Um sistema experimental para estudar Mecanotransdução em células do pulmão fetal

O objetivo deste procedimento é descrever um sistema experimental para estudar a transdução mecânica em células pulmonares fetais. Isso é realizado por meio da codificação de placas de cultura com proteínas da matriz extracelular. Em seguida, são isoladas células epiteliais tipo II do pulmão fetal de camundongo, seguido pelo isolamento de fibroblastos fetais de camundongo.

O passo final descreve um sistema in vitro para fornecer estimulação mecânica a células pulmonares. Em última análise, podem ser obtidos resultados que mostram um aumento na diferenciação de células do tipo dois por meio de PCR em tempo real, western blot e imagens de imunoquímica por fluorescência. Esses métodos podem ajudar a responder perguntas fundamentais no campo da transdução mecano, como o desenvolvimento pulmonar fetal e lesão pulmonar.

Demonstrando o procedimento estará Julian gu, um técnico do meu laboratório. Enquanto trabalhamos em uma cabine de fluxo laminar sob condições estéreis, preparamos 120 microgramas de laminina com 12 mililitros de PBS 1X frio e estéril por placa. Outras proteínas da matriz extracelular podem ser usadas para revestimento. Consulte o protocolo escrito para obter detalhes, em seguida, pegue uma placa BioFlex não tratada e adicione dois mililitros da solução de laminina a cada poço, obtendo uma concentração final de dois microgramas por centímetro quadrado.

Certifique-se de que os poços estejam completamente cobertos pela solução. Cubra totalmente a placa com filme plástico e coloque sobre uma superfície plana em um ambiente de quatro graus Celsius durante a noite para permitir que o laminado seja absorvido ao fundo dos poços. As placas revestidas podem ser armazenadas nessas condições por pelo menos uma semana, mantendo boa função de matriz extracelular no dia seguinte.

Em condições estéreis, lave as placas três vezes com um XPBS. Em seguida, adicione um mililitro de 1% BSA em um XPBS a cada poço. Incube por uma hora a 37 graus Celsius para bloquear os sítios de ligação não específicos nas membranas.

Em seguida, lave novamente as cavidades três vezes com um XPBS. Para remover as proteínas não absorvidas, adicione um mililitro de DMEM a cada cavidade da placa. Em seguida, armazene a placa a 37 graus Celsius até que os pneumócitos tipo II de pulmão de roedor fetal sejam isolados e estejam prontos para semeadura.

No dia anterior ao início do procedimento de isolamento celular, monte os copos com peneiras de malhas de náilon de 130 e 15 mícrons e esterilize-os por autoclavação. Autoclave também o mesmo número de bicos de vidro de 150 mililitros no dia do cultivo. Obtenha pulmões fetais de camundongo prenhe com tempo gestacional definido no dia E 17 a 19 da gestação.

Transfira o tecido para um tubo de centrífuga de 50 mililitros contendo meio DMEA e coloque-o sobre gelo. Prepare um tampão de digestão fresco em um tubo de centrífuga de 50 mililitros de acordo com a receita no protocolo escrito. E, enquanto trabalha em uma cabine de fluxo laminar, esterilize por filtração através de um filtro de seringa de 0,2 mícron.

10 mililitros deste tampão são suficientes para o tecido pulmonar obtido de aproximadamente 20 fetos de camundongo. Coloque o tubo cônico contendo o tampão de digestão em banho-maria a 37 graus Celsius. Asse o dium do tubo cônico contendo o tecido pulmonar fetal e transfira o tecido para uma placa de Petri estéril usando tesoura estéril ou lâmina de barbear, picando o tecido em pedaços com menos de um milímetro de tamanho.

Em seguida, transfira o tecido para o tubo cônico contendo o tampão de digestão pré-aquecido. Depois, auxilie mecanicamente a digestão do tecido pipetando a suspensão de células pulmonares fetais para cima e para baixo cem vezes com pipetas de tamanho de abertura decrescente. Após a conclusão do processo de digestão, centrifugue o homogeneizado a 1.300 RPM durante cinco minutos à temperatura ambiente.

Em seguida, remova cuidadosamente o sobrenadante por aspiração e ressuspenda o pellet contendo as células em 15 mililitros de DMEM acrescido de 20% de FBS. Depois, pegue os copos de peneira com malhas de náilon de 130 e 15 mícrons e coloque-os sobre os béqueres estéreis de 150 mililitros. Pipete o homogenato celular sobre a malha de 100 mícrons.

Colete o filtrado e pipete-o sobre a malha de 30 mícrons. Lave a malha de 30 mícrons várias vezes com DMEM fresco mais 10% de FBS. A maioria das células do tipo dois se aglomera e não passa através da malha.

Essas lavagens removem células não epiteliais que podem estar aderidas aos agregados. Aplique o filtrado da malha de 30 mícrons ao copo de tela de 15 mícrons. Novamente, lave várias vezes como antes.

Esta etapa recruta as células do tipo dois que podem ter passado pela malha de 30 mícrons. Colete as células agregadas não filtradas das malhas de 30 e 15 mícrons para enriquecimento adicional de células do tipo dois. Retenha o filtrado da malha de 15 mícrons se for necessário cultivar fibroblastos pulmonares de roedores fetais.

Caso contrário, descarte este filtrado. Em seguida, purifique a população de células epiteliais do tipo dois adicionando meio e incubando as células não filtradas provenientes dos copos com malhas de 30 e 15 mícrons em um frasco de cultura de tecidos de 75 centímetros quadrados durante 30 minutos; após essa incubação, centrifugue o sobrenadante como antes, despreze o sobrenadante, ressuspenda o pellet em dois mililitros de DMEM livre de soro e, em seguida, pipete um mililitro da suspensão celular em cada poço de placas BioFlex de seis poços revestidas com laminina. Neste ponto, as células aparecem em agregados quando observadas ao microscópio. Incube a placa em uma estufa de cultura de tecidos ajustada a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. Uma incubação de 24 horas é ideal, sendo necessária uma incubação mínima de seis horas.

Antes de iniciar os experimentos de tensão mecânica, colete o filtrado da malha de 15 mícrons e transfira para um frasco de cultura de tecidos de 75 centímetros quadrados a 37 graus Celsius por 30 a 60 minutos para permitir a adesão dos fibroblastos, aspire e descarte o sobrenadante. Em seguida, substitua o volume no frasco por DMEM sem soro e incube durante a noite. No dia seguinte, recolha as células com tripsina 0,25% em EDTA 0,4 milimolar e plaque-as em placas BioFlex revestidas com fibronectina, incubando em uma estufa de cultura de tecidos ajustada a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono, idealmente por 24 horas antes de iniciar os experimentos de tensão mecânica.

É necessário um período mínimo de incubação de seis horas se um número específico de células for exigido para os experimentos. As células do tipo dois são mantidas em frascos de DMEM sem soro de 75 centímetros quadrados após o isolamento, e no dia seguinte as células são tripsinizadas, contadas e então semeadas. A monocamada não deve apresentar confluência superior a 80% antes do início dos experimentos. No dia do experimento de estimulação mecânica, o meio de cultura celular é substituído por dois mililitros de DMEM fresco sem soro por poço, e a placa é então montada em uma unidade de tensão Flexcell FX 5,000.

Em seguida, aplique deformação biaxial EQU às membranas. O regime de deformação varia conforme a simulação das forças mecânicas in vivo. Conforme discutido no protocolo escrito, células cultivadas em membranas não esticadas por ST.

Os cultivados em paralelo são usados como controles para o experimento. Ao final do experimento, as monocamadas podem ser processadas para analisar alterações na expressão gênica por PCR em tempo real ou alterações na abundância de proteínas por western blot. Além disso, as monocamadas podem ser fixadas para experimentos de imunoquímica com esta técnica.

Após a fixação, as membranas são recortadas das placas e montadas em lâminas de vidro utilizando de 10 a 20 microlitros de água como agente de montagem antes da permeabilização e incubação com anticorpos. Os dados obtidos no experimento também podem ser utilizados para investigar a presença de substâncias liberadas, como fatores de crescimento ou citocinas. Esta imagem mostra células epiteliais fetais do tipo dois, fixadas com parmal, isoladas conforme este protocolo e semeadas em placas BioFlex revestidas com laminina.

As células foram fixadas e a fotografia foi tirada. No dia seguinte ao do plaqueamento das células sem estiramento não-ST. A pureza das células foi determinada como sendo 90 mais ou menos 5% por meio de análise microscópica da morfologia das células epiteliais e imunomarcação para a proteína C do surfactante. As figuras a seguir apresentam dados de células epiteliais fetais tipo II que foram expostas a uma tensão cíclica de 5% a 40 ciclos por minuto durante 16 horas.

Este blot norte de expressão de mRNA da proteína C do surfactante ilustra que a tração induz a diferenciação de células do tipo dois utilizando diferentes substratos de matriz extracelular. Os sinais de mais e menos representam, respectivamente, exposição ou ausência de exposição à tração. Os dados de expressão são apresentados no histograma como média mais ou menos erro padrão da média (SEM), com N igual a três, e o asterisco indica um valor de P inferior a 0,05.

Essas imagens de imunoquímica por fluorescência mostram os níveis da proteína C do surfactante em verde. Em células fetais do tipo II não expostas à tensão mecânica à esquerda e expostas à tensão mecânica à direita, os núcleos foram contra-esticados com DAPI, que aparece em azul. Este histograma quantifica os resultados de western blot de três experimentos, demonstrando que o estiramento mecânico aumenta os níveis da proteína C do surfactante.

Neste experimento, N é igual a três e o asterisco indica um valor de P inferior a 0,05. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como acelerar células pulmonares fetais e expô-las a estiramento mecânico.