Summary
该协议详细介绍了CLON-G的制备，以将中性粒细胞寿命延长至5天以上，并为使用流式细胞术和共聚焦荧光显微镜评估中性粒细胞死亡提供了可靠的程序。
Abstract
中性粒细胞的平均寿命小于24 h，限制了中性粒细胞的基础研究和中性粒细胞研究的应用。我们之前的研究表明，多种途径可以介导中性粒细胞的自发死亡。通过同时靶向这些途径，半胱天冬酶-溶酶体膜透化-氧化剂-坏死性凋亡抑制加粒细胞集落刺激因子（CLON-G）开发了鸡尾酒，可将中性粒细胞寿命延长至5天以上，而不会显着损害中性粒细胞功能。同时，还制定了用于评估和评估中性粒细胞死亡的可靠且稳定的方案。在这项工作中，我们表明CLON-G可以在 体外 将中性粒细胞寿命延长至5天以上，并且我们展示了FACS和共聚焦荧光显微镜延长中性粒细胞寿命。本报告介绍了CLON-G的制备程序，并展示了中性粒细胞的 体外 自发死亡测定，可用于中性粒细胞的研究和随后的中性粒细胞死亡，从而为中性粒细胞群落提供可靠的资源。
Introduction
已知中性粒细胞包括丰富的细胞质颗粒、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸 （NADPH） 氧化酶、抗菌酶和各种抵御入侵微生物的细胞器;此外，它们是高度运动的，并且是第一个募集到炎症部位的细胞，这意味着中性粒细胞是先天免疫系统的第一道防线1，2。因此，粒细胞输血疗法已成为中性粒细胞减少相关感染的有前途的临床治疗方法，可暂时增强中性粒细胞免疫力3，4，5。最近的发现清楚地表明，中性粒细胞在许多生理病理情况下也起着多面效应器的作用6。中性粒细胞的平均寿命小于24小时，因此，由于与稳定的遗传操作和长期储存相关的限制，中性粒细胞的基础研究和中性粒细胞研究的应用非常困难7，8，9，10，11.有一些细胞系可以部分展示一些中性粒细胞功能，如HL-60，PLB-985，NB4，Kasumi-1和诱导多能干细胞12。这些细胞系可以实现有效的基因编辑和冷冻保存;然而，它们仍然与原发性中性粒细胞有很大不同，因此不能忠实地概括中性粒细胞的功能13。因此，该领域的大多数研究仍然依赖于新鲜分离的原发性中性粒细胞。该领域仍然依赖于生成昂贵且耗时的条件敲除小鼠来研究中性粒细胞中的特定基因功能，但目前还没有人类模型存在。
在努力探索中性粒细胞死亡所涉及的异质过程以及调节这些过程的多种途径14，15之后，最近报道了一种名为CLON-G（半胱天冬酶-溶酶体膜透化-氧化剂-坏死性凋亡抑制加粒细胞集落刺激因子）的新疗法16.CLON-G 由 Q-VD-oph （喹啉基戊酰基-O-甲基天冬氨酸-[-2，6-二氟苯氧基]-甲基酮）、Hsp70（热休克蛋白 70）、DFO（去铁胺）、NAC（N-乙酰半胱氨酸）、Nec-1（坏死抑素-1）和 G-CSF（粒细胞集落刺激因子）组成。中性粒细胞自发性死亡由多种途径介导，包括细胞凋亡、坏死性凋亡和焦亡。Q-VD-oph 通过靶向半胱天冬酶 1、半胱天冬酶 3、半胱天冬酶 8 和半胱天冬酶 917 来抑制中性粒细胞作为泛半胱天冬酶抑制剂的凋亡。中性粒细胞坏死性凋亡依赖于涉及受体相互作用蛋白激酶-1 （RIPK1） 和混合谱系激酶结构域样蛋白 （MLKL） 的信号通路18。作为RIPK1抑制剂，Nec-1抑制中性粒细胞的坏死性凋亡。Hsp70和DFO可抑制溶酶体膜透化（LMP），诱导中性粒细胞凋亡19和焦亡20。活性氧（ROS）通过介导LMP19和细胞凋亡21以及抑制生存信号22，在中性粒细胞死亡中起重要作用。作为一种可以减少ROS积累的抗氧化剂，NAC延缓中性粒细胞死亡。作为一种生长因子，G-CSF激活中性粒细胞存活信号并抑制钙蛋白酶诱导的细胞凋亡23，24。通过同时靶向多个中性粒细胞自发死亡途径，中性粒细胞寿命可以有效地延长到5天以上，而不会影响其功能。CLON-G治疗扩大了中性粒细胞保存、运输和基因操作的可能性，可以加速中性粒细胞群落的研究。同时，基于中性粒细胞死亡的知识，目前批准的细胞死亡测定方案可能会对中性粒细胞14造成意外损害，因此这些方案已被改进为更适合中性粒细胞研究。本报告提供了使用 CLON-G 培养中性粒细胞的详细方案，以及使用流式细胞术和荧光成像对小鼠中性粒细胞进行体外细胞死亡测定。CLON-G对小鼠和人中性粒细胞均有效;但是，此处演示了鼠标示例以简化此协议。NAC的浓度对于小鼠中性粒细胞为1mM，对于人中性粒细胞为10μM。Hsp70具有物种特异性，因此应根据中性粒细胞的来源使用。对于该方案，中性粒细胞是否从外周血或骨髓中分离以及如何分离并不重要。
在本研究中，从小鼠骨髓中分离中性粒细胞以获得足够的中性粒细胞用于实验，因为可以从骨髓中获得约1 x 10 7-1.5 x 10 7中性粒细胞，而只能从单个8-12周龄C57BL / 6小鼠（任何性别）的外周血中分离出1 x 106个中性粒细胞。进行梯度离心以避免FACS分选或MACS分选的机械刺激可能造成的损坏和激活。
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Protocol
波士顿儿童医院和实验血液学国家重点实验室（SKLEH）动物护理和使用委员会批准并监督了所有程序。 图1 描述了用CLON-G培养中性粒细胞和 体外 死亡测定的流程图。
1. 使用克隆-G 延长中性粒细胞寿命
注意：所有提到的操作和材料必须是无菌的。确保所有溶液充分混合并均匀分布。
- 保存 CLON-G 组件
- 通过加入 973.7 μL 二甲基亚砜 （DMSO） 将 50 mg Q-VD-oph（参见 材料表）溶解至 100 mM 的终浓度，并移液直至混合物变得澄清。每管等分试样50μL，并在-20°C下保存。
注意：DMSO是一种有害的化学液体。穿上实验室外套、护目镜和口罩，以避免皮肤接触、眼神接触和吸入。 - 在4°C下解冻Hsp70（见 材料表），并旋转小瓶中的内容物。将每管1μL的Hsp70分装在冰上，并在-80°C下保存。
注意：Hsp70是一种蛋白质;超冷存储对于保持其稳定是必要的。避免冻融循环。 - 用 7.61 mL RPMI 1640 溶解 1 mg DFO（参见 材料表），以获得 200 μM 的储备液。 每管等分试样 500 μL，并在 −20 °C 下保存。
- 将 0.1 g NAC（参见 材料表）与 2.5 mL RPMI 1640 溶解在 15 mL 离心管中，并用 NaOH 将 pH 值调节至 7-7.4。将 RPMI 1640 加入最终体积为 3.06 mL，制成 200 mM NAC 储备液。用0.2μm过滤单元过滤。每管等分试样500μL，并在-20°C下保存。
注意：在这种高浓度下溶解NAC并不容易，涡旋可以帮助溶解它。RPMI 1640中的酚红是pH值的完美指示;当NAC刚刚溶解时，颜色是淡黄色的;调整它，直到它变成粉红色。NAC储备溶液在-20°C下可稳定保存长达1个月。 - 用 1.8 mL DMSO 将 10 mg Nec-1s（参见 材料表）溶解至 20 mM，并移液混合物直至其变得澄清。每管等分试样50μL，并在-20°C下保存。 避光。
- 用 1.25 mL RPMI 1640 溶解 250 μg G-CSF（参见 材料表）至 200 μg/mL。每管等分50μL，并在4°C下保存。
- 通过加入 973.7 μL 二甲基亚砜 （DMSO） 将 50 mg Q-VD-oph（参见 材料表）溶解至 100 mM 的终浓度，并移液直至混合物变得澄清。每管等分试样50μL，并在-20°C下保存。
- 制备2x CLON-G培养基
- 准备基本介质。向 50 mL 试管中加入 39.5 mL RPMI 1640、10 mL 胎牛血清 （FBS） 和 0.5 mL 笔链球菌（抗生素），制成含有 20% FBS 和 1% PS 作为碱性培养基的 RPMI 1640。
注意：这种高浓度的FBS用于延长中性粒细胞的培养时间，可能大于5天。如果培养时间为1-2天，10%-15%FBS就足够了。 - 在冰上解冻CLON-G组分的所有储备溶液。
- 加入 606 μL 碱性培养基，将 1 μL Hsp70 稀释至 20 μM。加入 9 μL 碱性培养基，将 1 μL 的 200 μg/mL G-CSF 稀释至 20 μg/mL。
- 将 976 μL 碱性培养基加入 15 mL 离心管中。加入 1 μL Q-VD-oph （100 mM）、10 μL DFO （200 μM）、1 μL Hsp70 （20 μM）、10 μL NAC （200 mM）、1 μL Nec-1 （20 mM） 和 1 μL G-CSF （20 μg/ mL），制成 1 mL 2x CLON-G 培养基。
注意：2x CLON-G培养基应在制备后立即使用。可以将2x CLON-G暂时储存在4°C。 剩余的 20 μM Hsp70 必须丢弃。
- 准备基本介质。向 50 mL 试管中加入 39.5 mL RPMI 1640、10 mL 胎牛血清 （FBS） 和 0.5 mL 笔链球菌（抗生素），制成含有 20% FBS 和 1% PS 作为碱性培养基的 RPMI 1640。
- 中性粒细胞培养
- 按照先前的报告25通过梯度离心分离小鼠中性粒细胞。将分离的小鼠中性粒细胞重悬于碱性培养基（100万个细胞/ 100μL）。
注意：避免通过轻轻处理来激活中性粒细胞。在整个过程中避免起泡。 - 将 500 μL 2x CLON-G 培养基、400 μL 碱性培养基和 100 μL 细胞悬液加入 24 孔非组织培养板（参见 材料表），轻轻移液 3 至 4 次。
注意：2x CLON-G培养基中高浓度的成分可能会损害中性粒细胞;避免在没有基本介质的情况下将它们加在一起。非组织培养培养板是避免中性粒细胞粘附所必需的。 - 将培养板顺利放入37°C和5%CO2 培养箱中。
注意：无需在7天内更换细胞培养基。CLON-G组合物的最终浓度为50μM Q-VD-OPH，1μM DFO，10 pM Hsp70，1 mM NAC，10μM Nec-1 s和10 ng / mL g-CSF。 - 用Wright Gimsa化合物染色剂对培养的中性粒细胞进行染色（参见材料表），并用光学显微镜进行分析（图2A-D）。或者，用APC-CD11b和PE-Cy7-Ly6G抗体染色，并用流式细胞术（图2E-I）分析，如前所述26。
- 按照先前的报告25通过梯度离心分离小鼠中性粒细胞。将分离的小鼠中性粒细胞重悬于碱性培养基（100万个细胞/ 100μL）。
2.中性粒细胞体 外 自发死亡试验
- 流式细胞术分析
- 在37°C和5%CO2的碱性培养基中以100万个细胞/ mL的密度培养分离的中性粒细胞。24孔培养板是非组织培养的。每孔加入 1 mL 细胞培养基。
- 将 1 g CaCl 2 与 45 mL 盐水溶解，制成 200 mM CaCl2。用0.2μm过滤单元过滤。保存在4°C。
- 准备染色混合物。将每个样品 7 μL 盐水添加到 1.5 mL 管中，并加入 0.4 mg/mL FITC-膜联蛋白-V、0.5 mg/mL 碘化丙啶 （PI） 和 200 mM CaCl2 溶液，每个样品各加入 1 μL。混合均匀。制备后立即使用溶液。
- 轻轻移液细胞培养基五到七次以充分混合，然后在所需时间点将 100 μL 转移到流式细胞术管中。
注意：在整个过程中避免起泡。 - 涡旋计数珠（见 材料表）以充分混合它们。将10 μL充分混合的计数珠移液到与步骤2.1.4相同的流式细胞术管中。
- 将 10 μL 制备的染色混合物（步骤 2.1.3）加入流式细胞术管中。在室温下避光孵育5分钟。
- 向管中加入 100 μL 生理盐水，并充分混合以确保计数珠和细胞的均匀分布。
- 对细胞培养基进行流式细胞术分析。以~400个事件/秒的低速率收集细胞。将APC-PE-Cy7-细胞门控至FSC-A和SSC-A，并将具有培养基FSC-A和SSC-A位置的完整细胞门禁至FITC-膜联蛋白-V和PE-PI;膜联蛋白-V−PI− 群体被归类为健康细胞。
注意：以下公式确定每个样品的健康细胞总数和中性粒细胞的活力：
每个样品的健康细胞总数27 = （1，000/计数磁珠数） ×膜联蛋白-V−PI− 群体数 × 10
中性粒细胞活力=指定时间的健康细胞总数/零时间的健康细胞总数
- 荧光图像测定
- 在37°C的碱性培养基中以100万个细胞/ mL的密度培养分离的中性粒细胞，在共聚焦板中以5%CO2 的密度培养分离的中性粒细胞，每板2mL细胞培养基。
注意：共聚焦荧光显微镜具有最佳的图像质量，但任何具有488/561 / DIC通道的荧光显微镜都足以支持此实验。 - 在指定的时间点轻轻取出板。将 0.4 mg/mL FITC-膜联蛋白-V、0.5 mg/mL PI 和 200 mM CaCl2 各 10 μL 均匀加入培养皿中。在室温下染色5分钟。
注意：在整个过程中避免晃动。均匀而温和地添加染色剂。 - 使用带有20倍物镜的共聚焦荧光显微镜在488（膜联蛋白-V）/ 561（PI）/ DIC通道处捕获荧光图像（参见 材料表）。将 488 通道的曝光时间设置为 500 毫秒，将 561 通道设置为 200 毫秒，将 DIC 通道设置为 100 毫秒。为每个板选择 5-10 个随机区域。细胞类型在我们之前发表的报告14 中定义。
- 在37°C的碱性培养基中以100万个细胞/ mL的密度培养分离的中性粒细胞，在共聚焦板中以5%CO2 的密度培养分离的中性粒细胞，每板2mL细胞培养基。
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Representative Results
CLON-G处理的中性粒细胞的Wright-Giemsa染色形态（图2A-D）和FACS表型（图2E-J）不受影响。基于流式细胞术分析（图3）和荧光图像测定（图4），CLON-G处理的中性粒细胞在24小时内的活力约为90%+。存活率较低可能是由于储存不当、CLON-G 组分浓度不当或起始分离中性粒细胞质量差。用碱性培养基培养24小时的未处理中性粒细胞的流式细胞术分析显示，这些中性粒细胞具有膜联蛋白-V阳性群体（图3B）。该群体的损失可能是由于细胞培养基中的乙二胺四乙酸（EDTA）。用碱性培养基培养24小时的中性粒细胞的荧光图像应包含膨化细胞（图4A中的白色箭头）。膨化细胞的损失可能是由于共聚焦板的摇晃或移液引起的。
图1：用CLON-G培养中性粒细胞和 体外 死亡测定的流程图。 请点击此处查看此图的大图。
图2：CLON-G处理的小鼠中性粒细胞的形态和细胞表面标志物表型。培养后用Wright-Giimsa化合物染色剂对细胞进行（A-D）染色，并使用40倍物镜通过显微镜进行评估，或用APC-CD11b和PE-Cy7-Ly6G抗体染色（E-I）并用流式细胞术分析。（J）统计分析指定时间点CD11b+和Ly6G +细胞的比例。比例尺为 10 μm。数据作为三个实验的SD平均值表示±。ns = 与相应组相比没有统计学上的显著差异。请点击此处查看此图的大图。
图3：CLON-G处理的小鼠骨髓中性 粒细胞的流式细胞术分析。 （A）设门策略，（B）代表性结果，以及（C）培养24小时后中性粒细胞的活力。数据作为三个实验的SD平均值表示±。**与 相应组相比，P < 0.001。 请点击此处查看此图的大图。
图4：基于荧光图像测定的中性粒细胞死亡的代表性结果。 用（A）碱性培养基培养24小时或CLON-G培养（B）24小时，（C）3天或（D）5天后中性粒细胞死亡。培养后，用FITC-膜联蛋白-V（绿色）和PI（红色）对细胞进行染色，并通过共聚焦荧光显微镜进行评估。比例尺为 40 μm。 请点击此处查看此图的大图。
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Discussion
中性粒细胞在先天性和适应性免疫中起着至关重要的作用，它们的稳态受到严格调节。中性粒细胞是人外周血中最丰富的白细胞，它们具有强大而快速的周转。一个健康的成年人每天可以从骨髓中释放1 x 109个中性粒细胞/kg28。因此，中性粒细胞的死亡已成为该领域令人费解的谜团之一，并且已经投入了很多努力来更好地理解它们。半胱天冬酶29，30，31，32，LMP 33，ROS21，22，33，坏死34，35，36，37和坏死性硬化18，38已被证明参与这些异质过程。GM-CSF 24和G-CSF23可以将中性粒细胞寿命延长至约24小时，并具有抑制功能。CLON-G靶向所有已知的中性粒细胞自发死亡机制。据我们所知，CLON-G目前在体外提供了最长的中性粒细胞寿命伸长率，而不会影响功能。
为了从CLON-G中性粒细胞培养中获得最佳结果，必须考虑几个注意事项。通过我们之前的药理学筛选16，强调CLON-G组分的准确浓度是成功的关键，因此，应尽量避免在制备过程中犯任何错误并妥善保存它们。关于中性粒细胞的操纵和纯化，很容易激活和杀死中性粒细胞;因此，在整个过程中应轻柔对待，并在分离后进行培养。它们对细胞浓度、培养板状况、温度和 pH 值敏感;更改此协议时必须小心。关于 体外 死亡测定，先前的结果表明，自发死亡的中性粒细胞膨胀为无法忍受机械力的膨化细胞;旋转、移液和洗涤将减少中性粒细胞的数量，并且用CaCl2 溶液替换标准结合缓冲液可以简化此过程并确保准确描述中性粒细胞14。同一实验中的技术重复之间的差异可能是由于操作过程中的发泡造成的。独立实验之间的差异可能是由于中性粒细胞纯度和新鲜度的变化39。
CLON-G结合了已知的途径和相应的抑制化学物质，以防止自发性中性粒细胞死亡。然而，该领域的核心问题仍然是介导中性粒细胞死亡的复杂途径，因为这些途径仍未完全了解。CLON-G处理的中性粒细胞的死亡是不可避免的。因此，CLON-G仍有改进的余地。至于CLON-G的成分，最好的选择是临床应用的药物，以扩大CLON-G处理的中性粒细胞临床应用的可能性;然而，Q-VD-oph和Rec-1仅用于研究，目前尚无针对它们的临床试验。因此，替代化合物对于临床应用是必要的。
通过将中性粒细胞寿命延长至5天以上，其功能完好无损，CLON-G可以为中性粒细胞研究解锁无限的可能性。通过这个扩展窗口，可以基于CLON-G开发观察，基因操作，长期储存，运输和冷冻保存。劳动力、时间和金钱成本将大幅降低，这将降低新研究人员的进入门槛。CLON-G还可以促进中性粒细胞临床应用，如粒细胞输血治疗。化疗后的中性粒细胞减少感染是癌症和造血恶性肿瘤患者死亡的主要原因40，41，42，43，44。粒细胞输血疗法作为帮助这些患者的替代疗法具有巨大潜力，但受到中性粒细胞寿命短的严重限制45。目前粒细胞输注的工艺流程比中性粒细胞的寿命更长，导致输注的中性粒细胞失去其作为一线免疫细胞的有效性。CLON-G治疗为准备粒细胞输注提供了足够的时间，这有可能挽救无数中性粒细胞减少感染患者的生命，并有助于减轻抗生素的过度使用。同时，本方案中性粒细胞死亡测定方案可以准确证明中性粒细胞的状态，提高实验结果的可复制性。
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Disclosures
作者声明，这项研究是在没有任何利益冲突的情况下进行的。
Acknowledgments
本项目得到了细胞生态系统创新基金海河实验室（22HHXBSS00036，22HHXBSS00019）、中国医学科学院医学科学创新基金（2021-I2M-1-040，2022-I2M-JB-015）、北京协和医学院中央高校专项研究基金（3332022062）和四川省科技支撑计划（编号：2021YJ0480）的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 µm syringe filter | Pall Corporation | 4612 | Filtrate prepared CLON-G components. |
| 1.5 mL micro centrifuge tube | LABSELECT | MCT-001-150 | Lab consumable. |
| 15 mL Centrifuge Tubes | LABSELECT | CT-002-15 | Lab consumable. |
| 24 well cell culture plate | Falcon | 351147 | Neutrophil culture plate. |
| 50 mL Centrifuge Tubes | LABSELECT | CT-002-50 | Lab consumable. |
| BD LSRII | BD | Instrument for flow cytometry analysis of neutrophil death. | |
| Calcium chloride (CaCl2) | Sigma Aldrich | C4901 | Assitant of Annexin-V binding to phosphatidylserine. |
| Confocal microscope | Perkinelmer | UltraVIEW VOX | Instrument for fluorescent analysis of neutrophil death. |
| Confocal plate | NEST | 801001-20mm | Lab consumable for fluorescent image assay. |
| Counting beads | Thermo Fisher | C36950 | Quantification in flow cytometry analysis of neutrophil death. |
| DFO | Sigma Aldrich | D9533 | Component of CLON-G. LMP inhibitor. |
| Dimethyl sulfoxide ( DMSO) | Sigma Aldrich | D2650 | Solvent for Q-VD-oph and Nec-1s. |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10099141C | Component of neutrophil culture basic medium. Nutrition supply. |
| FITC-Annexin-V | BD | 51-65874X | Annexin-V can bind to phosphatidylserine of aged cells.This is at FITC channel. |
| Hsp70 | Abcam | ab113187 | Component of CLON-G. LMP inhibitor. |
| NAC | Sigma Aldrich | A9165 | Component of CLON-G. Antioxidant. |
| Nec-1s | EMD Millipore | 852391-15-2 | Component of CLON-G. Necroptosis inhibitor. |
| Penicillin-Streptomycin Solution (PS) | Gibco | 15070063 | Component of neutrophil culture basic medium. Antibiotics to protect cells from bacteria comtamination. |
| Propidium Iodide (PI) | BioLegend | 421301 | For neutrophil death assay. A small fluorescent molecule that binds to DNA but cannot passively traverse into cells that possess an intact plasma membrane. |
| Q-VD-oph | Selleck chem | S7311 | Component of CLON-G. Pan-caspase inhibitor. |
| Recombinant Human Granulocyte Colony-stimulating Factor for Injection (CHO cell)(G-CSF) | Chugai Pharma China | GRANOCYTE | Component of CLON-G. Promote neutrophil survival through Akt pathway. |
| Round-Bottom Polystyrene Tubes | Falcon | 100-0102 | Lab consumable for flow cytometry analysis. |
| RPMI1640 | Gibco | C11875500BT | Component of neutrophil culture basic medium. |
| Saline | LEAGENE | R00641 | Solution for flow cytometry analysis of neutrophil death. |
| Sodium hydroxide (NaOH) | FENG CHUAN | 13-011-00029 | pH adjustion for NAC. |
| Wright-Giemsa Stain Solution | Solarbio | G1020 | Neutrophil cytospin staining. |
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