्रदर्शन सुनिश्चित करने के लिए विशेष रूप से उपयोगी हैं।

2. 3PM के लिए मछली की तैयारी

नोट: इस प्रक्रिया के लिए दस्ताने और एक प्रयोगशाला कोट पहनें। प्रयोग के अनुसार वयस्क zebrafish चुनें। ~ 15 मिनट के भीतर पूरी तैयारी (चरण 2.1 से 2.7) को समाप्त करें।

  1. 2% उच्च पिघलने बिंदु अगर के ~ 0.5 सेमी के साथ एक पेट्री पकवान तैयार करें। आगर में एक आयताकार छेद को मछली की तुलना में लंबे समय तक और थोड़ा चौड़ा काटें। आयत में एक छोर के साथ पेट्री डिश में पतली टयूबिंग (मछली के मुंह में पानी के छिड़काव के लिए) संलग्न करने के लिए मोम का उपयोग करें। पेट्री डिश के किनारे पर बड़े व्यास टयूबिंग (पानी को हटाने के लिए) संलग्न करने के लिए मोम का उपयोग करें।
  2. प्रयोग के लिए मछली चुनें। हांक के समाधान में 0.2 मिलीग्राम / एमएल ट्राइकेन समाधान (पीएच 7.2) के साथ मछली को एनेस्थेटिक करें जब तक कि मछली पूरी तरह से अनुत्तरदायी और गहराई से संवेदनाहारी न हो।
  3. मछली को एक गीले स्पंज पर इसकी तरफ रखें। एक माइक्रोसिरिंज का उपयोग करते हुए, मछली को लकवाग्रस्त करने के लिए रेट्रो-ऑर्बिटल रूप से पैंकुरोनियम ब्रोमाइड (हांक के समाधान में 0.4 μg / μL) के 3 μL इंजेक्ट करें। मछली को हांक के समाधान में संक्षेप में रखें ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि यह पूरी तरह से लकवाग्रस्त है।
  4. पेट्री डिश में मछली पृष्ठीय साइड-अप को टयूबिंग की ओर सिर के साथ रखें। टयूबिंग में हेरफेर करने के लिए संदंश का उपयोग करके, धीरे से मछली के मुंह को खोलें और टयूबिंग को मुंह में स्लाइड करें। धीरे से टयूबिंग की ओर मछली स्लाइड इतना है कि टयूबिंग मछली के मुंह के पीछे हो जाएगा.
  5. जल्दी से लेकिन धीरे से मछली के चारों ओर अगर सूखी और मछली के शीर्ष पर पानी को हटा दें। प्रयोगशाला गोंद में प्रयोगशाला ऊतक के एक छोटे से टुकड़े को डुबोएं और मछली के दोनों किनारों पर आगर पर ऊतक को रखें और गिल्स के लिए मछली की पीठ के पुच्छल पर।
    नोट: मछली पर धक्का मत करो या दबाव लागू करें। गिल्स पर गोंद होने से बचने के लिए सावधान रहें।
  6. उस क्षेत्र में इमेजिंग के दौरान मछली को बेहोश करने के लिए सीधे सिर की सतह पर बुपिवाकेन की एक छोटी सी बूंद लागू करें जहां लेजर त्वचा से संपर्क करेगा।
  7. माइक्रोस्कोप के लिए मछली के साथ पेट्री डिश लाओ और इसे मछली की सुविधा वाले पानी से भरें। टयूबिंग को पानी के पंप से कनेक्ट करें ताकि मछली के मुंह में 2 एमएल / मिनट पर सिस्टम पानी पंप किया जा सके और साथ ही साथ उसी दर पर पकवान से परफ्यूजन समाधान को हटा दिया जा सके। सुनिश्चित करें कि पानी एक बबलर के साथ ऑक्सीजनयुक्त है और एक मछलीघर हीटर के साथ ~ 30 डिग्री सेल्सियस तक गर्म हो गया है।
    नोट: मछली अब इमेजिंग के लिए तैयार है। इमेजिंग करते समय तीसरी हार्मोनिक पीढ़ी (टीएचजी) सिग्नल में रक्त प्रवाह की निगरानी करके मछली के स्वास्थ्य की निगरानी करें (अनुभाग 4.1 देखें)। 3 पी इमेजिंग को अधिक परिष्कृत मछली की तैयारी के साथ भी संगत होना चाहिए जैसे कि 2 पी इमेजिंग में उपयोग किए जाने वाले सिर को ठीक करने और आभासी वास्तविकता23 के दौरान इमेजिंग करते समय शरीर के आंदोलनों की अनुमति देने के लिए। यह पूरी तरह से गैर-इनवेसिव इमेजिंग खोपड़ी को हटाने की आवश्यकता से बचता है जैसा कि कशेरुकियों के अन्य अध्ययनों में विशिष्ट है और आक्रामक अनुसंधान और संबंधित दर्द को कम करने की दिशा में एक कदम है।

3. 3PM के लिए माउस तैयारी

नोट: निम्नलिखित प्रक्रियाओं के दौरान दस्ताने, सर्जिकल मास्क और लैब कोट पहनें। प्रयोग के अनुसार माउस लाइन चुनें। माउस को सर्जरी से पहले 12:12 घंटे के हल्के-अंधेरे चक्र के तहत रखा जाना चाहिए। पूरी सर्जरी (चरण 3.2-3.11) एसेप्टिक है, और उपयोग से पहले सभी सर्जरी उपकरणों को निष्फल किया जाना चाहिए। क्रैनियोटॉमी ~ 1 ज लेता है।

  1. एक डोनट के आकार का (4.5-6.5 मिमी व्यास) coverslip और एक coverslip डिस्क (5 मिमी व्यास) साफ parafilm पर जगह. कवरस्लिप डिस्क पर डोनट के आकार के कवरस्लिप को गोंद करने के लिए ऑप्टिकल चिपकने वाला की एक छोटी राशि को लागू करने के लिए एक सुई का उपयोग करें। 10-20 मिनट के लिए पराबैंगनी प्रकाश के तहत पैराफिल्म पर डिस्क-डोनट कवरस्लिप का इलाज करें। पैराफिल्म से पूरे डिस्क-डोनट कवरस्लिप को हटा दें, और मलबे को हटाने के लिए अतिरिक्त गोंद और 70% इथेनॉल को खरोंचने के लिए चिमटी का उपयोग करें।
    नोट: coverslips ~ 0.17 मिमी मोटी कर रहे हैं. डोनट के आकार के कवरस्लिप का उपयोग क्रोनिक इमेजिंग के लिए मस्तिष्क पर उचित दबाव लागू करने के लिए किया जाता है।
  2. एक प्रेरण कक्ष में 3% आइसोफ्लुरेन और 20% O2 गैस मिश्रण के साथ माउस को एनेस्थेटिकाइज़ करें। माउस का वजन करें। माउस को हीटिंग पैड पर एक प्रवण स्थिति में रखें। हीटिंग पैड का तापमान ~ 37 डिग्री सेल्सियस पर सेट करें।
  3. एक एनेस्थेटिक मास्क के प्लेसमेंट के साथ एक स्टीरियोटैक्सिक उपकरण के मुंह के छेद में ऊपरी दांतों को ठीक करें। कान की सलाखों को कानों तक ठीक करें। सर्जरी के दौरान 2% आइसोफ्लुरेन और 20% ओ2 गैस मिश्रण के साथ संज्ञाहरण बनाए रखें।
    नोट:: माउस की प्रतिक्रिया की निगरानी करके isoflurane की एकाग्रता समायोजित करें। सांस लेने की दर (गहरी नींद के लिए ~ 1 हर्ट्ज) देखकर संज्ञाहरण स्तर की जांच करें और सर्जरी से पहले किसी भी प्रतिक्रिया की जांच करने के लिए पैरों को चुटकी लें।
  4. चिकनाई के लिए आंखों पर मरहम लगाएं। पलकें बंद कर दें। सभी सर्जरी रोशनी चालू करें। सर्जरी से पहले माउस शरीर के वजन के आधार पर चमड़े के नीचे कीटोप्रोफेन, डेक्सामेथासोन और ग्लाइकोपाइरोलेट इंजेक्ट करें।
    नोट: दवा की खुराक क्रमशः केटोप्रोफेन, डेक्सामेथासोन और ग्लाइकोपाइरोलेट के लिए 2 मिलीग्राम / एमएल, 0.1 मिलीग्राम / एमएल, और 0.1 मिलीग्राम / एमएल हैं। केटोप्रोफेन, डेक्सामेथासोन और ग्लाइकोपाइरोलेट के लिए इंजेक्शन की मात्रा शरीर के वजन पर निर्भर करती है और क्रमशः 2.5 μL / g, 2 μL / g, और 2 μL / g है।
  5. सिर के मुकुट पर और कानों के पास बालों को हटा दें।
    1. कैंची या हेयर क्लिपर के साथ जितना संभव हो उतना बाल क्लिप करें और सर्जिकल साइट से क्लीप किए गए बालों को हटा दें।
    2. depilatory क्रीम की एक उचित राशि लागू करें। 1 मिनट तक प्रतीक्षा करें।
    3. खारा में भिगोए हुए एक कपास झाड़ू का उपयोग करके बालों और क्रीम को हटा दें।
    4. चरण 3.5.2 और 3.5.3 को दोहराएं जब तक कि बाल पूरी तरह से हटा न जाएं।
    5. क्षेत्र को साफ करने के लिए त्वचा पर 5% पोविडोन-आयोडीन समाधान और फिर 70% इथेनॉल लागू करें। इस प्रक्रिया को तीन बार दोहराएं।
  6. सिर पर एट्रोपिन (शरीर के वजन के आधार पर खुराक, 0.02-0.05 मिलीग्राम / किग्रा) का एक चमड़े के नीचे इंजेक्शन दें। 1 मिनट तक प्रतीक्षा करें।
  7. खोपड़ी को उजागर करने के लिए सिर के मुकुट पर त्वचा को काटें। सुनिश्चित करें कि ब्रेग्मा बिंदु और लैम्ब्डा बिंदु दोनों उजागर होते हैं। त्वचा के नीचे प्रवेश करने से धूल ड्रिलिंग से बचने के लिए बायोकंपैटिबल गोंद का उपयोग करके खोपड़ी के किनारे पर शेष त्वचा ऊतक को गोंद करें (जो प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया प्राप्त कर सकता है)।
  8. ब्याज के क्षेत्र पर एक 5 मिमी व्यास चक्र आकर्षित करने के लिए एक सर्जिकल मार्कर का उपयोग करें। उदाहरण के लिए, क्षेत्र के केंद्र का चयन करें ~ 2.5 मिमी पार्श्व और 2 मिमी पुच्छल ब्रेग्मा के लिए, जो सोमाटोसेंसरी कॉर्टेक्स और दृश्य प्रांतस्था के अधिकांश को कवर करता है।
  9. सर्कल के साथ धीरे-धीरे ड्रिल करें और आधे रास्ते में होने पर खोपड़ी को हाइड्रेट करने के लिए खारा लागू करें। अंतिम छमाही के लिए ड्रिलिंग गति को धीमा करें और खोपड़ी को हटाने से पहले खोपड़ी को खारा के साथ कवर करें। संदंश के साथ धीरे से खोपड़ी खोलें और मस्तिष्क में किसी भी रक्तस्राव को तुरंत रोकने के लिए खारा में भिगोए गए बाँझ जेलफोम का एक छोटा सा टुकड़ा लागू करें। खारा का उपयोग करके मस्तिष्क को हाइड्रेटेड रखें।
  10. तैयार डिस्क-डोनट कवरस्लिप के किनारे पर खारा की एक बूंद लागू करें मस्तिष्क के ऊतकों का सामना करना पड़ रहा है। कपाल विंडो में डिस्क-डोनट coverslip के उभरे हुए डिस्क भाग रखें। मस्तिष्क की सतह पर कवरस्लिप कपाल खिड़की के डिस्क भाग को धीरे से दबाने के लिए स्टीरियोटैक्सिक उपकरण द्वारा आयोजित एक लंबी पट्टी का उपयोग करें, यह सुनिश्चित करते हुए कि डोनट भाग कसकर खोपड़ी को कवर करता है। एक कपास झाड़ू के साथ डिस्क-डोनट coverslip के आसपास के क्षेत्र सूखी.
  11. डोनट के आकार के किनारे के नीचे बायोकंपैटिबल गोंद की एक परत लागू करें। डिस्क-डोनट कवरस्लिप के डोनट भाग के नीचे और उसके आसपास दंत सीमेंट मिश्रण की एक परत लागू करें। दंत सीमेंट के ऊपर गोंद की एक और परत लागू करें। 5% ग्लूकोज (शरीर के वजन के आधार पर खुराक, 10 μL / g) को पशु ऊर्जा प्रदान करने के लिए सर्जरी के दौरान हर घंटे चमड़े के नीचे इंजेक्ट किया जा सकता है।
  12. संज्ञाहरण प्रणाली को बंद कर दें। स्टीरियोटैक्टिक उपकरण से माउस को मुक्त करें। माउस को एक अनुकूलित कॉम्पैक्ट स्टीरियोटैक्टिक उपकरण में तुरंत स्थानांतरित करें, ~ 37 डिग्री सेल्सियस और एक संज्ञाहरण उपकरण पर एक हीटिंग पैड के साथ।
  13. अनुकूलित कॉम्पैक्ट स्टीरियोटैक्सिक उपकरण के हीटिंग पैड पर माउस को एक प्रवण स्थिति में रखें। तापमान को ~ 37 डिग्री सेल्सियस पर सेट करें। स्टीरियोटैक्टिक उपकरण के मुंह के छेद में ऊपरी दांतों को ठीक करें और माउस के कानों के लिए कान की सलाखों। एनेस्थेटिक ट्यूबों पर रखो, और 1.5% आइसोफ्लुरेन और 20% ओ2 गैस मिश्रण के साथ संज्ञाहरण बनाए रखें।
    नोट:: माउस अब इमेजिंग के लिए तैयार है। निम्न इमेजिंग प्रक्रियाओं के दौरान माउस anesthetized रखें। माउस की प्रतिक्रिया की निगरानी करके आइसोफ्लुरेन की एकाग्रता को समायोजित करें।

4. मछली और माउस दिमाग में Intravital इमेजिंग

  1. ज़ेब्राफ़िश मस्तिष्क में इंट्रावाइटल इमेजिंग
    नोट: उद्देश्य लेंस के तहत मछली मस्तिष्क को ठीक से खोजने के लिए, एक द्वितीयक चार्ज-युग्मित डिवाइस (सीसीडी) कैमरा का उपयोग वाइडफील्ड इमेजिंग के लिए उत्तेजना प्रकाश के समान पथ पर किया जाता है।
    1. माइक्रोस्कोप सेट करें और शक्ति को कैलिब्रेट करें (जैसा कि अनुभाग 1 में वर्णित है)।
    2. माइक्रोस्कोप पर एक कम आवर्धन (आमतौर पर 4x) उद्देश्य रखें।
    3. माइक्रोस्कोप के नीचे मछली और ट्यूबों से युक्त पेट्री डिश रखें।
    4. पेट्री डिश को रोशन करने के लिए एक प्रकाश उत्सर्जक डायोड (एलईडी) प्रकाश स्रोत का उपयोग करें।
    5. छवि अधिग्रहण सॉफ़्टवेयर का कैमरा मोड खोलें (चित्रा 2).
    6. लाइवक्लिक करें।
    7. स्क्रीन के दाईं ओर चैनल A चुनें.
    8. छवि को स्पष्ट रूप से देखने के लिए हिस्टोग्राम सेटिंग्स समायोजित करें.
      नोट: इन्हें आवश्यकतानुसार अद्यतन करने की आवश्यकता है।
    9. मोटर नियंत्रक पर मोटर सेटिंग को आधार पर सेट करें.
    10. जब तक मछली दिखाई नहीं देती तब तक उद्देश्य को कम करें।
      नोट: सुनिश्चित करें कि उद्देश्य लेंस सिर के साथ कोई शारीरिक संपर्क नहीं करता है।
    11. मछली के सिर के केंद्र को दृश्य के क्षेत्र के केंद्र में रखें।
    12. उद्देश्य को मछली के सिर से ऊपर और दूर ले जाएं।
    13. 3PM के लिए उच्च एनए उद्देश्य लेंस के साथ कम आवर्धन उद्देश्य लेंस को बदलें।
      नोट: कम आवर्धन लेंस और उच्च एनए उद्देश्य लेंस को पार्फोकल होने की आवश्यकता नहीं है, लेकिन यह सुनिश्चित करने के लिए पर्याप्त करीब होना चाहिए कि मछली उच्च एनए उद्देश्य लेंस के दृश्य के क्षेत्र में है।
    14. धीरे-धीरे उद्देश्य लेंस को कम करें, यह सुनिश्चित करें कि उद्देश्य सिर के साथ कोई शारीरिक संपर्क नहीं करता है। सीसीडी कैमरा सॉफ़्टवेयर में, सिर के शीर्ष के दिखाई देने पर उद्देश्य को स्थानांतरित करना बंद कर दें। z स्थान को 0 μm पर सेट करें.
      नोट: सुनिश्चित करें कि पानी-विसर्जन उद्देश्य का उपयोग करते समय उद्देश्य लेंस के नीचे कोई हवा के बुलबुले नहीं हैं।
    15. एलईडी प्रकाश स्रोत को बंद करें और सिस्टम के चारों ओर अंधेरे पर्दे को बंद करें।
    16. इमेजिंग अधिग्रहण सॉफ़्टवेयर को 3P इमेजिंग के लिए मल्टीफोटॉन जीजी मोड पर सेट करें और उद्देश्य लेंस के तहत शक्ति को 1 mW से कम (~ 1 मेगाहर्ट्ज पल्स पुनरावृत्ति दर के साथ) पर सेट करें।
    17. मोटर नियंत्रक पर उद्देश्य के लिए आधार से मोटर सेटिंग बटन परिवर्तित करें।
    18. कमरे में रोशनी बंद कर दें।
    19. PMTs को चालू करें और 3PM उत्तेजना स्रोत शटर खोलें। सुनिश्चित करें कि हड्डी की एक रूपरेखा प्रतिदीप्ति संकेत चैनल में ऑटोफ्लोरेसेंस के कारण और हड्डी के टीएचजी के कारण टीएचजी सिग्नल चैनल में दिखाई देती है (चित्रा 2 सी)।
    20. गहरी इमेजिंग करते समय शक्ति के स्तर को बढ़ाकर विभिन्न गहराई पर इमेजिंग करें।
  2. माउस मस्तिष्क में इंट्रावाइटल इमेजिंग
    नोट: इमेजिंग के दौरान हर घंटे एनेस्थेटिक माउस में 5% ग्लूकोज इंजेक्ट करें; खुराक शरीर के वजन (10 μL / g) पर आधारित है।
    1. इमेजिंग अधिग्रहण सॉफ़्टवेयर को 3P इमेजिंग के लिए मल्टीफोटॉन जीजी मोड पर सेट करें और उद्देश्य लेंस के तहत शक्ति को 1 mW से कम (~ 1 मेगाहर्ट्ज पल्स पुनरावृत्ति दर के साथ) पर सेट करें।
      नोट: सुनिश्चित करें कि सर्जरी विंडो विपथन को कम करने के लिए उद्देश्य लेंस के लंबवत रखा गया है। ठीक समायोजन स्टीरियोटैक्सिक उपकरण को झुकाकर किया जाता है।
    2. खिड़की के करीब उद्देश्य लेंस ले जाएँ और उद्देश्य और कपाल खिड़की के बीच पानी लागू; सभी मोटरों के अक्ष मानों को शून्य पर सेट करें.
      नोट: ~ 1,700 एनएम पर एच2ओ में प्रकाश अवशोषण बड़ा है, जो ~ 1-2 मिमी पानी की गहराई के बाद ~ 1,700 एनएम लेजर शक्ति को काफी कम कर देता है। ~ 1,700 एनएम उत्तेजना के लिए, डी2ओ का उपयोग करें, जिसमें पानी द्वारा अवशोषण को कम करने के लिए पानी के विसर्जन के लिए 1,700 एनएम पर बहुत कम अवशोषण है।
    3. छवि अधिग्रहण सॉफ्टवेयर में लाइव बटन पर क्लिक करें और पीएमटी चैनल खोलें, उदाहरण के लिए, एक प्रतिदीप्ति सिग्नल चैनल और एक टीएचजी सिग्नल चैनल। आवश्यकतानुसार PMT लाभ और पृष्ठभूमि स्तर को समायोजित करें.
    4. धीरे-धीरे बड़े रक्त वाहिकाओं और खिड़की के कांच की सतह से टीएचजी चैनल की निगरानी करके खिड़की की सतह का पता लगाने के लिए उद्देश्य लेंस को आगे बढ़ाएं। यदि आवश्यक हो तो विंडो ओरिएंटेशन समायोजित करें (चरण 4.2.12 में नोट देखें)। मस्तिष्क की सतह को परिभाषित करने के लिए मोटर्स को शून्य करें।
    5. इमेजिंग करें और इमेजिंग गहराई के अनुसार पावर स्तर को समायोजित करें।

Representative Results

इस प्रोटोकॉल के सफल समापन के परिणामस्वरूप इष्टतम प्रकाश मापदंडों (जैसे, नाड़ी अवधि, एनए) और विवो 3पीएम में उपयुक्त पशु तैयारी के साथ एक ठीक से संरेखित माइक्रोस्कोप होगा। व्यावसायिक रूप से उपलब्ध 3P सेटअप में ~ 1,300 एनएम और ~ 1,700 एनएम दोनों के लिए उपयुक्त दर्पण और लेंस शामिल हैं; इसलिए, प्रकाशिकी में कोई परिवर्तन की आवश्यकता नहीं है जब उत्तेजना तरंग दैर्ध्य 1,300 एनएम और 1,700 एनएम के बीच स्विच किया जाता है। यदि 3 पी सेटअप में लेंस में 1,300 और 1,700 एनएम के लिए एक उपयुक्त कोटिंग नहीं है, तो इन्हें लेजर पावर लॉस को कम करने के लिए उपयुक्त लोगों के साथ प्रतिस्थापित करने की आवश्यकता है। अनुकूलित 3PM और उचित पशु तैयारी के साथ, विवो प्रतिदीप्ति और उच्च विपरीत के साथ THG छवियों में मस्तिष्क के भीतर गहरी एकत्र किया जा सकता है।

चित्रा 3 बरकरार वयस्क zebrafish के प्रतिनिधि 3P छवियों से पता चलता है. वयस्क ज़ेब्राफ़िश मस्तिष्क में आनुवंशिक रूप से लेबल किए गए न्यूरॉन्स की उच्च-रिज़ॉल्यूशन, गैर-आक्रामक, और गहरी इमेजिंग 3PM का उपयोग करके प्राप्त की जाती है। यद्यपि टेलेन्सेफेलन क्षेत्र में इमेजिंग को वयस्क ज़ेबराफ़िश मस्तिष्क में 2PM24,25,26,27 का उपयोग करके रिपोर्ट किया गया है, 3PM पूरे टेलेन्सेफेलन और उन क्षेत्रों तक पहुंच सक्षम बनाता है जो अन्य तकनीकों का उपयोग करके निरीक्षण करने के लिए अधिक चुनौतीपूर्ण या असंभव हैं। ऑप्टिक टेक्टम और सेरिबैलम में सेल परतों का वितरण चित्र 3 सी में देखा जा सकता है। एक सफल इमेजिंग सत्र में, हड्डी टीएचजी चैनल और प्रतिदीप्ति चैनल में दिखाई देने वाले न्यूरॉन्स में दिखाई देती है। वयस्क ज़ेबराफ़िश इमेजिंग के लिए, माइक्रोस्कोप की कैमरा सुविधा का उपयोग मछली का पता लगाने के लिए किया गया था (चित्रा 3 ए)। माउस मस्तिष्क इमेजिंग के लिए यह कदम आवश्यक नहीं है क्योंकि कांच की खिड़की मस्तिष्क को आसानी से सुलभ बनाने के लिए पर्याप्त बड़ी है। वयस्क ज़ेबराफ़िश मस्तिष्क की उच्च-रिज़ॉल्यूशन संरचनात्मक छवियों को पिछले वर्गों में वर्णित प्रणाली का उपयोग करके प्राप्त किया गया था। खोपड़ी को टीएचजी चैनल (चित्रा 3 बी) में देखा जाता है, जो मस्तिष्क को नेविगेट करने और शीर्ष सतह को खोजने में मदद करता है। जैसा कि चित्रा 3 सी में देखा गया है, न्यूरॉन्स वयस्क मस्तिष्क में गहरे उच्च सिग्नल-टू-बैकग्राउंड अनुपात (एसबीआर) के साथ अलग-अलग हैं। मस्तिष्क के ऊपर का ऊतक प्रतिदीप्ति चैनल में ऑटोफ्लोरेसेंस के कारण दिखाई देता है।

चित्रा 4 GCaMP6s-लेबल न्यूरॉन्स (हरे) और टेक्सास रेड-लेबल वाले रक्त वाहिकाओं (लाल) की बहुरंगी 3P छवियों को 1,340 एनएम उत्तेजना10 के साथ वयस्क माउस मस्तिष्क में THG (नीले) संकेतों के साथ दिखाता है। छवियों को पिछले काम10 से reproduced कर रहे हैं. चित्रा 4 में, पर्याप्त प्रतिदीप्ति और टीएचजी संकेतों को प्राप्त करने के लिए पूरी गहराई में फोकस पर पल्स ऊर्जा को ~ 1.5 एनजे पर बनाए रखा गया था, और अधिकतम औसत लेजर शक्ति ~ 70 mW थी। नाड़ी की अवधि को ~ 60 fs में समायोजित किया गया था, और प्रभावी एनए ~ 0.8 था। 3PM सेटअप के अनुकूलन के साथ, उच्च-विपरीत छवियों को CA1 हिप्पोकैम्पस क्षेत्र (चित्रा 4A, B) में मस्तिष्क की सतह से 1.2 मिमी तक सफलतापूर्वक प्राप्त किया गया था। चित्रा 4C, D एक 10 मिनट रिकॉर्डिंग सत्र के लिए 750 μm की गहराई पर GCaMP6s-लेबल न्यूरॉन्स के Ca2+ गतिविधि के निशान दिखाते हैं, जो उच्च रिकॉर्डिंग निष्ठा दिखाते हैं।

यदि उत्तेजना लेजर misaligned है, तो दृश्य के क्षेत्र में संकेत चमक में nonuniformity मनाया जा सकता है। इसके अतिरिक्त, यदि लेजर पैरामीटर, जैसे पल्स अवधि, फोकस में उत्तेजना पल्स ऊर्जा, और प्रभावी एनए, अनुकूलित नहीं हैं, तो मछली की खोपड़ी या माउस मस्तिष्क की क्रैनियोटॉमी विंडो से टीएचजी छवि दिखाई नहीं देगी और / या उच्च उत्तेजना नाड़ी ऊर्जा की आवश्यकता होगी (उदाहरण के लिए, >2 एनजे / पल्स फोकस पर)। इसलिए, मस्तिष्क की सतह पर टीएचजी संकेतों को गहरे ऊतक इमेजिंग शुरू करने से पहले एक अनुकूलित 3पीएम सेटअप के लिए एक संकेतक के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है।

Figure 1
चित्रा 1: एक 3PM सेटअप के योजनाबद्ध चित्रण. उत्तेजना लेजर की तरंग दैर्ध्य ~ 1,300 एनएम या ~ 1,700 एनएम पर सेट किया गया है, एनओपीए के आइडलर पोर्ट से आउटपुट। प्रिज्म-जोड़ी कंप्रेसर और सी प्लेट कंप्रेसर का उपयोग क्रमशः ~ 1,300 एनएम और ~ 1,700 एनएम लेजर के लिए किया जाता है, उत्तेजना लेजर पल्स को प्रीचिर्प करने के लिए। ~ 1,300 एनएम और ~ 1,700 एनएम लेजर बीम फ्लिपर दर्पण के साथ स्विच किया जा सकता है। NOPA के सिग्नल पोर्ट का उपयोग ट्रिगरिंग सिग्नल प्राप्त करने के लिए किया जाता है। उत्तेजना शक्ति को नियंत्रित करने के लिए एक आधा तरंगपट और एक पीबीएस का उपयोग किया जाता है। प्रतिदीप्ति और THG का पता GAAsP PMTs द्वारा लगाया जाता है। प्रतिदीप्ति और THG संकेतों को अलग करने के लिए डाइक्रोइक दर्पण और बैंडपास फ़िल्टर के उपयुक्त संयोजनों का उपयोग किया जाता है। संक्षेप: 3PM = तीन फोटॉन माइक्रोस्कोपी; NOPA = गैर-संरेख ऑप्टिकल पैरामीट्रिक एम्पलीफायर; PBS = polarizing बीम विभाजक; THG = तीसरी हार्मोनिक पीढ़ी; DAQ = डेटा अधिग्रहण; पीएमटी = फोटोमल्टीप्लायर ट्यूब। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: मछली में intravital इमेजिंग के लिए प्रतिनिधि स्क्रीनशॉट (प्रोटोकॉल अनुभाग 4.1). (ए) जगह में 4x उद्देश्य लेंस के साथ छवि अधिग्रहण सॉफ्टवेयर के कैमरा मोड दृश्य। सॉफ़्टवेयर की मुख्य विशेषताओं को रेखांकित किया गया है और निम्नानुसार क्रमांकित किया गया है: 1. छवि अधिग्रहण सॉफ़्टवेयर का इमेजिंग मोड। मोड विकल्प कैमरा, मल्टीफोटॉन, और मल्टीफोटॉन जीजी हैं। सीसीडी कैमरे के साथ सफेद प्रकाश इमेजिंग के लिए, कैमरा मोड चुना जाता है। 2. लाइव बटन पर क्लिक करने से कैमरा चालू हो जाता है (या पीएमटी यदि मल्टीफोटॉन विकल्पों में), और माइक्रोस्कोप का वास्तविक समय दृश्य देखा जा सकता है। 3. कैप्चर सेटअप टैब में, वांछित इमेजिंग पैरामीटर (शक्ति, स्थान, गहराई) सेट हैं। 4. कैप्चर टैब में, छवियों को सहेजने के लिए एक फ़ोल्डर स्थान असाइन किया गया है। इमेजिंग को इस टैब में शुरू किया जा सकता है। 5. Z नियंत्रण सेटिंग z चरण मोटर को स्थानांतरित करके इमेजिंग की गहराई को नियंत्रित करती है। 6. एक zebrafish सिर की प्रतिनिधि छवि. सिर का रोस्ट्रल पक्ष बाईं ओर है। (बी) 25x उद्देश्य लेंस के साथ कैमरा मोड का प्रतिनिधि दृश्य। (C) Multiphoton GG मोड का प्रतिनिधि दृश्य जिसमें (B) में देखी गई छवि की THG छवि होती है। संक्षिप्त रूप: सीसीडी = चार्ज-युग्मित डिवाइस; PMT = photomultiplier ट्यूब; THG = तीसरी हार्मोनिक पीढ़ी। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र3: छवि अधिग्रहण सॉफ्टवेयर के साथ अधिग्रहित वयस्क ज़ेब्राफ़िश मस्तिष्क की प्रतिनिधि छवियां। (A) 4x उद्देश्य लेंस के साथ अधिग्रहित वयस्क ज़ेबराफ़िश सिर की कैमरा मोड छवि। छवि का शीर्ष रोस्ट्रल दिशा है। ओटी लोब और सीबी को रेखांकित किया गया है। (बी) एक 25x उद्देश्य लेंस के साथ मल्टीफोटॉन जीजी मोड में अधिग्रहित प्रतिनिधि छवि जिसमें (ए) की टीएचजी छवि होती है। (सी) सेरिबैलम और ऑप्टिक टेक्टम के चौराहे पर वयस्क ज़ेब्राफ़िश मस्तिष्क की प्रतिदीप्ति छवियां जहां जीएफपी को विभिन्न गहराई में न्यूरॉन्स के साइटोप्लाज्म में व्यक्त किया जाता है। स्केल सलाखों = 100 μm. संक्षिप्त रूप: ओटी = ऑप्टिक टेक्टेम; CB = सेरिबैलम; THG = तीसरी हार्मोनिक पीढ़ी; GFP = हरा फ्लोरोसेंट प्रोटीन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: GCaMP6s-लेबल न्यूरॉन्स (हरे), टेक्सास रेड-लेबल वाले रक्त वाहिकाओं (लाल), और माउस मस्तिष्क में 1,340 एनएम उत्तेजना पर तीसरी-हार्मोनिक पीढ़ी (नीला) के बहुरंगी 3 PM. (A) Z-स्टैक छवियों को मस्तिष्क की सतह से 1,200 μm तक नीचे 270 x 270 μm (512 x 512 पिक्सेल प्रति फ्रेम) के क्षेत्र-दृश्य के साथ। लेजर शक्ति को फोकस में ~ 1.5 एनजे पल्स ऊर्जा बनाए रखने के लिए इमेजिंग गहराई के अनुसार विविध था। उद्देश्य के तहत अधिकतम औसत शक्ति 70 mW थी। (बी) विभिन्न इमेजिंग गहराई पर चयनित 2 डी छवियों। (C) 270 x 270 μm (256 x 256 पिक्सेल) के फ़ील्ड-ऑफ-व्यू के साथ ड्यूरा के नीचे 750 μm पर गतिविधि रिकॉर्डिंग साइट। (डी) (सी) में इंगित लेबल न्यूरॉन्स से एक जागृत माउस में दर्ज सहज मस्तिष्क गतिविधि के निशान। फ्रेम दर 8.3 हर्ट्ज थी, जिसमें 0.51 μs का पिक्सेल रहने का समय था। लेजर पुनरावृत्ति दर 2 मेगाहर्ट्ज थी, और उद्देश्य लेंस के तहत औसत शक्ति 56 mW थी। प्रत्येक ट्रेस को इसकी बेसलाइन और कम-पास को 0.72 s समय स्थिरांक की हैमिंग विंडो का उपयोग करके फ़िल्टर किया गया था। स्केल सलाखों = 50 μm. यह आंकड़ा और आंकड़ा किंवदंती 10 से reproduced कर रहे हैं. संक्षिप्त नाम: 3PM = तीन फोटॉन माइक्रोस्कोपी। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्रा 5: माउस मस्तिष्क के neocortex में प्रभावी क्षीणन लंबाई. ईएएल (मैजेंटा लाइन) की गणना ऊतक प्रकीर्णन (लाल रेखा) और ऊतक (नीली रेखा) में पानी के अवशोषण से की जाती है, जो 75% पानी की संरचना को मानती है। काले तारे माउस मस्तिष्क 3,21,28,29 के नियोकॉर्टेक्स मेंईएएल के प्रयोगात्मक डेटा की सूचना का संकेत देते हैं। ध्यान दें कि ईएएल विभिन्न ऊतकों में भिन्न होता है। संक्षिप्त नाम: EAL = प्रभावी क्षीणन लंबाई। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

उत्तेजन तरंग दैर्ध्य
(nm)		 विसर्जन जल अधिकतम लेजर शक्ति
(mW)		 फोकस पर अधिकतम नाड़ी ऊर्जा *
(nJ)		 माउस प्रांतस्था में विशिष्ट EAL
(μm)		 माउस प्रांतस्था में इमेजिंग गहराई **
(मिमी)		 उद्देश्य के तहत पल्स ऊर्जा ***
(nJ)		 अधिकतम लेजर पुनरावृत्ति दर ****
(MHz)
1300 H2O या D2O Equation 3100 Equation 32 ~300 0.8 ~14 ~7
1.2 ~55 ~2
1.6 ~210 ~0.5
2.1 ~1100 ~0.1
1700 D2O Equation 350 Equation 33 ~400 0.8 ~7 ~7
1.2 ~20 ~2.5
1.6 ~55 ~1
2.1 ~190 ~0.3

तालिका 1: माउस कॉर्टेक्स इमेजिंग के लिए विशिष्ट 3 पी उत्तेजना की स्थिति।
* एक उच्च एनए (~ 1.0) उद्देश्य के साथ, ~ 50 एफएस की नाड़ी चौड़ाई, और फ्लोरोसेंट प्रोटीन (जैसे, जीएफपी और आरएफपी) जैसे विशिष्ट फ्लोरोफोर।
** इस धारणा के साथ कि ईएएल पूरे प्रांतस्था में समान है।
ध्यान में ~ 1 एनजे / पल्स प्राप्त करने के लिए, ईएएल और इमेजिंग गहराई से गणना की जाती है।
उद्देश्य और अधिकतम अनुमेय लेजर शक्ति के तहत नाड़ी ऊर्जा से गणना की।
संक्षेप: 3P = तीन फोटॉन; एनए = संख्यात्मक एपर्चर; GFP = हरा फ्लोरोसेंट प्रोटीन; RFP = लाल फ्लोरोसेंट प्रोटीन; EAL = प्रभावी क्षीणन लंबाई।

Discussion

यह प्रोटोकॉल एक वाणिज्यिक माइक्रोस्कोप और लेजर स्रोत के साथ 3 पी इमेजिंग स्थापित करने के लिए चरण-दर-चरण प्रक्रियाओं की व्याख्या करता है। 2PM की तुलना में, माउस मस्तिष्क हिप्पोकैम्पस जैसे गहरे क्षेत्रों में ऑप्टिकल एक्सेस की आवश्यकता वाले अनुप्रयोगों में 3PM का लाभ है। हालांकि 3PM ज्यादातर तंत्रिका विज्ञान में उपयोग किया जाता है, 3PM को संभावित रूप से अन्य ऊतकों जैसे लिम्फ नोड्स, हड्डियों और ट्यूमर में गहरे ऊतक अवलोकन के लिए लागू किया जा सकता है।

यह सत्यापित करना महत्वपूर्ण है कि इमेजिंग सिस्टम शॉट-शोर सीमा के करीब प्रदर्शन करता है, जो यह सुनिश्चित करता है कि पता लगाने और डेटा अधिग्रहण इलेक्ट्रॉनिक्स पीएमटी के बाद छवि में नगण्य शोर का योगदान करते हैं। पता लगाए गए फोटॉनों की संख्या में अनिश्चितता फोटॉन शॉट शोर द्वारा मौलिक रूप से सीमित है। शॉट-शोर सीमित प्रदर्शन को एक उच्च-लाभ फोटोडिटेक्टर (जैसे, एक पीएमटी) का उपयोग करके एक विशिष्ट मल्टीफोटॉन माइक्रोस्कोप में प्राप्त किया जा सकता है। फोटॉन शॉट शोर एक पॉइसन सांख्यिकीय वितरण का अनुसरण करता है, जिसमें वितरण का मानक विचलन वितरण के माध्य के वर्ग मूल के बराबर होता है। शॉट-शोर सीमित प्रदर्शन सत्यापित करने के लिए, प्रोटोकॉल अनुभाग में चरण 1.14 का पालन करें।

एच2ओ द्वारा प्रकाश क्षीणन से बचने के लिए, विसर्जन के लिए डी2ओ का उपयोग करना सहायक है, विशेष रूप से ~ 1,700 एनएम उत्तेजना के लिए। जब D2O का उपयोग किया जाता है, तो हर ~ 10 मिनट में D2O को ताज़ा करना या इमेजिंग के दौरान D 2 O/ H2O विनिमय से बचने के लिए D2O की एक बड़ी मात्रा का उपयोग करना आवश्यक है। कोई भी कमरे के वातावरण 3 से डी2ओ को सील कर सकताहै। यदि इमेजिंग के लिए एक लंबी कार्य दूरी (डब्ल्यूडी) उद्देश्य लेंस (उदाहरण के लिए, 4 मिमी या उससे अधिक समय पर डब्ल्यूडी) का उपयोग किया जाता है, तो विसर्जन तरल मोटाई 2-3 मिमी से अधिक हो सकती है। बढ़ी हुई मोटाई एच2ओ अवशोषण को गैर-नगण्य बनाती है, यहां तक कि ~ 1,300 एनएम21 पर भी। इसलिए, एक लंबे WD उद्देश्य लेंस का उपयोग करते समय D2O 1,300 nm 3PM के लिए भी आवश्यक हो सकता है।

चूंकि 3 पी प्रतिदीप्ति तीव्रता फोकस (Eq. (1)) पर उत्तेजना नाड़ी ऊर्जा के घन पर निर्भर करती है, इसलिए उचित लेजर शक्ति की स्थापना विशेष रूप से जीवित ऊतकों में थर्मल और नॉनलाइनर क्षति से बचने के दौरान पर्याप्त 3 पी प्रतिदीप्ति संकेतों को प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण है। औसत लेजर शक्ति को थर्मल क्षति सीमा से नीचे रखा जाना चाहिए। माउस मस्तिष्क में, उदाहरण के लिए, थर्मल ऊतक क्षति से बचने के लिए, माउस मस्तिष्क की सतह पर औसत शक्ति को 1 मिमी की गहराई पर ~ 1,300 एनएम उत्तेजना के लिए ~ 100 mW पर या उससे नीचे रखा जाना चाहिए और 230 μm x 230μm 21 के फील्ड-ऑफ-व्यू (FOV) के साथ। इसी तरह, ~ 1,700 एनएम पर औसत शक्ति को ~ 1 मिमी की गहराई पर ~ 50 mW पर या उससे नीचे रखा जाना चाहिए और ~ 230 μm x 230 μm (अप्रकाशित डेटा) का एक एफओवी। इसके अलावा, उत्तेजना संतृप्ति और संभावित nonlinear क्षति से बचने के लिए, उत्तेजना नाड़ी ऊर्जा को क्रमशः 30 के लिए ~ 1,300 एनएम और Equation 3~ 1,700 एनएम उत्तेजना के लिए 2 एनजे और3 एनजे पर Equation 3रखा जाना चाहिए।

ऊतकों में प्रकाश अवशोषण और प्रकीर्णन के कारण, फोकस में नाड़ी ऊर्जा 1 ईएएल द्वारा ऊतकों के प्रवेश के बाद 1/e (~ 37%) तक क्षीण हो जाती है। ईएएल विभिन्न ऊतकों में और उत्तेजना तरंग दैर्ध्य के साथ भिन्न होता है, उदाहरण के लिए, माउस मस्तिष्क के नियोकॉर्टेक्स में, ईएएल ~ 300 μm और ~ 400 μm ~ 1,300 एनएम और ~ 1,700 एनएम पर क्रमशः 3,29 (चित्रा 5) है। इसलिए, एक ही नाड़ी ऊर्जा को ध्यान में रखने के लिए (जैसे, 1 एनजे / पल्स) एन ईएएल की गहराई पर, सतह नाड़ी ऊर्जा को 1 एनजे × ईएन से गुणा करने की आवश्यकता होती है। संरचनात्मक और कार्यात्मक गतिशीलता की तेजी से इमेजिंग के लिए, एक उच्च पुनरावृत्ति दर (1 मेगाहर्ट्ज या उच्चतर पर) के साथ एक उत्तेजना लेजर एक उच्च फ्रेम दर 5,6,7,10 प्राप्त करने के लिए वांछनीय है। हालांकि, नाड़ी ऊर्जा की आवश्यकता और औसत लेजर शक्ति सीमा लागू पुनरावृत्ति दर को बाधित करती है।

उदाहरण के लिए, जब हम 4 ईएएल पर एक मामूली गहरे क्षेत्र की छवि बनाते हैं (यानी, 1,300 एनएम उत्तेजना के साथ माउस कॉर्टेक्स में ~ 1.2 मिमी), सतह पर ~ 55 एनजे / पल्स को ध्यान में रखने के लिए 1 एनजे / पल्स रखने की आवश्यकता होती है। जब औसत शक्ति सीमा 100 mW है, तो हम एक ~ 2 मेगाहर्ट्ज लेजर पुनरावृत्ति दर लागू कर सकते हैं। हालांकि, 7 ईएएल की गहराई पर गहरी छवि बनाने के लिए, फोकस पर 1 एनजे / पल्स बनाए रखने के लिए सतह पर ~ 1,100 एनजे / पल्स की आवश्यकता होती है। थर्मल क्षति से बचने के लिए अधिकतम औसत शक्ति 100 mW है, यह मानते हुए कि सतह पर 1,100 nJ / पल्स प्राप्त करने के लिए लेजर पुनरावृत्ति दर को 0.1 मेगाहर्ट्ज तक कम किया जाना चाहिए। तालिका 1 माउस मस्तिष्क प्रांतस्था में विशिष्ट इमेजिंग स्थितियों को सारांशित करती है। ध्यान दें कि तालिका 1 में इमेजिंग गहराई मान लें कि EAL पूरे माउस कॉर्टेक्स में समान है।

इसके अलावा, गहरे ऊतक 3PM में लेजर पावर सीमा के कारण, फ्रेम दर और छवि पिक्सेल आकार के बीच एक ट्रेड-ऑफ मौजूद है, जो कैल्शियम इमेजिंग जैसे कार्यात्मक इमेजिंग के लिए विशेष रूप से महत्वपूर्ण है। अधिकतम उपलब्ध लेजर पुनरावृत्ति दर फोकस में आवश्यक नाड़ी ऊर्जा और लागू औसत लेजर शक्ति के आधार पर प्रत्येक गहराई पर तय की जाती है जैसा कि ऊपर चर्चा की गई है, उदाहरण के लिए, 1,300 एनएम उत्तेजना के साथ ~ 4 ईएएल के बराबर गहराई पर 2 मेगाहर्ट्ज। सामान्य तौर पर, इमेजिंग के लिए प्रति पिक्सेल कम से कम एक पल्स की आवश्यकता होती है। तदनुसार, न्यूनतम उपलब्ध पिक्सेल रहने का समय लेजर पुनरावृत्ति दर द्वारा निर्धारित किया जाता है, उदाहरण के लिए, 2 मेगाहर्ट्ज उत्तेजना के साथ 0.5 μs / पिक्सेल।

3P छवियों में उच्च स्थानिक रिज़ॉल्यूशन (पार्श्व में ~ 1 μm) रखने के लिए, यह ~ 1 μm2 के क्षेत्र में 1 पिक्सेल सेट करने के लिए आदर्श है, उदाहरण के लिए, 250 x 250 μm2 के FOV के लिए 256 x 256 पिक्सेल। इसलिए, काफी बड़े FOV (उदाहरण के लिए, 256 x 256 पिक्सेलके साथ 250 x 250 μm 2), 0.5 मेगाहर्ट्ज, 1 मेगाहर्ट्ज, और 2 मेगाहर्ट्ज पल्स पुनरावृत्ति दर क्रमशः ~ 7.6, ~ 15, और ~ 30 फ्रेम / एस की सैद्धांतिक अधिकतम फ्रेम दरों को सैद्धांतिक अधिकतम फ्रेम दर देते हैं। इसी तरह, लेजर पुनरावृत्ति दर का अनुकूलन आवश्यक है, लक्ष्य की गहराई, स्कैन गति और एफओवी के आधार पर, थर्मल क्षति सीमा के तहत पर्याप्त पल्स ऊर्जा लागू करने के लिए। इमेजिंग गति को बढ़ाने के लिए, एक अनुकूली उत्तेजना स्रोत का उपयोग न्यूरॉन्स (यानी, ब्याज के क्षेत्रों) पर सभी उत्तेजना दालों को केंद्रित करने के लिए किया जा सकता है, जो न्यूरॉन्स31 की मांग पर लेजर दालों को वितरित करता है।

3PM लाभप्रद है जब जीवित ऊतकों के भीतर गहरी इमेजिंग में 2PM की तुलना में और अत्यधिक बिखरने वाले मीडिया जैसे खोपड़ी, हड्डियों और माउस मस्तिष्क के सफेद पदार्थ परत (यानी, बाहरी कैप्सूल) के माध्यम से। लंबे समय तक EAL और 3PE के उच्च-क्रम nonlinear उत्तेजना गहरे ऊतक इमेजिंग लाभ. उदाहरण के लिए, माउस कॉर्टेक्स में GCaMP6 की छवि बनाने के लिए, 920 एनएम उत्तेजना के साथ 2P प्रतिदीप्ति संकेत 690 μm पर Equation 3उथले क्षेत्रों में 1,300 एनएम उत्तेजना के साथ 3P प्रतिदीप्ति संकेत से अधिक है (यानी, 1,300 एनएम पर ~ 2.3 ईएएल) 21। हालांकि, 920 एनएम की तुलना में 1,300 एनएम पर लंबे समय तक ईएएल के कारण, 3पीई ~ 690 μm और गहरे 21 की गहराई पर 2P उत्तेजना (2PE) की तुलना में मजबूत प्रतिदीप्ति देता है। इस गहराई को 'सिग्नल क्रॉसओवर गहराई' के रूप में परिभाषित किया गया है, जिस पर 2PE और 3PE की प्रतिदीप्ति सिग्नल ताकत एक ही पुनरावृत्ति दर और समान अधिकतम स्वीकार्य औसत शक्तियों21 के समान है। सिग्नल क्रॉसओवर गहराई 2PE और 3PE और फ्लोरोफोर के लिए उत्तेजना तरंग दैर्ध्य पर निर्भर करती है।

व्यवहार में, 920 एनएम उत्तेजना कम पानी के अवशोषण के कारण 1,300 एनएम उत्तेजना की तुलना में उच्च औसत लेजर शक्ति की अनुमति देती है। हालांकि, 2PE की उच्च औसत शक्ति सिग्नल क्रॉसओवर गहराई को केवल 0.9 EALs4 द्वारा धक्का देगी। इसके अलावा, जब नमूना घनी लेबल किया जाता है, तो 3PE में बहुत अधिक SBR का अतिरिक्त लाभ होता है। इसलिए, सिग्नल क्रॉसओवर लंबाई तक पहुंचने से पहले भी, 3PM 2PM की तुलना में इमेजिंग के लिए बेहतर हो सकता है। उदाहरण के लिए, जब माउस मस्तिष्क वास्कुलचर इमेजिंग, जिसमें ~ 2% का वॉल्यूम अंश (यानी, लेबलिंग घनत्व) होता है, 100 mW उत्तेजना शक्ति के साथ 1,300 nm 3PM फ्लोरोसीन के लिए ~ 700 μm की गहराई पर 200 mW उत्तेजना शक्ति के साथ 920 nm 2PM को मात देता है।

3PM में एक पतली लेकिन अत्यधिक बिखरने वाली परत के माध्यम से इमेजिंग करते समय भी एक लाभ होता है जो उत्तेजना बीम के बिंदु-प्रसार समारोह को विकृत कर सकता है और एक डिफोकस पृष्ठभूमि 4 उत्पन्न कर सकताहै। उदाहरण के लिए, माउस मस्तिष्क की बरकरार खोपड़ी के माध्यम से, 2PM छवियां मस्तिष्क की सतह13 से <100 μm की उथली गहराई पर भी defocus पृष्ठभूमि से पीड़ित हैं। एक समान defocus पृष्ठभूमि माउस मस्तिष्क 32 में सफेद पदार्थ के माध्यम से 1,280 एनएम उत्तेजना के साथ2PM में मनाया गया था। इसलिए, जब ऊतकों को टर्बिड परतों के माध्यम से चित्रित किया जाता है, तो लेबलिंग घनत्व की परवाह किए बिना उच्च-विपरीत इमेजिंग के लिए 3PM 2PM से बेहतर होता है।

हमने हाल ही में एक मोतियों के प्रेत और सैद्धांतिक विश्लेषण की सूचना दी है जो दिखाता है कि 3PM की इमेजिंग गहराई सीमा 8 EALs33 से अधिक है; 8 ईएएल माउस कॉर्टेक्स में ~ 1,700 एनएम उत्तेजना के साथ ~ 3 मिमी के बराबर हैं। हालांकि, वर्तमान में उपलब्ध लेजर में माउस मस्तिष्क में 8 ईएएल प्राप्त करने के लिए पर्याप्त नाड़ी ऊर्जा नहीं है। मजबूत लेजर के आगे के विकास 3PM की वर्तमान इमेजिंग गहराई सीमा धक्का होगा.

Disclosures

लेखकों ने कोई प्रतिस्पर्धी हितों की घोषणा नहीं की है।

Acknowledgments

इस काम को NSF DBI-1707312 कॉर्नेल NeuroNex हब और NIH 1U01NS103516 द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
5% Povidone-iodine Amazon NDC 67818-155-32 Aceptical cleaning of surgical areas
70% Ethanol Thermo Fisher Scientific CAS 64-17-5 Aceptical cleaning of surgical areas
Agarose Sigma A4718-256 Preparing zebrafish chamber
Atropine Cornell Veterinary Care
Bergamo II Thorlabs Multiphoton Imaging Microscope
Bupivacaine Cornell Veterinary Care
Dexamethasone Cornell Veterinary Care
Donut shape glass (ID4.5, OD6.5) Potomac Photonics Cover glass used for craniotomy
eye ointment (or topical ophthalmic ointment) Puralube Vet Ointment NDC 17033-211-38 Used as a lubricant to prevent irritation or to relieve dryness of the eye during surgery and anesthesia
GaAsP Amplified PMT Thorlabs PMT2100 PMT detector
Glucose Cornell Veterinary Care
Glycopyrrolate Cornell Veterinary Care
Heater (800 W) Finnex Aquarium heater for zebrafish water)
Isoflurane USP 250 mL Piramal NDC 66794-0013-25 For anesthesia of mice
Ketoprofen Cornell Veterinary Care
Kimwipes Kimtech Laboratory tissue for preparing zebrafish
Nanofil syringe (10 micrometer) with 36 G needle WPI NANOFIL + NF36BV Syringe and needle for injection of pancuronium bromide
Optical Adhesive Norland NOA 68 To stick round coverslip and donut shape glass together.
Pancuronium Bromide Cornell Veterinary Care
Peristaltic Pump Elemental Science ESI MP2 Water pump for zebrafish setup
Polyethylene tubing (I.D. 0.58 mm., O.D. 0.965 mm.) Elemental Science MP2 pump tubing Tubing that goes in the mouth of the zebrafish
Round Cover Slip German Glass #1.5, 5 mm Electron Microscopy Sciences 7229605 Cover glass used for craniotomy
Spirit-NOPA Spectra Physics Tunable Optical Parametric Amplifier
SR400 Stanford Research Systems SR400 Photon counter
Standard Photodiode Power Sensor Thorlabs S122C Power detector
Sterilized phosphate buffered saline (PBS) Millipore Sigma SKU 806552-500ml Used during mouse brain surgery
Surgical drape Dynarex disposable towel drape 4410 For aceptical mouse surgery
Thin strip boxing wax Corning Rubber Co., Inc. Holding tubing in place in zebrafish chamber
ThorImage Thorlabs Image acquisition software
Tricaine (Ethyl-m-aminobenzoate methanesulfonate salt) MP 103106 Zebrafish anesthesia and euthanasia
Tygon tubing (I.D. 1/16 in., O.D. 1/8 in.) Tygon Tubing for water flow for zebrafish preparation
VaporGuard VetEquip 931401 For recycling isoflurane
Vetbond tissue adhesive 3M 1469SB To glue the glass window on the mouse skull, and to glue the laboratory tissue when preparing the fish.
XLPLN25XWMP2 Olympus Multiphoton Excitation Dedicated Objective

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References

  1. Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248 (4951), 73-76 (1990).
  2. Helmchen, F., Denk, W. Deep tissue two-photon microscopy. Nature Methods. 2 (12), 932-940 (2005).
  3. Horton, N. G., et al. In vivo three-photon microscopy of subcortical structures within an intact mouse brain. Nature Photonics. 7 (3), 205-209 (2013).
  4. Wang, T., Xu, C. Three-photon neuronal imaging in deep mouse brain. Optica. 7 (8), 947-960 (2020).
  5. Ouzounov, D. G., et al. In vivo three-photon imaging of activity of GCaMP6-labeled neurons deep in intact mouse brain. Nature Methods. 14 (4), 388-390 (2017).
  6. Weisenburger, S., et al. Volumetric Ca2+ imaging in the mouse brain using hybrid multiplexed sculpted light microscopy. Cell. 177 (4), 1050-1066 (2019).
  7. Yildirim, M., Sugihara, H., So, P. T. C., Sur, M. Functional imaging of visual cortical layers and subplate in awake mice with optimized three-photon microscopy. Nature Communications. 10, 177 (2019).
  8. Takasaki, K., Abbasi-Asl, R., Waters, J. Superficial bound of the depth limit of two-photon imaging in mouse brain. eNeuro. 7 (1), (2020).
  9. Guesmi, K., et al. Dual-color deep-tissue three-photon microscopy with a multiband infrared laser. Light, Science & Applications. 7, 12 (2018).
  10. Hontani, Y., Xia, F., Xu, C. Multicolor three-photon fluorescence imaging with single-wavelength excitation deep in mouse brain. Science Advances. 7 (12), 3531 (2021).
  11. Liu, H., et al. In vivo deep-brain structural and hemodynamic multiphoton microscopy enabled by quantum dots. Nano Letters. 19 (8), 5260-5265 (2019).
  12. Chow, D. M., et al. Deep three-photon imaging of the brain in intact adult zebrafish. Nature Methods. 17 (6), 605-608 (2020).
  13. Wang, T., et al. Three-photon imaging of mouse brain structure and function through the intact skull. Nature Methods. 15 (10), 789-792 (2018).
  14. Xu, C., Webb, W. W. Multiphoton excitation of molecular fluorophores and nonlinear laser microscopy. Topics in Fluorescence Spectroscopy. 5. , Springer. Boston, MA. 471-540 (2002).
  15. Mostany, R., Portera-Cailliau, C. A craniotomy surgery procedure for chronic brain imaging. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (12), e680 (2008).
  16. Łukasiewicz, K., Robacha, M., Bożycki, Ł, Radwanska, K., Czajkowski, R. Simultaneous two-photon in vivo imaging of synaptic inputs and postsynaptic targets in the mouse retrosplenial cortex. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (109), e53528 (2016).
  17. Kyweriga, M., Sun, J., Wang, S., Kline, R., Mohajerani, M. H. A large lateral craniotomy procedure for mesoscale wide-field optical imaging of brain activity. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (123), e52642 (2017).
  18. Gordon, J. P., Martinez, O. E., Fork, R. L. Negative dispersion using pairs of prisms. Optics Letters. 9 (5), 150-152 (1984).
  19. Entenberg, D., et al. Setup and use of a two-laser multiphoton microscope for multichannel intravital fluorescence imaging. Nature Protocols. 6 (10), 1500-1520 (2011).
  20. Horton, N. G., Xu, C. Dispersion compensation in three-photon fluorescence microscopy at 1,700 nm. Biomedical Optics Express. 6 (4), 1392-1397 (2015).
  21. Wang, T., et al. Quantitative analysis of 1300-nm three-photon calcium imaging in the mouse brain. eLife. 9, 53205 (2020).
  22. Cheng, L. -C., Horton, N. G., Wang, K., Chen, S. -J., Xu, C. Measurements of multiphoton action cross sections for multiphoton microscopy. Biomedical Optics Express. 5 (10), 3427-3433 (2014).
  23. Huang, K. -H., et al. A virtual reality system to analyze neural activity and behavior in adult zebrafish. Nature Methods. 17 (3), 343-351 (2020).
  24. Jacobson, G. A., Rupprecht, P., Friedrich, R. W. Experience-dependent plasticity of odor representations in the telencephalon of zebrafish. Current Biology. 28 (1), 1-14 (2018).
  25. Li, J., et al. Early development of functional spatial maps in the zebrafish olfactory bulb. Journal of Neuroscience. 25 (24), 5784-5795 (2005).
  26. Barbosa, J. S., et al. Live imaging of adult neural stem cell behavior in the intact and injured zebrafish brain. Science. 348 (6236), 789-793 (2015).
  27. Dray, N., et al. Large-scale live imaging of adult neural stem cells in their endogenous niche. Development. 142 (20), 3592-3600 (2015).
  28. Kobat, D., et al. Deep tissue multiphoton microscopy using longer wavelength excitation. Optics Express. 17 (16), 13354-13364 (2009).
  29. Wang, M., Wu, C., Sinefeld, D., Li, B., Xia, F., Xu, C. Comparing the effective attenuation lengths for long wavelength in vivo imaging of the mouse brain. Biomedical Optics Express. 9 (8), 3534-3543 (2018).
  30. Vogel, A., Noack, J., Hüttman, G., Paltauf, G. Mechanisms of femtosecond laser nanosurgery of cells and tissues. Applied Physics B. 81 (8), 1015-1047 (2005).
  31. Li, B., Wu, C., Wang, M., Charan, K., Xu, C. An adaptive excitation source for high-speed multiphoton microscopy. Nature Methods. 17 (2), 163-166 (2019).
  32. Kobat, D., Horton, N. G., Xu, C. In vivo two-photon microscopy to 1.6-mm depth in mouse cortex. Journal of Biomedical Optics. 16 (10), 106014 (2011).
  33. Akbari, N., Rebec, M. R., Xia, F., Xu, C. Imaging deeper than the transport mean free path with multiphoton microscopy. Biomedical Optics Express. 13, 452-463 (2022).

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Hontani, Y., Akbari, N., Kolkman, K. E., Wu, C., Xia, F., Choe, K., Wang, G. Z., Sokolova, M., Fetcho, J. R., Xu, C. Deep-Tissue Three-Photon Fluorescence Microscopy in Intact Mouse and Zebrafish Brain. J. Vis. Exp. (179), e63213, doi:10.3791/63213 (2022).

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