Um sistema experimental para estudar Mecanotransdução em células do pulmão fetal

Forças mecânicas desempenham um papel chave no desenvolvimento de pulmão e lesão pulmonar. Aqui, nós descrevemos um método para isolar roedores fetais de pulmão de células do tipo II epiteliais e fibroblastos e expô-los a estimulação mecânica utilizando um

O objetivo deste procedimento é descrever um sistema experimental para estudar a transdução mecânica em células pulmonares fetais. Isso é feito codificando placas de cultura com proteínas da matriz extracelular. Em seguida, as células epiteliais do pulmão fetal de camundongo tipo dois são isoladas, seguidas pelo isolamento de fibroblastos fetais de camundongo.

A etapa final descreve um sistema in vitro para fornecer estimulação mecânica às células pulmonares. Em última análise, podem ser obtidos resultados que mostram um aumento da diferenciação celular do tipo dois por meio de imagens imunoquímicas de PCR em tempo real, western blot e fluorescência. Esses métodos podem ajudar a responder a questões-chave no campo da transdução mecânica, como desenvolvimento pulmonar fetal e lesão pulmonar.

Demonstrando o procedimento será Julian gu, Um técnico do meu laboratório Enquanto estamos trabalhando em uma capela de fluxo laminar sob condições estéreis faz 120 microgramas de laminina com 12 mililitros de frio estéril um XPBS por placa. Outras proteínas da matriz extracelular podem ser usadas para revestimento. Consulte o protocolo escrito para obter detalhes, pegue uma placa BioFlex não tratada e adicione dois mililitros da solução laminada a cada poço até uma concentração final de dois microgramas por centímetro quadrado.

Certifique-se de que os poços estejam completamente cobertos pela solução. Cubra totalmente a placa com filme plástico e coloque em uma superfície plana em um ambiente de quatro graus Celsius durante a noite para permitir que o laminado seja absorvido pelo fundo dos poços. As placas revestidas podem ser armazenadas nessas condições por pelo menos uma semana, mantendo uma boa função de ECM no dia seguinte.

Em condições estéreis, lave os poços três vezes com um XPBS. Em seguida, adicione um mililitro de 1% BSA em um XPBS a cada um. Bem, incube a 37 graus Celsius por uma hora para bloquear locais de ligação inespecíficos nas membranas.

Então, novamente, lave os poços três vezes com um XPBS. Para remover as proteínas não absorvidas, adicione um mililitro de DMEM a cada poço da placa. Em seguida, armazene a placa a 37 graus Celsius até que as células epiteliais do pulmão fetal tipo dois estejam isoladas e prontas para o plaqueamento.

Um dia antes de iniciar o procedimento de isolamento celular, monte os copos da tela com malhas de nylon de 130 e 15 mícrons e esterilize-os em autoclavagem. Também autoclave o mesmo número de picos de vidro de 150 mililitros no dia da cultura. Obtenha pulmões fetais de camundongos grávidas cronometrados em E 17 a 19 de gestação.

Transfira o tecido para um tubo de centrífuga de 50 mililitros contendo meio DMEA e coloque-o no gelo. Faça o tampão de digestão fresco em um tubo de centrífuga de 50 mililitros de acordo com a receita do protocolo escrito. E enquanto trabalha em um filtro de capa de fluxo laminar, esterilize através de um filtro de seringa de 0,2 mícron.

10 mililitros desse tampão são suficientes para o tecido pulmonar obtido de aproximadamente 20 fetos de camundongos. Coloque o tubo cônico contendo o tampão de digestão em banho-maria a 37 graus Celsius. Asate o dium do tubo cônico contendo o tecido pulmonar fetal e transfira o tecido para uma placa de Petri estéril usando uma tesoura estéril ou uma lâmina de barbear, pique o tecido em pedaços com menos de um milímetro de tamanho.

Em seguida, transfira o tecido para o tubo cônico contendo o tampão de digestão pré-aquecido. Em seguida, auxilie mecanicamente a digestão do tecido pipetando a suspensão de células pulmonares fetais para cima e para baixo cem vezes cada usando pipetas de tamanho de abertura decrescente. Após a conclusão do processo de digestão, centrifugar o homogenato a 1 300 rpm durante cinco minutos à temperatura ambiente.

Em seguida, remova cuidadosamente o supino por aspiração e ressuspenda o pellet contendo as células em 15 mililitros de DMEM mais 20% de FBS. Em seguida, recupere os copos de tela com malhas de náilon de 130 e 15 mícrons e coloque-os em cima dos copos estéreis de 150 mililitros. Pipetar o homogeneizado de células para a malha de 100 mícrons.

Recolher o filtrado e pipetá-lo para a malha de 30 mícrons. Lave a malha de 30 mícrons várias vezes com DMEM fresco mais 10% FBS. A maioria das células do tipo dois se aglomera e não passa pela malha.

Essas lavagens removem as células não epiteliais que podem estar presas aos aglomerados. Aplique o filtrado da malha de 30 mícrons no copo da tela de malha de 15 mícrons. Novamente, lave várias vezes como antes.

Esta etapa recruta as células do tipo dois que podem ter passado pela malha de 30 mícrons. Recolha as células não filtradas agrupadas das malhas de 30 e 15 mícrons para posterior enriquecimento celular do tipo dois. Reter o filtrado da malha de 15 mícrons se for cultivada fibroblastos pulmonares de roedores fetais.

Caso contrário, rejeitar este filtrado. Além disso. Purifique a população de células epiteliais do tipo dois adicionando meios e incubando as células não filtradas dos copos de malha de 30 e 15 mícrons em um frasco de cultura de tecidos de 75 centímetros quadrados por 30 minutos após esta incubação, centrifugue o super nome como antes, de pellet as células e, em seguida, ressuspenda o pellet em dois mililitros de DMEM livre de soro pro feto, pipete um mililitro da suspensão celular em cada poço do laminado revestido Placas de seis poços BioFlex neste ponto, as células aparecem em aglomerados quando observadas ao microscópio, incubam a placa em uma incubadora de cultura de tecidos ajustada a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. Uma incubação de 24 horas é ideal e é necessário um mínimo de seis horas de incubação.

Antes de iniciar os experimentos de deformação mecânica, pegue o filtrado da malha de 15 mícrons e transfira para um frasco de cultura de tecidos de 75 centímetros quadrados a 37 graus Celsius por 30 a 60 minutos para permitir que o fibroblasto adira, aspire e descarte o sate. Em seguida, substitua o volume no frasco por DMEM livre de soro e incube durante a noite. No dia seguinte, colha as células com 0,25% de tripsina em EDTA 0,4 milimolar e coloque-as em placas BioFlex revestidas com fibronectina incubadas em uma incubadora de cultura de tecidos ajustada a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono, idealmente por 24 horas antes de iniciar os experimentos de tensão mecânica.

É necessária uma incubação mínima de seis horas se for necessário um número específico de células para as experiências. As células do tipo dois são mantidas em frascos de DMEM livre de soro de 75 centímetros quadrados após o isolamento, e no dia seguinte as células são contadas tripsicamente e, em seguida, a monocamada sentada não deve ser superior a 80% confluente antes do início dos experimentos. No dia do experimento de estimulação mecânica, o meio de cultura celular é substituído por dois mililitros de DMEM livre de soro fresco por poço, e a placa é então montada em uma unidade de cepa FX 5.000 de célula flexível.

Em seguida, aplique a deformação biaxial EQU nas membranas. O regime de deformação varia dependendo da simulação de forças mecânicas in vivo. Conforme discutido no protocolo escrito, as células cultivadas em membranas não ST esticadas.

Cultivados em paralelo são usados como controles para o experimento. No final do experimento, as monocamadas podem ser processadas para analisar mudanças na expressão gênica por PCR em tempo real ou mudanças na abundância de proteínas por western blot. Além disso, monocamadas podem ser fixadas para experimentos de imunoquímica para esta técnica.

Após a fixação, as membranas asticas são cortadas das placas e montadas em lâminas de vidro usando 10 a 20 microlitros de água como agente de montagem antes da permeação e incubação com anticorpos. O super datin do experimento também pode ser usado para investigar a presença de substâncias liberadas, como fatores de crescimento ou citocinas. Esta imagem mostra células epiteliais do tipo fetal E 18 fixadas parmal que foram isoladas como neste protocolo e plaqueadas em placas BioFlex codificadas com laminina.

As celas foram fixadas e a fotografia foi tirada. No dia seguinte, as células de estiramento não-ST foram plaqueadas. A pureza das células foi determinada em 90 mais ou menos 5% por análise microscópica da morfologia das células epiteliais e imunocoloração para a proteína surfactante C. As figuras a seguir apresentam dados de células epiteliais do tipo fetal dois que foram expostas a 5% de tensão cíclica a 40 ciclos por minuto durante 16 horas.

Esta expressão de mRNA da proteína C do surfactante ilustra que a cepa induz a diferenciação celular do tipo dois usando diferentes substratos de MEC. Os sinais de mais menos representam exposição à cepa ou nenhuma exposição à cepa, respectivamente. Os dados de expressão são apresentados no histograma como média mais ou menos SEM, o N igual a três e o asterisco indica um valor de P inferior a 0,05.

Essas imagens imunoquímicas de fluorescência mostram os níveis de proteína C do surfactante em verde. No tipo fetal, duas células não expostas a tensão mecânica à esquerda e expostas a tensão mecânica nos núcleos direitos foram contracoradas com dapi, que aparece em azul. Este histograma quantifica os resultados do western blot de três experimentos que mostram que o estiramento mecânico aumenta os níveis de proteína C do surfactante.

Neste experimento, o N é igual a três e o asterisco indica um valor de P inferior a 0,05. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como acelerar as células pulmonares fetais e expô-las ao alongamento mecânico.