Trichuris muris infección: un modelo de tipo 2 inmunidad y la inflamación en el intestino

El objetivo general de este procedimiento es establecer y mantener un modelo de infección natural por hain. Los primeros ratones se infectan con huevos de espejos de tra curus por sonda nasogástrica oral. 21 días después, los animales infectados se sacrifican y se extraen sangre mesentérica, ganglios linfáticos, gránulos fecales, colon y buscador.

A partir de estas muestras, se generó la respuesta inmunitaria contra los trucos. Los espejos se pueden analizar. Las muestras de suero pueden ser analizadas por lysa para detectar anticuerpos específicos contra TRA.

reestimulación in vitro de las células de los ganglios linfáticos se puede realizar para analizar las respuestas inmunitarias celulares. Los gránulos fecales de Western blotter se pueden utilizar para la evaluación del contenido de proteínas y el análisis de expresión génica se puede realizar mediante un análisis QPCR del colon. Por último, la punta del ciego se puede utilizar para la histología, mientras que el resto del ciego se puede utilizar para determinar la carga de gusanos en ratones infectados.

En última instancia, se pueden obtener resultados que muestran si un ratón es resistente o susceptible a la infección por trais MOU y se puede caracterizar la respuesta inmunitaria montada contra el parásito. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la inmunología, como qué factores controlan la activación de las células T auxiliares, así como qué proteínas son necesarias para la diferenciación de dos células TH. Los huevos de los MOU de Trauss se pueden propagar en ratones inmunodeficientes o cepas genéticamente susceptibles, como un KR 35 días después de la infección para recolectar huevos de ratones sacrificados.

Exponga la superficie ventral del animal y enjuague el abdomen del ratón con etanol utilizando pinzas y tijeras estériles. Agarre la piel abdominal y haga una pequeña incisión. Exponga el contenido abdominal, identifique el ciego y el colon proximal, y luego retírelos.

Transfiera los órganos a una placa de Petri de 10 centímetros que contenga penicilina y estreptomicina, DMEM suplementado. A continuación, corte el ciego y el colon proximal, exponiendo la luz y los gusanos con fórceps. Coloque los órganos abiertos en un vaso de precipitados que contenga PBS y agite suavemente para lavar las heces.

Una vez que se haya lavado el ciego, transfiéralo a una placa de Petri nueva y use pinzas curvas suaves para sacar suavemente los gusanos. Transfiera todos los gusanos de cada ratón a un pocillo de una placa de seis pocillos que contiene cinco mililitros de DMEM suplementado con antibióticos. Coloque el plato de seis pocillos con una toalla de papel húmeda dentro de un recipiente Tupperware e incube a 37 grados centígrados durante cuatro horas para permitir que los gusanos pongan huevos.

Después de esta incubación, use fórceps para eliminar los gusanos del pocillo original y divídalos en dos nuevos pocillos que contengan DMEM. Dividir los gusanos de esta manera maximizará la recuperación de los huevos con una pipeta. Coseche el medio restante que contiene el antígeno secretado y los huevos del pozo original y transfiéralo a un tubo Falcon de 15 mililitros.

Centrifugar el tubo a 3000 RPM durante cinco minutos. A continuación, retire y guarde el supinato que contiene antígeno de cuatro horas y Reese's doble el huevo que contiene el pellet en agua estéril. Coloque la placa de seis pocillos que contiene gusanos a 37 grados centígrados una vez más y colénela durante la noche a la mañana siguiente.

Después de desechar los gusanos, coseche el contenido de los pozos como se muestra anteriormente y centrifugue el sobrenadante para aislar los huevos. Guarde el sobrenadante que contiene antígeno durante la noche y vuelva a suspender los huevos en agua. Como antes, combine estos huevos con los huevos obtenidos de la incubación de cuatro horas.

Filtra los huevos a través de un colador de 70 micras para eliminar los gusanos sobrantes. Luego transfiéralos a un matraz cuadrado de 75 centímetros. Cubra el matraz con papel de aluminio para protegerlo de la luz y almacene los huevos durante seis semanas a temperatura ambiente.

Esto permitirá que los huevos maduren y se encarguen después de seis semanas. Lavar los huevos y remover nuestra agua y contar los huevos viables. Visto aquí.

Como ejemplo de un huevo embrionado viable y un huevo no viable, Reese's dobla la concentración de Exeter de 50 por 50 microlitros. En este punto, los huevos pueden almacenarse a cuatro grados centígrados antes de infectar a los ratones. Asegúrese de reenviar completamente la solución que contiene huevos.

Transfiera la cantidad deseada de inóculo a un tubo de 14 mililitros e invierta el tubo para mezclar. Extraiga 200 microlitros de huevos en una aguja de alimentación de tamaño adecuado para el tamaño del animal instalada en una jeringa de un mililitro. Frote el pescuezo del ratón y administre los huevos por sonda nasogástrica oral.

Regrese el ratón infectado a su jaula y deje que la infección continúe durante 21 días. Después de 21 días, use una jeringa no heparinizada para recolectar la sangre de los ratones infectados por punción cardíaca. Después de la eutanasia con dióxido de carbono, las muestras de sangre se pueden almacenar a cuatro grados centígrados.

Para el aislamiento sérico y el análisis de IgGs e IgE específicas de tra por Eliza. Exponga la cavidad abdominal del ratón como se describió anteriormente. Luego, use fórceps para extraer el ciego con unas tijeras u otro par de pinzas.

Empuje el intestino delgado hacia la derecha, exponiendo los ganglios linfáticos mesentéricos. Retire suavemente los ganglios linfáticos teniendo cuidado de no cortar los intestinos y colóquelos en un tubo Falcon de 15 mililitros que contenga dos mililitros de medio. Posteriormente, las células de los ganglios linfáticos se pueden extraer in vitro con un sobrenadante de antígeno S de cuatro horas de los cultivos de gusanos para analizar la respuesta inmunitaria celular al parásito.

Una vez que se han extraído los ganglios linfáticos, extirpe el secum y el colon como se describió anteriormente, usando fórceps, libere los gránulos fecales del colon distal, colocándolos en el tubo de oxígeno de dos mililitros Los gránulos se pueden almacenar a menos 20 grados Celsius y analizar el contenido de proteínas mediante Western blot con tijeras. Corta aproximadamente un centímetro de colon proximal y colócalo en un tubo que contenga ARN. Posteriormente almacenar a cuatro grados centígrados.

Corta unos cinco milímetros de la punta del ciego sujetando la punta del ciego con pinzas. Use una jeringa de tres mililitros y una aguja de calibre 22 para enjuagar la muestra con PBS. Luego transfiéralo a un tubo de cinco mililitros de flk y tapón a presión que contenga 4% de paraldehído.

La muestra de ciego fijado en paraldehído puede almacenarse a cuatro grados centígrados y utilizarse para análisis histológicos. Coloca el resto del ciego en una placa de Petri y congélala a menos 20 grados centígrados para matar a los gusanos. Para facilitar la enumeración de los gusanos, descongele el secum y colóquelo en una placa de Petri que contenga unos cinco mililitros de agua con unas tijeras.

Corta el seno para exponer el lumen y agítalo para recoger las heces en un plato. Coloque el líquido limpio en una placa de Petri fresca que contenga agua y use pinzas curvas suaves para raspar las células epiteliales intestinales. Transfiera el secum a una nueva placa de Petri que contenga agua y rompa el tejido en pedazos pequeños.

E Observe las heces, las células epiteliales intestinales y el tejido del ciego bajo un microscopio de disección y enumere los gusanos, eliminándolos a medida que se cuentan y colocándolos en un plato fresco. Así es como deben verse los gusanos en el ciego antes y después del aislamiento, como se muestra aquí. Después de la infección de los espejos del trago, los seis negros son capaces de controlar los parásitos, mientras que los ratones KR desarrollan cargas parasitarias elevadas.

De manera similar, los ratones A KR susceptibles desarrollan títulos de IgG específicos de TRA dos a marcadamente más altos que los ratones negros seis, según lo determinado por Eliza en suero. En este experimento, el análisis de Western blot reveló que la cantidad de beta de la proteína específica de la célula caliciforme aumentó en las heces de los ratones Black Six, pero no en los ratones KR después de la infección. El análisis histológico del ciego distal muestra hiperplasia de células caliciformes y producción de moco en ratones TRAs TRAs negros infecciosos resistentes, pero no en ratones KR susceptibles.

Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo propagar huevos de trismus, infectar ratones experimentales y recolectar los tejidos intestinales, el meso, los ganglios linfáticos entéricos y la sangre para el análisis de infecciones en ratones susceptibles o resistentes.