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अपशिष्ट जल और वायु नमूनों में सार्स-सीओवी-2 आरएनए का परिमाणीकरण और संपूर्ण जीनोम लक्षण वर्णन

Published: June 30, 2023 doi: 10.3791/65053
Automatic Translation
1,2,3, 4,5,6, 3, 3, 1,2, 1,2, 1,2, 2,3, 4,5, 1,2
1Institute of Sustainable Processes, University of Valladolid, 2Department of Chemical Engineering and Environmental Technology, University of Valladolid, 3Department of Public Health Microbiology, National Laboratory of Health, Environment and Food, 4ICBAS - School of Medicine and Biomedical Sciences, Porto University, 5Epidemiology Research Unit (EPIUnit), Instituto de Saúde Pública da Universidade do Porto, 6Laboratório para a Investigação Integrativa e Translacional em Saúde Populacional (ITR)

Summary

इस प्रोटोकॉल का उद्देश्य अपशिष्ट जल और हवा के नमूनों में सार्स-सीओवी-2 आरएनए की मात्रा निर्धारित करना है, जिसका उपयोग अपशिष्ट जल आधारित महामारी विज्ञान अध्ययन के लिए किया जाएगा और इनडोर और आउटडोर एरोसोल में सार्स-सीओवी-2 के जोखिम जोखिम का आकलन करना है। यह प्रोटोकॉल सार्स-सीओवी-2 पूरे जीनोम लक्षण वर्णन के लिए एक टाइल्ड एम्प्लिकॉन लॉन्ग-टेम्प्लेट अनुक्रमण दृष्टिकोण का भी वर्णन करता है।

Abstract

अपशिष्ट जल आधारित महामारी विज्ञान कई देशों में सार्स-सीओवी-2 और अन्य संक्रामक रोगों के लिए एक आशाजनक और प्रभावोत्पादक निगरानी प्रणाली के रूप में उभरा है। इस प्रक्रिया में आमतौर पर अपशिष्ट जल एकाग्रता, न्यूक्लिक एसिड निष्कर्षण, चयनित जीनोमिक खंडों का प्रवर्धन और प्रवर्धित जीनोमिक खंड का पता लगाना और परिमाणीकरण शामिल होता है। इसी तरह हवा के नमूनों में सार्स-सीओवी-2 जैसे संक्रामक एजेंटों का पता लगाने और उनकी मात्रा निर्धारित करने के लिए इस पद्धति का लाभ उठाया जा सकता है. प्रारंभ में, सार्स-सीओवी-2 को मुख्य रूप से बोलने, छींकने, खांसने, गाने या सांस लेने के दौरान संक्रमित व्यक्ति द्वारा उत्पन्न बूंदों के साथ निकट व्यक्तिगत संपर्क के माध्यम से फैलने के लिए माना गया था। हालांकि, कई अध्ययनों ने स्वास्थ्य सुविधाओं की हवा में सार्स-सीओवी-2 आरएनए की उपस्थिति की सूचना दी है, जो वायरस के लिए एक व्यवहार्य मार्ग के रूप में हवाई संचरण को स्थापित करता है। यह अध्ययन अपशिष्ट जल और हवा के नमूनों दोनों से वायरस के पर्यावरणीय पहचान, परिमाणीकरण और अनुक्रमण की सुविधा के लिए स्थापित प्रोटोकॉल का एक समग्र प्रस्तुत करता है।

Introduction

दिसंबर 2019 में, सीओवीआईडी -19 नामक एक नई बीमारी सामने आई, जो पहले से अज्ञात कोरोनावायरस, सार्स-सीओवी-21 के कारण हुई थी। परिणामस्वरूप वैश्विक महामारी ने दुनिया भर में नैदानिक और सार्वजनिक स्वास्थ्य प्रयोगशालाओं के लिए एक महत्वपूर्ण चुनौती प्रस्तुत की है, क्योंकि बड़ी संख्या में व्यक्तियों को समुदाय में वायरस संचरण और प्रसार का सही आकलन करने के लिए परीक्षण की आवश्यकता होती है। हालांकि, कई क्षेत्रों में, समय पर और स्थानिक रूप से व्यापक तरीके से परीक्षण के आवश्यक स्तर को प्राप्त करना आर्थिक रूप से असंभव है। व्यक्तिगत नैदानिक निदान पर आधारित वर्तमान निगरानी प्रणाली लक्षण गंभीरता और व्यक्तिगत रिपोर्टिंग पर बहुत अधिक निर्भर करती है, साथ ही साथ ये लक्षण4,5,6,7,8,9,10 की आबादी में प्रसारित मौजूदा बीमारियों के साथ किस हद तक ओवरलैप होते हैं। नतीजतन, बिना लक्षण वाले मामलों की एक बड़ी संख्या बीमारी के बोझको कम करके 7,11 करने में योगदान देती है।

इन चुनौतियों के कारण, कोविड-19 निगरानी के लिए अपशिष्ट जल आधारित महामारी विज्ञान (डब्ल्यूबीई) को पूरक निगरानी रणनीति के रूप में प्रस्तावित किया गया था। डब्ल्यूबीई को पहली बार 200112 में वर्णित किया गया था, और शुरू में कोकीन और अन्यअवैध दवाओं का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया गया था। यह दृष्टिकोण इस धारणा पर निर्भर करता है कि किसी भी पदार्थ की प्रारंभिक एकाग्रता की गणना करना संभव है जो अपशिष्ट जल में स्थिर है और मनुष्यों द्वारा उत्सर्जित 8,12 है। डब्ल्यूबीई को सार्स-सीओवी-2 3,8,14,15,16 के लिए पूरक और कुशल निगरानी प्रणाली के रूप में कई देशों में सफलतापूर्वक लागू किया गया है। जलीय वातावरण में मानव वायरस का पता लगाने के अधिकांश तरीके इन चरणों का पालन करते हैं: एकाग्रता, न्यूक्लिक एसिड निष्कर्षण, चुने गए जीनोमिक खंड (या खंडों) का प्रवर्धन, और प्रवर्धित जीनोमिक खंडका पता लगाना /

सार्स-सीओवी-2 का पता लगाने और मात्रा का निर्धारण करने के लिए एक और महत्वपूर्ण वातावरण हवा के नमूनों में है। प्रारंभ में, सार्स-सीओवी-2 को मुख्य रूप से बोलने, छींकने, खांसने, गानेया सांस लेने के दौरान संक्रमित व्यक्ति द्वारा उत्पन्न एरोसोल से श्वसन बूंदों के साथ घनिष्ठ व्यक्तिगत संपर्क के माध्यम से प्रेषित किया गया था। हालांकि, कई अध्ययनों ने हवा में सार्स-सीओवी-2 आरएनए की उपस्थिति की रिपोर्ट करना शुरू कर दिया, विशेष रूप से स्वास्थ्य सुविधाओं और अन्य संलग्न स्थानोंमें 18,19,20,21. अस्पतालों और अन्य संलग्न स्थानों में घर के अंदर लिए गए हवा के नमूनों में सार्स-सीओवी-2 की व्यवहार्यता के सबूत पाए गए हैं, जब वायरस की सांद्रतापर्याप्त रूप से 22,23,24 थी। बाहरी अध्ययनों में आम तौर पर सार्स-सीओवी-2 का कोई सबूत नहीं मिला है, सिवाय भीड़-भाड़ वाले बाहरी स्थानों 21,25,26,27,28,29 के। अब तक, सार्स-सीओवी-2 के हवाई संचरण को संचरणके एक मोड के रूप में मान्यता दी गई है। एक हालिया समीक्षा अध्ययन बाहर के बीच अंतर को दर्शाता है, जहां भीड़भाड़ वाले क्षेत्रों के बाहर और घर के अंदर हवाई संचरण के जोखिम न्यूनतम हैं, जहां खराब हवादार वातावरण में बड़े जोखिम मौजूद हो सकते हैं जिसमें मजबूत स्रोत (यानी, संक्रमित लोगों की संख्या) मौजूद हो सकते हैं। हाल ही में एक व्यापक समीक्षा अध्ययन ने बाहरी बनाम इनडोर वातावरण में हवाई संचरण के जोखिमों के बीच पर्याप्त अंतर पर प्रकाश डाला है, विशेष रूप से खराब वेंटिलेशन वाले भीड़-भाड़ वाले क्षेत्रों में। अध्ययन से संकेत मिलता है कि बाहरी वातावरण में हवाई संचरण का जोखिम न्यूनतम है, जहां वायरसके कणों के कमजोर पड़ने और फैलाव के लिए हवा की एक बड़ी मात्रा उपलब्ध है। इन निष्कर्षों का कोविड-19 से संबंधित सार्वजनिक स्वास्थ्य नीतियों और दिशानिर्देशों पर महत्वपूर्ण प्रभाव पड़ता है। इनडोर और आउटडोर वातावरण के बीच संचरण जोखिमों में महत्वपूर्ण अंतर को पहचानकर, नीति निर्माता वायरस के प्रसार को कम करने और सार्वजनिक स्वास्थ्य की रक्षा के लिए अधिक प्रभावी रणनीति विकसित कर सकते हैं।

विभिन्न पर्यावरणीय नमूनों से सार्स-सीओवी-2 का पता लगाने, मात्रा का निर्धारण और अनुक्रमण के लिए कई तरह के तरीके और प्रोटोकॉल हैं। इस विधि लेख का उद्देश्य अच्छी तरह से स्थापित प्रोटोकॉल का एक संयोजन प्रस्तुत करना है जो विभिन्न क्षमता स्तरों वाली प्रयोगशालाओं को अपशिष्ट जल और हवा के नमूनों से वायरस का पर्यावरणीय पता लगाने, परिमाणीकरण और अनुक्रमण करने की अनुमति देता है।

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Protocol

यहां वर्णित सभी विधियों को कहीं और प्रकाशित किया गया है और इसमें मूल विधियों से छोटे संशोधन शामिल हैं।

1. अपशिष्ट जल संग्रह और नमूना पूर्व प्रसंस्करण

नोट: पर्यावरणीय नमूनों में सार्स-सीओवी-2 आरएनए की कम सांद्रता के कारण, 33,34,35 का सफल पता लगाने के लिए एकाग्रता चरण का कार्यान्वयन महत्वपूर्ण है। अपशिष्टजल में सार्स-सीओवी-2 का पता लगाने के लिए यहां वर्णित पहली विधि है।

  1. अपशिष्ट जल के नमूने का संग्रह और एकाग्रता
    1. 24 घंटे मिश्रित अपशिष्ट जल के नमूने का 1 एल एकत्र करें। नमूना को 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें और 24 घंटे के भीतर प्रोटोकॉल के साथ आगे बढ़ें।
    2. बोतल को धीरे से हिलाकर नमूने को समरूप करें। 70 एमएल को 100 एमएल केन्द्रापसारक ट्यूब में इकट्ठा करें या नमूने को 50 एमएल के दो केन्द्रापसारक ट्यूबों में विभाजित करें।
    3. एकाग्रता प्रक्रिया के आंतरिक नियंत्रण के रूप में प्रत्येक नमूने के 70 एमएल में मेंगोवायरस के 20 μL (3.2 x 103 प्रतियां / μL) स्पाइक करें। वैकल्पिक रूप से, प्रत्येक 50 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में 10 μL मेंगोवायरस (3.2 x 103 प्रतियां / μL) स्पाइक करें।
    4. बड़े कणों और जीवों (गोली) को हटाने के लिए 10 मिनट के लिए 700 x g पर नमूना और सेंट्रीफ्यूज को समरूप करें।
    5. 4 डिग्री सेल्सियस पर 40 मिनट के लिए 4,000 एक्स जी पर सेंट्रीफ्यूजिंग करके 10 केडीए के कटऑफ के साथ केन्द्रापसारक अल्ट्राफिल्ट्रेशन उपकरणों के साथ एकाग्रता के लिए परिणामी सुपरनैटेंट का उपयोग करें। 40 मिनट के लिए 700 x g पर सेंट्रीफ्यूजिंग करके और अल्ट्राफिल्ट्रेशन डिवाइस की स्थिति को कम करके ध्यान केंद्रित करें।
    6. परिणामी एकाग्रता की मात्रा को मापें। नमूने में ठोस पदार्थों की मात्रा के आधार पर मात्रा बदल जाएगी जो केन्द्रापसारक फिल्टर को रोकती है। इस अध्ययन में, प्राप्त एकाग्रता मात्रा 200-1,200 μL के बीच थी।
    7. एक वाणिज्यिक किट या इन-हाउस विधि का उपयोग करके आरएनए निष्कर्षण के लिए परिणामी एकाग्रता का उपयोग करें। इस अध्ययन में उपयोग किए गए नमूनों के लिए, वायरल आरएनए निष्कर्षण के लिए एक विशिष्ट वाणिज्यिक किट का उपयोग 50 μL की क्षालन मात्रा के साथ किया जाता है।
    8. फ्लोरोमेट्रिक आरएनए परिमाणीकरण किट के साथ निकाले गए आरएनए की एकाग्रता को मापें। निकाले गए आरएनए को एलिकोट में विभाजित करें और आगे के विश्लेषण तक -80 डिग्री सेल्सियस पर फ्रीज करें।
      नोट: प्रत्येक आरएनए अलगाव प्रक्रिया सेट के लिए, अलगाव का एक नकारात्मक नियंत्रण (एनसीआई) शामिल किया जाना चाहिए, जिसमें निष्कर्षण के दौरान संभावित संदूषण का पता लगाने के लिए केवल बफर शामिल हैं।
  2. कोरिओलिस कॉम्पैक्ट एयर सैंपलर का उपयोग करके हवा के नमूनों का संग्रह।
    1. नमूना आवृत्ति और नमूना स्थानों को परिभाषित करके अनुसंधान लक्ष्य के अनुसार एक नमूना रणनीति चुनें।
    2. एयर सैंपलर पर प्रवाह दर सेट करें (यहां, 30 मिनट के लिए 50 एल / कृपया ध्यान दें कि 200 एल / मिनट से अधिक की प्रवाह दर वायरल आरएनए को नीचा दिखा सकती है, इसलिए 200 एल / मिनट से नीचे प्रवाह दर का उपयोग करने की सिफारिश की जाती है।
    3. शुरुआत करके संग्रह शुरू करने से पहले एयर सैंपलर में एक बाँझ शंकु रखें। एक बार नमूना समाप्त हो जाने के बाद, शंकु में बाँझ फॉस्फेट-बफर्ड सेलाइन (पीबीएस) के 5-15 मिलीलीटर जोड़ें। 15 सेकंड के लिए नमूने को धीरे से भंवर करें या हाथ से हिलाएं। क्रायोट्यूब में 4 डिग्री सेल्सियस या -80 डिग्री सेल्सियस पर 24 घंटे तक नमूने स्टोर करें।
    4. एक वैकल्पिक एकाग्रता चरण किया जा सकता है। ब्लीच का उपयोग करके प्रत्येक प्रयोग के बाद शंकु को साफ और विघटित करें।
    5. एक वाणिज्यिक किट या इन-हाउस विधि का उपयोग करके आरएनए निकालें। इस अध्ययन में नमूनों के लिए, वायरल आरएनए निष्कर्षण के लिए एक विशिष्ट वाणिज्यिक किट का उपयोग 50 μL की क्षालन मात्रा के साथ किया जाता है।
    6. फ्लोरोमेट्रिक आरएनए परिमाणीकरण किट के साथ निकाले गए आरएनए की एकाग्रता को मापें। निकाले गए आरएनए को एलिकोट में विभाजित करें और आगे के विश्लेषण तक -80 डिग्री सेल्सियस पर फ्रीज करें।
      नोट: प्रत्येक आरएनए अलगाव प्रक्रिया सेट के लिए, अलगाव का एक नकारात्मक नियंत्रण (एनसीआई) शामिल किया जाना चाहिए, जिसमें निष्कर्षण के दौरान संभावित संदूषण का पता लगाने के लिए केवल बफर शामिल हैं।

2. रियल-टाइम-क्वांटिटेटिव पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (आरटी-क्यूपीसीआर) द्वारा सार्स-सीओवी-2 आरएनए का परिमाणीकरण

नोट: नीचे दिया गया प्रोटोकॉल सीडीसी 2019-नॉवल कोरोनावायरस (2019-एनसीओवी) आरटी-पीसीआर नैदानिक पैनल37 के अनुसार है। ठंड और पिघलने के चक्र से बचने के लिए प्राइमर / प्रोब मिश्रण को कई एलिकोट में विभाजित करें।

  1. प्रत्येक लक्ष्य के लिए प्रतिक्रिया मास्टरमिक्स तैयार करें (मेंगोवायरस; सार्स-सीओवी-2 [एन1 और एन2 जीन]) जैसा कि तालिका 1 में दिखाया गया है, अभिकर्मक सेटअप रूम में एक साफ हुड में। प्राइमर/प्रोब मिश्रण और एंजाइम को व्युत्क्रम द्वारा पांच बार मिलाएं। वैकल्पिक रूप से, प्राइमरों /जांच मिश्रण और एंजाइमपांच बार प्रकाश पल्स-भंवर।
    नोट: तैयारी और उपयोग के दौरान सभी अभिकर्मकों को ठंडा रखें। फ्रीज-पिघलना चक्र को कम करने के लिए, एलिकोट में फ्रीज करने की अत्यधिक अनुशंसा की जाती है।
  2. नीचे सामग्री को इकट्ठा करने के लिए ट्यूबों को नीचे (15-30 सेकंड के लिए 1,000 x g ) घुमाएं और ट्यूबों को ठंडे रैक या बर्फ पर रखें।
  3. प्रत्येक लक्ष्य के लिए 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब लेबल करें। प्रत्येक माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में आवश्यक प्रत्येक अभिकर्मक की मात्रा जोड़ें (आवश्यक नियंत्रण सहित प्रतिक्रियाओं की संख्या प्रति प्रतिक्रिया मात्रा का गुना)। ऊपर और नीचे पाइप करके मिलाएं और नीचे सामग्री को इकट्ठा करने के लिए 5 सेकंड के लिए सेंट्रीफ्यूज करें।
  4. माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबों को एक ठंडे रैक में रखें और 15 μL को स्ट्रिप पीसीआर ट्यूबों या कूलिंग रैक में 96-वेल प्लेट में वितरित करें। प्लेट को कवर करें और इसे न्यूक्लिक एसिड हैंडलिंग क्षेत्र में ले जाएं (इसे शीतलन रैक में रखें)।
  5. निकाले गए आरएनए के एक एलिकोट को पिघलाएं और धीरे-धीरे भंवर को 5 सेकंड के लिए पिघलाएं। पहले से तैयार मास्टरमिक्स युक्त प्रत्येक प्रतिक्रिया वेल या ट्यूब के लिए आरएनए के पिपेट 5 μL (गैर-टेम्पलेट नियंत्रण [एनटीसी] के 5 μL के अलावा, अलगाव का नकारात्मक नियंत्रण [NCI], और सकारात्मक नियंत्रण [पीसी])। क्रॉस-संदूषण से बचने के लिए आवश्यकतानुसार अक्सर दस्ताने बदलें।
  6. पूरी प्रतिक्रिया प्लेट या ट्यूबों को कवर करें और धीरे से भंवर। सेंट्रीफ्यूज (15-30 सेकंड के लिए 1,000 x g ) प्लेट या पीसीआर ट्यूब।
  7. निम्नलिखित साइक्लिंग स्थितियों के साथ 25 μL RT-qPCR शुरू करें: 10 मिनट के लिए 45 डिग्री सेल्सियस पर रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस; 10 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर पोलीमरेज़ सक्रियण; 15 सेकंड के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर विकृतीकरण के 45 चक्र; और 45 सेकंड के लिए 60 डिग्री सेल्सियस पर एनीलिंग / विस्तार।
  8. कॉन्टे एट अल .38 द्वारा रिपोर्ट के अनुसार मेंगोवायरस नियंत्रण की वसूली दक्षता की गणना करें:
    Equation 1 × 100

3. अपशिष्ट जल और डेटा विश्लेषण में अनुक्रमण वेरिएंट।

नोट: वर्णित प्रोटोकॉल Quick et al.39,40 द्वारा बनाया गया एक संशोधित प्रोटोकॉल है। यह पीसीआर टाइलिंग पद्धति-आर्टिक प्राइमरों और वर्स्किप प्राइमरों द्वारा सार्स-सीओवी-2 जीनोम प्रवर्धन के लिए प्राइमरों के दो सेटों का उपयोग करता है। प्राइमरों के संयोजन का उपयोग सर्वोत्तम जीनोम कवरेज की गारंटी देने और एक प्रकार के प्राइमरों के विफल होने के कारण नए उत्परिवर्तन की संभावना को कम करने के लिए किया जाता है। सामान्य तौर पर, प्रोटोकॉल को तीन भागों में विभाजित किया जाता है: रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन (आरटी) और एम्प्लिकॉन पीढ़ी, अनुक्रमण पुस्तकालय तैयारी, और अनुक्रमण और डेटा विश्लेषण।

  1. रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन और एम्पलीकॉन जनरेशन।
    1. सुनिश्चित करें कि इनपुट नमूनों में पीसीआर-ग्रेड पानी में उन्हें सही ढंग से पतला करने के लिए एक ज्ञात क्यूपीसीआर साइक्लिंग थ्रेशोल्ड (सीटी) मान है। सीटी मान क्यूपीसीआर के साथ परिमाणीकरण के दौरान प्राप्त किया जाता है। कमजोर पड़ने निम्नानुसार हैं: यदि सीटी मान 12-15 है, तो नमूने को 1: 100 पतला करें; यदि सीटी मान 15-18 है, तो नमूने को 1: 10 पतला करें; यदि सीटी मान 18-35 है, तो नमूने को पतला न करें। 35 के सीटी मान से ऊपर के नमूनों में काम नहीं करने की उच्च संभावना है।
    2. एक पीसीआर प्लेट में, प्लेट पर अपनी स्थिति के लिए प्रत्येक नमूने का पिपेट 16 μL। रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन (आरटी) मास्टरमिक्स (5x) के 4 μL जोड़ें। प्लेट को कवर करें और निम्नलिखित शर्तों के साथ पीसीआर प्रतिक्रिया शुरू करें: 2 मिनट के लिए 25 डिग्री सेल्सियस, 20 मिनट के लिए 55 डिग्री सेल्सियस और 1 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस।
    3. प्रत्येक प्राइमर सेट के 10 μM कमजोर पड़ने (ARTIC पूल A और पूल B, और VarSkip पूल A और पूल B) तैयार करें। प्राइमरों के प्रत्येक सेट (ARTIC सेट A और B, और VarSkip सेट A और B) के लिए मास्टरमिक्स तैयार करें जैसा कि तालिका 2 में है। चार मास्टरमिक्स इसके परिणामस्वरूप होंगे।
    4. एक नई पीसीआर प्लेट पर, प्रत्येक संबंधित कुएं में मास्टरमिक्स के 20 μL का उपयोग करें। प्रत्येक मिश्रण में आरटी नमूने के 5 μL जोड़ें।
      नोट: प्रत्येक नमूने में चार प्रतिक्रिया मिश्रण होंगे- आर्टिक पूल ए और बी, और वर्स्किप पूल ए और बी।
    5. प्लेट को कवर करें और पीसीआर प्रतिक्रिया को निम्नानुसार शुरू करें: 30 सेकंड के लिए 98 डिग्री सेल्सियस पर पोलीमरेज़ सक्रियण; 15 सेकंड के लिए 98 डिग्री सेल्सियस पर विकृतीकरण के 35 चक्र; और 4 मिनट के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पर एनीलिंग / विस्तार। प्लेट को नीचे (15-30 सेकंड के लिए 1,000 x g ) घुमाएं। आर्टिक प्रतिक्रिया पूल को मिलाएं और अलग से वरस्किप प्रतिक्रिया पूल को मिलाएं। प्रत्येक नमूने में दो 50 μL एम्पलीकॉन प्रतिक्रियाएं होंगी।
    6. प्रत्येक कुएं में पीसीआर शुद्धिकरण के लिए 50 μL मोती-आधारित अभिकर्मक जोड़ें और पाइपिंग द्वारा अच्छी तरह मिलाएं। 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट करें।
      नोट: हर उपयोग से पहले, मोतियों को फिर से निलंबित करने के लिए पीसीआर शुद्धिकरण अभिकर्मक को सख्ती से मिलाएं।
    7. प्लेट को चुंबकीय पृथक्करण स्टैंड पर रखें और मोतियों को गोली बनाने और तरल को साफ करने की प्रतीक्षा करें (~ 5 मिनट)। पिपेट और सतह पर तैरने वाले को छोड़ दें। पीसीआर प्लेट को मैग्नेटिक स्टैंड पर रखें।
    8. चुंबकीय स्टैंड पर पीसीआर प्लेट को बनाए रखते हुए, मोती गोली को छूने के बिना प्रत्येक नमूने में 80% इथेनॉल के 200 μL जोड़ें। इथेनॉल को हटा दें।
    9. पिछले चरण को दोहराएँ। इथेनॉल को वाष्पित करने की अनुमति देने के लिए प्लेट को चुंबकीय स्टैंड पर 30 सेकंड के लिए खुला छोड़ दें।
    10. चुंबकीय स्टैंड से प्लेट निकालें और प्रत्येक नमूने में 15 μL पीसीआर-ग्रेड पानी जोड़ें। पाइपटिंग द्वारा गोली को फिर से निलंबित करें। 2 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट करें।
    11. प्लेट को चुंबकीय स्टैंड पर वापस रखें और मोतियों को गोली (2 मिनट) करने दें। प्रत्येक नमूने से एक नई पीसीआर प्लेट में सतह पर तैरनेवाले के 15 μL को सावधानीपूर्वक पिपेट करें।
    12. फ्लोरोमेट्रिक आरएनए परिमाणीकरण किट के साथ प्रत्येक नमूने की एकाग्रता को मापें। अगले चरण में 12.5 μL में प्रत्येक नमूने का लगभग 50 ng लें। यदि आवश्यक हो, तो पीसीआर-ग्रेड पानी में नमूना पतला करें।
  2. पुस्तकालय की तैयारी
    1. इलुमिना डीएनए लाइब्रेरी तैयारी किट से 1.75 μL प्रतिक्रिया बफर और प्रत्येक नमूने में एंजाइम मिश्रण के 0.75 μL जोड़ें। प्लेट को कवर करें, भंवर संक्षेप में, और नीचे घूमें (15-30 सेकंड के लिए 1,000 x g )। 5 मिनट के लिए 21 डिग्री सेल्सियस और 5 मिनट के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
    2. एक नई प्लेट में, प्रत्येक नमूने के लिए पीसीआर-ग्रेड पानी के पिपेट 3 μL को एक नई पीसीआर प्लेट में ले जाया जाता है। तैयार नमूनों के 0.75 μL, अनुक्रमण पुस्तकालय तैयारी के लिए बारकोड के 1.25 μL, और T4 डीएनए लिगेज मास्टरमिक्स के 5 μL जोड़ें। पाइपिंग द्वारा अच्छी तरह मिलाएं, संक्षेप में एक सेंट्रीफ्यूज में (15-30 सेकंड के लिए 1,000 x ग्राम ) घुमाएं और 20 मिनट के लिए 21 डिग्री सेल्सियस और 10 मिनट के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
      नोट: यदि 25 से कम नमूने का उपयोग कर रहे हैं, तो इस चरण में सभी वॉल्यूम को दोगुना करें।
    3. एक ही कम-बाइंडिंग ट्यूब में प्रत्येक नमूने के 10 μL जोड़कर सभी नमूनों को एक साथ पूल करें। 480 μL को अगले चरण में ले जाएं।
    4. पूल में पीसीआर शुद्धिकरण के लिए 192 μL मोती-आधारित अभिकर्मक जोड़ें और पाइपिंग द्वारा अच्छी तरह मिलाएं। 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट करें।
    5. ट्यूब को एक चुंबकीय स्टैंड पर रखें और सतह पर तैरने वाले के साफ होने और एक मोती गोली बनने की प्रतीक्षा करें। सतह पर तैरने वाले को हटा दें। चुंबकीय स्टैंड से ट्यूब को हटा दें।
    6. शॉर्ट फ्रैग्मेंट बफर (एसएफबी) के 700 μL जोड़ें और पाइपिंग द्वारा मिलाएं। चुंबकीय स्टैंड पर वापस रखें और गोली बनने और तरल को साफ करने की प्रतीक्षा करें (~ 5 मिनट)। सतह पर तैरने वाले को बाहर निकालें और इसे छोड़ दें।
    7. पिछले चरण को दोहराएँ। ट्यूब को चुंबकीय स्टैंड पर छोड़ दें। मोती को छूने के बिना 80% इथेनॉल के 100 μL जोड़ें। इथेनॉल को पिपेट करें और मोती को 30 सेकंड तक सूखने दें।
      नोट: मोती को अधिक सूखने की अनुमति न दें।
    8. चुंबकीय स्टैंड से ट्यूब निकालें और पीसीआर-ग्रेड पानी के 35 μL जोड़ें। पाइपटिंग द्वारा मिलाएं और 2 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट करें। ट्यूब को चुंबकीय स्टैंड पर रखें और मोती को गोली और तरल को साफ करने की अनुमति दें। पिपेट 35 μL सुपरनैटेंट को एक नई ट्यूब में ले जाता है।
    9. पूल किए गए पुस्तकालय की आरएनए एकाग्रता को मापें। 30-50 एनजी आरएनए की मात्रा तक पहुंचने के लिए आवश्यक मात्रा को पिपेट करें और इसे 30 μL की अंतिम मात्रा तक पहुंचने के लिए पीसीआर-ग्रेड पानी से भरें।
    10. एडेप्टर लिगेशन रिएक्शन मिक्स तैयार करें: पूल लाइब्रेरी का 30 μL, एडेप्टर मिक्स II का 5 μL, लिगेशन रिएक्शन बफर का 10 μL (5x), और T4 DNA लिगेज का 5 μL। पाइपटिंग और स्पिन-डाउन (15-30 सेकंड के लिए 1,000 x g ) द्वारा मिलाएं। 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट करें।
    11. पीसीआर शुद्धिकरण के लिए मोती-आधारित अभिकर्मक के 20 μL जोड़ें और पाइपिंग द्वारा मिलाएं। कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
    12. ट्यूब को चुंबकीय स्टैंड पर रखें और मोती गोली बनने और सतह पर तैरने वाले के रंगहीन होने की प्रतीक्षा करें। सावधानी से बाहर निकालें और सतह पर तैरने वाले को छोड़ दें।
    13. चुंबकीय स्टैंड से निकालें और एसएफबी के 125 μL जोड़ें। पाइपटिंग द्वारा मिलाएं और मोतियों को अलग करने के लिए चुंबकीय स्टैंड पर वापस रखें। जब तरल स्पष्ट हो जाता है, तो सतह पर तैरने वाले को पिपेट और फेंक दें।
    14. पिछले चरण को दोहराएँ। ट्यूब को चुंबकीय स्टैंड पर 30 सेकंड के लिए खुला छोड़ दें ताकि कुछ बचे हुए तरल वाष्पित हो जाएं।
    15. चुंबकीय स्टैंड से ट्यूब को हटा दें और क्षालन बफर के 15 μL जोड़ें। पाइपटिंग और संक्षेप में स्पिन-डाउन (15-30 सेकंड के लिए 1,000 x g ) द्वारा अच्छी तरह मिलाएं। 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट करें। 2 मिनट के लिए चुंबकीय स्टैंड पर रखें।
    16. पिपेट 15 μL सुपरनैटेंट को एक नई कम-बाध्यकारी ट्यूब में बदल देता है। यह अंतिम पुस्तकालय है। फ्लोरोमेट्रिक डीएनए परिमाणीकरण किट के साथ एकाग्रता को मापें।
      नोट: अगले चरण में, 12 μL की आवश्यकता है। यदि एकाग्रता बहुत अधिक है और पुस्तकालय के 12 μL से कम की आवश्यकता है, तो क्षालन बफर अभिकर्मक के साथ 12 μL तक भरें।
  3. फ्लो सेल लोडिंग और अनुक्रमण।
    1. वास्तविक समय डीएनए और आरएनए अनुक्रमण डिवाइस में प्रवाह सेल (आर 9.4.1) डालें।
    2. फ्लश बफर (एफबी) अभिकर्मक की एक ट्यूब में फ्लश टीथर (एफएलटी) अभिकर्मक के 30 μL जोड़कर प्राइमिंग मिश्रण तैयार करें। मिश्रण करने और नीचे घूमने के लिए भंवर (15-30 सेकंड के लिए 1,000 x g )।
    3. प्राइमिंग पोर्ट कवर खोलें। 1,000 μL पिपेट का उपयोग करके, 200 μL पर सेट करें और टिप को प्राइमिंग पोर्ट में डालें। वॉल्यूम सेटिंग व्हील को चालू करें और वॉल्यूम को तब तक बढ़ाएं जब तक कि टिप में तरल दिखाई न दे। टिप को छोड़ दें।
      नोट: केवल पहिया को तब तक घुमाएं जब तक कि नोक में तरल के कुछ μL दिखाई न दें। बड़ी मात्रा में खींचने से प्रवाह सेल को नुकसान हो सकता है।
    4. धीरे-धीरे प्राइमिंग पोर्ट में प्राइमिंग मिश्रण के 800 μL जोड़ें, इस बात का ध्यान रखें कि बुलबुले पेश न करें। 5 मिनट तक प्रतीक्षा करें।
    5. इस बीच, लोडिंग के लिए पुस्तकालयों को तैयार करें। अनुक्रमण बफर के 37.5 μL, लोडिंग बफर के 25.5 μL, और लाइब्रेरी के 12 μL मिलाएं।
      नोट: पाइपिंग से पहले लोडिंग बफर मिलाएं। इस अभिकर्मक में मोती बहुत जल्दी ठीक हो जाते हैं।
    6. पोर्ट कवर खोलें। प्राइमिंग पोर्ट में प्राइमिंग मिश्रण के पिपेट 200 μL।
      नोट: कवर पोर्ट खुले होने के साथ प्राइमिंग पोर्ट में पाइप िंग करते समय, कोई नमूना पोर्ट से आने वाली छोटी बूंदों को नोटिस करेगा। पिपेट काफी धीमा है ताकि नमूना पोर्ट बूंदों को बिना फैलाए अंदर खींच सके।
    7. तैयार लाइब्रेरी को लोड करने से पहले, पाइपिंग द्वारा अच्छी तरह मिलाएं। 75 μL पर 100 μL पिपेट सेट का उपयोग करके, लाइब्रेरी और पिपेट ड्रॉप को नमूना पोर्ट में ड्रॉप द्वारा ले जाएं। पोर्ट को न छुएं और तरल के अतिप्रवाह से बचने के लिए अगली बूंद लोड करने से पहले प्रत्येक बूंद को बंदरगाह में अवशोषित करने की प्रतीक्षा करें।
    8. कवर पोर्ट और प्राइमिंग पोर्ट बंद करें। सॉफ़्टवेयर खोलें और अनुक्रमण प्रयोग शुरू करें। बेसकॉलिंग का चयन करें. 96 मल्टीप्लेक्स नमूने वाली लाइब्रेरी के लिए, 10-12 घंटे का अनुक्रमण आमतौर पर पर्याप्त डेटा उत्पन्न करने के लिए पर्याप्त होता है।
      नोट: सॉफ्टवेयर का उपयोग करके, कोई नमूना पत्रक को .csv प्रारूप में सम्मिलित कर सकता है। नमूना पत्रक को निम्न डेटा की आवश्यकता होती है: flow_cell_id, position_id, sample_id, experiment_id, flow_cell_product_code और किट. उपयोग की गई किट के साथ फ्लो सेल आईडी (फ्लो सेल के किनारे सूचीबद्ध) की आवश्यकता होती है। सुझाए गए प्रोटोकॉल के लिए, LSK109 किट का चयन किया जाना चाहिए।
  4. अनुक्रमण डेटा विश्लेषण
    1. संपीड़ित फास्टक्यू रीडिंग को डब्ल्यूएफ-आर्टिक वर्कफ़्लो41 में डालें। वर्कफ़्लो को दो भिन्न प्राइमर योजनाओं (ARTIC/V4.1 और NEB-VarSkip/v1a) के साथ अलग-अलग चलाएँ. दो ". primertrimmed.rg.सॉर्टेड.bam" फ़ाइलें प्रत्येक नमूने के लिए बनाई जाती हैं।
    2. BAM फ़ाइलों को "samtools मर्ज" कमांड42 के साथ एक एकल फ़ाइल में मर्ज करें। सापेक्ष वंश बहुतायतको पुनर्प्राप्त करने के लिए, डिफ़ॉल्ट सेटिंग्स छोड़ते हुए, मर्ज की गई बीएएम फ़ाइल को फ्रेजा टूल में डालें।
    3. FASTA फ़ाइल बनाने के लिए, मर्ज की गई BAM फ़ाइल को डिफ़ॉल्ट सेटिंग्स44,45 के साथ "samtools mpileup" और "ivar" उपकरण में डालें। उत्परिवर्तन कॉलिंग के लिए, FASTA फ़ाइल को नेक्स्टक्लेड टूल46,47 में लोड करें।

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Representative Results

तालिका 3 में सारांशित परिणाम इस लेख में वर्णित विधि का उपयोग करके अपशिष्ट जल और हवा के नमूनों में सार्स-सीओवी-2 आरएनए का पता लगाने और परिमाणीकरण के उदाहरण दिखाते हैं। अपशिष्ट जल के नमूने स्पेन और स्लोवेनिया में अपशिष्ट जल उपचार संयंत्रों से एकत्र किए गए थे और तीन प्रतिकृतियों में से कम से कम दो में सीटी 40 से कम होने पर सकारात्मक माना जाता था, जिसमें सीटी में 5% से कम की भिन्नता होने पर परिमाणीकरण को वैध माना जाता था। स्पेन और पुर्तगाल में, इनडोर और आउटडोर हवा के नमूने एकत्र किए गए थे, और समान नियम लागू किए गए थे। हवा के नमूनों के लिए डुप्लिकेट का उपयोग किया गया था, न कि अपशिष्ट जल के नमूनों के लिए तीन प्रतियों का, क्योंकि अध्ययन का उद्देश्य सार्स-सीओवी-2 आरएनए का पता लगाना था, न कि इसकी मात्रा निर्धारित करना। इसके अलावा, आरटी-क्यूपीसीआर रन को केवल तभी वैध माना जाता था जब उपयोग किए गए सभी नियंत्रण (जैसा कि इस प्रोटोकॉल में वर्णित है) अपेक्षा के अनुसार व्यवहार करते थे और यदि मेंगोवायरस आरएनए नियंत्रण में कोई महत्वपूर्ण विचलन नहीं देखा गया था। इन नमूनों के लिए, मेंगोवायरस रिकवरी दक्षता 13.7% और 19.7% के बीच भिन्न थी। अवरोध का आकलन दस गुना और 100 गुना निकाले गए आरएनए को पतला करके और परिणामी आरटी-क्यूपीसीआर परिणामों की तुलना करके, साथ ही साथ एक वाणिज्यिक किट का उपयोग करके किया गया था। निर्माताओं द्वारा वर्णित प्रत्येक निषेध नियंत्रण किट के निर्देशों का पालन किया जाना चाहिए।

अपशिष्ट जल के नमूनों में तीन प्रतियों के बीच 1.91% से 13.98% तक का मानक विचलन था और यह 3.05 x 10 3 से 2.83 x 108 जीन प्रतियों / एल तक था। हवा के नमूने 0.54% और 10.95% के बीच डुप्लिकेट के बीच मानक विचलन के साथ 6.17 x 103 से 5.48 x 109 तक थे। यहपिछले अध्ययनों 6,48,49,50 के अनुसार है।

जैसा कि इस प्रोटोकॉल में वर्णित है, नमूने अनुक्रमित किए गए थे और तीन अनुक्रमित नमूना परिणामों का एक उदाहरण तालिका 4 और चित्रा 1 में संक्षेपित किया गया है। सभी तीन नमूनों में, वंश BA.5.x को फ्रेजा उपकरण (95.3%, 95.4%, और 99.8%) द्वारा सबसे प्रचलित के रूप में सौंपा गया था।

Figure 1
चित्र 1: चयनित अपशिष्ट जल नमूनों में सार्स-सीओवी-2 वंश प्रसार। फ्रीजा उपकरण का उपयोग करके वंशावली सौंपी गई थी। प्रसार संख्या का सारांश आवश्यक रूप से 100% तक नहीं पहुंचता है, क्योंकि कुछ डेटा पर्याप्त गुणवत्ता के नहीं हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

तालिका 1: आरटी-क्यूपीसीआर द्वारा सार्स-सीओवी2 परिमाणीकरण के लिए मास्टरमिक्स तैयार करने के लिए प्रत्येक में अभिकर्मकों और मात्राओं को जोड़ा जाना है। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

तालिका 2: नमूनों में पूर्ण सार्स-सीओवी-2 जीनोम को बढ़ाने के लिए मास्टरमिक्स तैयार करने के लिए प्रत्येक के अभिकर्मकों और मात्राओं को जोड़ा जाना है। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

तालिका 3: अपशिष्ट जल और हवा के नमूनों से सार्स-सीओवी-2 आरएनए के आरटी-क्यूपीसीआर परिमाणीकरण परिणामों का सारांश। एन 1 जीन का उपयोग परिमाणीकरण के लिए किया गया था और एन 2 का उपयोग पुष्टि (सकारात्मक या नकारात्मक) के लिए किया गया था। परिणाम प्रतियों / एल के रूप में व्यक्त किए जाते हैं। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

तालिका 4: पता लगाए गए उत्परिवर्तन और वंश प्रसार। वंशावली को फ्रेजा टूल का उपयोग करके और नेक्स्टक्लेड का उपयोग करके पाए गए रुचि के उत्परिवर्तन के अनुसार सौंपा गया था। प्रत्येक नमूने के लिए जीनोम कवरेज दिखाया गया है। प्रसार संख्या का सारांश आवश्यक रूप से 100% तक नहीं पहुंचता है, क्योंकि कुछ डेटा पर्याप्त गुणवत्ता के नहीं हैं। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

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Discussion

(आरटी-) क्यूपीसीआर विधियों का उपयोग करके माइक्रोबियल और वायरल का पता लगाने और परिमाणीकरण ने अपनी उल्लेखनीय संवेदनशीलता के कारण व्यापक स्वीकृति प्राप्त की है। हालांकि, पर्यावरणीय नमूनों का विश्लेषण करते समय इन तकनीकों को कई चुनौतियों का सामना करना पड़ता है। अपशिष्ट जल के नमूनों में निरोधात्मक पदार्थों की एक बहुतायत होती है जो माप को तिरछा कर सकती है और भ्रामक परिणाम उत्पन्न कर सकती है। इन सीमाओं से निपटने और परिशुद्धता बढ़ाने के लिए, एक जटिल प्रोटोकॉल की कल्पना, डिजाइन और कार्यान्वयन किया गया था। यह प्रोटोकॉल वैज्ञानिक साहित्य से प्रोटोकॉल के संयोजन से तैयार किया गया था और विशेष रूप से प्रक्रिया के प्रत्येक चरण में कड़े नियंत्रणों की एक श्रृंखला को शामिल करके क्यूपीसीआर विधियों में निहित प्रतिबंधों को संबोधित करने के लिए तैयार किया गया था। इन कठोर गुणवत्ता नियंत्रण उपायों को एकीकृत करके, यह प्रोटोकॉल जटिलपर्यावरणीय नमूनों में क्यूपीसीआर-आधारित पहचान और परिमाणीकरण विधियों द्वारा सामना की जाने वाली चुनौतियों का एक मजबूत समाधान प्रदान करता है। आरएनए निष्कर्षण और आरटी-क्यूपीसीआर प्रतिक्रिया के दौरान संदूषण की संभावना का आकलन करने के लिए अलगाव का नकारात्मक नियंत्रण (एनसीआई) और गैर-टेम्पलेट नियंत्रण (एनटीसी) आवश्यक उपकरण हैं। इसके अलावा, मेंगोवायरस नियंत्रण आरएनए का एकीकरण अंतर-नमूना परिवर्तनशीलता का मूल्यांकन करने के लिए एक महत्वपूर्ण साधन प्रदान करता है, साथ ही एकाग्रता चरण की दक्षता और जटिल पर्यावरणीय नमूनों में मौजूद एजेंटों के निरोधात्मक प्रभाव। प्रत्येक आरटी-क्यूपीसीआर प्रतिक्रिया में, प्रवर्धन प्रक्रिया की प्रभावशीलता की पुष्टि करने के लिए सकारात्मक नियंत्रण शामिल किए जाने चाहिए। प्रोटोकॉल के प्रत्येक चरण की सावधानीपूर्वक निगरानी करना महत्वपूर्ण है, जिसमें नमूनों के भंडारण और प्रसंस्करण समय शामिल हैं। नमूनों का क्षरण तापमान और अपशिष्ट जल की जटिल संरचना से प्रभावित हो सकता है, जिससे नमूनों को 4 डिग्री सेल्सियस के तापमान पर संग्रहीत करना और उन्हें 24 घंटे के भीतर संसाधित करना आवश्यक हो जाता है। इन कड़े गुणवत्ता नियंत्रण उपायों का पालन करके, शोधकर्ता और सार्वजनिक स्वास्थ्य कार्यकर्ता माइक्रोबियल और वायरल आबादी में महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि को उजागर करने औरमानव स्वास्थ्य पर पर्यावरणीय कारकों के प्रभाव को बेहतर ढंग से समझने के लिए आत्मविश्वास से और सटीक रूप से पर्यावरणीय नमूनों का विश्लेषण कर सकते हैं।

सार्स-सीओवी-2 का पता लगाने के लिए आरएनए लक्ष्यों का चयन एक महत्वपूर्ण कारक है जो आरटी-क्यूपीसीआर परख की संवेदनशीलता को प्रभावित कर सकता है। इस अध्ययन में, लेखकों ने आरडीआरपी, ई, एन 1, और एन 2 लक्ष्यों का मूल्यांकन किया और पाया कि आरडीआरपी और ई परख में एन 1 और एन 2 परखों की तुलना में कम संवेदनशीलता थी, जो पिछले शोध53 के अनुरूप थी। एन 1 और एन 2 परख डबल बुझाने वाली जांच का उपयोग करते हैं, जिन्हें (आरटी-) क्यूपीसीआर परख54 में उनकी संवेदनशीलता बढ़ाने के लिए दिखाया गया है। उन कारणों से मात्रा निर्धारण के लिए एन 1 और आरएनए उपस्थिति की पुष्टि के रूप में एन 2 का उपयोग करने का निर्णय लिया जाता है, ताकि बहुत कम सांद्रता पाए जाने पर संदेह को खत्म किया जा सके। आरटी-क्यूपीसीआर लक्ष्यों के बीच देखी गई विसंगतियों को पहले36 बताया गया था।

कई अध्ययनों में इसी तरह के प्रोटोकॉल का उपयोग किया गया है और चल रही कोविड-19महामारी 6,48,49,55,56 के दौरान अपशिष्ट जल में सार्स-सीओवी-2 आरएनए का सफलतापूर्वक पता लगाने और परिमाणीकरण की सूचना दी गई है। रिपोर्ट किए गए सार्स-सीओवी-2 आरएनए सांद्रता इस अध्ययन और प्रोटोकॉल48,50,55 में रिपोर्ट किए गए लोगों के अनुसार हैं। इनमें से कुछ अध्ययनों ने सक्रिय मामलों और आरटी-क्यूपीसीआर लक्ष्य जीन, विशेष रूप से एन 1 और एन 2 6,36,49,50,55,57,58,59 की सांद्रता के बीच संबंधों का पता लगाया है। प्राप्त जीन सांद्रता में परिवर्तनशीलता को कम करने के लिए, प्रारंभिक वायरल लोड36 प्राप्त करने के लिए नमूने के समय प्रवाह दर से प्रयोगात्मक सांद्रता को गुणा करने का प्रस्ताव किया गया है। इस दृष्टिकोण को स्पेन में वीटार कोविड-19 परियोजना में शामिल किया गया है, जो अपशिष्ट जल में कोविड-19 के लिए एक राष्ट्रीय निगरानी प्रणालीहै।

कोविड-19 अपशिष्ट जल आधारित महामारी विज्ञान (डब्ल्यूबीई) अध्ययन के अगले चरण के रूप में, शोधकर्ताओं ने समुदायों के भीतर चिंता के रूपों के प्रसार का अनुमान लगाने के लिए अपशिष्ट जल में सार्स-सीओवी-2 उत्परिवर्तन का पता लगाने का प्रयास किया है। पिछले अध्ययनों ने अपशिष्ट जल में पहचाने गए वेरिएंट और एक ही समय में आबादी में मौजूद लोगों के बीच एक मजबूत संबंध दिखाया है। इन निष्कर्षों से पता चलता है कि अपशिष्ट जल आधारित निगरानी सार्स-सीओवी-2 वेरिएंट61,62 के प्रसार को ट्रैक करने में एक मूल्यवान उपकरण के रूप में काम कर सकती है। डब्ल्यूबीई ने सार्स-सीओवी-2 की निगरानी में बहुत वादा दिखाया है और इसका उपयोग महामारियों के लिए भविष्य की निगरानी रणनीतियों को विकसित करने के लिए किया जा सकता है। यह दृष्टिकोण महामारी के शुरुआती चरणों में विशेष रूप से उपयोगी है, जब सीमित व्यक्तिगत परीक्षण होते हैं और कई मामले स्पर्शोन्मुख हो सकते हैं, और नैदानिक निगरानी के लिए एक पूरक रणनीति है। इसलिए, डब्ल्यूबीई कम आर्थिक क्षमता वाले स्थानों में विशेष रूप से उपयोगी हो सकता है जो अन्य अधिक महंगी निगरानी रणनीतियों को बर्दाश्त नहीं कर सकते हैं। वर्णित विधि को आसानी से अन्य वायरस के लिए अनुकूलित किया जा सकता है जो भविष्य में निगरानी के लिए प्रासंगिक हो सकते हैं।

इनडोर और आउटडोर वातावरण में हवा के नमूने के परिणामों से पता चला है कि सार्स-सीओवी-2 आरएनए दोनों वातावरणों में मौजूद है, हालांकि बाहरी वातावरण में कम सांद्रता में 38,63,64। इन निष्कर्षों से पता चलता है कि जिन गतिविधियों और एक्सपोजर में मास्क पहनना और सोशल डिस्टेंसिंग बनाए रखना मुश्किल है, जैसे कि खाना, पीना या संगीत समारोहों में भाग लेना, कोविड-19 संचरण के लिए उच्च जोखिम पैदा कर सकता है। इस तरह के जोखिमों को कम करने के लिए, उचित वेंटिलेशन उपायों और मास्क के उपयोग पर विचार करना महत्वपूर्ण है, विशेष रूप से चिंता के नए रूपों के उभरने के साथ जो अधिक पारगम्य हैं, जैसे डेल्टा (बी.1.617.2) और ओमीक्रॉन (बी.1.1.529) वेरिएंट। कई क्षेत्रों में कोविड-19 प्रतिबंधों को हटाने के मद्देनजर, सार्स-सीओवी-2 के सामुदायिक प्रसार को कम से कम रखनेऔर भविष्य में बीमारी के प्रकोप को रोकने के लिए मास्क के उपयोग को बनाए रखने की सिफारिश की गई है।

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Disclosures

लेखकों के पास कोई प्रतिस्पर्धी आर्थिक हित या हितों का अन्य टकराव नहीं है।

Acknowledgments

यह काम कैस्टिला वाई लियोन की क्षेत्रीय सरकार और फेडर कार्यक्रम (परियोजना सीएलयू 2017-09, यूआईसी 315 और VA266P20) से वित्तीय सहायता के साथ किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Adapter+A25+A2:D19+A2:D20+A2+A2:D19 Oxford Nanopore EXP-AMII001 Sequencing
AllPrep PowerViral DNA/RNA Kit Qiagen 28000-50 RNA extraction kit
AMPure XP Beckman Coulter A63880 PCR Purification, NGS Clean-up, PCR clean-up
ARTIC SARS-CoV-2 Amplicon Panel IDT 10011442 SARS-CoV-2 genome amplification
Blunt/TA Ligase Master Mix NEB M0367S Library preparation
CENTRICON PLUS­70 10KDA. Fisher Scientific 10296062 Concentration filters
CORIOLIS COMPACT AIR SAMPLER Bertin Technologies 083-DU001 Air sampler
Duran laboratory bottles Merck Z305200-10EA Sampling Bottles
Flow Cell (R9.4.1) Oxford Nanopore FLO-MIN106D Sequencing
General labarotory consumables (tubes, qPCR plates, etc)
Ligation Sequencing Kit Oxford Nanopore SQK-LSK109 Sequencing
LunaScript RT SuperMix Kit NEB E3010  cDNA synthesis
Mengovirus extraction control Kit Biomérieux KMG Concentration control
Nalgene General Long-Term Storage Cryogenic Tubes Thermofisher 5011-0012 Sample storage
Native Barcoding Expansion 1-12 (PCR-free Oxford Nanopore EXP-NBD104 Barcoding
NEBNext Ultra II End Repair/dA-Tailing Module NEB E7595 DNA repair
NEBNext VarSkip Short SARS-CoV-2 Primer Mixes NEB E7658 SARS-CoV-2 genome amplification
NEBNext Quick Ligation Reaction Buffer NEB B6058S Sequencing 
Phosphate buffered saline Merck P4474 Collection buffer
Phosphate-buffered saline (PBS, 1X), sterile-filtered Thermofisher J61196.AP Elution of air samples
Q5 Hot Start High-Fidelity 2X Master Mix NEB M0494S hot start DNA polymerase
Qubit RNA HS Assay Kit Thermofisher Q32852 RNA quantitation
SARS-CoV-2 RUO qPCR Primer & Probe Kit IDT 10006713 Primer-Probe mix and qPCR positive control
TaqPath 1-Step RT-qPCR Master Mix Thermofisher A15299 RT-qPCR kit

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References

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