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폐수 및 공기 샘플에서 SARS-CoV-2 RNA의 정량화 및 전체 게놈 특성 분석

Published: June 30, 2023 doi: 10.3791/65053
Automatic Translation
1,2,3, 4,5,6, 3, 3, 1,2, 1,2, 1,2, 2,3, 4,5, 1,2
1Institute of Sustainable Processes, University of Valladolid, 2Department of Chemical Engineering and Environmental Technology, University of Valladolid, 3Department of Public Health Microbiology, National Laboratory of Health, Environment and Food, 4ICBAS - School of Medicine and Biomedical Sciences, Porto University, 5Epidemiology Research Unit (EPIUnit), Instituto de Saúde Pública da Universidade do Porto, 6Laboratório para a Investigação Integrativa e Translacional em Saúde Populacional (ITR)

Summary

이 프로토콜은 폐수 기반 역학 연구에 사용할 폐수 및 공기 샘플의 SARS-CoV-2 RNA를 정량화하고 실내 및 실외 에어로졸에서 SARS-CoV-2에 대한 노출 위험을 평가하는 것을 목표로 합니다. 이 프로토콜은 또한 SARS-CoV-2 전체 게놈 특성 분석을 위한 타일형 앰플리콘 긴 템플릿 염기서열 분석 접근법을 설명합니다.

Abstract

폐수 기반 역학은 많은 국가에서 SARS-CoV-2 및 기타 전염병에 대한 유망하고 효과적인 감시 시스템으로 부상했습니다. 이 공정에는 일반적으로 폐수 농축, 핵산 추출, 선택된 게놈 세그먼트의 증폭, 증폭된 게놈 세그먼트의 검출 및 정량화가 포함됩니다. 이 방법론은 공기 샘플에서 SARS-CoV-2와 같은 감염원을 검출하고 정량화하는 데에도 유사하게 활용될 수 있습니다. 초기에 SARS-CoV-2는 주로 감염된 개인이 말, 재채기, 기침, 노래 부르기 또는 숨을 쉴 때 생성된 비말과의 밀접한 개인 접촉을 통해 확산되는 것으로 추정되었습니다. 그러나 점점 더 많은 연구에서 의료 시설의 공기 중에 SARS-CoV-2 RNA가 존재한다고 보고하여 공기 중 전파가 바이러스의 실행 가능한 경로임을 입증했습니다. 이 연구는 폐수 및 공기 샘플에서 바이러스의 환경 검출, 정량화 및 염기서열 분석을 용이하게 하기 위해 확립된 프로토콜의 복합체를 제시합니다.

Introduction

2019년 12월, 이전에 알려지지 않은 코로나바이러스인 SARS-CoV-21에 의해 발생하는 COVID-19라는 새로운 질병이 등장했습니다. 그로 인한 글로벌 팬데믹은 많은 사람들이 지역 사회에서 바이러스 전파 및 확산을 정확하게 평가하기 위해 검사를 필요로 하기 때문에 전 세계 임상 및 공중 보건 실험실에 상당한 도전을 제시했습니다. 그러나 많은 지역에서 적시에 공간적으로 포괄적인 방식으로 필요한 수준의 테스트를 달성하는 것은 경제적으로 실현 불가능하다 2,3. 개별 임상 진단을 기반으로 하는 현재의 감시 시스템은 증상의 심각도와 개별 보고뿐만 아니라 이러한 증상이 인구 4,5,6,7,8,9,10에서 유행하는 기존 질병과 겹치는 정도에 크게 의존합니다. 결과적으로, 무증상 사례의 수가 많다는 것은 질병 부담에 대한 현저한 과소평가에 기여한다 7,11.

이러한 문제로 인해 COVID-19 감시를 위한 폐수 기반 역학(WBE)이 보완적인 감시 전략으로 제안되었습니다. WBE는 2001년에 처음 기술되었으며12 처음에는 코카인 및 기타 불법 약물을 추적하는 데 사용되었다13. 이 접근법은 폐수에서 안정하고 인간에 의해 배설되는 모든 물질의 초기 농도를 계산할 수 있다는 가정에 의존합니다 8,12. WBE는 SARS-CoV-2 3,8,14,15,16에 대한 보완적이고 효율적인 감시 시스템으로 많은 국가에서 성공적으로 구현되었습니다. 수생 환경에서 인간 바이러스를 검출하는 대부분의 방법은 농축, 핵산 추출, 선택한 게놈 세그먼트(또는 세그먼트)의 증폭, 증폭된 게놈 세그먼트의 검출/정량화 단계를 따릅니다3.

SARS-CoV-2의 검출 및 정량을 위한 또 다른 중요한 환경은 공기 샘플입니다. 초기에 SARS-CoV-2는 주로 감염된 사람이 말하거나, 재채기하거나, 기침하거나, 노래하거나, 숨을 쉴 때 발생하는 에어로졸의 호흡기 비말과의 밀접한 개인 접촉을 통해 전염되는 것으로 생각되었다17. 그러나 여러 연구에서 공기 중, 특히 의료 시설 및 기타 밀폐된 공간에서 SARS-CoV-2 RNA의 존재를 보고하기 시작했습니다 18,19,20,21. SARS-CoV-2의 생존력에 대한 증거는 바이러스 농도가 충분히 높았을 때 병원 및 기타 밀폐된 공간의 실내에서 채취한 공기 샘플에서 발견되었습니다22,23,2 4. 실외 연구에서는 일반적으로 붐비는 실외 공간을 제외하고는 SARS-CoV-2의 증거가 발견되지 않았다 21,25,26,27,28,29. 현재 SARS-CoV-2의 공기 중 전파는 전파 방식으로 인식되고있다 30,31. 최근 문헌고찰 연구에 따르면 밀집된 지역 밖에서 공기 중 전염 위험이 최소화되는 실외와 강력한 감염원(예: 감염자 수)이 존재할 수 있는 환기가 잘 되지 않는 환경에서 더 큰 위험이 나타날 수 있는 실내 간의 차이를 보여줍니다. 최근의 종합 문헌고찰 연구에서는 실외 환경과 실내 환경, 특히 환기가 잘 되지 않는 밀집된 장소에서 공기 중 전염 위험 간에 상당한 차이가 있음을 강조했습니다. 이 연구는 바이러스 입자의 희석 및 분산을 위해 더 많은 양의 공기가 존재하는 실외 환경에서 공기 중 전염의 위험이 최소화됨을 나타낸다(32). 이러한 결과는 COVID-19와 관련된 공중 보건 정책 및 지침에 중요한 영향을 미칩니다. 정책 입안자는 실내와 실외 환경 간의 전염 위험의 상당한 차이를 인식함으로써 바이러스 확산을 완화하고 공중 보건을 보호하기 위한 보다 효과적인 전략을 개발할 수 있습니다.

다양한 환경 샘플에서 SARS-CoV-2의 검출, 정량화 및 염기서열 분석을 위한 다양한 방법과 프로토콜이 있습니다. 이 방법 기사는 다양한 용량 수준을 가진 실험실이 폐수 및 공기 샘플에서 바이러스의 환경 검출, 정량화 및 시퀀싱을 수행할 수 있도록 하는 잘 확립된 프로토콜의 조합을 제시하는 것을 목표로 합니다.

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Protocol

여기에 설명된 모든 방법은 다른 곳에서 발표되었으며 원래 방법에서 약간 수정된 내용이 포함되어 있습니다.

1. 폐수 수집 및 시료 전처리

참고: 환경 샘플에서 SARS-CoV-2 RNA의 농도가 낮기 때문에 성공적인 검출을 위해서는 농도 단계의 구현이 중요합니다33,34,35. 여기에 설명된 것은 폐수36에서 SARS-CoV-2를 검출하기 위해 최초로 보고된 방법입니다.

  1. 폐수 샘플의 수집 및 농축
    1. 1L의 24시간 복합 폐수 샘플을 수집합니다. 샘플을 4°C에서 보관하고 24시간 이내에 프로토콜을 진행합니다.
    2. 병을 부드럽게 흔들어 샘플을 균질화합니다. 70mL를 100mL 원심 튜브에 수집하거나 샘플을 50mL의 원심 튜브 2개로 나눕니다.
    3. 농축 공정의 내부 통제로 각 샘플의 70mL에 20μL의 mengovirus(3.2 x 103 copies/μL)를 스파이크합니다. 또는 각 50mL 원심분리기 튜브에 10μL의 mengovirus(3.2 x 103 copies/μL)를 스파이크합니다.
    4. 시료를 균질화하고 700 x g에서 10분 동안 원심분리하여 큰 입자와 유기체(펠릿)를 제거합니다.
    5. 4°C에서 40분 동안 4,000 x g 으로 원심분리하여 10KDa의 컷오프를 가진 원심 한외여과 장치로 농축을 위해 생성된 상층액을 사용합니다. 700 x g 에서 40분 동안 원심분리하고 한외여과 장치의 위치를 반전시켜 농축액을 용리합니다.
    6. 결과 농축액의 부피를 측정하십시오. 부피는 원심 필터를 막는 샘플의 고형물의 양에 따라 변합니다. 이 연구에서 얻은 농축액 부피는 200-1,200 μL 사이였습니다.
    7. 생성된 농축액은 상용 키트 또는 사내 분석법을 사용하여 RNA 추출에 사용합니다. 이 연구에 사용된 샘플의 경우 용출량이 50μL인 바이러스 RNA 추출을 위한 특정 상용 키트가 사용됩니다.
    8. 형광 RNA 정량 분석 키트로 추출된 RNA의 농도를 측정합니다. 추출된 RNA를 부분 표본으로 나누고 추가 분석이 있을 때까지 -80°C에서 동결합니다.
      참고: 각 RNA 분리 절차 세트에 대해 추출 중 가능한 오염을 검출하기 위한 완충액만 포함하는 분리 음성 제어(NCI)가 포함되어야 합니다.
  2. Coriolis 소형 공기 샘플러를 사용한 공기 샘플 수집
    1. 표본 추출 빈도와 표본 추출 위치를 정의하여 연구 목표에 따라 표본 추출 전략을 선택합니다.
    2. 에어 샘플러의 유량을 설정합니다(여기서는 30분 동안 50L/min). 유속이 200L/min 이상이면 바이러스 RNA가 분해될 수 있으므로 200L/min 미만의 유속을 사용하는 것이 좋습니다.
    3. 시작을 펄스하여 수집을 시작하기 전에 공기 샘플러에 멸균 콘을 놓습니다. 샘플링이 완료되면 5-15mL의 멸균 인산염 완충 식염수(PBS)를 콘에 추가합니다. 샘플을 부드럽게 소용돌이치거나 손으로 15초 동안 흔듭니다. 4°C 또는 -80°C에서 최대 24시간 동안 샘플을 cryotube에 보관합니다.
    4. 선택적 농축 단계를 수행할 수 있습니다. 표백제를 사용하여 각 실험 후에 콘을 청소하고 오염을 제거합니다.
    5. 상용 키트 또는 자체 분석법을 사용하여 RNA를 추출합니다. 이 연구의 샘플에는 용출량이 50μL인 바이러스 RNA 추출을 위한 특정 상용 키트가 사용됩니다.
    6. 형광 RNA 정량 분석 키트로 추출된 RNA의 농도를 측정합니다. 추출된 RNA를 부분 표본으로 나누고 추가 분석이 있을 때까지 -80°C에서 동결합니다.
      참고: 각 RNA 분리 절차 세트에 대해 추출 중 가능한 오염을 검출하기 위한 완충액만 포함하는 분리 음성 제어(NCI)가 포함되어야 합니다.

2. 실시간 정량적 중합효소연쇄반응(RT-qPCR)에 의한 SARS-CoV-2 RNA 정량 분석

참고: 아래 프로토콜은 CDC 2019-신종 코로나바이러스(2019-nCoV) RT-PCR 진단 패널37에 따른 것입니다. 프라이머/프로브 혼합물을 여러 부분 표본으로 나누어 동결 및 해동 주기를 방지합니다.

  1. 각 표적에 대한 반응 마스터믹스를 준비합니다(mengovirus; SARS-CoV-2 [N1 및 N2 유전자])를 표 1과 같이 시약 설정실의 깨끗한 후드에 담았습니다. 프라이머/프로브 혼합물과 효소를 반전으로 5회 혼합합니다. 양자택일로, 가벼운 맥박 소용돌이는 뇌관/조사 혼합 및 효소5 시간.
    알림: 준비 및 사용 중에는 모든 시약을 차갑게 유지하십시오. 동결-해동 주기를 최소화하려면 부분 표본으로 동결하는 것이 좋습니다.
  2. 튜브를 아래로 돌리고(15-30초 동안 1,000 x g ) 바닥에 내용물을 모으고 튜브를 차가운 선반이나 얼음 위에 놓습니다.
  3. 각 표적에 대해 1.5mL 마이크로 원심분리기 튜브에 라벨을 부착합니다. 각 마이크로 원심분리기 튜브에 필요한 각 시약의 양을 추가합니다(반응당 부피 x 필요한 대조군을 포함한 반응 횟수). 피펫팅을 위아래로 혼합하고 5초 동안 원심분리하여 바닥에 있는 내용물을 수집합니다.
  4. 마이크로 원심분리기 튜브를 콜드 랙에 보관하고 15μL를 스트립 PCR 튜브 또는 냉각 랙의 96웰 플레이트에 분주합니다. 플레이트를 덮고 핵산 취급 구역으로 옮깁니다(냉각 랙에 보관).
  5. 추출된 RNA의 부분 표본을 해동하고 5초 동안 부드럽게 소용돌이칩니다. 5μL의 RNA(5μL의 비템플릿 대조군[NTC], 분리 음성 대조군[NCI] 및 양성 대조군[PC]에 추가)를 각 반응 웰 또는 이전에 준비된 마스터믹스가 포함된 튜브에 피펫팅합니다. 교차 오염을 방지하기 위해 필요에 따라 장갑을 자주 교체하십시오.
  6. 전체 반응판 또는 튜브를 덮고 부드럽게 소용돌이칩니다. 원심분리기(15-30초 동안 1,000 x g ) 플레이트 또는 PCR 튜브.
  7. 다음 사이클링 조건에서 25 μL RT-qPCR을 시작합니다: 45°C에서 10분 동안 역전사 효소; 95°C에서 10분 동안 중합효소 활성화; 95°C에서 15초 동안 45회 변성 주기; 60 °C에서 45 초 동안 어닐링 / 확장.
  8. Conte et al.38에 의해 보고된 mengovirus 대조군의 회복 효율을 계산합니다.
    Equation 1 × 100

3. 폐수 및 데이터 분석의 염기서열분석 변형

참고: 설명된 프로토콜은 Quick et al.39,40에 의해 생성된 수정된 프로토콜입니다. PCR 타일링 방법론에 의한 SARS-CoV-2 게놈 증폭을 위해 ARTIC 프라이머와 VarSkip 프라이머의 두 가지 프라이머 세트를 사용합니다. 프라이머의 조합은 최상의 게놈 커버리지를 보장하고 한 유형의 프라이머가 고장날 수 있는 새로운 돌연변이의 가능성을 최소화하는 데 사용됩니다. 일반적으로 프로토콜은 역전사(RT) 및 앰플리콘 생성, 염기서열분석 라이브러리 준비, 염기서열분석 및 데이터 분석의 세 부분으로 나뉩니다.

  1. 역전사 및 앰플리콘 생성
    1. 입력 샘플에 알려진 qPCR 순환 임계값(Ct) 값이 있는지 확인하여 PCR 등급 물에서 올바르게 희석합니다. Ct 값은 qPCR로 정량화하는 동안 얻어집니다. 희석액은 다음과 같습니다 : Ct 값이 12-15 인 경우 샘플을 1:100으로 희석하십시오. Ct 값이 15-18이면 샘플을 1:10으로 희석합니다. Ct 값이 18-35이면 샘플을 희석하지 마십시오. Ct 값이 35 이상인 샘플은 작동하지 않을 가능성이 높습니다.
    2. PCR 플레이트에서 각 샘플의 16μL를 플레이트의 해당 위치로 피펫팅합니다. 4μL의 역전사(RT) 마스터믹스(5x)를 추가합니다. 플레이트를 덮고 25°C에서 2분, 55°C에서 20분, 95°C에서 1분 동안 PCR 반응을 시작합니다.
    3. 각 프라이머 세트(ARTIC 풀 A 및 풀 B, VarSkip 풀 A 및 풀 B)의 10μM 희석액을 준비합니다. 표 2와 같이 각 프라이머 세트(ARTIC 세트 A 및 B, VarSkip 세트 A 및 B)에 대한 마스터믹스를 준비합니다. 이를 통해 4개의 마스터믹스가 탄생합니다.
    4. 새 PCR 플레이트에서 마스터믹스 20μL를 각 해당 웰에 피펫팅합니다. 각 혼합물에 RT 샘플 5μL를 추가합니다.
      참고: 각 샘플에는 ARTIC 풀 A와 B, VarSkip 풀 A와 B의 4가지 반응 혼합물이 있습니다.
    5. 플레이트를 덮고 다음과 같이 PCR 반응을 시작합니다 : 중합효소 활성화 98 °C에서 30 초; 98°C에서 15초 동안 35회 변성 주기; 65°C에서 4분 동안 어닐링/연장. 플레이트를 아래로 돌립니다(1,000-15초 동안 30 x g ). ARTIC 반응 풀을 결합하고 VarSkip 반응 풀을 별도로 결합합니다. 각 샘플에는 두 개의 50μL 앰플리콘 반응이 있습니다.
    6. PCR 정제를 위한 비드 기반 시약 50μL를 각 웰에 추가하고 피펫팅으로 잘 혼합합니다. 실온에서 5분 동안 배양합니다.
      참고: 매번 사용하기 전에 PCR 정제 시약을 세게 혼합하여 비드를 재현탁하십시오.
    7. 플레이트를 자기 분리 스탠드에 놓고 비드가 펠릿을 형성하고 액체가 맑아질 때까지 기다립니다(~5분). 피펫팅하고 상층액을 버립니다. PCR 플레이트를 마그네틱 스탠드에 보관하십시오.
    8. 마그네틱 스탠드에 PCR 플레이트를 유지하면서 비드 펠릿을 건드리지 않고 각 샘플에 200μL의 80% 에탄올을 추가합니다. 에탄올을 제거하십시오.
    9. 이전 단계를 반복합니다. 에탄올이 증발할 수 있도록 마그네틱 스탠드의 플레이트를 덮지 않은 상태로 30초 동안 그대로 두십시오.
    10. 마그네틱 스탠드에서 플레이트를 제거하고 각 샘플에 15μL의 PCR 등급 물을 추가합니다. 피펫팅으로 펠릿을 재현탁합니다. 실온에서 2분간 배양합니다.
    11. 플레이트를 마그네틱 스탠드에 다시 놓고 비드가 펠릿이 되도록 합니다(2분). 각 샘플에서 상층액 15μL를 새 PCR 플레이트로 조심스럽게 피펫팅합니다.
    12. 형광 RNA 정량 분석 키트로 각 샘플의 농도를 측정합니다. 12.5 μL의 각 샘플에서 약 50 ng를 다음 단계로 가져갑니다. 필요한 경우 샘플을 PCR 등급의 물에 희석합니다.
  2. 도서관 준비
    1. Illumina DNA 라이브러리 준비 키트의 반응 완충액 1.75μL와 효소 혼합물 0.75μL를 각 샘플에 추가합니다. 플레이트를 덮고 잠시 소용돌이친 다음 아래로 회전합니다(15-30초 동안 1,000 x g ). 21°C에서 5분, 65°C에서 5분간 배양합니다.
    2. 새 플레이트에서 각 샘플에 대해 3μL의 PCR 등급 물을 새 PCR 플레이트에 피펫팅합니다. 준비된 샘플 0.75μL, 염기서열분석 라이브러리 준비를 위한 바코드 1.25μL, T4 DNA 리가아제 마스터믹스 5μL를 추가합니다. 피펫팅으로 잘 혼합하고 원심분리기에서 잠시 스핀다운(15-30초 동안 1,000 x g )하고 21°C에서 20분, 65°C에서 10분 동안 배양합니다.
      참고: 25개 미만의 샘플을 사용하는 경우 이 단계의 모든 볼륨을 두 배로 늘립니다.
    3. 각 샘플의 10μL를 동일한 저결합 튜브에 추가하여 모든 샘플을 함께 모읍니다. 480 μL를 다음 단계로 이동합니다.
    4. PCR 정제를 위한 비드 기반 시약 192μL를 풀에 추가하고 피펫팅으로 잘 혼합합니다. 실온에서 10분 동안 배양합니다.
    5. 튜브를 자석 스탠드에 놓고 상층액이 맑아지고 비드 펠릿이 형성될 때까지 기다립니다. 상층액을 제거합니다. 마그네틱 스탠드에서 튜브를 제거합니다.
    6. 700 μL의 짧은 단편 완충액(SFB)을 추가하고 피펫팅으로 혼합합니다. 마그네틱 스탠드에 다시 놓고 펠릿이 형성되고 액체가 맑아질 때까지 기다립니다(~5분). 상층액을 피펫으로 꺼내 버리십시오.
    7. 이전 단계를 반복합니다. 튜브를 마그네틱 스탠드에 그대로 두십시오. 비드를 건드리지 않고 100μL의 80% 에탄올을 추가합니다. 에탄올을 피펫으로 꺼내고 비드를 30초 동안 건조시킵니다.
      알림: 비드가 과도하게 건조되지 않도록 하십시오.
    8. 마그네틱 스탠드에서 튜브를 제거하고 35μL의 PCR 등급 물을 추가합니다. 피펫팅으로 혼합하고 실온에서 2분 동안 배양합니다. 튜브를 마그네틱 스탠드에 놓고 비드가 펠릿이 되고 액체가 제거되도록 합니다. 상층액 35μL를 새 튜브에 피펫팅합니다.
    9. 통합 라이브러리의 RNA 농도를 측정합니다. 30-50ng의 RNA 양에 도달하는 데 필요한 부피를 피펫팅하고 최종 부피 30μL에 도달하기 위해 PCR 등급의 물로 채웁니다.
    10. 어댑터 결찰 반응 혼합물을 준비합니다: 통합 라이브러리 30μL, 어댑터 믹스 II 5μL, 결찰 반응 완충액 10μL(5x) 및 T4 DNA 리가아제 5μL. 피펫팅과 스핀다운(15-30초 동안 1,000 x g )으로 혼합합니다. 실온에서 10분 동안 배양합니다.
    11. PCR 정제를 위해 비드 기반 시약 20μL를 추가하고 피펫팅으로 혼합합니다. 실온에서 10분간 배양합니다.
    12. 튜브를 마그네틱 스탠드에 놓고 비드 펠릿이 형성되고 상층액이 무색이 될 때까지 기다립니다. 조심스럽게 피펫팅하여 상층액을 버립니다.
    13. 마그네틱 스탠드에서 제거하고 125μL의 SFB를 추가합니다. 피펫팅으로 혼합하고 마그네틱 스탠드에 다시 올려 비드를 분리합니다. 액체가 맑아지면 피펫팅하고 상층액을 버립니다.
    14. 이전 단계를 반복합니다. 남은 액체가 증발할 때까지 마그네틱 스탠드에서 튜브를 30초 동안 열어 둡니다.
    15. 마그네틱 스탠드에서 튜브를 제거하고 용출 완충액 15μL를 추가합니다. 피펫팅과 짧은 스핀다운(15-30초 동안 1,000 x g )으로 잘 섞습니다. 실온에서 5분 동안 배양합니다. 마그네틱 스탠드에 2분 동안 놓습니다.
    16. 상층액 15μL를 새로운 저결합 튜브에 피펫팅합니다. 이것이 최종 라이브러리입니다. 형광 DNA 정량 분석 키트로 농도를 측정합니다.
      참고: 다음 단계에서는 12μL가 필요합니다. 농도가 매우 높고 라이브러리의 12μL 미만이 필요한 경우 용출 완충 시약으로 최대 12μL를 채웁니다.
  3. 플로우 셀 로딩 및 염기서열분석
    1. 플로우 셀(Flow cell)(R9.4.1)을 실시간 DNA 및 RNA 염기서열분석 장치에 삽입합니다.
    2. 플러시 버퍼(FB) 시약 튜브에 30μL의 플러시 테더(FLT) 시약을 추가하여 프라이밍 혼합물을 준비합니다. 소용돌이를 혼합하고 회전합니다(15-30초 동안 1,000 x g ).
    3. 프라이밍 포트 커버를 엽니다. 1,000 μL 피펫을 사용하여 200 μL로 설정하고 팁을 프라이밍 포트에 삽입합니다. 볼륨 설정 휠을 돌려 팁의 액체가 보일 때까지 볼륨을 높입니다. 팁을 버리십시오.
      알림: 팁에 몇 μL의 액체가 보일 때까지만 휠을 돌리십시오. 더 많은 양을 당기면 플로우 셀이 손상될 수 있습니다.
    4. 800μL의 프라이밍 혼합물을 프라이밍 포트에 천천히 추가하되 기포가 생기지 않도록 주의합니다. 5분 동안 기다립니다.
    5. 그 동안 로드할 라이브러리를 준비합니다. 염기서열분석 완충액 37.5μL, 로딩 완충액 25.5μL, 라이브러리 12μL를 혼합합니다.
      알림: 피펫팅하기 전에 로딩 버퍼를 혼합하십시오. 이 시약의 비드는 매우 빠르게 침전됩니다.
    6. 포트 커버를 엽니다. 프라이밍 혼합물 200μL를 프라이밍 포트에 피펫팅합니다.
      알림: 커버 포트가 열린 상태에서 프라이밍 포트에 피펫팅하는 동안 샘플 포트에서 작은 방울이 나오는 것을 볼 수 있습니다. 피펫은 샘플 포트가 방울을 쏟지 않고 끌어당길 수 있도록 충분히 천천히 합니다.
    7. 준비된 라이브러리를 로드하기 전에 피펫팅으로 잘 혼합하십시오. 75 μL로 설정된 100 μL 피펫을 사용하여 라이브러리와 피펫을 샘플 포트에 한 방울씩 넣습니다. 액체가 넘치지 않도록 포트를 만지지 말고 다음 방울을 넣기 전에 각 방울이 포트에 흡수될 때까지 기다리십시오.
    8. 덮개 포트와 프라이밍 포트를 닫습니다. 소프트웨어를 열고 염기서열분석 실험을 시작합니다. 베이스콜 링 켜기를 선택합니다. 96개의 멀티플렉스 샘플이 있는 라이브러리의 경우 일반적으로 10-12시간의 염기서열분석으로 충분한 데이터를 생성할 수 있습니다.
      알림: 소프트웨어를 사용하여 샘플 시트를 .csv 형식으로 삽입할 수 있습니다. 샘플 시트에는 flow_cell_id, position_id, sample_id, experiment_id, flow_cell_product_code 및 키트 데이터가 필요합니다. 플로우 셀 ID(플로우 셀 측면에 나열됨)가 사용된 키트와 함께 필요합니다. 제안된 프로토콜의 경우 LSK109 키트를 선택해야 합니다.
  4. 염기서열분석 데이터 분석
    1. 압축된 fastq 판독값을 wf-artic 워크플로우41에 삽입합니다. 두 개의 서로 다른 프라이머 체계(ARTIC/V4.1 및 NEB-VarSkip/v1a)를 사용하여 워크플로우를 별도로 실행합니다. 두 ". primertrimmed.rg.sorted.bam" 파일이 각 샘플에 대해 생성됩니다.
    2. "samtools merge" 명령42를 사용하여 BAM 파일을 단일 파일로 병합합니다. 병합된 BAM 파일을 기본 설정을 그대로 두고 Freyja 도구에 삽입하여 상대적 계보 풍부도43을 복구합니다.
    3. FASTA 파일을 만들려면 병합된 BAM 파일을 기본 설정44,45를 사용하여 "samtools mpileup" 및 "ivar" 도구에 삽입합니다. 돌연변이 호출의 경우 FASTA 파일을 Nextclade 도구46,47에 로드합니다.

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Representative Results

표 3에 요약된 결과는 이 기사에 설명된 방법을 사용하여 폐수 및 공기 샘플에서 SARS-CoV-2 RNA를 검출하고 정량화한 예를 보여줍니다. 폐수 샘플은 스페인과 슬로베니아의 폐수 처리장에서 수집되었으며 3번의 반복실험 중 최소 2번에서 Ct가 40 미만이면 양성으로 간주되었으며 Ct의 변동이 5% 미만인 경우 정량화가 유효한 것으로 간주되었습니다. 스페인과 포르투갈에서는 실내 및 실외 공기 샘플을 수집하여 동일한 규칙을 적용했습니다. 연구의 목적이 SARS-CoV-2 RNA를 검출하는 것이지 정량화하는 것이 아니었기 때문에 폐수 샘플의 경우 삼중이 아닌 공기 샘플에 대해 복제본이 사용되었습니다. 또한, RT-qPCR 실행은 사용된 모든 대조군(이 프로토콜에 설명된 대로)이 예상대로 작동하고 mengovirus RNA 대조군에서 유의한 편차가 관찰되지 않은 경우에만 유효한 것으로 간주되었습니다. 이 샘플의 경우 멩고바이러스 회수 효율은 13.7%에서 19.7% 사이였습니다. 억제는 10배 및 100배 추출된 RNA를 희석하고 결과 RT-qPCR 결과를 비교하고 상용 키트를 사용하여 평가했습니다. 각 억제 제어 키트에 대한 지침은 제조업체에서 설명한 대로 따라야 합니다.

폐수 샘플은 삼중 중 1.91%에서 13.98%의 표준 편차를 가졌고 3.05 x 10 3에서 2.83 x 108 유전자 사본/L. 공기 샘플의 범위는 6.17 x 103에서 5.48 x 109 사이였으며 중복 사이의 표준 편차는 0.54%에서 10.95% 사이였습니다. 이는 선행 연구 6,48,49,50에 따른 것이다.

이 프로토콜에 설명된 바와 같이, 샘플은 시퀀싱되었으며 3개의 시퀀싱된 샘플 결과의 예가 표 4 및 그림 1에 요약되어 있습니다. 세 샘플 모두에서 BA.5.x 계통은 Freyja 도구에 의해 가장 널리 퍼진 것으로 지정되었습니다(95.3%, 95.4% 및 99.8%).

Figure 1
그림 1: 선택한 폐수 샘플의 SARS-CoV-2 계통 유병률. 계보는 Freyja 도구를 사용하여 할당되었습니다. 유병률 수치의 요약이 반드시 100%에 도달하는 것은 아니며, 일부 데이터의 품질이 충분하지 않기 때문입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

표 1: RT-qPCR에 의한 SARS-CoV2 정량을 위한 마스터믹스를 준비하기 위해 각각에 추가할 시약 및 부피. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

표 2: 샘플에서 완전한 SARS-CoV-2 게놈을 증폭하기 위해 마스터믹스를 준비하기 위해 각각에 추가할 시약 및 부피. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

표 3: 폐수 및 공기 샘플에서 SARS-CoV-2 RNA의 RT-qPCR 정량 결과 요약. N1 유전자는 정량화에 사용되었고 N2는 확인(양성 또는 음성)에 사용되었습니다. 결과는 copies/L로 표시됩니다. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

표 4: 검출된 돌연변이 및 계통 유병률. 계통은 Freyja 도구를 사용하고 Nextclade를 사용하여 발견된 관심 돌연변이에 따라 할당되었습니다. 각 샘플에 대한 게놈 커버리지가 표시됩니다. 유병률 수치의 요약이 반드시 100%에 도달하는 것은 아니며, 일부 데이터의 품질이 충분하지 않기 때문입니다. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

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Discussion

(RT-)qPCR 방법을 사용한 미생물 및 바이러스 검출 및 정량화는 뛰어난 감도로 인해 널리 수용되고 있습니다. 그러나 이러한 기술은 환경 샘플을 분석할 때 많은 어려움에 직면합니다. 폐수 샘플에는 측정을 왜곡하고 오해의 소지가 있는 결과를 생성할 수 있는 억제 물질이 많이 포함되어 있습니다. 이러한 한계를 극복하고 정밀도를 높이기 위해 복잡한 프로토콜이 고안, 설계 및 구현되었습니다. 이 프로토콜은 과학 문헌의 프로토콜을 결합하고 공정의 각 단계에서 일련의 엄격한 제어를 통합하여 qPCR 방법에 내재된 제한 사항을 구체적으로 해결함으로써 맞춤화되었습니다. 이러한 엄격한 품질 관리 조치를 통합함으로써 이 프로토콜은 복잡한 환경 시료51,52에서 qPCR 기반 검출 및 정량화 방법이 직면한 문제에 대한 강력한 솔루션을 제공합니다. 분리의 음성 제어(NCI) 및 비템플릿 제어(NTC)는 RNA 추출 및 RT-qPCR 반응 중 오염 가능성을 평가하는 데 필수적인 도구입니다. 또한, 멩고바이러스 제어 RNA의 통합은 복잡한 환경 시료에 존재하는 약제의 억제 효과뿐만 아니라 시료 간 변동성을 평가하는 중요한 수단을 제공합니다. 모든 RT-qPCR 반응에서 증폭 과정의 효과를 확인하기 위해 양성 대조군이 포함되어야 합니다. 샘플의 보관 및 처리 시간을 포함하여 프로토콜의 각 단계를 주의 깊게 모니터링하는 것이 중요합니다. 시료의 분해는 온도와 폐수의 복잡한 조성에 의해 영향을 받을 수 있으므로 시료를 4°C의 온도에서 보관하고 24시간 이내에 처리하는 것이 필수적입니다. 이러한 엄격한 품질 관리 조치를 준수함으로써 연구원과 공중 보건 종사자는 환경 샘플을 자신 있고 정확하게 분석하여 미생물 및 바이러스 집단에 대한 중요한 통찰력을 발견하고 환경 요인이 인체 건강에 미치는 영향을 더 잘 이해할 수 있습니다48.

SARS-CoV-2 검출을 위한 RNA 표적의 선택은 RT-qPCR 분석의 민감도에 영향을 미칠 수 있는 중요한 요소입니다. 이 연구에서 저자는 RdRp, E, N1 및 N2 표적을 평가했으며 RdRp 및 E 분석이 N1 및 N2 분석보다 민감도가 낮다는 것을 발견했으며 이는 이전 연구53과 일치합니다. N1 및 N2 분석은 이중 소광제 프로브를 사용하며, 이는 (RT-)qPCR 분석에서 감도를 향상시키는 것으로 나타났습니다54. 이러한 이유로 인해 매우 낮은 농도가 발견될 때 의심을 없애기 위해 N1을 정량화에 사용하고 N2를 RNA 존재 확인에 사용하기로 결정했습니다. RT-qPCR 표적 간에 관찰된 불일치는 이전에36개로 보고되었습니다.

여러 연구에서 유사한 프로토콜을 사용했으며 진행 중인 COVID-19 팬데믹기간 동안 폐수에서 SARS-CoV-2 RNA의 성공적인 검출 및 정량화를 보고했습니다 6,48,49,55,56. 보고된 SARS-CoV-2 RNA 농도는 이 연구 및 프로토콜 48,50,55에서 보고된 농도와 일치합니다. 이러한 연구 중 일부는 RT-qPCR 표적 유전자, 특히 N1및 N2 6,36,49,50,55,57,58,59의 활성 사례와 농도 사이의 관계를 탐구했습니다. 얻어진 유전자 농도의 변동성을 줄이기 위해, 초기 바이러스 부하(36)를 얻기 위해 실험 농도에 샘플링 시의 유속을 곱하는 것이 제안되었다. 이 접근 방식은 폐수60의 COVID-19에 대한 국가 모니터링 시스템인 스페인의 VATar COVID-19 프로젝트에 통합되었습니다.

COVID-19 폐수 기반 역학(WBE) 연구의 다음 단계로, 연구원들은 폐수에서 SARS-CoV-2 돌연변이를 검출하여 지역 사회 내에서 우려되는 변이의 순환을 추정하려고 시도했습니다. 이전 연구에서는 폐수에서 확인된 변이와 동시에 모집단에 존재하는 변이 사이에 강한 상관관계가 있음을 보여주었습니다. 이러한 결과는 폐수 기반 모니터링이 SARS-CoV-2 변종61,62의 확산을 추적하는 데 유용한 도구가 될 수 있음을 시사합니다. WBE는 SARS-CoV-2 모니터링에서 큰 가능성을 보여주었으며 전염병에 대한 미래 감시 전략을 개발하는 데 사용할 수 있습니다. 이 접근 방식은 개별 검사가 제한적이고 많은 사례가 무증상일 수 있는 팬데믹 초기 단계에서 특히 유용하며 임상 감시에 대한 보완 전략이 있습니다. 따라서 WBE는 다른 더 비싼 감시 전략을 감당할 수 없는 경제적 능력이 낮은 곳에서 특히 유용할 수 있습니다. 설명된 방법은 향후 모니터링과 관련될 수 있는 다른 바이러스에 쉽게 적용할 수 있습니다.

실내 및 실외 환경에서의 공기 샘플링 결과는 SARS-CoV-2 RNA가 실외 환경에서 더 낮은 농도로 존재하지만 두 환경 모두에 존재한다는 것을 보여주었습니다 38,63,64. 이러한 결과는 먹고, 마시고, 음악 축제에 참석하는 것과 같이 마스크 착용과 사회적 거리두기를 유지하기 어려운 활동과 노출이 COVID-19 전염 위험을 더 높일 수 있음을 시사합니다. 이러한 위험을 완화하기 위해서는 특히 델타(B.1.617.2) 및 오미크론(B.1.1.529) 변종과 같이 전염성이 더 높은 새로운 우려 변이의 출현에 따라 적절한 환기 조치와 마스크 사용을 고려하는 것이 중요합니다. 많은 지역에서 COVID-19 제한이 해제됨에 따라 SARS-CoV-2의 지역 사회 전파를 최소화하고 질병의 향후 발병을 예방하기 위해 마스크 사용을 유지하는 것이 좋습니다 5,21,26,65.

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Disclosures

저자는 경제적 이익 또는 기타 이해 상충이 없습니다.

Acknowledgments

이 작업은 Castilla y Leon 지방 정부와 FEDER 프로그램 (프로젝트 CLU 2017-09, UIC315 및 VA266P20)의 재정 지원으로 수행되었습니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Adapter+A25+A2:D19+A2:D20+A2+A2:D19 Oxford Nanopore EXP-AMII001 Sequencing
AllPrep PowerViral DNA/RNA Kit Qiagen 28000-50 RNA extraction kit
AMPure XP Beckman Coulter A63880 PCR Purification, NGS Clean-up, PCR clean-up
ARTIC SARS-CoV-2 Amplicon Panel IDT 10011442 SARS-CoV-2 genome amplification
Blunt/TA Ligase Master Mix NEB M0367S Library preparation
CENTRICON PLUS­70 10KDA. Fisher Scientific 10296062 Concentration filters
CORIOLIS COMPACT AIR SAMPLER Bertin Technologies 083-DU001 Air sampler
Duran laboratory bottles Merck Z305200-10EA Sampling Bottles
Flow Cell (R9.4.1) Oxford Nanopore FLO-MIN106D Sequencing
General labarotory consumables (tubes, qPCR plates, etc)
Ligation Sequencing Kit Oxford Nanopore SQK-LSK109 Sequencing
LunaScript RT SuperMix Kit NEB E3010  cDNA synthesis
Mengovirus extraction control Kit Biomérieux KMG Concentration control
Nalgene General Long-Term Storage Cryogenic Tubes Thermofisher 5011-0012 Sample storage
Native Barcoding Expansion 1-12 (PCR-free Oxford Nanopore EXP-NBD104 Barcoding
NEBNext Ultra II End Repair/dA-Tailing Module NEB E7595 DNA repair
NEBNext VarSkip Short SARS-CoV-2 Primer Mixes NEB E7658 SARS-CoV-2 genome amplification
NEBNext Quick Ligation Reaction Buffer NEB B6058S Sequencing 
Phosphate buffered saline Merck P4474 Collection buffer
Phosphate-buffered saline (PBS, 1X), sterile-filtered Thermofisher J61196.AP Elution of air samples
Q5 Hot Start High-Fidelity 2X Master Mix NEB M0494S hot start DNA polymerase
Qubit RNA HS Assay Kit Thermofisher Q32852 RNA quantitation
SARS-CoV-2 RUO qPCR Primer & Probe Kit IDT 10006713 Primer-Probe mix and qPCR positive control
TaqPath 1-Step RT-qPCR Master Mix Thermofisher A15299 RT-qPCR kit

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