Name: Cultura e Eletrofisiologia de células em NRCC patch-clamp-Chips (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-02-07T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 36 s
Description: Aprenda a registrar a atividade eletrofisiológica de neurônios cultivados em chips patch-clamp planares. Este método permite estudar funções de canais iônicos em redes neurais e realizar triagens de fármacos com resolução sem precedentes.

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Os autores gostariam de agradecer Alexei Bogdanov para a fabricação de patch-clamp fichas no CPFC, e Tran Hue, Ping Zhao e Mateus Shiu para obter ajuda com a montagem. Naweed Syed foi apoiada por um Instituto Canadense de Pesquisa em Saúde (CIHR) subvenção. Collin Lucas é o destinatário da NSERC e Patrimônio Alberta Fundação de Pesquisa Médica (AHFMR) bolseiros.

1. Fabricação de chips O processo descrito em 6 resultados de uma 3 micrómetros película auto-pé de espessura, uma baixa resistência de 1 acesso Mohm e uma superfície lisa de abertura em forma de funil, que facilita uma vedação íntimo com a célula 9, ver Figura 2. As aparas são singulated e coladas em pacotes de Plexiglas com a abertura virada um furo de ligação do chip para um canal subterrâneo. A colagem é dispensado de uma maneira que minimiza a capacitância de derivação para um pF 17 nominal. Os pacotes são equipados com duas mm de diâmetro e 1,5 mm 6 tubos de vidro longas como portas fluídicos (Figura 3). <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3288/3288fig2.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="A Figura 2"> Figura 2. Micrografia eletrônica de varredura de uma secção de feixe de íons focalizados de um chip de patch-clamp NRCC mostra uma superfície lisa dióxido de silício e forma de funil, que favorece os contatos íntimos de células, e um orifício superficial que representa uma resistanc baixo acessoe. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3288/3288fig2.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="A Figura 2"> Figura 3. Um chip é colada no fundo do frasco de cultura em um pacote de Plexiglas equipado com fluidos subterrâneos e tubos de vidro. 2. Priming, esterilização e testes Os seguintes passos devem ser realizados em um gabinete de segurança de biologia para evitar a contaminação ou obstrução da abertura. <ul type="disc"><li> Esterilizar fichas em um líquido de limpeza Harrick plasma de base (www.harrickplasma.com) com uma pressão de ar 0,1-0,3 mbar residual durante 15 min à potência máxima de 18 W. Outros sistemas de ar de plasma pode ser utilizado, com a densidade de potência comparável (24 mW / cm 3) e mantendo o produto da densidade de potência e constante de tempo. O tratamento com plasma também torna os chips hidrofílico, o que facilita a escorva. </li><li> Coloque os tubos de vidro com tubos de silicone Silastic Laboratório estéril, 1mm x 2mm ID OD (Cole ParmerCat. # 96115-08), 3inch de um lado, uma polegada do outro lado. </li><li> Encha fluídica através dos tubos com esterilizada por filtração da solução tampão de padrão de fosfato (PBS), certificando-se nenhuma bolha é aprisionado. </li><li> Clip do tubo de silicone longo tempo de pressurizar o PBS a partir do lado curto, a 1 atm. Um conjunto de PBS que escoa através da abertura pode ser visível no frasco. Prenda o fornecimento pressurizado do PBS e retire o tubo de silicone curta distância que a oferta. </li><li> Encha frasco com filtrada PBS utilizando uma seringa. </li><li> Imergir um Ag / Ag: Cl eléctrodo no tubo curto e um contra-eléctrodo no frasco. Um medidor de impedância é utilizada para confirmar que a resistência de acesso é entre 300kohm e 3Mohm ea capacitância shunt é entre 10pF e 25pF. Um chip com menor resistência é provável que tenha um vazamento, e uma maior capacitância é considerado impróprio para uso, pois não pode capturar mais rápido dinâmica de eletrofisiologia da célula 6. Um chip com menor capacidadeou maior resistência é considerado conectado, embora pudesse ser simplesmente que uma bolha está preso no orifício. Alguns chips são testados novamente depois de 1H e encontrado para ter a impedância eletroquímica correta. </li><li> Lavar o canal fluídica com água desionizada estéril; esvaziar o frasco de topo e lavar com o mesmo, duas vezes. </li><li> Mergulha-se o chip de embalado, com tubos em água estéril fresco desionizada durante 30 min, em seguida, carregar com outros chips em um recipiente estéril cheio com água desionizada estéril. Isto assegura que os chips permanecem hidrófilo e protegido de contaminação. </li></ul> 3. Fichas de preparação em laboratório de biologia celular As seguintes etapas são realizadas em uma capela de fluxo laminar filtrado HEPA usando técnicas assépticas, todas as soluções utilizadas neste procedimento deve ser filtrada esterilizados antes da utilização usando um filtro de 0.22μm. <ul type="disc"><li> Abra um recipiente de chips sob uma capela de fluxo laminar filtrado HEPA e retirar as fichas de ContaINER face para baixo para evitar escavar possíveis contaminantes flutuantes em frasco superior. </li><li> Lavar parte superior do frasco de 2x chip com filtrada água estéril desionizada para remover todos os detritos residual a partir da superfície do chip. </li><li> Aspirar água desionizada estéril fora do frasco de topo. </li><li> Ligue uma extremidade do tubo de silastic ligado ao canal de fluídica a uma seringa pressurizada contendo água filtrada estéril desionizada. No nosso sistema, seringas preenchidas com solução são pressurizados por ligação a um reservatório de ar comprimido definido para 20psi. Para garantir a esterilidade, o ar é filtrado (filtro de 0,22 um) antes da entrada para a seringa e nosso sistema também tem uma válvula de ligar / desligar que nos permite parar ou aplicar pressão quando necessário. </li><li> Usando um hemostato, fixar a extremidade de saída da tubagem. </li><li> Abra o de ligar / desligar as válvulas para pressurizar a solução. </li><li> Para enxaguar o fluídica subterranen do chip com água estéril fresco desionizada, unclamp a extremidade de saída da tubagem. </li><li> Para parace a água para cima através da abertura, fixar a extremidade de saída da tubagem com um hemostato. </li><li> Para evitar a drenagem da água, prenda as extremidades de entrada e saída da tubulação com uma hemostats e fechar a on / off válvulas. </li><li> Separar a extremidade de entrada da tubagem a partir da seringa. </li><li> Inserir tampões de vidro em ambas as extremidades do tubo e remover os hemostats. </li><li> Preencha frasco topo com água deionizada steriled filtro. </li><li> Colocar a tampa de um prato 35 milímetros esterilizada na base de um prato 100 milímetros estéril </li><li> Chip de lugar na parte superior da tampa 35 mm, e com tampa 100 tampa prato mm. </li><li> Fichas de imagem para garantir que a membrana ea abertura das fichas são livres de detritos e / ou bolhas de ar. No nosso laboratório usamos um microscópio vertical e uma 20x objectivo de longa distância de trabalho. </li><li> Se detritos e / ou bolhas de ar, lavar repetidamente canal fluídico e frasco superior. Se os detritos e / ou bolhas de ar não pode ser removido, o chip é descartado. </li><li> Uma vez que os chips sãodigitalizado, retornar à câmara de fluxo laminar e desligue ambas as extremidades do tubo. </li><li> Anexar uma extremidade do tubo a uma seringa pressurizada contendo meios fisiológicos. </li><li> Prender a extremidade de saída da tubagem com um hemostato </li><li> Abrir a válvula de pressão, remover o hemostato a partir da extremidade de saída dos fluidos e lave o canal fluídica com meios fisiológicos </li><li> Para enxaguar o fluídica subterrâneo com meios fisiológicos, abrir a de ligar / desligar as válvulas e remover o hemostato a partir da extremidade de saída da tubagem. </li><li> Para forçar os meios fisiológicos para cima através da abertura, fixar a extremidade de saída da tubagem com um hemostato. </li><li> Prenda no lado de entrada da tubulação com uma pinça hemostática e fechar a on / off válvulas. </li><li> Remover a extremidade de entrada do tubo da seringa e ficha ambas as extremidades do tubo por meio de tampões Glas. </li><li> Remova os hemostats. </li><li> Remover a água do frasco de topo. </li><li> Encher o frasco de topo com filtros de esterilizados meios fisiológicos. </li><li>Coloque novamente o chip no prato 100 milímetros Petri. </li><li> Coloque a base de um prato 35 milímetros para o prato 100 mm e enchê-lo com água esterilizada por filtro desionizada para enriquecer humidade. </li><li> Cubra o prato até o momento para revestimento </li></ul> 4. Revestimento celular dos neurônios caracol Os chips de patch-clamp pode ser adequado para uma variedade de preparações. Estamos atualmente testando as nossas fichas com mamíferos primárias de neurônios corticais e que tenham obtido resultados preliminares com células cultivadas por 14 dias 7, o que indica que nosso protocolo de esterilização é adequada e que os chips não são citotóxicos em culturas a longo prazo. Para efeitos do presente protocolo, os neurônios de moluscos foram escolhidos porque representam um modelo simples, mas bem estabelecido para estudar a eletrofisiologia neuronal 11, e é com essas células que obtivemos os resultados mais significativos para a data de 10. Isolamento das células e procedimentos detalhados cultura têmforam descritas anteriormente 12, 13. <ul type="disc"><li> Remova a casca exterior 2-3 stagnalis meses Lymnaea velho com uma pinça sem corte e animais anestesiam em Lymnaea salina contendo Listerine 10%. Todos os passos subsequentes realizada assepticamente dentro de uma capa fluxo de ar laminar com equipamento de dissecção estéril e soluções à temperatura ambiente. </li><li> Substituir mídia fisiológicas nas fluídica com a solução de gravação apropriado usando uma pipeta Eppendorf. No caso de neurónios Lymnaea a solução contém (em mM): 50 KCl, 5 MgCl2, 5 etilenobis (oxietilenonitrilo) de ácido tetraacético (EGTA) e 5 4 - (2-hidroxietil)-1-piperazinoetanossulfónico (HEPES, pH 7,4 ; 130 mOsm) 14 </li><li> Pino os caracóis em um prato Sylgard preenchido com solução salina e Lymnaea remover cérebro inteiro, como descrito anteriormente 13 </li><li> Trate o isolacérebros ed em meio definido (MS) de enzima tripsina (solução a 0,2%, Sigma, catálogo # T-9201) durante 18 minutos, seguido por tratamento em DM e inibidor de tripsina (Sigma, soja, Catalog # T-9003) durante 15 minutos. </li><li> Fixar os cérebros em um prato Sylgard pequeno enchido com alta osmolaridade definido mídia (HODM - DM com glicose adicionado; 750 uL de solução de glicose 1M a 20 mL de MS). </li><li> Usando fórceps finos e tesouras de dissecação, remover o invólucro exterior e interior dos gânglios de interesse, expondo os neurónios. </li><li> Usando uma pipeta de vidro polido fogo preenchido com HODM e ligada a uma microsseringa, aplicar sucção suave perto da célula de interesse (dorsal pedal esquerdo 1) até que o neurónio destaca a partir do cérebro e é suspenso na pipeta. </li><li> A pipeta de vidro é então movido e mergulhado neurochips individuais quando o afastamento suave a partir do micro-permite que os neurónios a ser suavemente empurrada para fora da pipeta e colocado no topo dos furos de patch individuais sobre as fichas.</li><li> Permitir que as células se sentar sem ser perturbado por um mínimo de 2 horas à temperatura ambiente para promover a sua fixação à superfície do chip em torno da abertura. </li></ul> 5. Gravações eletrofisiológicas Para ligar as fichas para o amplificador (no nosso caso de um amplificador Multiclamp 700B, Molecular Devices, Foster City, CA, EUA) <ul type="disc"><li> Substituir a solução no fluídica subterrânea e no frasco de chip com as soluções de gravação adequado. No caso de neurónios Lymnaea, as câmaras de cultura superiores são preenchidos com Lymnaea salina (em mM: NaCl 51,3, 1,7 KCl, 4 CaCl2, e 1,5 MgCl2) tamponado a pH 7,9 com HEPES 14. </li><li> Para a estabilidade, chip cola o numa lâmina de vidro e colocá-lo sob um microscópio. </li><li> Para ligar o chip para o amplificador (no nosso caso de um amplificador Multiclamp 700B, Molecular Devices, Foster City, CA, EUA), cortar uma das extremidades do tubo e inserir uma Silver fio que está ligado à cabeça fase. </li><li> Coloque o eléctrodo de referência no frasco parte superior do chip. </li><li> O chip está agora pronto para a gravação. </li><li> Aplicar um passo mV 5 com o amplificador para medir a resistência total (R t) e determinar a configuração dos neurónios: célula-inscritos (R t&gt; 1 GΩ); célula inteira (Rt = 50-100 transientes mohms mais capacitivo, indicativa de ruptura da membrana sobre a abertura); ou nenhuma vedação (R t &lt;5 mohms). No nosso último conjunto de experiências 10, 58 por cento% das células teve alta resistência selos e, destes, 80% das células mostraram respostas excitáveis. </li></ul> 6. Os resultados representativos <ul type="disc"><li> Aplicar despolarizante impulsos de corrente (20 incremento pA) para o neurónio (neste caso LPeD1). </li><li> Segure o neurônio em Vm próximo do seu potencial de repouso (~ - 60 mV). </li><li> Observe as respostas a estes pulsos despolarizantes. Potenciais de ação ultrapassagem deveser observado se o neurônio é viável. </li><li> A Figura 4 mostra um resultado representativo, que é discutida em detalhe em 14, 15. </li></ul><img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/3288/3288fig4.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 4"> Figura 4. Respostas Tensão (superior) de um neurônio LPeD1 a série graduada de intracelulares pulsos de corrente (abaixo). Os impulsos de corrente foram aplicados em Vm = - 60mV. Solução de problemas <ul type="disc"><li> Antes do plaqueamento, os chips de imagem para determinar se membrana ea abertura são livres de detritos e adequado para o plaqueamento. Nós usamos um microscópio vertical e um 20x objetivo de longa distância de trabalho. Em nosso último conjunto de experimentos 1, 67% por cento dos chips foram preparadas com sucesso dessa forma. </li><li> Se detritos e / ou bolhas de ar estão presentes descartar chip e tentar outro. </li><li> Diversos tratamentos de superfície (plasma) ou revestimento (PDL, PEI, etc) pode ser tentado, mas o sucesso pode ser altamente dependente tipo de célulausado. </li><li> A composição da solução de fluídica ("pipeta") em crítica para a formação do giga-seal e toda a célula. Ajuste a solução, prestando atenção ao pH da osmolaridade, e maquiagem iônica. </li><li> Para a cultura de longo prazo, começar com a mídia em canais microfluídicos, em seguida, mudar para pipetar solução antes da gravação através de suave perfusão gravidade alimentado (~ 0,5 ml / min). </li></ul>

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</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Patch-clamp NRCC da plataforma interrogatório chip é uma ferramenta potencialmente poderosa para os testes de conteúdo de informação de alta farmacêuticas e investigar modelos in vitro de doença. As suas vantagens em comparação com pipetas de vidro são uma resistência de acesso de baixo, que é uma vantagem para sondar células grandes, e apesar de uma capacitância um pouco maior irá resultar em dinâmica comparáveis ​​para as células mais pequenas. Célula espontânea para selos de abertura foram rotineiramente obtidos, e entrada de célula inteira foi observado para ser 14 espontânea. Uma clara diferença entre chips e pelo método da pipeta de vidro é o facto de que a sonda é parte do prato de cultura de células e não é manualmente posto em contacto com a membrana celular. Cultura de células, possivelmente parte de redes funcionais, resulta em modelos mais biologicamente relevantes, como modelos de doenças, e um mecanismo diferente para garantir alta de células para sondar selos 16. No entanto, em contraste com as suspensões de células, a aspiração cannot ser usado para posicionar uma célula na sonda. Neurónios Snail, como outras células grandes, são passíveis de posicionamento manual na parte superior da sonda. Para as células mais pequenas que requerem tempos mais longos de cultura, temos obviado a necessidade de qualquer manipulação e manter uma alta probabilidade de obtenção de uma vedação por polipéptidos de adesão de modelação em cima das sondas para colocar as células em cima das sondas, e demonstraram a colocação de células na sonda 17,18. NRCC também está a desenvolver um chip de poliimida de patch-clamp microfluídico 19 com uma capacitância comparável ao do vidro pipeta. O objetivo final desse projeto é um múltiplo de sondas chip de patch-clamp que permite o monitoramento simultâneo da atividade eletrofisiológica dos neurônios envolvidos em várias comportamento da rede para a resolução dos canais iônicos individuais 14. Este método é um método de resolução alta complementar para matrizes de multi-eléctrodo 20.

cultura e eletrofisiologia de células em nrcc patch-clamp-chips

Culturing and Electrophysiology of Cells on NRCC Patch-clamp Chips

Devido à sua extraordinária sensibilidade ea capacidade de monitorar e controlar células individuais a nível dos canais iônicos, patch de aperto é o padrão ouro de eletrofisiologia aplicada a modelos de doenças e telas farmacêuticas tanto 1. O método envolve, tradicionalmente, suavemente contactando uma célula com uma pipeta de vidro cheio de uma solução fisiológica a fim de isolar um pedaço de membrana sob o seu ápice 2. Um eléctrodo inserido na pipeta captura do canal de íon actividade dentro do remendo de membrana ou, quando há ruptura, por toda a célula. Na última década, de patch-clamp fichas têm sido propostos como uma alternativa 3, 4: uma película suspensa separa o meio fisiológico a partir do meio de cultura, e uma abertura microfabricados no filme substitui o vértice da pipeta. Patch-clamp fichas foram integrados em sistemas automatizados e comercializado para high-throughput screening 5. Para incrfacilidade de transferência, que incluem a entrega fluídica de células de suspensão, o seu posicionamento sobre a abertura por sucção, e rotinas de automatizados para detectar células de sonda-selos e entra em modo de célula inteira. Nós relatamos na fabricação de um chip de silício de patch-clamp com impedância otimizada e forma do orifício que permite a gravação de alta qualidade de potenciais de ação em neurônios cultivados caracol 6; recentemente, temos também relataram progressos no sentido de interrogar os neurônios de mamíferos 7. Os nossos de patch-clamp fichas são fabricados no Canadian Photonics Fabrication Centro 8, uma fundição comercial, e estão disponíveis em grandes séries. Estamos ansiosos para participar de colaborações com eletrofisiologistas para validar o uso da tecnologia NRCC em diferentes modelos. As fichas são utilizados de acordo com o esquema geral representado na Figura 1: o chip de silício está na parte inferior de um frasco de cultura Plexiglas e parte de trás da abertura é ligado a um Chann subterrâneael equipado com tubos em cada extremidade da embalagem. As células são cultivadas no frasco ea célula na parte superior da sonda é monitorizada por um eléctrodo de medição inserido no duas channel.The fora dos portos fluídicos facilitar a troca de solução com perturbação mínima para a célula, o que é uma vantagem em comparação com pipetas de vidro para intracelular perfusão. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3288/3288fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Princípio de medição usando o chip de patch-clamp NRCC Nós detalhe aqui os protocolos para esterilizar e escorvar os chips, carregá-los com placa de suporte, os com células e, finalmente, utilizá-los para gravações electrofisiológicos.

Nós mostramos como planar de patch-clamp fichas fabricado no National Research Council of Canada são esterilizados, preparado, carregado com médio, revestida com as células, e usado para gravações eletrofisiológicas.

Cultura e Eletrofisiologia de células em NRCC patch-clamp-Chips

Devido à sua sensibilidade requintada e à capacidade de monitorar e controlar células individuais ao nível dos canais iônicos, o patch-clamp é o padrão-ouro...

O objetivo geral do experimento a seguir é registrar a atividade eletrofisiológica de células cultivadas por meio de um chip de patch clamp planar. Isso é alcançado por meio da esterilização, condicionamento e teste dos chips de patch clamp para permitir o crescimento de culturas celulares e o subsequente monitoramento de sua atividade eletrofisiológica. Após o teste, os chips podem ser armazenados até serem novamente condicionados em um laboratório de biologia celular.Como próximo passo, os neurônios são extraídos dos membros, estaus e cultivados sobre os chips. Finalmente, os chips são conectados a um amplificador de patch clamp para monitorar a atividade eletrofisiológica das células. A principal vantagem desta tecnologia em relação aos chips de patch clamp planares existentes é que ela é adequada para uso com culturas de neurônios estabelecidas, permitindo a investigação de neurônios que se comunicam sinapticamente. Este método e a abordagem permitirão uma melhor compreensão das funções dos canais iônicos em células excitáveis embutidas em uma rede neuronal, tanto em condições normais quanto patológicas. As implicações deste método estendem-se à farmacologia, onde pode ser utilizado para realizar triagens de fármacos com média produtividade e alto conteúdo informativo para canais iônicos e proteínas receptoras. Optamos por demonstrar este método utilizando neurônios de caramujo, pois esses neurônios podem ser facilmente posicionados e cultivados.E como esses neurônios irão reformar uma rede em cultura, eles constituem um excelente modelo para estudos de transformação. Mais importante ainda, esses chips também podem ser utilizados em outros sistemas celulares, como células cardíacas e cancerígenas. O principal desafio no uso de chips para patch clamp planar é obter chips com aberturas limpas, além de um adequado plaqueamento e cultivo celular.Chips desconectados seriam contraproducentes, e, portanto, todos os chips são testados antes de serem utilizados. O ponto mais crítico da avaliação eletrofisiológica ocorre após as células terem sido cultivadas. Consiste na formação do selo gigasseal entre a membrana celular e a borda superior do chip.Todos os chips de patch clamp plantar produzidos utilizam células isoladas em suspensão e dependem da sucção para atrair as células até a abertura, formando um selo giga. Formação de selo giga. O uso de nossos chips ocorre espontaneamente.Embora os neurônios sejam cultivados e o processo não dependa de sucção, demonstrarei a etapa de esterilização e seleção do chip. Tanya explicará o carregamento em um laboratório de biologia celular, Colin ilustrará o preparo e o plaqueamento das células. Por fim, Marcia mostrará como são realizadas nossas gravações. Para iniciar este procedimento, esterilize os chips em um limpador de plasma heric basic com 0,1 a 0,3 milibares de pressão residual de ar por 15 minutos na potência máxima de 18 watts.O tratamento com plasma também torna o chip hidrofílico, o que facilita o escorvamento. Em seguida, conecte os tubos de vidro com uma mangueira de silicone laboratorial elástica e estéril, com três polegadas em uma extremidade e uma polegada na outra extremidade. Depois, preencha os tubos com solução estéril padrão de tampão fosfato, certificando-se de que nenhuma bolha fique aprisionada.Pinça o tubo de silicone longo enquanto pressuriza o PBS pela extremidade curta a uma atmosfera. Em seguida, libere a pressão no canal fluidico. Depois disso, preencha o frasco com PBS usando uma seringa.Imersa um eletrodo de prata, cloreto de prata no frasco e um eletrodo contrário no tubo curto. Utilize um medidor de impedância para confirmar que a resistência de acesso está entre 300 kilo ohms e três mega ohms, e que a capacitância em derivação está entre 10 pico farad e 25 pico farad. Em seguida, lave o canal fluidico com água estéril desionizada.Esvazie o frasco superior e repita o processo de lavagem duas vezes. Em seguida, imerja o pacote com o chip nos tubos em água desionizada estéril fresca por 30 minutos. Depois, carregue outros chips em um recipiente estéril contendo água desionizada estéril.Isso garante que os chips permaneçam hidrofílicos e protegidos contra contaminação. Abra um recipiente de chip sob uma cabine de fluxo laminar com filtro HEPA e remova os chips com o frasco superior voltado para baixo para evitar contaminação por detritos de embalagem flutuando na superfície da água. Para remover qualquer resíduo remanescente da superfície do chip, enxágue o frasco superior duas vezes com água desionizada estéril filtrada. Conecte uma extremidade da tubulação elástica ligada ao canal fluidico a uma seringa pressurizada contendo água desionizada estéril filtrada.Neste sistema, a água na seringa é pressurizada por um tanque de ar comprimido ajustado a uma atmosfera para garantir que o ar estéril seja filtrado antes de entrar na seringa. Este sistema também é equipado com duas válvulas liga-desliga que permitem o controle da pressão quando necessário. Prenda a extremidade de saída da fluidica com uma pinça hemostática.Em seguida, abra a válvula do tanque de ar comprimido para pressurizar a solução. Então, abra o hemostato na extremidade de saída da fluidica para lavar o chip com água desionizada estéril fresca. Prenda a extremidade de saída da fluidica com um hemostato para forçar a água a subir através da abertura.Para evitar a drenagem de água, prenda a entrada da fluidica com o hemostato e feche as válvulas liga-desliga. Em seguida, desconecte a extremidade de entrada da tubulação da seringa. Tampe ambas as extremidades da tubulação e remova os hemostatos.Encha o frasco superior com água estéril desionizada filtrada. Em seguida, coloque a tampa de uma placa estéril de 35 milímetros sobre a base de uma placa estéril de 100 milímetros. Posteriormente, coloque um chip sobre a tampa de 35 milímetros e cubra com a tampa de uma placa de 100 milímetros.Para garantir que a membrana e a abertura dos chips estejam livres de detritos ou bolhas de ar, os chips são submetidos à imagem. Caso haja detritos ou bolhas de ar, o canal fluidico e o frasco superior são lavados repetidamente com água estéril.Se os detritos ou bolhas de ar não puderem ser removidos, o chip é descartado. Após a obtenção das imagens dos chips, retorne com eles para a câmara de fluxo laminar. Desconecte ambas as extremidades da tubulação.Conecte uma extremidade da tubulação a uma seringa pressurizada contendo meio fisiológico e prenda a extremidade de saída da tubulação com o hemostato para lavar o sistema microfluídico com meio fisiológico. Abra as válvulas liga-desliga e remova o hemostato da extremidade de saída da tubulação para forçar o meio fisiológico a subir através da abertura, prenda a extremidade de saída da tubulação com o hemostato, a extremidade de entrada da tubulação com o hemostato e feche as válvulas liga-desliga. Em seguida, remova a extremidade de entrada da tubulação da seringa e tampe ambas as extremidades da tubulação com tampões de vidro.Em seguida, remova os hemostatos. Posteriormente, remova a água do frasco superior. Encha o frasco superior com meio estéril filtrado.Coloque o chip de volta no recipiente de 100 milímetros. Em seguida, coloque a base do recipiente de 35 milímetros dentro do recipiente de 100 milímetros e preencha-o com água estéril desionizada filtrada para aumentar a umidade. Em seguida, cubra o recipiente até o momento da semeadura.Para iniciar este procedimento, remova a concha externa de li sags com dois a três meses de idade usando um par de pinças rombas. Em seguida, anestesie os animais em salina limba contendo 10% de Listerine em uma cabine de fluxo laminar. Fixe os caracóis em um recipiente tipo cell guard contendo salina limba e remova completamente o cérebro.Em seguida, trate os cérebros isolados com meio definido contendo enzima tripsina por 18 minutos. Após isso, trate-os com meio definido e inibidor de tripsina. Por 15 minutos, fixe os cérebros em um pequeno prato com grade celular contendo meio definido de alta osmolaridade, utilizando um par de pinças finas e um par de tesouras de dissecação.Remova a bainha externa e interna dos gânglios de interesse e exponha os neurônios. Em seguida, fixe uma pipeta de vidro polida ao fogo, preenchida com meio definido de alta osmolaridade, a uma micros seringa e aplique suavemente sucção próxima à célula de interesse até que o neurônio se desprenda do cérebro e fique suspenso na pipeta. Após trocar o meio nos fluidos do chip neuro para uma solução de registro apropriada, incline a pipeta de vidro em um frasco de cultura e exponha suavemente o neurônio sobre a abertura do chip.Deixe as células em repouso, sem perturbar, por um mínimo de duas horas à temperatura ambiente para promover sua adesão à superfície do chip ao redor da abertura. Substitua a solução no recipiente de cultura pela solução de registro apropriada para garantir estabilidade. Cole o chip em uma lâmina de vidro e coloque-o sob um microscópio para conectar os chips ao amplificador.Corte a extremidade longa do tubo e insira o fio de prata conectado ao estágio de cabeçote. Em seguida, coloque o eletrodo de referência no recipiente de cultura com o chip. O chip está agora pronto para gravação.Aqui mostra-se um exemplo das respostas de voltagem de um neurônio dorsal esquerdo do pedal a uma série graduada de pulsos de corrente intracelular. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como registrar a atividade eletrofisiológica de células cultivadas com um chip de patch clamp planar. Lembre-se de que, no primeiro passo, selecionamos chips para garantir que os não utilizados para semear células tenham o orifício tampado; usuários de Ture Biology iniciam pelo passo de carregamento e normalmente ainda encontram alguns chips bloqueados em cada lote.Este novo método representa um avanço importante no desenvolvimento de uma tecnologia de baixo custo que permite a investigação de redes neurais in vitro com um nível de resolução sem precedentes. Essa tecnologia pode levar a ensaios avançados para identificação de alvos terapêuticos, desenvolvimento de fármacos e avaliação diagnóstica. O desenvolvimento adicional dessa tecnologia proporcionará novos meios para pesquisadores da área da saúde explorarem terapias inovadoras para doenças ou distúrbios neurológicos.O seu potencial estende-se a células cardíacas, câncer e outras células que possuem propriedades eletrogênicas ou.

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Research

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