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生化学の必需品

このコレクションは、一般的に使用される精製方法を、アフィニティクロマトグラフィーなどの分析方法と同様に、を示しています。また、生体の相互作用と機能を評価するためのビデオショーケースの方法, このような共同免疫沈降と代謝標識.

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    05:25
    透析: 拡散による分離

    透析は拡散に基づく分子を分離するため生物化学で使用される一般的な手法です。この手順では、半透膜にはサイズに基づいて特定の分子の動きことができます。このメソッドは、タンパク質溶液から脱塩、として知られているバッファーのバッファー分子またはイオンの交換の除去に適用できます

    このビデオをカバーすると共に、一般的なプロシージャ透析のいくつかのアプリケーションがレビューされ、透析の原理遠心、膜タンパク質後洗剤を除去するグラデーションの試薬の除去を含む。抽出、およびソリューション環境の変化によるタンパク質の再構成します

    生化学的サンプルが通常ダウン析膜中大きな生体分子内で開催。透析は、ゆっくりとしたプロセスです。それは夜間に実行を許可する一般的なあるいは複数日にわたる。 透析液が純粋な水の場合、全体的なバッファー濃度が下がり、脱塩として知られているプロセス。ソリューションには、他の小さな粒子が含まれている、いくつかはサンプルでは、バッファー交換につながるに移動します。透析は平衡プロセスなので透析液更新できます複数回さらに小さい分子を転置します。サンプルは、さらなる処理のため再収集プロセスが完了します。 今あなた ' 見 ve 透析の基礎ができます ' s の一般的な手順を見てみましょう。 手順を開始する前に膜が透析液中に浸漬します。これにより、使いやすく、あらゆる防腐剤を削除します。一度準備ができて、サンプルを注射器で通常、収集して透析コンテナーに追加されます。これは裸管をすることができます。 またはカセット内に含まれます。余分な空気がサンプルを最大化する透析セットアップから削除され ' 膜の表面積を s。セットアップは、拡散を最大限に攪拌を透析液に分類されます。それで攪拌を阻害しないする必要があります。 透析液が変更される関連する間隔でサンプルと透析液間の平衡に到達します。最後の変更後の反応は通常一晩実行に残っています。十分な時間期間の後、カセットから無料のバッファーまたは交換のサンプルが削除されます。サンプルの分析または実験の性質によっては、さらに処理することができますを収集した後。 今は ' 一般的な透析の手順見てきました、' s はこの手法は生化学で使用される方法のいくつかを参照してください。 密度勾配は、複雑な生体試料を分離する一般的な方法です。この概念は、塩化物イオンを小さな粒子、ショ糖やセシウムの分布に依存します。完了すると、これらの試薬は通常収集されたサンプルを処理することができます前に削除する必要があります。透析は将来の分析のための精製されたサンプルを利用することが可能になります。 ある特定の蛋白質がセル内で見つかった ' s 脂質二重層とは通常球状脂質ベシクル リポソームと呼ばれるにそれらを散在しました。タンパク質や脂質は最初洗剤で抽出し

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    08:06
    酵素試金とカイネティクス

    酵素反応速度論では、生物に必要な化学反応を促進する生体の酵素の触媒作用について説明します。フォーム製品の基板と呼ばれる分子に作用する酵素。酵素の速度論的パラメーターは直接または間接的に時間をかけて基板または製品の濃度の変化を測定するアッセイによって判別されます。

    このビデオでは、酵素反応速度論 (レート方程式を含む) と運動モデルの基本原則をカバーします。酵素試金を支配する概念はまた、典型的な比色定量法に続いて議論します。アプリケーションの説明フェルスター共鳴エネルギー移動 (FRET) 分析、環境では、細胞外酵素を特徴付けるを介して酵素免疫測定法と調査 DNA 修復速度分子プローブの使用します。

    酵素は、生命に不可欠な生化学的触媒です。酵素試金は、酵素の触媒作用の解明、酵素反応の動力学的性質の研究に使用されます。このビデオは酵素反応速度論をカバーし、一般的な手順では、上に行くし、.いくつかのアプリケーションを表示

    酵素は、蛋白質、まい KM の結果の高い効率の結果します。 酵素反応速度論を解明するために使用する要素は、実験的に決定する必要があります。これらの試金は通常、制御された環境で酵素と基質ソリューションを混合することによって実行されます。観測は、基板、製品、または時間経過に伴って副生成物の濃度の変化を測定することによって作られています。 濃度の経年変化は、反応速度を決定するために使用されます。速度を決定するために複数の濃度で率データを取得する必要があります。占める割合バーク プロットとして知られている逆の初期濃度と逆の初期速度のプロットが直線の場合、反応はミカエリス-メンテン型の速度論に従います。斜面と直線の切片は、KM と Vmax は、kcat と酵素の効率を計算する使用できますの速度論的パラメーターの決定を許可します。 今では酵素反応速度論の原則を議論されている、典型的な酵素試金の実行方法を見てみましょう。 この手順では、比色定量法が示されています。最初のステップは、蛋白質濃度と吸光度を関連付ける標準的な曲線を生成します。濃度既知のソリューションは、コントロールのサンプルと一緒に用意しています。標的タンパク質と反応する開発者ソリューションは、着色された化合物を生成する追加されます。吸光度が測定し、標準曲線の生成を濃度に対してプロットします。 アッセイを実行するには、知られている基質濃度は酵素の適切な量と共に用意しています。酵素と基質は混合し、インキュベートする指定された時間間隔を許可しました。緩衝溶液と加熱ブロック pH と温度を管理します。焼入エージェントを追加して、反応を停止します。開発者ソリューションは反応に追加し、混合します。キュベットに配置されます、ソリューションと吸光度を測定します。基板の消費量は、標準曲線を測定した吸光度を比較することによって決まります。収集したデータを使用して、初期の反応速度は時間の経過と共に濃度をプロットすることによって決定されます。最後に、速度データと濃度、ミカエリス-メンテン型プロットが行われます。回転数と酵素の効率など酵素の動力学的性質の決定が可能になります。 今では試金プロシージャを確認しましたところ、その他さまざまな試金が実行されると、アプリケーシ

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    07:26
    MALDI-TOF 質量分析法

    マトリックス支援レーザー脱離イオン化 (MALDI) は、生体分子の解析に最適な質量分析イオン源です。気体状の化合物をイオン化、代わりにサンプルはレーザーによって打たれるマトリックスに埋め込まれます。マトリックスは、エネルギーの大半を吸収します。このエネルギーの一部は、サンプルでは、結果としてイオン化するに転送されます。試料イオンは、飛行時間 (TOF) アナライザーを使用して識別できます。

    このビデオは、行列と飛行時間型の質量電荷比を明らかにする使用方法を含む、MALDI-TOF の原則をカバーしています。この手順は、MALDI プレート、プレート、サンプルの読み込みと TOF 質量分析計の操作の準備を示しています。最後のセクションでは、アプリケーションおよびバリエーションが表示されます、全細胞分析を含む複雑な生体試料および電子スプレー イオン化の評価。

    マトリックス支援レーザー脱離イオン化または MALDIどのさらなる技術によって識別することができます。詳細については、トピックをこのコレクションのビデオを参照してください。 MALDI-TOF の基本が議論されている今、研究室では、プロセスを見てみましょう。 実験を開始する前にサンプルの脱着ができるマトリックスの選択を検討することが重要です。それする必要がありますレーザー エネルギーを吸収する、真空中で安定である、ない標的分子と反応、脱着することができます。、サンプルの種類に応じて異なる行列が優先されます。大きい蛋白質 CHCA と DHB の組み合わせは個々 の行列よりも解像度と呼ばれるピークのよりよい分離を示しています。 いくつかのサンプルを準備する方法があります。「二重層」、または「サンドイッチ」方式と呼ばれるものを紹介します。まず、質量は汚染に非常に敏感、超高純度試薬、MALDI プレートをきれい。不活性ガスの流れとプレートを乾燥させます。 次に、飽和マトリックス ソリューションで作られています、通常有機溶剤。ソリューションは MALDI プレートに縞になる、乾燥します。トリフルオロ酢酸または、TFA を含む行列の 2 番目の飽和溶液を調製します。TFA の気体段階にイオンに役立ちます。 次に、サンプル ソリューションは、乾燥した行列スポットの上に追加されます。マトリックス「サンドイッチ」を完成、サンプル上に TFA を含むマトリックス ソリューションを追加します。スポットの均質性は、低倍率の顕微鏡下で確認できます。 知られている大衆の広い範囲との混合物であり m/z に飛行時間を関連付けるために使用は、校正標準をプレートします。最後に、陰性対照として単独での行列をプレートします。 スポットを分析するには、楽器にターゲット プレートを配置します。破片、タイトな真空の形成を可能にするがないことを確認します。ソフトウェアで標準を選択、負の制御、および関心のサンプル。ラベルの正しい識別とスポット。 解析のパフォーマンスを改善するためにイオン源とレンズ電圧を操作できます。楽器やサンプルの仕様により異なります。標準のスポットに焦点を当てるし、ソフトウェアで計測器を校正します。 次に、各サン

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    07:08
    タンデム質量分析法

    タンデム質量分析法における関心の生体分子は生体試料から分離され、その組成とシーケンスを明らかにするために複数のサブユニットに断片化されました。これは、シリーズの質量分析装置を持っていることで。最初の分光計は、特定質量比を充電するためのサンプルとフィルター イオンをイオン化します。フィルター処理されたイオンは断片化し、フラグメントの分析、2 つ目の質量分析計に渡されます。

    このビデオは、質量比の選択と解離のメソッドを含むタンデム質量分析法の原則を紹介します。また生化学的化合物を分析するための一般的な手順で使用しているタンデム質量分析法による衝突誘起解離。アプリケーションでは、監視、タンパク質翻訳後修飾の定量およびタクロリムス血中濃度の検出選択反応を説明します。

    タンデム質量分析のリンクが最初に質量分析の複数の段階、生体分子を分離、化学構造の側面を確認して一緒に。生体は、その分子の組成を決定し難い大規模で複雑な構造を持ちます。タンデム質量分析は、後で識別・手順は、サンプルをイオン化するためです。生体分子、マトリックス支援レーザー脱離エレクトロ スプレー イオン化とこれは通常です。前駆物質イオン信号は、イオン光学系のチューニングによって、最適化されます。ターゲットが分離されれば、および断片化メソッドを選択すると、CID など。 衝突のセルに前駆イオンを加速する、電圧印加の強さは、断片化の程度を影響します。前駆体がほぼ最高製品イオンと比較して 10% 豊富になるまで、この電圧が増加します。複数スペクトルが取得され、十分な信号対雑音比を達成するまでの平均します。必要スキャン数は元の前駆イオンの信号強度に依存して、3 から 300 までの範囲をすることができます。 この例では、エシェリヒア属大腸菌 K-12 から脂質 A の検体は、CID 後 19 主なフラグメントを持っていた。リピド A の構造はよく知られている、サンプルから特定の構成を再構築するためのソフトウェアを許可します。 今では手順を見てきた、いくつかの生化学のタンデム質量分析法を使用する方法を見てみましょう。 タンデム質量分析法における一般的なスキャン モードは選択した反応の監視、または SRM です。SRM では、両方の質量分析装置は、前駆体および製品、特定のイオンに焦点を当て、選択した質量電荷比に固定されます。SRM の感度の高いのためペプチド濃度既知の標準スペクトルを利用し、定量化する興味の蛋白質をできるように、未知のサンプルを比較できます。、 タンパク質一般官能基のメチル基、リン酸基、糖鎖と呼ばれる糖などの添加により通常翻訳後変更されます。これらは細胞シグナリング プロセス、細胞が互いに通信する方法の解明に重要です。タンデム質量分析法より小さいコンポーネントに蛋白質をフラグメント化、ため特定のフラグメントまたはアミノ酸も PTM の位置を特定することが可能です。アセチル化とトリメチルなどのいくつかの変更は、クロマト グラフ分離は、質量分析の前に行われるだけで、質量を区別することは困難。 患者の血液で多くの検体は、典型的な質量分析法の検出限界以下の濃度で発見されます。SRM の別の利点は、すべてが 1 つの製品のイオン、感度、検出下限値を最大 100 倍に強化を破棄です

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    07:38
    タンパク質の結晶化

    タンパク結晶、生体分子の固体格子を取得はタンパク質の構造を解明し、タンパク質の機能の研究ができます。結晶化は、pH、温度、イオン強度、および蛋白質の集中を含む多くの要因の組み合わせで浄化された蛋白質を乾燥を伴います。結晶を取得すると、蛋白質の構造、x 線回折法と電子密度モデルの計算によって解明されうる。

    このビデオは、タンパク質の結晶化を紹介し、一般的な手順を示しています。タンパク質の発現と精製、結晶化、x 線回折の手順で覆われています。タンパク質の結晶化のアプリケーションには、膜タンパク質の構造解析、サイト裁決、インシリコ創が含まれます。

    タンパク質の結晶化、蛋白質の格子状固体のフォームを取得するプロセスです。これらの結晶は、構造生物学、タンパク質機能の研究を支援する特に貴重です。量産仕様や SDS ページなどの他の技術だけ蛋白質の一次元構造の情報を提供できます。組換え蛋白質の表現の x。各露光量は、各スポットの回折結晶から出てくるし、検出器によって登録されているが、イメージを提供します。データは、結晶内の原子の配置のモデルを生成する結合されます。結果として得られる結晶構造 2 オングストロームの一般的な解像度と、原子の三次元配置を示しています。 タンパク質の結晶化の原理について説明しましたが、一般的なプロトコルを見てみましょう。 手順を開始するには、興味の遺伝子を含む表現のベクトルはセルに変換されます。細胞を培養し、中間ログ段階で式が IPTG 遺伝子の mRNA の転写をトリガーするなど、インデューサを追加することによって開始されます。タンパク質発現後粗材は換散バッファー中に浮遊し、遠心分離によって明らかに。 明らかにしライセートがニッケル列に読み込まれます、polyhistidine タグ付きタンパク質が他のすべての生体分子が洗い流される中列にバインドします。 純粋な蛋白質の数ミリグラムを取得すると、気相拡散による結晶化の準備が整いました。24 ウェル ハング/シッティング ドロップ トレイは、さまざまな濃度の塩化ナトリウムとナトリウム酢酸緩衝液でいっぱいです。座ってのドロップ、タンパク質と貯留層のソリューションの平等なボリューム、各井戸の上の棚の上に戻し、トレイは透明テープで覆われています。インキュベーション室に格納されます、トレイと井戸が次の日、その後、数日ごとの成長のため監視されます。 受けたことを適切な結晶 x 線回折分析の準備は完了です。結晶は、選択した方向に結晶を配置するゴニオ メーターにマウントされます。あらゆる角度で x 線回折パターンを作り出すの単色ビーム クリスタルが点灯します。ソフトウェアでは、結晶内の原子の位置を決定することで結晶内の電子密度の三次元モデルに、さまざまな方向で撮影した 2次元の画像に変換します。 今では手順を見直している、タンパク質の結晶化と別の結晶化の技術のいくつかの有用なアプリケーションを確認してみましょう。 タンパク質の結晶化は、インシリコ創薬に使えます。インフルエンザ ウイルスのポリメラーゼ基本的なタンパク質 2、哺乳類のウイルス感染症にリンクされている、三次元構造は、結晶化と x 線回折法

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    07:50
    クロマトグラフィーによる生体分子の浄化方法

    生化学、クロマトグラフィーによる精製手法を利用して、複雑な混合物から物質を分離します。生化学者で一般的に使用される 2 つの手段は、サイズ排除クロマトグラフィーおよびアフィニ ティー ・ クロマトグラフィー。サイズ排除クロマトグラフィーでは、多孔質ビーズを充填したカラムは、サイズに基づいて混合物のコンポーネントを分離します。一方、アフィニ ティー ・ クロマトグラフィーは生体分子の特定の分離のためターゲット固有の配位子を含む液相で構成される列を使用してできます。

    このビデオは、サイズ排除とアフィニ ティー ・ クロマトグラフィー、それらを支配する概念の導入として提供しています。固定化金属アフィニ ティー ・ クロマトグラフィーによるヒスチジン付けられた蛋白質の浄化のためのステップバイ ステップの手順を説明します。生物化学および生物医学研究のクロマト グラフ法の両方のためのアプリケーションがプロファイルもされます。

    「クロマトグラフィー」は複雑な混合物、に列を終了します。小さな分数列からは、チューブで収集されます。各分画をゲル電気泳動やその他の分析技術ターゲット分子の品質をテストします。 今アフィニ ティー ・ クロマトグラフィーまたは AC、蛋白質を浄化するために最も効率的な方法のいずれかで見てみましょう。多くの生体分子選択的に AC を固定相にターゲット固有のリガンドを付着によって利用する特定配位子をプロパティにバインドします。 リガンドは、および残りの部分を通過するとき混合物は列に流れる、標的分子が添付します。混合物はカラムに通した後、特異性に基づいて 2 つの溶出方法の 1 つを通してターゲット分子を収集できます。 生物特異的溶出と言うことが、「通常の」や「逆の役割」があります。通常役割生物特異的溶出ターゲット生体分子と結合する付着のリガンドと競合する、エージェントが追加されます。 逆ロール生物特異的溶出、エージェントは付着のリガンドをバインドするターゲットと競合します。2 番目の溶出タイプ、無指定の溶出ソリューションの pH、イオン強度、または極性の変更ターゲット リガンドが削減されます。「タグ」を含む蛋白質を表現できるタンパク質はリガンドを固定化することができますバインドされません、場合: 短いペプチド配列リガンドを結合するように設計。 1 つの変化は金属イオンを固定化したアフィニ ティー ・ クロマトグラフィー、略して、「IMAC」ニッケルやコバルトのような付着金属のリガンドが変更された蛋白質のヒスチジン残基に結合。分子生物学的手法によるターゲット蛋白質はヒスチジン残基、ヒスチジンのイミダゾールの側鎖を介して金属にバインド polyhistidine タグと呼ばれるを繰り返し生成されます。連結された後は、蛋白質逆役割特定溶出を介して無料のイミダゾールを収集することができます、後でダウン ストリーム アプリケーションのさまざまな。 アフィニ ティー ・ クロマトグラフィーの理論を見てきた、今、研究室で IMAC 手順を見てみましょう。 IMAC の静止した段階は移動相と彼の付けられた蛋白質の結合をできるようにサンプルの混合物に直接追加できます。こ

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    07:30
    二次元ゲル電気泳動

    二次元ゲル電気泳動法 (2DGE) は、生体分子の混合物からの何千もの問題を解決できる手法です。この技法が一緒に結合されている 2 つの明瞭な分離法: 等電集中 (IEF) とナトリウム dodecyl 硫酸ポリアクリルアミドゲル電気泳動 (SDS-PAGE)。これは物理的に彼らの等電点 (電気化学的特性) と、分子量でゲルの 2 つの軸にまたがる化合物を分離します。

    このビデオでは手順は、2DGE と複雑なタンパク質溶液の組成を特徴付けるための一般的な手順の主な概念を説明します。病気の発生と進展、治療、次の翻訳後修飾 (PTM) 蛋白質の調査の監視のためのバイオ マーカー検出を含むアプリケーションのセクションでこの技術の 3 つの例のとおりです。

    2 次元、または 2 D、ゲル電気泳動法は単一の混合物からたくさんの蛋白質を分離する 2 つの異なる分離法を用いる。1 つの技術の SDS-PAGE やナトリウム dodecyl用いてプロテオーム マップを可視化、興味の蛋白質が識別されます。 第 2 ゲルの電気泳動の原理について説明した、代表的な検査法に行きましょう。 実験を実行する前に、蛋白質はメディアに可溶化する必要があります。サンプルの可溶化脱水素結合相互作用、タンパク質の電荷、ジスルフィド結合を破るに還元剤の変更を防ぐために非イオン性洗剤を混乱させるためカオトロ ピック剤の組み合わせでタンパク質を集約することによって達成され、バッファーします。遠心分離、および結果として得られるペレット; のコレクションによって、干渉の豊富なタンパク質や他の分子を削除するには、材料を順番に抽出します。エンドヌクレアーゼに実験を妨げる DNA を使用する酵素処理後。 タンパク質を可溶化されている、一度 IPG ストリップがストリップのクリーニング液と洗浄によって調製し、乾燥する逆さまのまま。各ストリップ ストリップ ホルダー番号を割り当てられます。一度準備ができて、細胞のエキスがプラスの末尾に負からゆっくりと、スライド モーションのストリップ上に読み込まれます。電極上に、ゲルのストリップの下に湿気のあぶらとり紙を配置水分補給の目的IPG ストリップし、IEF 楽器の上に並んでいます。高電流を適用し、タンパク質が移行し始めます。 最初の次元が完了した後、SDS ページのゲルは、鋳造装置で用意しています。IPG のストリップは、SDS 含んでいる平衡バッファーにダウン顔を置くことによって扱われます。電気泳動装置、電気泳動バッファーの追加準備します。治療の IPG ストリップは、ピンセット、ゲル板の上に置かれ、agarose シール ソリューションで封を使用して収集されます。電圧源は、電界、最速の移動蛋白質はゲルの底から 1 cm まで保持されますを適用します。 電気泳動の終了後、タンパク質を視覚化する必要があります。従来この Coomassie 青いや銀の硝酸塩との汚損によって実行されます。興味の蛋白質はゲルから転送、西部のしみの分析を行ったことがあります。 2 番目の識別方法には、質量分析法で分析するよりも、それらを消化、ゲルからタンパク質の切除が含まれます。 今では我々 は、手順を確認したとこ

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    08:27
    代謝ラベリング

    代謝ラベリングを使用して、生化学的変換とセルに発生する変更をプローブします。自然の生体分子の構造を模倣する化学類縁体を使用して、これは。セルは、類縁体の内因性の生化学的プロセスは、ラベル付けされている化合物を生産を利用します。ラベル検出および親和性の札は、SDS-PAGE や NMR などの他の生化学的分析手法を用いた代謝経路を解明するために使用することができることができます。

    このビデオは、代謝ラベリングとショー 2 つの一般的な手順の概念を紹介します。 最初は、同位体標識を使用して蛋白質のリン酸化の特徴します。2 番目のカバー代謝ラベリングのも 3 つのアプリケーション内でのタンパク質間相互作用を特徴付けるための光反応性ラベリング表示されます: 植物素材をラベル付け、分類の速度を測定するための RNA および初期胚の糖鎖をラベリングします。

    代謝ラベリングを使用して、セルの機械を調査します。これは生化学的変換と発生する変更をプローブする化学きますスナップショットとして機能します。これはどんな反応が反応種を識別することによって代謝経路で発生しているし、の結合部位を決定することでやり取りする方法に洞察力を提供します。 Bioorthogonal ラベリング戦略は、自然な生体分子がほとんどない反応性を持つ小型の官能基を持つ類縁体を利用します。たとえば、アザイドと言われてその反応の生化学的反応に直交する、小規模の機能グループです。シュタウディンガー結紮のホスフィン グループのアジドフェニル グループを攻撃します。これは近くのエステル、アミン結合リガンドの結果と分子反応遷移状態を得られます。Bioorthogonal 機能グループ分子に組み込まれては蛍光官能など検出タグで結紮することができ、親和性抗原などタグします。 いくつかの概念および新陳代謝の戦略が議論されている今、研究室では、プロセスを見てみましょう。 代謝標識実験の最初のステップは興味の蛋白質を集めることです。これを行うには、セル、プレート、育つ、表現方法は目的タンパク質の合成を促進するために使用されます。この例では、ロイシン豊富な繰り返しキナーゼまたはニラで表現されます。リン酸、放射性リン-32 を含む、アナログとして使用されます。電離放射線に対する保護するために適切な対策が必要です。これには、作業領域の設定、適切な保護具を身に着けている、放射能汚染のチェックが含まれます。安全対策が実行されると、同位体の類縁化合物を含む培地が用意しています。文化からメディアを削除、1 つを含む同位体化学類縁体に置き換えされ、培養します。次の培養細胞が分離します。ライセートの収集し、精製します。 浄化後、蛋白質は SDS ページを使用し、PVDF 膜に転送が解決されます。オートラジオグラフィーは、フィルムを x 線に膜を公開することによってされるので、蛍光イメージャを使用して測定します。西部にしみが付くこと、PVDF 膜のタンパク質の相対レベルを測定するために使用されます。この例ではロイシン豊富なリン酸化レベルは、キナーゼは、293 t 細胞を測定した合成を繰り返します。どのくらいリン ゲノムスキャニング ショーは、蛋白質に組み込まれました。ニラの蛋白質のレベルを解明西部にしみが付くこと。画像解析ソフトを使用

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    06:56
    ゲルシフトアッセイ (EMSA)

    ゲルシフトアッセイ (EMSA) は、タンパク質や核酸の間のバインディングを明らかにするために使用生化学的なプロシージャです。このアッセイ標識核酸およびテスト蛋白質が混在します。バインディングは、質量に基づくコンポーネントを分離するゲルの電気泳動によって決められてタメて構造。

    このビデオは、EMSA とゲルおよび蛋白質の準備、バインド、電気泳動、検出などの一般的な手順の概念を示しています。このビデオで説明したアプリケーションには、クロマチンの酵素、biontinylation が組み込まれた変更された EMSA の分析と結合性細菌の応答調節物質に関する研究が含まれます。

    EMSA、電気泳動の移動性シフト試金のゲル シフト試金とも呼ばれますは、汎用性と敏感な生化学的なプロシージャです。EMSA はゲルの電気泳動のバンドの変化に着目したタンパク質と核酸との間のバインディングを解明します。

    このビデオは、EMSAがあります。これを行うには、分子生物学的手法、細胞の蛋白質を表現し、浄化されます。 核酸増幅は、プローブを作成するラベルします。ラベリングは、放射性リン 32 を含む dCTP を 10 分間インキュベーションを介して行われます。放射線の安全なワークベンチと保護具が必要です。 ゲルは、用意しています。ゲル非変化、蛋白質の構造を変更して可能性のある電気泳動中にプローブからバインド解除を防ぐする必要があります。ポリアクリルアミドゲルの長さに 5 を 20 nm と短いプローブ 100 塩基対までの役に立つの細孔径があります。Agarose のゲルは 70-700 nm の細孔径を持ち、大きいプローブ用に便利です。 タンパク質と核酸プローブの準備、我々 はバインドに進みます。トリス緩衝液を用意し、タンパク質とプローブが追加されます。PH を生理的条件と塩濃度のタンパク質が非標的核酸と弱い結合を形成することを防ぐために十分にする必要があります。4 ° C で 20-30 分のため反応が進む 次のステップは電気泳動です。低イオン強度および結合の反作用で使用されるような pH のバッファーが利用されています。錯体を安定化、モビリティを向上させ、熱発生は少なく、「ケージ効果」が得られます。電気泳動後のゲルのコンポーネントは、フィルター紙の上に転送されます。暗い部屋では、フィルター ペーパー、フィルムに公開されます。プローブに結合するタンパク質と、2 つの異なるラベルの付いた領域は転送で表示されます。コンプレックスを表す 1 つと非連結のプローブを表す別の 1 つ。分離は、核酸に蛋白質が正常にバインドされることを示します。 今では基本的な手順を見てきた、いくつかのアプリケーションを見てみましょう。 クロマチンは、DNA および真核細胞に存在する蛋白質の堅く詰められた複合体であります。酵素のクロマチン転写する DNA を開く構造に変更します。複合体の移動を変更、EMSA を使用して酵素の結合活性を探索できます。 分類に別の方法でメチル基転移酵素酵素と DNA との相互作用を活用しています。補足因子は、DNA メチル基転移酵素を介して完全にバインドする変更できます。リン 32 のラ

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    08:48
    タンパク質の吸光光度定量

    濃度の測定は、多くの生化学的な試金の基本的なステップです。タンパク質の吸光光度定量活用という事実をサンプルに光吸収物質が含まれていますより多く、少ない光は、それを送信します。濃度と吸収との関係は線形なのでこの現象使用できます試料中濃度を測定する不明です。

    このビデオでは、タンパク質の吸光光度定量法の基本を解説し、ブラッドフォードの試金および Lowry 方法を紹介します。ビデオの手順は一般的なブラッドフォードの試金をカバーします。覆われているアプリケーションには、核酸濃度・純度を特徴付けるための量が非常に少ない、バイオミメティック材料の効率と Remazol 色素を用いたタンパク質の吸光光度定量の別のバリエーションを結合の決定の直接測定が含まれます。

    多くの生化学的な試金の基本的なステップは、サンプル中のタンパク質の濃度を決定します。小さなサンプル集中の決定、nm。しかし、ブラッドフォードの試金は集中の短い範囲に線形希釈はしばしば解析の前に必要なのでです。 Lowry 法は、ビウレットの試薬、ペプチド結合と反応して銅イオンと芳香族アミノ酸の酸化 Ciocâlteu Folin 試薬のアルカリ溶液を組み合わせたものです。サンプルの結果の色の変化はタンパク質濃度に比例します。 750 に減らされた Folin 試薬の吸光度を判断できる nm。直接吸収のような各蛋白質はユニークな応答には、興味の蛋白質のためにキャリブレーションする必要があります。今、我々 は、最も一般的なアッセイの背後にある基本的な原則を確認したところ、吸収とブラッドフォードの試金の実行方法直接見てみましょう。 直接吸光分析するには、ゼロの吸光度を決定する空白を分光光度計を校正します。標準的なソリューションは、検量線の作成に使用、調理されます。その後、最初の標準の因数は、キュベットに追加、分光光度計に配置。 吸光度値 280 nm が記録されます。このプロセスは、実行ごとにきれいなキュベットを使用して、それぞれの標準の繰り返されます。完了すると、検量線は濃度と吸光度をプロットすることによって作成されます。この直線の傾きは、濃度を吸光度を関連するモル減衰係数です。 次に、未知のサンプルは、キュベットに追加され、吸光度値が記録されます。同様に別の吸光光度定量法のデータ解析と同様、ブラッドフォードの試金を見ているカバーします。 ここでは、ブラッドフォード蛋白質の試金は 96 ウェル プレートに BSA の標準で実行されます。まず、BSA 在庫ソリューションを用意しています。 未知のソリューションは、濃度の試金の範囲内で確実に脱イオン水で希釈しました。キットによって Coomassie の染料はまた希釈を必要があります。その後、検量線は 96 ウェル プレートに BSA の基準を追加することによって設定されます。 脱イオン水は、標準曲線の生成に必要な濃度に達するに追加されます。未知のサンプルは、トリプリケート正確な測定を使用するために、プレートを追加必要があります。Coomassie 色素が追加されます次に、ピペットを混ぜて、

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    08:41
    密度勾配遠心

    密度勾配遠心分離し、生体分子や細胞構造を浄化するために使用する一般的な手法であります。この手法は、懸濁液、溶媒よりもより密な粒子が堆積物、それらがより少なく密が浮かびますしながら事実を悪用します。高速遠心がこのプロセスを加速する密度勾配遠心管中の密度を減少させるレイヤリング液体によって確立することができます内の生体分子を分離するために使用されます。

    ビデオ、サンプル準備、ショ糖密度勾配、超遠心分離と分別された検体のコレクションの作成を示すプロシージャを含む密度勾配超遠心法の原理を説明します。アプリケーションでは、核酸の複合体、およびセシウム塩化密度勾配を用いた分離の分離多蛋白質の複合体の分離を説明します。

    密度勾配遠心分離および生化学的な実験のための細胞構造を浄化する一般的な方法であります。手法は、非破壊の密度勾配で細胞成分を分離するのに高速、または、超遠心分離機を使用します。このビデオは、密度勾配超遠心法の原理を説明します、ショ糖密度勾配を使用して一削除する、予備の低速遠心による分別があります。次に、ショ糖ソリューションが用意されています。 ショ糖が増加額各ソリューションはより集中され、したがって、先行するものより高密度で追加されます。ソリューションの正確な密度は生物により異なるが、分離するコンポーネントによって異なります。ソリューションの最後の解決策、試料の密度のコンポーネントよりも高密度に分離するコンポーネント間の密度が必要です。アプリケーションでスクロース、核酸のようなより高密度のコンポーネントを分離するためのテクニックを説明します。 きれいな遠心管にはショ糖密度勾配が作成されました。ピペットを使用最も濃縮されたショ糖溶液を描画します。握られた直立物管、ピペット チップを壁の高置かれ、液体調剤着実にダウン。作業領域は、振動および他の妨害を置かないことが重要です。 先端を交換した後残りの解決策は、密度の高い順に追加されます。彼らは独立した層を形成し、混合を避けるために慎重に分配されます。最後に、細胞のサンプルの約 30 ミリリットルがグラデーションの上に追加され、チューブの重量を量った。これはプロセスの次のステップ、重量配分のバランスをとるためです。 遠心分離をできるだけ早く開始する必要があります。チューブは、スロットに反対の等しい重量の空のソリューションを配置することによって、バランスの取れた、ローターに配置されます。ローターは、超遠心機、密封システムに配置されます。温度と回転速度と時間を設定します。典型的な値は、16 時間以上 100,000 × g の力で 4 ° C です。 遠心分離の後、チューブが、ローターから引き出される直立し、邪魔されずにそれを保つために世話します。携帯電話のさまざまなコンポーネントがソリューションのレイヤー間離散バンドに分画しました。分数は、注射器で収集できます。または、チューブの底部は罰金、滅菌針でパンクすることができ、生殖不能の管に流出収集します。細胞成分が分離されました。-80 ° C で保存することができます。 今では基本的な手順を見てきた、いくつかのアプリケーションを見てみましょう。 典型的なアプリケーションは、植物細胞における多蛋白質複合体の分離です。この例で

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    08:07
    Co 免疫沈降法とプルダウンの試金

    Co-免疫沈降 (CoIP) プルダウン ・ アッセイは、安定したタンパク質間相互作用を識別するために密接に関連するメソッドです。これらのメソッドは、免疫沈降、抗体と結合した自由な蛋白質からターゲット蛋白質を分離する方法に関連しています。CoIP、抗体結合蛋白質は抗体と結合しない別の蛋白質にバインド自体、これはタンパク質タンパク質を保持する分離プロセスによって、続いて複雑な。プルダウンの試金の違いは餌の親和性タグ付きタンパク質を交換して、抗体、アフィニ ティー ・ クロマトグラフィー蛋白質蛋白質の複合体を分離するために使用します。

    このビデオでは、CoIP、プルダウンの試金、および研究室での実装について説明します。試薬、装置、浄化し、バインドされた蛋白質を分析するために使用楽器など、各テクニックの手順プロトコルが覆われています。このビデオのアプリケーション セクションが myxovirusの読み込みを減らす沸騰によって抗体と固体のサポートから解放されます。 プルダウン アッセイは、co-免疫沈降、抗体ではなく、「餌」蛋白質の使用でのみが異なるに似ています。分子生物学的手法によるこのタンパク質の餌は、ヒスチジンの残余のシリーズなどの親和性タグと設計されています。これらの親和性の札、「生体分子分離クロマトグラフィー ベース」で説明タンパク質は、固定化のアフィニティーリガンド タグのために特定のキャプチャされます。キャプチャされたタンパク質を「餌」と複合体を形成するタンパク質を含むサンプルでインキュベーションします。蛋白質の複合体は、「餌」タンパク質にタグの特定の競争力のある検体を含む溶液で洗浄することにより親和性サポートから解放されます。プルダウン アッセイは、co-免疫沈降によって予測された蛋白質の相互作用を確認するため、未知の蛋白質の相互作用を発見するために役立ちます。 Co 免疫沈降とプルダウン ・ アッセイの原理が説明されている、今は実験室プロシージャを見てみましょう。 最初 co 免疫沈降を説明しましょう。一連の microfuge の管の次の追加: PBS バッファー、および蛋白抗体に結合する樹脂タンパク質複合体、即ち 50% 溶液です。適切な配分を確保するため microfuge の管が回転して、追加の PBS バッファーで樹脂を洗浄するし。細胞ライセート、目的のタンパク質を含むと 2 μ g の抗体が microfuge の管に追加され、混合物は 4 ° C で 1 時間の回転遠心分離によってビーズをペレット、上清を捨て、ビーズ 3 回洗浄バッファーを非バインド タンパク質を削除して再。抗体蛋白質の複合体を含むビーズは、SDS ページ サンプル読み込みバッファー、抗体の複合体の除去、SDS-PAGE とイムノブロット解析を減らすことです。 今、プルダウンの試金のための手順について説明します:「餌」タンパク質は適切な親和性タグとプラスミドで表されます。ログ相成長を達した後セルを溶解し, して遠心し。「餌」タンパク質のビオチン タグをキャプチャ、中断されたストレプトアビジン セファローズ ビーズがおよび microfuge の管に戻します。ビーズは遠心し、上清を吸引により慎重に削

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    07:04
    膜タンパク質の再構成

    再構成は、元のフォームまたは関数に分離生体分子を返すプロセスです。これは、膜タンパク質は、細胞の重要な機能を有効にし、近くの脂質の動作に影響を研究するため便利です。原精製膜蛋白質の機能を研究するには、彼らは人工脂質膜にそれらを統合することによって再構成する必要があります。

    このビデオは、膜タンパク質の再構成の概念と洗剤、人工の小胞に隔離された蛋白質の定款及びソリューションから洗剤の分離、脂質を用いた人工膜小胞の形成を使用して蛋白質の隔離など、関連する手順を紹介します。最後に、2 つのアプリケーションが覆われている: 膜の輸送蛋白質及び集光性タンパク質の再構成の再構成。

    再構成は、元のフォームまたは機能に分離生体分子を復元するプロセスです。このアプローチは、膜タンパク質は、多くの重要な細胞プロセスを有効にして、隣接の脂質の動作に影響を勉強するときによく使用されます。ただし、細胞環境の複雑さは、膜タンパク質機能の勉強は難しいin-situ 蛋白質を再構成するリポソームと可溶性タンパク質が結合され、透析または化学吸着によって、洗剤がソリューションから削除されます。タンパク質とリポソーム急速に組み立ててプロテオリポソーム、だから親水性グループのみが公開されます。タンパク質には、細胞膜で分離して調べることができます彼らと、機能します。 リポソームの膜タンパク質の再構成のプロトコルを介してタンパク質再構成の基礎を説明しましたので、これで行こう 膜タンパク質を分離するには、セルが分離されます。遠心分離と切れ目のない細胞が削除されます。 上清は膜をペレットを高速で遠心分離します。ペレットの再懸濁は、タンパク質を抽出する洗剤が追加されます。 残りの細胞の残骸が追加の遠心分離によって削除されます。タンパク質は、カラム ・ クロマトグラフィと培養上清より精製した集中や必要に応じてさらに精製します。 リポソームを準備するには、有機溶媒中でリン脂質の懸濁液、窒素またはアルゴンの下で乾燥させます。 リン脂質が水和反応バッファーと水和および混合物は、リポソームの作成を完了する超音波処理します。 洗剤は、蛋白質と結合されるリポソームを可溶化に追加されます。 洗剤は、ポリスチレン ビーズ、透析、または洗剤バインド列への吸着によって削除されます。結果プロテオリポソームは浄化され、その後の実験で使用する準備ができています。 今、あなたは、膜タンパク質の再構成手順の基本原則に精通しているが、生化学のタンパク質再構成のいくつかのアプリケーションを見てみましょう。 膜輸送タンパク質は、トランスポート メカニズムの明確な理解を得るために再構成されました。その関数の後の再構成は、ヨウ化物イオンの流出を確認しました。その後、様々 な小分子イオン チャネル阻害剤や度の存在下で輸送活動を調べた。このように、これらの小さな分子の輸送蛋白質との直接相互作用を検討する可能性が。 クロロフィルとカロテノイド結合膜タンパク質植物の光を収穫、電荷分離を促進するため、光損傷を軽減します。これらの集光性タンパク質を再構成によって、フォールディング動力学と顔料との相互作用を学ぶことができます。この手法

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    06:38
    蛍光共鳴エネルギー移動 (FRET)

    蛍光共鳴エネルギー移動 (FRET) は、近距離の生化学的な相互作用を調査するために使用する現象です。フレットのドナー蓄光分子非放射活性を転送できますエネルギー受容体分子にそれぞれ排出量と吸光度スペクトルが重なっている場合。転送されたエネルギーの量 — とサンプルの全体的な放出したがって — 蓄光分子のドナー-アクセプタ対の近さによって異なります。フレットの解析はこれから生体分子構造と相互作用の詳細な情報を取得するその他の生化学の手法を組み合わせて “ 分光ルーラー。 ”

    このビデオの原則と FRET。蛍光の詳細については、参照してくださいゼウス ' s 蛍光顕微鏡ビデオ。異なる蛍光物質を吸収し、頻繁に重複する別の波長の光を発する。別蛍光体の吸収スペクトルと、蛍光体の発光スペクトルが大幅に重なっている場合、“ ドナー ” によって吸収される仮想光子をリリース、“ 受容体 ”。興奮してドナーがある 10 nm アクセプター、エネルギーのドナーからアクセプターに双極子-双極子相互作用によって転送されます。ドナーから光の放射によるエネルギーの放出はそれに応じて低下します。一方、興奮の受容体はその発光波長で発光します。フレットの応答は、効率、または蛍光または放射の他のプロセスではなくフレットによってドナーから放出されるエネルギーの割合の面で評価されます。効率は、ドナーとアクセプターとして機能するフレットを可能にする間の距離に強く依存する ' 分子 ' または ' 分光 ' ルーラー。 生化学、フレット用いられる質的彼らは互いのフレット範囲外移動と fluorophores を監視することによって分子構造変化を観察します。同様に、フレットのペアを含む分子と細胞機能を学ぶことができます。ラベル付きの分子は酵素活性、フレット停止し観察される蛍光の波長変化によって切断されかどうか。 フレットの背後にある原理を理解することができます ' プロトコルと提示し、データを解釈するいくつかの方法の概要を見て。 前に実験、関心、DNA やタンパク質の生体蛍光タグで分子生物学手法修正を導入する一般的な方法を使用して工作。細胞に遺伝物質は、トランスフェクション、エレクトロポレーション。 、セルが例えば蛍光顕微鏡でフレット可視化の準備、分子が 1 分子 FRET のスライドに固定化される可能性がありますまたはサンプルは、高スループット スクリーニングのための井戸に読み込まれます。 、励起レーザー、顕微鏡および関連機器用意しています。(A) フレット実験は度々 強力なレーザー。(B) 適切な PPE と安全手順を使用する必要がありますサンプルは楽器に配置し励起レーザー点灯。。 実験細胞の挙動を監視、カラー画像表示

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    06:57
    表面プラズモン共鳴 (SPR)

    表面プラズモン共鳴 (SPR) 分子の親和性、反応速度論、特異性、および生体分子の濃度を評価するためのバイオ センサーの無料のラベルの背後にある根本的な光学現象であります。SPR バイオ センサー プリズム上に金属の薄い層で生体分子相互作用が発生します。生体分子のリアルタイムの相互作用は、金属フロンディアの下面からの反射光の変化を測定することによって監視できます

    このビデオは SPR と解析および生体分子の相互作用を可視化するための使用方法の基本的な概念を説明します。これは、サンプルの準備やスプレーを使用して結合率を調査するための実験プロトコルが続きますアプリケーション] セクションで、SPR イメージング、ローカライズされた SPR、量子ドットの増強 SPR を検討している

    表面プラズモン共鳴または SPR が生体分子の結合・吸着相互作用を評価するための特定のラベル無料バイオの背後にある根本的な現象。ラベル付け、ELISA最初。これにより、順番に興味の analyte 結合するリガンドのかなりの量をセンサーの上に固定される、プロシージャの間に配位子が分離してしまう可能性を低減します。 一度リガンド センサーの動員は、バッファー内のセンサー上の試料が流れていた。結合率と他のキネティック情報試料リガンドを結合として、時間の経過と共に SPR 角度の変更を監視することによってを計算できます。 反射率データも使えます、SPR イメージングや、スプリングによって CCD 検出器に反射した光を演出します。これは全体のセンサーの表面の高コントラスト、高解像度の画像を生成します。SPR と関連の技術を使用して、分子の親和性、反応速度論、特異性、濃度の質問は回答できます。 何をされるか分かっているので、SPR 実験で測定されるさせて ' 結合率を調査するための手順を見て。 プロシージャ、実行およびサンプル バッファーを開始を準備する必要があります前に。実行中のバッファーを使用して、センサーの上に配位子を預けるし、サンプル バッファーを使用して試料を入金します。センサー チップは丁寧に掃除して、鞘に読み込まれます。その後、デバイスは、フロー ・ セルの下部になる楽器に配置されます。計測器ソフトウェアの実験とその後の分析のセットアップします。必要に応じて、リガンドをキャプチャする基板を用いたセンサーの表面は準備万端します。センサー表面に基質によってキャプチャされます実行バッファー内センサーの表面上の配位子が流れていた。 、サンプル バッファーの検体は、それが選択的に固定化リガンド結合のフロー ・ セルを介して実行されます。反射率の変化をプロットし、速度定数および他調査の反応の反応速度データを決定するコントロールと比較します。 SPR 実験を行う方法を理解すると、今、' 生化学における SPR のいくつかの他のアプリケーションを見て。 ここ、SPR イメージングは、時間に対する反射率のセンサー 3 D グラフ 11 受容体の配列がタンパク質を評価する使用され、蛋白質ごとの反射率データから受容体濃度を調製します。これら " プロファイル " 各蛋白質に独特があり、したがって

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