Bilaminar Co-cultura de neurônios de rato Primária Cortical e Glia

O objetivo deste procedimento é cultivar neurônios primários na presença de uma camada de glia que suporta seu crescimento. Esses neurônios podem ser posteriormente isolados como uma população pura de neurônios para análise. Isso é feito primeiro cultivando as células gliais primárias.

O segundo passo é subcultivar as células gliais em uma superfície, que se oporá aos neurônios cultivados. Em seguida, as camadas de células gliais neuronais são combinadas em um sistema de co-cultura estável. Em última análise, a análise citoquímica mostra o desenvolvimento de uma camada pura de neurônios maduros.

Olá, meu nome é Anna T e sou estudante do laboratório Dr.Olympia Muci na Drexel University. Aqui, demonstraremos como cultivar neurônios corticais na presença de uma camada de alimentação da glia. Esta é uma técnica que foi originalmente desenvolvida por Gary Banker e colegas e aprendida pelo laboratório do Dr. Muci e Richard Miller na Universidade de Chicago, que adaptamos às nossas necessidades experimentais.

A principal vantagem desta técnica sobre a cultura neuronal pura é que os fatores troféu liberados pela glia apoiam o crescimento e a diferenciação neuronal. Enquanto os neurônios podem ser isolados posteriormente como uma população pura. Para se preparar para a dissecação, coloque as ferramentas estéreis em etanol a 70%, adicione quatro mililitros de dissecção a frio, pratos médios a 60 milímetros e, em seguida, descongele 2,5% de viagens e DNAs no gelo.

Depois de decapitar os filhotes de dois a quatro dias, coloque as cabeças em um prato estéril de 100 milímetros para cada cabeça. Faça um corte na linha média da pele e puxe a pele para trás para expor o crânio. Em seguida, use uma tesoura curva para fazer um corte na linha média e dois cortes laterais no crânio sem danificar o tecido cerebral por baixo.

Em seguida, remova a parte superior do crânio para expor o cérebro, extraia o cérebro e coloque-o no prato de 60 milímetros com quatro mililitros de dissecção a frio, meio preparado anteriormente em um microscópio estéreo. Separe os hemisférios, remova o mesencéfalo e retire as meninges. Colete todos os córtices cerebrais dissecados em um novo prato de 60 milímetros com meio de dissecção a frio fresco.

Em seguida, pique o tecido com uma tesoura curva. Em seguida, transfira o tecido picado para um tubo estéril de 15 mililitros. Traga o volume para 4,5 mililitros com meio de dissecção a frio e adicione 500 microlitros de 2,5% de viagens.

Em seguida, enrole o tubo em filme paralímpico e coloque-o em banho-maria a 37 graus Celsius por 15 minutos. Enquanto isso, misture invertendo o tubo a cada cinco minutos. Em seguida, transfira o tecido para um novo tubo de 15 mililitros e tente minimizar o meio de dissecção contendo tripsia que está sendo transferido para o tubo.

Agora traga o volume final para 4,8 mililitros com meio de dissecção fresco e adicione 200 microlitros de DNAs a uma concentração final de 60 microgramas por mililitro. Em seguida, triture suavemente com uma pipeta estéril de cinco mililitros cerca de 20 vezes e adicione 10 mililitros de meio glioplating. Aguarde de quatro a cinco minutos para que os grandes pedaços de tecido se depositem no fundo.

Depois disso, transfira os 80% superiores da suspensão celular para um tubo de 50 mililitros. Em seguida, repita a duração do tecido com mais dois a três mililitros de GL plating. Média. Novamente, deixe o tecido assentar.

Transfira os 80% superiores para a coleção anterior posteriormente. Aumente o volume total para 20 mililitros. Em seguida, centrifugue-o por 15 minutos a 280 vezes G. Depois disso, aspire o supinato e ressuspenda a paleta de células em cinco a sete mililitros de meio de revestimento GGL.

Em seguida, adicione placas adicionais, médias a 10 mililitros para cada cérebro dissecado e misture bem as células. Colocar 10 mililitros de suspensão de células em cada balão quadrado de 75 centímetros. Em seguida, incubar o balão de cultura a 37 graus Celsius.

Troque o meio de cultura após 24 a 48 horas e, a cada três a quatro dias, prepare as lamínulas Therman. As lamínulas plásticas utilizadas uma cultura secundária ggl adicionam três pequenas gotas de cera para plast derretida ao redor da circunferência de cada thermadox lavado e autoclave. As células serão revestidas deste lado do thermadox.

Nossos thermon são feitos à mão, inserções reutilizáveis de 60 milímetros com cerca de 52 milímetros de furos perfurados. Embora comercialmente disponíveis, também podem ser utilizadas inserções de poços de cultura. O próximo passo é lavar o ggl primário com PBS duas vezes.

Agitar vigorosamente cada balão para eliminar as células soltas. Cada frasco com ggl primário confluente fornecerá cerca de 10 milhões de astroglia. Portanto, costumamos usar de dois a quatro frascos por experimento.

Em seguida, desconecte as células com 0,05% de disparos em EDTA. Combine as células de dois frascos em um tubo cônico de 50 mililitros e adicione uma quantidade igual de meio de revestimento GGL, depois centrifugue por 15 minutos a 280 vezes a gravidade. Aspire o supinato e dissolva os grânulos GL em alguns mililitros de GL Média.

Conte as células usando um hemocitômetro e dilua a suspensão celular conforme necessário. Em seguida, coloque 500.000 células em pratos de 60 milímetros ou em lamínulas térmicas usando o meio de revestimento GL para placa térmica. 600 microlitros de células em cada lamínula de cobertura em forma gota a gota e, após duas horas, vire cada thermadox para submergir as células em meio de revestimento glia.

Se estiver preparando pratos de 60 milímetros de glia secundária para lamínulas neuronais, troque o meio para o final dois na noite anterior à dissecção neuronal. Neste procedimento, para preparar as lamínulas de vidro de 15 milímetros, adicione três pequenas gotas de parablastos derretidos. Encere ao redor da circunferência de cada lamínula estéril para separar fisicamente as camadas de células e evitar a camada de raspagem das células.

A tampa desliza todos os pratos de 60 milímetros com 0,5 miligramas por mililitro de polilisina por duas horas ou durante a noite. Em seguida, lave-os com água estéril duas a três vezes e deixe-os secar completamente Para preparar a dissecção neuronal. Eutanásia de uma rata grávida de 17 dias.

Pulverize com etanol 70% e corte medialmente através da pele para expor o útero. Depois disso, remova todos os fetos e coloque-os em um prato estéril de 100 milímetros. Depois de dissecar e decapitar rapidamente cada feto, coloque cada cabeça em um prato de 60 milímetros com quatro mililitros de meio de dissecção a frio sob o microscópio estéreo.

Use um par de fórceps para isolar os córtices cerebrais, abrindo a pele e o crânio, extraindo o cérebro, separando os hemisférios e removendo o mesencéfalo e as meninges. Colete todos os córtices dissecados em um prato fresco de 60 milímetros com meio de dissecção a frio. Em seguida, pique o tecido com uma tesoura curva em pedaços de cerca de um milímetro.

Transfira o tecido picado para um tubo estéril de 15 mililitros. Traga o volume para 4,5 mililitros com meio de dissecção a frio e adicione 500 microlitros de 2,5% de viagens ao tecido. Depois disso.

Enrole o tubo em filme paralímpico e coloque-o em banho-maria a 36 graus Celsius por 15 minutos. Enquanto isso, misture invertendo o tubo a cada cinco minutos. Em seguida, transfira o tecido para um novo tubo de 50 mililitros e tente minimizar a transferência do meio de dissecção contendo tripsina para o tubo.

Traga o volume para 4,8 mililitros com meio de dissecção fresco e adicione 200 microlitros de D Ns a uma concentração final de 60 microgramas por mililitro. Em seguida, triture cerca de 10 vezes com uma pipeta estéril de cinco ou dois mililitros. Repita esta etapa conforme necessário.

Usando uma pipeta de macarrão polido a fogo para dissociar a maior parte do tecido, deixe os pedaços restantes de tecido assentarem no fundo por quatro a cinco minutos. Em seguida, remova a suspensão unicelular superior, deixando para trás os pedaços de tecido assentados. Transfira-o para um novo tubo com um volume igual de meio de revestimento de neurônios e misture-os suavemente.

Em seguida, conte as células usando um hemocitômetro e coloque-as em lamínulas de 15 milímetros como cerca de 35.000 células em 200 microlitros ou em pratos de 60 milímetros como cerca de 1 milhão de células em três mililitros. Incube as células a 36,5 graus Celsius por três a quatro horas após a incubação. Combine a camada de neurônios e o ggl secundário para neurônios em pratos de 60 milímetros.

Lave as células com DMEM quente. Troque o meio para quatro mililitros de N dois meios e adicione um thermon com ggl a cada placa. Com o GL voltado para os neurônios em busca de lamínulas neuronais, transfira de três a cinco lamínulas para cada prato de 60 milímetros de ggl secundário com os neurônios voltados para baixo 24 horas após o plaqueamento dos neurônios, adicione 10 micromolares de citosina Beta D Arab azi a cada prato para evitar a proliferação da glia mostrado aqui como um exemplo de neurônios da neuroglia por co-cultura laminar.

Cinco horas após o revestimento, os processos continuam a se alongar nesta fase. Aqui está um exemplo de neurônios da co-cultura bilanar da neuroglia 12 dias após o plaqueamento. Nesta fase, os axônios e nites estendidos das células são claramente visíveis.

À medida que os neurônios amadurecem, os ABAs dendríticos tornam-se mais elaborados e desenvolvem contatos sinápticos cerca de duas a três semanas após o revestimento. Muitos espinhos dendríticos são visíveis, como mostrado nesta figura. Ao realizar esta técnica, é importante trabalhar rapidamente e manter a esterilidade de cada reagente é a falta de antibióticos em nossa cultura.

O meio torna as células muito suscetíveis à contaminação.