Cultura e Eletrofisiologia de células em NRCC patch-clamp-Chips

O objetivo geral do experimento a seguir é registrar a atividade eletrofisiológica das células cultivadas por meio de um chip de grampo planar. Isso é conseguido esterilizando, preparando e testando os chips de grampo de adesivo para permitir o crescimento da cultura de células e o subsequente monitoramento de sua atividade eletrofisiológica. Após o teste, os chips podem ser armazenados até que sejam preparados novamente em um laboratório de biologia celular.

Como próximo passo, os neurônios são extraídos dos membros, estaus e cultivados nos chips. Finalmente, os chips são conectados a um amplificador patch clamp para monitorar a atividade eletrofisiológica das células. A principal vantagem desta tecnologia sobre os chips de patch clamp planejador existentes é que ela é adequada para uso com neurônios que estabelecem cultura, permitindo a interrogação de comunicação sináptica, comunicação em neurais.

Este método e a abordagem permitirão uma melhor compreensão das funções dos canais iônicos de células excitáveis incorporadas em uma rede neuronal em condições normais e patológicas. As implicações deste método se estendem à farmacologia, onde pode ser usado para realizar rendimento médio, alto conteúdo de informação, triagem de medicamentos para canais iônicos e proteínas receptoras. Optamos por demonstrar esse método usando neurônios de caracol porque esses neurônios podem ser facilmente posicionados e cultivados.

E como esses neurônios reformarão a rede em cultura, eles são um excelente mod de estudos para a transformação. Mais importante, esses chips também podem ser usados em outros sistemas celulares, como células cardíacas e cancerígenas. O principal desafio com o uso de chips planares de patch clamp é obter chips com aberturas limpas, células de revestimento e cultura.

Chips desconectados seriam contraproducentes e, portanto, todos os chips são testados antes de serem usados. O ponto mais crítico da avaliação eletrofisiológica ocorre quando as células são cultivadas. Consiste na formação do selo giga entre a membrana celular e as duas bordas superiores baratas.

Todos os chips de grampo de remendo plantar produzidos datam de usar célula isolada em suspensão e dependem da sucção para atrair células para a abertura para formar um selo giga. Formação GigE. O uso de nossos chips ocorre espontaneamente.

Embora os neurônios sejam cultura e não dependam de sucção, demonstrarei a etapa de esterilização e triagem do chip. Tanya explicará o carregamento em um laboratório de biologia celular, Colin ilustrará a preparação e o revestimento celular. Finalmente, Marcia mostrará que nossas gravações são feitas Para iniciar este procedimento, esterilize os chips em um limpador de plasma básico herético com 0,1 a 0,3 milibares de pressão de ar residual por 15 minutos na potência máxima de 18 watts.

O tratamento com plasma também torna o chip hidrofílico, o que facilita a preparação. Em seguida, encaixe os tubos de vidro com um tubo de silicone de laboratório elástico cel estéril, três polegadas em uma extremidade e uma polegada na outra extremidade. Em seguida, encha os tubos com solução tampão de fosfato padrão estéril, certificando-se de que nenhuma bolha fique presa.

Prenda o tubo de silicone longo enquanto pressuriza o PBS da extremidade curta em uma atmosfera. Em seguida, liberar a pressão no canal fluídico. Depois disso, encha o frasco com PBS usando uma seringa.

Mergulhe um eletrodo de prata e cloreto de prata no frasco e um contraeletrodo no tubo curto. Use um medidor de impedância para confirmar que a resistência de acesso está entre 300 quilo ohms e três mega ohms, e a capacitância do shunt está entre 10 pico ferriday e 25 pico ferriday. Em seguida, lave o canal fluídico com água deionizada estéril.

Esvazie o frasco superior e repita o processo de enxágue duas vezes. Em seguida, mergulhe a embalagem para lascar com os tubos em água fresca e estéreis deionizadas por 30 minutos. Em seguida, coloque outros chips em um recipiente estéril cheio de água deionizada estéril.

Isso garante que os chips permaneçam hidrofílicos e protegidos contra contaminação. Abra um recipiente de cavacos sob uma capela de fluxo laminar filtrado HEPA e remova os cavacos com o frasco superior voltado para baixo para evitar a contaminação de detritos de embalagem flutuando na superfície da água. Para remover quaisquer detritos residuais da superfície do cavaco, enxágue o frasco superior duas vezes com água deionizada estéril filtrada Conecte uma extremidade do tubo elástico conectado ao canal fluídico a uma seringa pressurizada contendo água deionizada filtrada estéril.

Neste sistema, a água na seringa é pressurizada por um tanque de ar comprimido ajustado para uma atmosfera para garantir que o ar de esterilidade seja filtrado antes de entrar na seringa. Este sistema também é equipado com duas válvulas on-off que permitem o controle da pressão quando necessário. Prenda a extremidade de saída dos fluidos com um hemostático.

Em seguida, abra a válvula do tanque de ar comprimido para pressurizar a solução. Em seguida, abra o hemostático na extremidade de saída dos fluidos para lavar o chip com água deionizada estéril fresca. Prenda a extremidade de saída dos fluidos com um hemostático para forçar a água a subir pela abertura.

Para evitar a drenagem da água, prenda a entrada dos fluidos com o hemostático e feche as válvulas liga-desliga. Em seguida, retire a extremidade de entrada do tubo da seringa. Conecte as duas extremidades do tubo e remova os hemostáticos.

Encha o frasco superior com a água deionizada estéril filtrada. Em seguida, coloque a tampa de um prato estéril de 35 milímetros na base de um prato estéril de 100 milímetros. Em seguida, coloque um chip em cima da tampa de 35 milímetros e cubra com uma tampa de prato de 100 milímetros.

Para garantir que a membrana e a abertura dos chips estejam livres de detritos ou bolhas de ar, os chips são fotografados. Se houver detritos ou bolhas de ar. O canal fluídico e o frasco superior são lavados repetidamente com água estéril.

Se os detritos ou bolhas de ar não puderem ser removidos, o cavaco é descartado. Depois que os cavacos forem fotografados, traga-os de volta para a capela de fluxo laminar. Desconecte ambas as extremidades da tubulação.

Conecte uma extremidade do tubo a uma seringa pressurizada contendo meios fisiológicos e prenda a extremidade de saída do tubo com o hemostático para enxaguar o fluido subterrâneo com meios fisiológicos. Abra as válvulas de ligar e desligar e remova o hemostático da extremidade de saída da tubulação para forçar o meio fisiológico para cima através da braçadeira de abertura, a extremidade de saída da tubulação com a braçadeira do hemostático, a extremidade de entrada da tubulação com o hemostático e feche as válvulas de ligar. Em seguida, remova a extremidade de entrada do tubo da seringa e tampe ambas as extremidades do tubo com plugues de vidro.

Em seguida, remova os hemostáticos. Em seguida, remova a água do frasco superior. Encha o frasco superior com meio estéril filtrado.

Coloque o chip de volta no prato de 100 milímetros. Depois disso, coloque a base do prato de 35 milímetros no prato de 100 milímetros e encha-o com água deionizada estéril filtrada para enriquecer a umidade. Em seguida, cubra o prato até o momento do revestimento.

Para iniciar este procedimento, remova a casca externa de li-sags de dois a três meses com uma pinça romba. Em seguida, anestesiar os animais em solução salina contendo 10% de Listerine em uma capela de fluxo de ar laminar. Prenda os caracóis em um prato de proteção celular cheio de solução salina e remova todo o cérebro.

Em seguida, trate os cérebros isolados em meios definidos com enzima tripsina por 18 minutos. Depois disso, trate-os em meio definido e inibidor de tripsina. Por 15 minutos, prenda os cérebros em uma pequena placa de proteção celular preenchida com meios definidos de alta osmolaridade usando uma pinça fina e uma tesoura de dissecação.

Remova a bainha externa e interna dos gânglios de interesse e exponha os neurônios. Em seguida, conecte uma pipeta de vidro polido a fogo preenchida com meios definidos de alta osmolaridade a uma seringa micros aplica suavemente a sucção perto da célula de interesse até que o neurônio se ligue ao cérebro e seja suspenso na pipeta. Depois de mudar a mídia nos fluidos do chip neuro para uma solução de gravação apropriada, despeje a pipeta de vidro em um frasco de cultura e exponha suavemente o neurônio em cima da abertura do chip.

Deixe as células descansarem sem perturbações por no mínimo duas horas em temperatura ambiente para promover sua fixação à superfície do chip ao redor da abertura. Substitua a solução na placa de cultura pela solução de gravação apropriada Para estabilidade. Cole o chip em uma lâmina de vidro e coloque-o sob um microscópio para conectar os chips ao amplificador.

Corte a extremidade longa do tubo e insira o fio de prata conectado ao estágio principal. Em seguida, coloque o eletrodo de referência na placa de cultura de chips. O chip agora está pronto para gravação.

Aqui mostra um exemplo das respostas de voltagem de um neurônio dorsal do pedal esquerdo a uma série graduada de pulsos de corrente intracelular. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como registrar a atividade eletrofisiológica de células cultivadas com um chip de grampo de patch planar. Lembre-se de que, na primeira etapa, examinamos os chips para garantir que os usuários de biologia não usados nas placas tenham um Ture biologia, comecem na etapa de carregamento e normalmente ainda encontrem alguns chips de bloco para cada lote.

Este novo método representa um avanço importante no desenvolvimento de uma tecnologia barata que fornece a interrogação com um nível sem precedentes de resolução de redes neurais in vitro. Essa tecnologia pode levar a ensaios avançados para identificação de alvos terapêuticos, desenvolvimento de medicamentos e avaliação diagnóstica. O desenvolvimento adicional dessa tecnologia fornecerá novos meios para os pesquisadores de saúde explorarem novas terapias para doenças ou distúrbios neurológicos.

Seu potencial se estende a células cardíacas, câncer e outras células que possuem propriedades eletrogênicas ou