Summary
Este protocolo detalha a preparação do CLON-G para estender a vida útil dos neutrófilos para mais de 5 dias e fornece um procedimento confiável para avaliar a morte de neutrófilos com citometria de fluxo e microscopia de fluorescência confocal.
Abstract
O tempo médio de vida de um neutrófilo é inferior a 24 horas, o que limita a pesquisa básica sobre neutrófilos e a aplicação de estudos com neutrófilos. Nossa pesquisa anterior indicou que múltiplas vias poderiam mediar a morte espontânea de neutrófilos. Um coquetel foi desenvolvido visando simultaneamente essas vias, caspases-membrana lisossômica permeabilização-oxidante-necroptose inibição mais fator estimulador de colônias de granulócitos (CLON-G), que prolongou a vida útil dos neutrófilos para mais de 5 dias sem comprometer significativamente a função dos neutrófilos. Concomitantemente, um protocolo confiável e estável para avaliação e avaliação da morte de neutrófilos também foi desenvolvido. Neste trabalho, mostramos que o CLON-G pode prolongar a vida útil dos neutrófilos in vitro para mais de 5 dias, e exibimos o prolongamento da vida útil dos neutrófilos com FACS e microscopia de fluorescência confocal. Este relato introduz procedimentos para a preparação de CLON-G e mostra um ensaio in vitro de morte espontânea de neutrófilos, que pode ser usado para o estudo de neutrófilos e para subsequentemente interrogar a morte de neutrófilos, fornecendo assim um recurso confiável para a comunidade de neutrófilos.
Introduction
Os neutrófilos são conhecidos por compreender um arsenal de grânulos citoplasmáticos abundantes, nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato (NADPH) oxidase, enzimas antimicrobianas e várias organelas que defendem contra micróbios invasores; Além disso, são altamente móveis e são as primeiras células recrutadas para o local da inflamação, ou seja, os neutrófilos são a primeira linha de defesa do sistema imune inato 1,2. A terapia de transfusão de granulócitos tornou-se, portanto, um tratamento clínico promissor para infecções relacionadas à neutropenia para aumentar transitoriamente a imunidade neutrofílica 3,4,5. Descobertas recentes têm mostrado claramente que os neutrófilos também funcionam como efetores multifacetados em muitos cenários fisiopatológicos6. O tempo médio de vida de um neutrófilo é inferior a 24 h e, portanto, a pesquisa básica sobre neutrófilos e a aplicação de estudos de neutrófilos são tremendamente difíceis devido às limitações relacionadas à manipulação genética estável e ao armazenamento a longo prazo 7,8,9,10,11 . Existem algumas linhagens celulares que podem apresentar parcialmente algumas funções neutrófilas, como HL-60, PLB-985, NB4, Kasumi-1 e células-tronco pluripotentesinduzidas12. Essas linhagens celulares podem alcançar edição gênica e criopreservação; no entanto, eles ainda diferem imensamente dos neutrófilos primários e, portanto, não podem recapitular fielmente as funções dos neutrófilos13. Assim, a maior parte da pesquisa nesse campo ainda se baseia em neutrófilos primários recém-isolados. O campo ainda depende da geração de camundongos knock-out condicionais caros e demorados para investigar funções gênicas específicas em neutrófilos, mas nenhum modelo humano existe atualmente.
Tendo nos empenhado em explorar os processos heterogêneos envolvidos na morte de neutrófilos e as múltiplas vias que regulam esses processos14,15, um novo tratamento denominado CLON-G (caspases-membrana lisossômica permeabilização-oxidante-inibição da necroptose mais fator estimulador de colônias de granulócitos) foi recentemente relatado 16. O CLON-G consiste em Q-VD-oph (quinolil-valil-O-metilaspartil-[-2,6-difluorofenoxi]-metil cetona), Hsp70 (proteína de choque térmico 70), DFO (deferoxamina), NAC (N-acetilcisteína), Nec-1s (necrostatina-1s) e G-CSF (fator estimulador de colônias de granulócitos). A morte espontânea dos neutrófilos é mediada por múltiplas vias, incluindo apoptose, necroptose e piroptose. A Q-VD-OPH inibe a apoptose de neutrófilos como inibidor da pan-caspase, tendo como alvo a caspase 1, caspase 3, caspase 8 e caspase9 17. A necroptose neutrofílica é dependente de uma via de sinalização envolvendo a proteína quinase-1 de interação com o receptor (RIPK1) e a proteína de domínio semelhante ao domínio da linhagem mista de linhagem quinase (MLKL)18. Como um inibidor de RIPK1, Nec-1s inibem a necroptose de neutrófilos. Hsp70 e DFO podem inibir a permeabilização da membrana lisossômica (LMP), o que poderia induzir apoptose neutrofílica19 e piroptose20. As espécies reativas de oxigênio (EROs) desempenham papéis vitais na morte de neutrófilos, mediando LMP19 e apoptose21 e inibindo sinais de sobrevivência22. Como um antioxidante que pode reduzir o acúmulo de EROs, NAC retarda a morte de neutrófilos. Como fator de crescimento, o G-CSF ativa sinais de sobrevivência de neutrófilos e inibe a apoptose induzida pela calpaína23,24. Ao visar simultaneamente múltiplas vias de morte espontânea de neutrófilos, o tempo de vida dos neutrófilos pode ser efetivamente estendido para mais de 5 dias sem comprometer sua função. O tratamento com CLON-G amplia as possibilidades de preservação, transporte e manipulação gênica de neutrófilos, o que pode acelerar a pesquisa na comunidade de neutrófilos. Enquanto isso, com base no conhecimento da morte de neutrófilos, os protocolos atualmente aprovados para ensaios de morte celular podem causar danos inesperados aos neutrófilos14, de modo que esses protocolos foram refinados para serem mais apropriados para estudos com neutrófilos. Este relatório fornece protocolos detalhados para cultura de neutrófilos com CLON-G e um ensaio in vitro de morte celular de neutrófilos de camundongos usando citometria de fluxo e imagem de fluorescência. O CLON-G é eficaz em neutrófilos humanos e de camundongos; no entanto, as amostras de camundongos são demonstradas aqui para simplificar esse protocolo. A concentração de NAC é de 1 mM para neutrófilos de camundongos e 10 μM para neutrófilos humanos. A Hsp70 é espécie-específica e, portanto, deve ser utilizada de acordo com a fonte do neutrófilo. Para este protocolo, não importa se os neutrófilos são isolados do sangue periférico ou da medula óssea e como são isolados.
Para o presente estudo, os neutrófilos foram isolados da medula óssea de camundongos para obter neutrófilos suficientes para os experimentos, pois cerca de 1 x 10 7-1,5 x 107 neutrófilos podem ser obtidos da medula óssea, enquanto apenas 1 x 10 6 neutrófilos podem ser isolados do sangue periférico de um único camundongo C57BL/6 de 8-12 semanas de idade (de ambos os sexos). A centrifugação por gradiente foi realizada para evitar possíveis danos e ativação a partir da estimulação mecânica da classificação FACS ou MACS.
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Protocol
O Comitê de Cuidados e Uso de Animais do Boston Children's Hospital and State Key Laboratory of Experimental Hematology (SKLEH) aprovou e monitorou todos os procedimentos. A Figura 1 apresenta o fluxograma da cultura de neutrófilos com CLON-G e o ensaio de morte in vitro .
1. Extensão da vida útil dos neutrófilos com CLON-G
NOTA: Todas as operações e materiais mencionados devem ser estéreis. Certifique-se de que todas as soluções estejam bem misturadas e distribuídas uniformemente.
- Preservação dos componentes do CLON-G
- Dissolver 50 mg de Q-VD-oph (ver Tabela de Materiais) para uma concentração final de 100 mM, adicionando 973,7 μL de dimetilsulfóxido (DMSO), e pipetar o líquido até que a mistura fique clara. Alíquota 50 μL por tubo e conservar a -20 °C.
CUIDADO: O DMSO é um líquido químico nocivo. Use jaleco, óculos e máscara para evitar contato com a pele, contato visual e inalação. - Descongelar a Hsp70 (ver Tabela de Materiais) a 4 °C e girar o conteúdo no frasco para injetáveis. Alíquota 1 μL de Hsp70 por tubo sobre gelo e conservar a -80 °C.
NOTA: Hsp70 é uma proteína; O armazenamento ultrafrio é necessário para mantê-lo estável. Evite o ciclo de congelamento-descongelamento. - Dissolver 1 mg de DFO (ver Tabela de Materiais) com 7,61 mL RPMI 1640 para obter um estoque de 200 μM. Alíquota 500 μL por tubo e conservar a -20 °C.
- Dissolver 0,1 g de NAC (ver Tabela de Materiais) com 2,5 mL de RPMI 1640 em um tubo de centrífuga de 15 mL e ajustar o pH para 7-7,4 com NaOH. Adicione RPMI 1640 a um volume final de 3,06 mL para fazer um estoque NAC de 200 mM. Filtre-o com uma unidade de filtragem de 0,2 μm. Alíquota 500 μL por tubo e conserva a -20 °C.
NOTA: Dissolver NAC nesta alta concentração não é fácil, e vórtice pode ajudar a dissolvê-lo. O vermelho de fenol no RPMI 1640 é uma indicação perfeita do pH; quando o NAC é apenas dissolvido, a cor é amarelada; ajustá-lo até que fique rosado. As soluções de estoque NAC são estáveis por até 1 mês a -20 °C. - Dissolver 10 mg de Nec-1s (ver Tabela de Materiais) para 20 mM com 1,8 ml de DMSO e pipetar a mistura até ficar clara. Alíquota 50 μL por tubo e conservar a -20 °C. Proteger da luz.
- Dissolver 250 μg de G-CSF (ver Tabela de Materiais) para 200 μg/mL com 1,25 mL de RPMI 1640. Alíquota 50 μL por tubo e conservar a 4 °C.
- Dissolver 50 mg de Q-VD-oph (ver Tabela de Materiais) para uma concentração final de 100 mM, adicionando 973,7 μL de dimetilsulfóxido (DMSO), e pipetar o líquido até que a mistura fique clara. Alíquota 50 μL por tubo e conservar a -20 °C.
- Preparo de meio de cultura 2x CLON-G
- Prepare o meio básico. Adicionar 39,5 mL de RPMI 1640, 10 mL de soro fetal bovino (SFB) e 0,5 mL de pen-strep (antibióticos) a um tubo de 50 mL para fazer RPMI 1640 com 20% de SFB e 1% de PS como meio básico.
NOTA: Esta alta concentração de FBS é usada para fornecer a cultura prolongada de neutrófilos, que pode ser superior a 5 dias. Se o tempo de cultivo for de 1-2 dias, 10%-15% FBS é suficiente. - Descongele todas as soluções de estoque dos componentes CLON-G no gelo.
- Diluir 1 μL de Hsp70 a 20 μM adicionando 606 μL do meio básico. Diluir 1 μL de 200 μg/mL G-CSF para 20 μg/mL adicionando 9 μL do meio básico.
- Adicionar 976 μL de meio básico a um tubo de centrífuga de 15 mL. Adicionar 1 μL de Q-VD-oph (100 mM), 10 μL de DFO (200 μM), 1 μL de Hsp70 (20 μM), 10 μL de NAC (200 mM), 1 μL de Nec-1s (20 mM) e 1 μL de G-CSF (20 μg/mL) para fazer 1 mL de meio 2x CLON-G.
NOTA: O meio CLON-G 2x deve ser usado imediatamente após o seu preparo. Pode-se armazenar o 2x CLON-G temporariamente a 4 °C. Restos de 20 μM Hsp70 devem ser descartados.
- Prepare o meio básico. Adicionar 39,5 mL de RPMI 1640, 10 mL de soro fetal bovino (SFB) e 0,5 mL de pen-strep (antibióticos) a um tubo de 50 mL para fazer RPMI 1640 com 20% de SFB e 1% de PS como meio básico.
- Cultura de neutrófilos
- Isolar neutrófilos de camundongos por centrifugação por gradiente seguindo relato anterior25. Ressuspender os neutrófilos isolados de camundongos no meio básico (1 milhão de células/100 μL).
NOTA: Evite ativar os neutrófilos manuseando-os suavemente. Evite espuma durante todo o processo. - Adicionar 500 μL de 2x meio CLON-G, 400 μL do meio básico e 100 μL da suspensão celular a placas de cultura não cultivadas em tecidos de 24 poços (ver Tabela de Materiais) e pipetar suavemente três a quatro vezes.
NOTA: Altas concentrações dos componentes no meio 2x CLON-G podem danificar os neutrófilos; evite adicioná-los sem o meio básico. A placa de cultura não cultivada em tecidos é necessária para evitar a adesão de neutrófilos. - Colocar a placa de cultura numa incubadora a 37 °C e a 5 % de CO2 sem problemas.
NOTA: É desnecessário trocar o meio celular dentro de 7 dias. As concentrações finais da composição do CLON-G são 50 μM Q-VD-Oph, 1 μM DFO, 10 pM Hsp70, 1 mM NAC, 10 μM Nec-1 s e 10 ng/mL G-CSF. - Colorir os neutrófilos cultivados com o composto Wright Giemsa (ver Tabela de Materiais) e analisar com microscópio de luz (Figura 2A-D). Alternativamente, corar com os anticorpos APC-CD11b e PE-Cy7-Ly6G e analisar com citometria de fluxo (Figura 2E-I), conforme descrito anteriormente26.
- Isolar neutrófilos de camundongos por centrifugação por gradiente seguindo relato anterior25. Ressuspender os neutrófilos isolados de camundongos no meio básico (1 milhão de células/100 μL).
2. Ensaio in vitro de morte espontânea de neutrófilos
- Análise por citometria de fluxo
- A cultura isolou neutrófilos a uma densidade de 1 milhão de células/mL no meio básico a 37 °C e 5% CO2. A placa de cultura de 24 poços é não cultivada em tecidos. Adicionar 1 mL de meio celular por poço.
- Dissolver 1 g de CaCl 2 com 45 mL de solução salina para produzir 200 mM de CaCl2. Filtre-o com uma unidade de filtragem de 0,2 μm. Conservar a 4 °C.
- Prepare a mistura de coloração. Adicionar 7 μL de solução salina por amostra a um tubo de 1,5 ml e adicionar 0,4 mg/ml de FITC-Anexina-V, 0,5 mg/ml de iodeto de propídio (PI) e 200 mM de solução de CaCl2 a 1 μL cada por amostra. Misture bem. Use a solução imediatamente após a preparação.
- Pipetar suavemente o meio celular cinco a sete vezes para misturar bem, seguido de transferir 100 μL para um tubo de citometria de fluxo nos pontos de tempo desejados.
OBS: Evite espuma durante todo o processo. - Contas de contagem de vórtices (consulte Tabela de Materiais) para misturá-las bem. Pipetar 10 μL das esferas de contagem bem misturadas para o mesmo tubo de citometria de fluxo que no passo 2.1.4.
- Adicionar 10 μL da mistura de coloração preparada (passo 2.1.3) ao tubo de citometria de fluxo. Incubar à temperatura ambiente durante 5 minutos longe da luz.
- Adicione 100 μL de soro fisiológico ao tubo e misture bem para garantir a distribuição uniforme das esferas e células de contagem.
- Realizar análise por citometria de fluxo do meio celular. Colete as células a uma taxa baixa com ~400 eventos/s. Portar as células APC-PE-Cy7- para FSC-A e SSC-A, e portar as células intactas com posições médias FSC-A e SSC-A para o FITC-Annexina-V e PE-PI; a população de Anexina-V−PI− é classificada como células saudáveis.
NOTA: As seguintes equações determinam o número total de células saudáveis por amostra e a viabilidade dos neutrófilos:
Número total de células saudáveis por amostra27 = (1.000/número de contas de contagem) × número de população de Anexina-V−PI− × 10
Viabilidade de neutrófilos = número total de células saudáveis no tempo indicado/número total de células saudáveis no tempo zero
- Ensaio de imagem fluorescente
- A cultura isolou neutrófilos a uma densidade de 1 milhão de células/mL no meio básico a 37 °C e 5% CO 2 em uma placa confocal com2 mL de meio celular por placa.
NOTA: Um microscópio de fluorescência confocal tem a melhor qualidade de imagem, mas qualquer microscópio de fluorescência que tenha canais 488/561/DIC é suficiente para suportar este experimento. - Retire o prato suavemente no momento indicado. Adicionar 10 μL cada de 0,4 mg/mL de FITC-Anexina-V, 0,5 mg/mL IP e 200 mM de CaCl2 à placa uniformemente. Manchar à temperatura ambiente por 5 min.
NOTA: Evite agitar durante todo o processo. Adicione os agentes corantes uniforme e suavemente. - Capturar imagens de fluorescência em 488 (annexin-V)/561 (PI)/canais DIC usando um microscópio confocal de fluorescência com uma lente objetiva de 20x (ver Tabela de Materiais). Defina o tempo de exposição do canal 488 como 500 ms, o canal 561 como 200 ms e o canal DIC como 100 ms. Selecione 5-10 áreas aleatórias para cada placa. Os tipos celulares são definidos em nosso relato publicado anteriormente14.
- A cultura isolou neutrófilos a uma densidade de 1 milhão de células/mL no meio básico a 37 °C e 5% CO 2 em uma placa confocal com2 mL de meio celular por placa.
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Representative Results
A morfologia corada por Wright-Giemsa (Figura 2A-D) e os fenótipos FACS (Figura 2E-J) dos neutrófilos tratados com CLON-G não foram afetados. A viabilidade dos neutrófilos tratados com CLON-G em 24 h foi de cerca de 90%+ com base na análise por citometria de fluxo (Figura 3) e nos ensaios de imagem fluorescente (Figura 4). Menor viabilidade pode resultar de armazenamento inadequado, concentrações inadequadas dos componentes do CLON-G ou má qualidade dos neutrófilos isolados iniciais. A análise por citometria de fluxo dos neutrófilos não tratados que foram cultivados com o meio básico por 24 h mostrou que esses neutrófilos tinham uma população positiva para Anexina V (Figura 3B). A perda dessa população pode ser devida ao ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) no meio celular. As imagens de fluorescência dos neutrófilos cultivados com o meio básico por 24 h devem conter células inchadas (seta branca na Figura 4A). A perda de células inchadas pode resultar da agitação ou pipetagem da placa confocal.
Figura 1: Fluxograma da cultura de neutrófilos com CLON-G e ensaio de morte in vitro. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Morfologia e fenótipos de marcadores de superfície celular dos neutrófilos de camundongos tratados com CLON-G. As células foram coradas (A-D) com o composto Wright-Giemsa após cultura e avaliadas por microscopia com objetiva 40x ou (E-I) coradas com anticorpos APC-CD11b e PE-Cy7-Ly6G e analisadas por citometria de fluxo. (J) As proporções das células CD11b+ e Ly6G+ nos momentos indicados foram analisadas estatisticamente. A barra de escala é de 10 μm. Os dados são apresentados como médias ± DP de três experimentos. ns = não houve diferença estatisticamente significante em relação ao grupo correspondente. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Análise por citometria de fluxo de neutrófilos de medula óssea de camundongos tratados com CLON-G . (A) Estratégia de gateing, (B) resultados representativos e (C) viabilidade dos neutrófilos após cultivo por 24 h. Os dados são apresentados como médias ± DP de três experimentos. **P < 0,001 em relação ao grupo correspondente. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Resultados representativos para morte de neutrófilos com base no ensaio de imagem de fluorescência. Morte de neutrófilos após cultivo com (A) meio básico por 24 h ou CLON-G por (B) 24 h, (C) 3 dias ou (D) 5 dias. Após o cultivo, as células foram coradas com FITC-Anexina-V (Verde) e PI (Vermelho) e avaliadas por microscopia confocal de fluorescência. A barra de escala é de 40 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Os neutrófilos desempenham papéis vitais na imunidade inata e adaptativa, e sua homeostase é fortemente regulada. Os neutrófilos são os leucócitos mais abundantes no sangue periférico humano e têm um turnover robusto e rápido. Um adulto saudável pode liberar 1 x 109 neutrófilos/kg diariamente da medula óssea28. A morte dos neutrófilos tornou-se, portanto, um dos enigmas intrigantes desse campo, e muito esforço tem sido dedicado para melhor compreendê-los. Acredita-se que a caspase 29,30,31,32, a lombovespa 33, a ROS21,22,33, a necrose 34,35,36,37 e a necropotose 18,38 estejam envolvidas nesses processos heterogêneos. GM-CSF 24 e G-CSF23 podem prolongar a vida útil dos neutrófilos para cerca de24h com funções suprimidas. O CLON-G tem como alvo todos os mecanismos conhecidos de morte espontânea de neutrófilos. Até onde sabemos, o CLON-G atualmente proporciona o maior alongamento da vida útil dos neutrófilos in vitro sem comprometer a função.
Várias ressalvas devem ser consideradas para se obter os melhores resultados da cultura de neutrófilos com CLON-G. Através de nossa triagem farmacológica prévia16, foi enfatizado que concentrações precisas dos componentes do CLON-G são fundamentais para o sucesso e, portanto, deve-se tentar evitar erros durante o preparo e preservá-los adequadamente. Em relação à manipulação e purificação dos neutrófilos, é fácil ativar e matar os neutrófilos; portanto, devem ser tratados suavemente durante todo o processo e cultivados uma vez isolados. São sensíveis à concentração celular, à condição da placa de cultura, à temperatura e ao pH; deve-se ter cuidado ao mudar esse protocolo. Com relação ao ensaio de morte in vitro , resultados anteriores demonstraram que neutrófilos espontaneamente mortos incham para células inchadas que são intoleráveis à força mecânica; girar, pipetar e lavar reduziria o número de neutrófilos, e substituir o tampão de ligação padrão por uma solução de CaCl2 pode simplificar esse processo e garantir a representação precisa dos neutrófilos14. Discrepâncias entre as duplicatas técnicas em um mesmo experimento poderiam resultar da formação de espuma durante a operação. Diferenças entre experimentos independentes podem ser devidas a variações na pureza e frescor dos neutrófilos39.
O CLON-G combina vias conhecidas e substâncias químicas inibitórias correspondentes para prevenir a morte espontânea de neutrófilos. No entanto, a questão central desse campo permanece em relação às complicadas vias que mediam a morte de neutrófilos, uma vez que estas ainda não são totalmente compreendidas. A morte dos neutrófilos tratados com CLON-G é inevitável. Assim, o CLON-G ainda tem espaço para melhorias. Quanto aos componentes do CLON-G, as melhores escolhas são fármacos aplicados clinicamente para ampliar a possibilidade de aplicação clínica dos neutrófilos tratados com CLON-G; no entanto, Q-VD-oph e Rec-1s são apenas para pesquisa, e ensaios clínicos com foco neles não estão atualmente disponíveis. Assim, compostos alternativos são necessários para aplicação clínica.
Ao prolongar a vida útil dos neutrófilos para mais de 5 dias com suas funções intactas, o CLON-G pode desbloquear infinitas possibilidades para a pesquisa de neutrófilos. Com essa janela estendida, a observação, a manipulação de genes, o armazenamento a longo prazo, o transporte e a criopreservação podem ser desenvolvidos com base no CLON-G. Os custos de mão-de-obra, tempo e dinheiro seriam reduzidos substancialmente, o que diminuiria as barreiras de entrada para novos pesquisadores. O CLON-G também pode promover aplicações clínicas de neutrófilos, como a terapia de transfusão de granulócitos. A infecção neutropênica pós-quimioterapia é uma das principais causas de morte em pacientes portadores de câncer e neoplasias hematopoéticas 40,41,42,43,44. A terapia transfusional de granulócitos, que tem grande potencial como alternativa terapêutica para auxiliar esses pacientes, é severamente limitada pelo curto tempo de vida dos neutrófilos45. O fluxo atual do processo para transfusão de granulócitos leva mais tempo do que a vida útil de um neutrófilo, levando os neutrófilos transfundidos a perderem sua eficácia como uma célula imune de primeira linha. O tratamento com CLON-G fornece tempo suficiente para a preparação de transfusões de granulócitos, que têm o potencial de salvar inúmeras vidas de pacientes infectados por neutropênicos e ajudar a mitigar o uso excessivo de antibióticos. Ao mesmo tempo, o presente protocolo para o ensaio de morte de neutrófilos pode demonstrar com precisão o estado dos neutrófilos e melhorar a replicabilidade dos resultados experimentais.
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Disclosures
Os autores declaram que a pesquisa foi conduzida na ausência de conflitos de interesse.
Acknowledgments
Este projeto foi apoiado pelo Haihe Laboratory of Cell Ecosystem Innovation Fund (22HHXBSS00036, 22HHXBSS00019), pelo Fundo de Inovação para Ciências Médicas da Academia Chinesa de Ciências Médicas (CAMS) (2021-I2M-1-040,2022-I2M-JB-015), pelo Fundo Especial de Pesquisa para Universidades Centrais, pela Faculdade de Medicina da União de Pequim (3332022062) e pelo Programa de Apoio à Ciência e Tecnologia da Província de Sichuan (NO. 2021YJ0480).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 µm syringe filter | Pall Corporation | 4612 | Filtrate prepared CLON-G components. |
| 1.5 mL micro centrifuge tube | LABSELECT | MCT-001-150 | Lab consumable. |
| 15 mL Centrifuge Tubes | LABSELECT | CT-002-15 | Lab consumable. |
| 24 well cell culture plate | Falcon | 351147 | Neutrophil culture plate. |
| 50 mL Centrifuge Tubes | LABSELECT | CT-002-50 | Lab consumable. |
| BD LSRII | BD | Instrument for flow cytometry analysis of neutrophil death. | |
| Calcium chloride (CaCl2) | Sigma Aldrich | C4901 | Assitant of Annexin-V binding to phosphatidylserine. |
| Confocal microscope | Perkinelmer | UltraVIEW VOX | Instrument for fluorescent analysis of neutrophil death. |
| Confocal plate | NEST | 801001-20mm | Lab consumable for fluorescent image assay. |
| Counting beads | Thermo Fisher | C36950 | Quantification in flow cytometry analysis of neutrophil death. |
| DFO | Sigma Aldrich | D9533 | Component of CLON-G. LMP inhibitor. |
| Dimethyl sulfoxide ( DMSO) | Sigma Aldrich | D2650 | Solvent for Q-VD-oph and Nec-1s. |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10099141C | Component of neutrophil culture basic medium. Nutrition supply. |
| FITC-Annexin-V | BD | 51-65874X | Annexin-V can bind to phosphatidylserine of aged cells.This is at FITC channel. |
| Hsp70 | Abcam | ab113187 | Component of CLON-G. LMP inhibitor. |
| NAC | Sigma Aldrich | A9165 | Component of CLON-G. Antioxidant. |
| Nec-1s | EMD Millipore | 852391-15-2 | Component of CLON-G. Necroptosis inhibitor. |
| Penicillin-Streptomycin Solution (PS) | Gibco | 15070063 | Component of neutrophil culture basic medium. Antibiotics to protect cells from bacteria comtamination. |
| Propidium Iodide (PI) | BioLegend | 421301 | For neutrophil death assay. A small fluorescent molecule that binds to DNA but cannot passively traverse into cells that possess an intact plasma membrane. |
| Q-VD-oph | Selleck chem | S7311 | Component of CLON-G. Pan-caspase inhibitor. |
| Recombinant Human Granulocyte Colony-stimulating Factor for Injection (CHO cell)(G-CSF) | Chugai Pharma China | GRANOCYTE | Component of CLON-G. Promote neutrophil survival through Akt pathway. |
| Round-Bottom Polystyrene Tubes | Falcon | 100-0102 | Lab consumable for flow cytometry analysis. |
| RPMI1640 | Gibco | C11875500BT | Component of neutrophil culture basic medium. |
| Saline | LEAGENE | R00641 | Solution for flow cytometry analysis of neutrophil death. |
| Sodium hydroxide (NaOH) | FENG CHUAN | 13-011-00029 | pH adjustion for NAC. |
| Wright-Giemsa Stain Solution | Solarbio | G1020 | Neutrophil cytospin staining. |
References
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