Prueba genética para los alimentos modificados

Environmental Science
 

Overview

Fuente: Laboratorios de Margaret obrero y Kimberly Frye - Universidad de Depaul

Modificación genética de los alimentos ha sido una cuestión controvertida debido a problemas de debates sobre salud y seguridad ambiental. Este experimento demuestra conocimientos técnicos de cómo alimento ADN genéticamente se identifica, permitiendo educado decisión decisiones acerca de los peligros de seguridad y el potencial de usar genéticamente modificación organismos (OMG) en alimentos.

La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) se utiliza para amplificar DNA de alimentos para probar para la presencia de ADN transgénico en los productos alimenticios. Presencia de bandas de ADN específicas se detecta mediante el uso de electroforesis en gel de tirar alimentos extraído ADN a través de un gel de agarosa al 3%, una concentración lo suficientemente densa para separar las bandas de ADN que contiene el ADN genéticamente modificado. Varios controles se utilizan en el procedimiento de electroforesis para DNA se extrae con éxito prueba alimentos (cartilla de planta), y proveer ejemplos conocidos de ambos genéticamente modificado ADN (ADN modificado genéticamente adquirido) y no-transgénicos ADN (control de alimentos no-GMO certificados comprado).

Cite this Video

JoVE Science Education Database. Fundamentos de la ciencia ambiental . Prueba genética para los alimentos modificados. JoVE, Cambridge, MA, (2017).

Principles

La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) identifica secuencias de ADN que se han insertado en la planta de GM. A diferencia de las proteínas, el ADN es una molécula relativamente estable, así fragmentos de ADN pueden ser aislados de los productos muy elaborados y son lo suficientemente intactos para ser amplificados por PCR. Ingenieros genéticos utilizan sólo un pequeño número de secuencias reguladoras (secuencias del promotor y terminador) para controlar la expresión de los genes insertados, y así que estas secuencias son comunes a la mayoría de los cultivos transgénicos. Las dos secuencias identificadas en este procedimiento son dos de las secuencias reguladoras más comunes, promotor del gen 35S del virus del mosaico del coliflor (CaMV) y el gen de terminator nopaline sintasa (NOS) de Agrobacterium tumefaciens.

Polimerización en cadena consiste en ciclos repetitivos, cada uno que consiste en la desnaturalización de la plantilla, primer recocido y extensión del primer recocido por Taq ADN polimerasa. Una vez que el ADN se extrae de los alimentos, se utiliza un termociclador para manipular rápidamente la temperatura, causando las etapas de los ciclos PCR.

La etapa de desnaturalización ocurre cuando las muestras se calientan rápidamente a 94 ° C, haciendo que los filamentos de la DNA separar. Enfriamiento rápido a 59 ° C permite cartillas templar a los filamentos de ADN separados y luego recalentar a 72 ° C para la Taq ADN polimerasa extender los iniciadores, hacer copias completas de cada filamento de la DNA y completar un ciclo termal.

Continuación, el ADN amplificado se puede ejecutar a través de un gel de agarosa con electroforesis para separar el DNA en bandas visibles para la identificación del gen promotor 35S y terminador NOS. ADN amplificado se carga en pozos en un extremo del gel, con un tinte de carga adquiridos que pesan la muestra para evitar la disolución en el búfer de circundante. El tinte de carga también proporciona un visual, por lo que se aprecia el movimiento de ADN durante la electroforesis en el tinte "frente". El proceso de electroforesis funciona mediante el uso de una corriente eléctrica separada en los extremos de cátodo y el ánodo. DNA se carga en el gel en el extremo más cercano al lado del cátodo de la cámara, y la carga negativa de ADN se siente atraída por el extremo del ánodo de la cámara y se tira a través de la agarosa. Grandes secuencias de ADN (aumento del número de pares de bases) no se pueden mover fácilmente a través de agarosa y se separarán hacia fuera temprano, mientras que las secuencias más pequeñas son capaces de viajar más lejos abajo del gel hacia el final del ánodo.

Un proceso de tinción ayuda a atar a la DNA para añadir contraste entre el gel de fondo y los bancos de ADN para mejor visualización de los resultados. Utilizando siempre lugares conocidos para los diferentes tamaños de secuencias de ADN que cada gel de prueba puede ser analizada para la presencia o ausencia del promotor 35S y genes terminator de enmiendas.

Los controles se utilizan para que DNA se extrae correctamente y para proporcionar una comparación a las muestras de alimentos de prueba. Planta comprada cartilla se agrega a cada muestra para proporcionar ácidos nucleicos común a todas las plantas. Esto permite una comprobación de control de calidad en el proceso de extracción de ADN, porque cualquier DNA de la planta extraída debe ser extendida con esta cartilla durante PCR y también puede considerarse en el gel después de electroforesis. Primer comprado para el 35S y los genes NOS sirven como control positivo para prever bandas de ADN en el gel de modificación genética. Si el control de la plantilla de GMO-positiva no ampliar, hay un problema con la reacción de PCR y puede confiar en un resultado de GMO-negativo de la comida de prueba. Un producto de alimentos no-GMO certificados también es adquirido y utilizado como control negativo para mostrar lo que la separación de ADN parece cuando ningún material genéticamente modificado está presente.

Procedure

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1. extracción de ADN de muestras de alimentos

  1. Añadir 500 μl de la matriz de mezcla PCR comprado a cada uno de los 2 tubos de tapón de rosca con una pipeta de transferencia o micropipeta de volumen ajustable de 200-1.000 μl. Pipetee hacia arriba y hacia abajo con la pipeta entre cada alícuota para mezclar uniformemente la matriz de la polimerización en cadena.
  2. Etiquetar un tubo de tapón de rosca "sin transgénicos" y otra "prueba".
  3. Pesar 0,5 g de alimentos no-GMO certificados y poner en el mortero.
  4. Añadir 2,5 mL de agua destilada y moler con mortero por 2 min formar una mezcla.
  5. Añadir otros 2,5 mL de agua destilada y continuar la molienda con mortero hasta que la mezcla se convierte en lo suficientemente suave para pipeta.
  6. Extraiga con pipeta 50 μl de mezcla de suelo al tubo de tapón de rosca conteniendo 500 μl de premezcla de PCR con la etiqueta "no-OGM" usando la marca de 50-μL en una pipeta graduada. Tapar el tubo.
  7. Repita los pasos 1.3 – 1.6 para preparar la muestra de alimento.
  8. Extraiga con pipeta 50 μl de mezcla de alimentos de prueba de suelo al tubo de tapón de rosca etiquetado como "prueba". Tapar el tubo.
  9. Vortex no-GMO alimentos y prueba PCR tubos para tubos de 1 min y coloque en baño de agua de 95 ° C durante 5 minutos. Si no se dispone de ningún vórtice, flick el tubo varias veces para mezclar antes de colocar en baño de agua.
  10. Colocar tubos en una centrífuga durante 5 minutos. Debe formar una pelotilla sólida en la parte inferior del tubo. Si el pellet no está formado después de 5 min, centrifugar nuevamente por intervalos de 2 min hasta que se forme de la pelotilla.
  11. Tubos pueden ser utilizados inmediatamente para PCR o almacenados en el refrigerador hasta por 1 semana.

2. Ajuste de reacciones de PCR

  1. Número de tubos de PCR 1 – 6 y les inicial. El número debe corresponder a los siguientes contenidos del tubo aparece en la tabla 1.
  2. Coloque cada tubo PCR marcado en un porta de microtubo con las tapas abiertas.
  3. Usando una punta nueva para cada adición, agregar 20 μl de la cartilla que se indica en la tabla 1 para cada tubo PCR. Tubos con tapón.
  4. Usando una punta nueva para cada tubo, agregar 20 μl de la muestra de ADN indicada en la tabla 1 para cada tubo de PCR, asegurándose de que la pipeta solo partir del sobrenadante y evitando el sedimento sólido en la parte inferior de los tubos.
  5. Después de cada muestra de ADN se pipetea en el tubo correspondiente de polimerización en cadena, utilice la pipeta para mezclar ADN y cartilla pipeteando suavemente de arriba abajo; volver a tapar los tubos.
  6. Colocar tubos PCR en termociclador y programa al cycler para:
    Desnaturalizar inicial: 1 ciclo a 94 ° C por 2 min.
    Amplificación: 40 ciclos a 94 ° C por 1 min (desnaturalizar), 59 ° C por 1 min (recocido) y 72 ° C por 2 min (extensión).
    Extensión final: 1 ciclo a 72 ° C durante 10 minutos.
    Hold: 4 ° C indefinidamente.

3 Preparación del Gel de agarosa al 3%

  1. Con laboratorio o cinta adhesiva, cinta firmemente de los extremos abiertos de la bandeja de gel. Asegúrese de cinta está sellada en los bordes de la bandeja para evitar que la agarosa fundida escaparse hacia fuera.
  2. Pesar 3 g de agarosa en un erlenmeyer de 250 mL o más grande.
  3. Añadir 100 mL de tampón de x TAE 1 (comprado o preparado de concentrado).
  4. Usando una placa magnética con una barra de agitación, calentar el vaso de precipitados hasta que la agarosa se disuelva completamente en el búfer y la solución hierve y se vuelve claro. Alternativamente, puede utilizarse un horno de microondas por colocar la taza en el horno y calefacción para intervalos de 30 s, usando una varilla de agitación para mezclar cada 10 s, repitiendo hasta que la mezcla está hirviendo y vueltas claro.
  5. Invertir un matraz Erlenmeyer de 50 mL dentro de la abertura del frasco de 250 mL para actuar como un reflujo, impidiendo la evaporación de solución de agarosa.
  6. Deje que la solución de agarosa enfriar a 60 ° C y verter 30-50 mL en cada bandeja de gel con cinta.
  7. Coloque un peine de gel en el primer par de muescas para crear pozos de gel.
  8. Deje el gel se enfríe completamente antes de retirar la cinta y peine. Gel se solidifique y vuelta de claro a turbio cuando listo, aproximadamente 10-20 minutos.

4. electroforesis de los productos PCR

  1. Un gel de agarosa 3% hecha de antemano sobre una bandeja de gel o utilice una bandeja de gel que se ha utilizado para lanzar un gel de agarosa 3% vertido.
  2. Deslice la bandeja de gel en la cámara de electroforesis con los pozos más cercanos al extremo del cátodo (negro).
  3. Vierta 1 buffer de x TAE en la cámara, lo suficiente para tener 2 mm de tampón sobre la parte superior de la bandeja de gel.
  4. Obtener tubos PCR de Termociclador y lugar en soporte para microtubo.
  5. Utilizando una punta de pipeta nueva cada vez, añadir 10 μl de compra anaranjado G carga del tinte (LD) para cada muestra y mezclar bien.
  6. Carga 20 μl de la regla de peso molecular y 20 μl de cada muestra en el gel en el orden indican (tabla 2).
  7. Electroforesis del gel del funcionamiento durante 30 min a 100 V.
  8. Retire la bandeja de gel de gel cámara y deslice para quitar de la bandeja. Coloque el gel en una bandeja de tinción.
  9. Sumergir el gel en la mancha de gel ADN adquirida durante 5 min., agitando cuidadosamente la bandeja para ayudar a distribuir la tinción en el gel.
  10. Transferir el gel a un recipiente de lavado y enjuague con agua corriente (40-55 ° C) para aproximadamente 10 s.
  11. Desmanchar por 3 x el lavado en agua caliente del grifo durante 6 min con suave agitación para obtener mejores resultados. Si es necesario, continuar la extracción en agua caliente hasta que se alcanza el contraste deseado.
Número de tubo Cartilla de Muestra de ADN
1 Primer planta de 20 μl (verde) Control de alimentos no-GMO 20 μl ADN
2 Cartilla GMO 20 μl (rojo) Control de alimentos no-GMO 20 μl ADN
3 Primer planta de 20 μl (verde) Comida de prueba 20 μl ADN
4 Cartilla GMO 20 μl (rojo) Comida de prueba 20 μl ADN
5 Primer planta de 20 μl (verde) Control positivo de GMO 20 μl ADN
6 Cartilla GMO 20 μl (rojo) Control positivo de GMO 20 μl ADN

Tabla 1. Lista de los números de tubo adecuado, imprimaciones y muestras de ADN.

Pozo 1 1 control de alimentos no-GMO con planta primers 20 μl de la muestra.
Pozo 2 2 control de alimentos no-GMO con GMO primers 20 μl de la muestra.
Pozo 3 3 alimentos de prueba con planta primers 20 μl de la muestra.
Pozo 4 4 alimentos de prueba con GMO primers 20 μl de la muestra.
Pozo 5 5 ADN positivo GMO con planta primers 20 μl de la muestra.
Pozo 6 6 ADN positivo GMO con GMO primers 20 μl de la muestra.
Pozo 7 Peso molecular PCR regla 20 μl.
Pozo 8 Deje en blanco.

Tabla 2. El orden adecuado para cargar 20 μl de la regla de peso molecular y 20 μl de cada muestra en el gel.

Los alimentos genéticamente modificados son productos que contienen un ingrediente o ingredientes cuyo ADN ha sido alterado específicamente. Presencia de estas modificaciones puede ser detectado usando una técnica llamada reacción en cadena de la polimerasa.

Modificación genética de los alimentos ha sido una cuestión controvertida debido a problemas de debates sobre salud y seguridad ambiental. La capacidad de detectar genéticamente alterada ADN en muestras de alimentos de interés permite para tomar decisiones educadas sobre los peligros de seguridad y el potencial de usar genéticamente modificado organismos u OMG, suministros de alimentos.

La reacción en cadena de polimerasa, o PCR, es utilizado para amplificar alimentos ADN para determinar la presencia o ausencia de secuencias genéticamente modificadas. Electroforesis en gel de tira de ADN amplificado a través de una matriz de gel de agarosa y separa las bandas de DNA de diferentes tamaños que corresponden a los marcadores modificados o no modificados. Estos son entonces comparados con grupos control de los alimentos que contienen OGM, o sea modificación libre.

Este video ilustra los principios de detección de ADN modificado genéticamente de los alimentos las muestras, cómo extraer ADN y amplificación de marcadores utilizados en el proceso de modificación genética y cómo se puede establecer la presencia o ausencia de OGM en muestras de alimentos.

Reacción en cadena de polimerasa identifica secuencias de ADN que se han insertado en los alimentos genéticamente modificados. El ADN es una molécula relativamente estable, así viable conveniente para la amplificación de fragmentos de ADN pueden ser aislados incluso de altamente procesados productos como frituras de maíz o hamburguesas vegetales.
Un pequeño número de secuencias de ADN reguladoras se utiliza para controlar la expresión de los genes insertados, por lo que estas secuencias están presentes en la mayoría de los cultivos transgénicos. Este procedimiento identifica dos de los más comúnmente utilizados, el promotor del gen 35S y el gene del synthase del nopaline terminator. La secuencia de 35S es un promotor fuerte y cuando un gen insertado unidad constante, altos niveles de expresión. El terminador de la sintasa de nopaline es incluido para detener la transcripción del gen insertado en el punto final deseado.

Polimerización en cadena implica repetitivas de calefacción y refrigeración de ciclos en un termociclador, una máquina que controla bien la temperatura de los tubos de reacción de PCR. Calentar la muestra a 94 ° C produce filamentos de la DNA desnaturalizar y separar. Rápido enfriamiento a entre 45 y 65 °C permite cartillas templar a los filamentos de ADN separados. Finalmente, el calentamiento a 72 °C permite la enzima Taq polimerasa extiende los cebadores y la duplicación completa de la región de destino.

Planta comprada cartilla se agrega a cada muestra y amplificará en las muestras que contienen ADN de la planta. Plantillas positivo OMG 35S y NOS sirven para proporcionar un control positivo de los OMG. Un certificado no-GMO se utiliza como control negativo. Si cualquiera de estas reacciones de control muestran bandas inesperadas, puede confiables en los resultados de las muestras de prueba.

ADN amplificado se ejecuta a través de un gel de agarosa por electroforesis. Productos de PCR son mezclados con un colorante y cargados en pozos. ADN está cargado negativamente y cuando carga en el gel en el extremo del cátodo de la cámara se moverá hacia el final del ánodo cuando se aplica corriente. Grandes fragmentos de ADN no se pueden mover como fácilmente mediante el gel de matriz así quedará más cercana al cátodo, mientras que secuencias más pequeñas se mueven hacia el extremo del ánodo, dando por resultado la separación de ADN de diferentes tamaño en distintas bandas.

Después de la electroforesis, coloración del gel ayuda a visualizar bandas separadas de ADN.

Ahora que estamos familiarizados con los principios de detección de OGM y el uso de PCR y electroforesis para la identificación de organismos modificados genéticamente, echemos un vistazo de cómo esto puede llevarse a cabo en el laboratorio.

Una vez que se han identificado los productos de interés, el análisis pueden comenzar. Para extraer el ADN, tomar dos ciegas limpia tubos y en cada una de estas transferencia 500 μL del reactivo de aislamiento de ADN adquirido, asegurándose de pipetear la mezcla hacia arriba y hacia abajo entre alícuotas para mezclar uniformemente el reactivo. Etiqueta de uno de lo tubos "no-OGM" y la otra "prueba".

A continuación, pesar 0,5 g de alimentos no-GMO certificados y coloque en un mortero limpio. Añadir 2,5 mL de agua destilada y moler con el mortero por 2 min formar una mezcla. Añadir otro 2,5 mL de agua destilada y continuar moliendo la mezcla hasta que esté lo suficientemente suave para pipetear.

Pipetee 50 μL de la mezcla de no-GMO conocido para el "no-GMO" etiquetado ciegas tubo que contiene el reactivo de aislamiento de ADN. Ahora añadir 50 μL de la mezcla de muestra de alimentos de prueba a ciegas tubo marcado "Prueba". Vórtice los dos tubos que contienen las muestras de alimentos y reactivo de la DNA durante 1 minuto. A continuación, coloque los tubos en un baño de agua a 95 ° C durante 5 minutos. Finalmente, coloque los tubos en la centrífuga durante 5 minutos. Sobre la examinación, una pelotilla sólida debe ser formada en la parte inferior del tubo. Si no se forma una pelotilla después de 5 min, centrifugar nuevamente por intervalos de 2 min hasta que se forme de la pelotilla. Las muestras ahora pueden ser utilizadas inmediatamente para PCR o almacenadas en el refrigerador hasta por 1 semana.

Primeros, tubos PCR de número seis. Estos números corresponderán a los contenidos del tubo aparece en la tabla. Coloque cada uno de los tubos de PCR etiquetados en un porta de microtubo con las tapas abiertas.

Usando una punta nueva para cada adición, agregar 20 cartilla μL indicados en la tabla a cada tubo PCR. A continuación añadir 20 μL de las muestras de ADN indicada en la tabla a cada tubo PCR. Pipetee hacia arriba y hacia abajo para mezclar. Para muestras de alimentos peletizadas, asegúrese de pipeta sólo desde el sobrenadante y evitar el sólido precipitado en la parte inferior de los tubos. Por último, colocar los tubos PCR en un termociclador y programarlo a través de la calefacción y refrigeración los pasos indicados en la tabla.

Colocar un gel de agarosa al 3% en la cámara de electroforesis con los pozos más cercanos al extremo del cátodo. Añadir Tampón TAE en la cámara de cubierta de 2 mm por encima de la bandeja del gel. Recoger los tubos PCR en el termociclador y colocarlos en un soporte de microtubo. Utilizando una punta de pipeta nueva cada vez, añadir 10 μL de ADN adquirido carga colorante a cada muestra y mezclar bien.

Usando una punta nueva cada vez, cargar los pocillos del gel de agarosa con 20 μL de peso molecular ruler en un pozo y 20 μL de cada muestra en los pocillos subsiguientes, como se indica en esta tabla. Establezca la cámara de electroforesis a 100 V durante 30 minutos.

Una vez que el gel ha terminado funcionando, desconecte la cámara del gel, retire la bandeja y coloque el gel en una bandeja de tinción. Sumergir el gel en comprado 100 x mancha de gel durante 5 minutos, sacudiendo la bandeja suavemente para distribuir el tinte. Una vez teñido, transferir el gel a un recipiente de lavado y enjuague con agua corriente para aproximadamente 10 s. Destain lavándolo tres veces en agua caliente durante 3 minutos cada uno, cada uno con una agitación suave para obtener mejores resultados. Si es necesario, continuar la extracción en agua caliente hasta que se alcanza el contraste deseado.

La presencia o ausencia de una banda de bp 200 en carril 4 indica si la comida de prueba contiene OMG. Los iniciadores de planta determinan si el ADN de plantas fue extraído con éxito de la muestra. El control de alimentos no-GMO es un indicador de resultados falsos positivos, ocurriera. Si el control de alimentos no-GMO sale positivo, significa la PCR fue contaminada en algún momento. El control de la plantilla de GMO-positivo es un indicador de falsos negativos. Si el control de la plantilla de GMO-positiva no ampliar, hay un problema con la reacción de PCR y puede confiar en un resultado de GMO-negativo de la comida de prueba.

Geles se pueden colocar sobre un papel blanco o amarillo para proporcionar fondo de contraste para destacar las bandas de ADN, o mayor contraste se puede lograr utilizando una caja de luz UV.

La posibilidad de probar los productos alimenticios o productos de ingredientes genéticamente modificados es pertinente para un número de aplicaciones científicas o reglamentarias.

Hay algunas pruebas de que ADN transgénico de cultivos modificados genéticamente puede convertirse en río en los genomas de poblaciones silvestres de cultivos. Por ejemplo, polinizadores pueden facilitar a esta transferencia fertilizando salvaje-tipo plantas con polen de un origen genéticamente modificado. Esta es una preocupación, como los impactos de la diseminación de estos genes insertados en los ecosistemas en su conjunto no se entienden bien. PCR prueba de poblaciones silvestres puede proporcionar datos sobre la potencial difusión y éxito en la contención, de inserciones de genéticas.

Falta de etiquetado o el etiquetado incorrecto de ingredientes genéticamente modificados puede ser un problema de consumo. Esto puede ser debido a la preferencia del consumidor de consumo o introducción potencial de alergenos durante el proceso de GM, aunque este último es controvertido. En algunos países, ingredientes genéticamente modificados deben figurar en el acondicionamiento de los alimentos. Juntas directivas en estos países pueden utilizar PCR pruebas para comprobar la precisión de etiquetado de alimentos.

Que la modificación genética introducida a un cultivo confiere resistencia a plaguicidas, algunos estudios han expresado preocupación por la producción de "súper malezas". Esencialmente, estos pueden ser cualquier planta no inicialmente destinado a la modificación que se obtiene la resistencia a pesticidas a través de mecanismos como introgresión o hibridación. Estas plantas se pueden entonces capaces de difundir con más éxito y ser más difíciles de controlar que los sin el inserto. PCR prueba de modificación genética puede ayudar a destacar y seguir tales poblaciones potenciales para determinar si esta extensión podría resultar problemática.

Sólo ha visto introducción de Zeus para pruebas de alimentos transgénicos. Ahora debe comprender los principios detrás de identificar los alimentos genéticamente modificados mediante PCR, cómo extraer y amplificar ADN de los alimentos y cómo determinar si la muestra de alimento se ha modificado genéticamente. ¡Gracias por ver!

Results

Después de la extracción, geles pueden analizarse examinando en carriles de alimentación de prueba (tabla 3) para determinar si las bandas de ADN para el promotor 35S y NOS terminator genes están presentes en los lugares conocidos en el gel. Colocar el gel en una caja de luz ultravioleta puede ayudar a proporcionar mayor contraste (figura 1). Alternativamente, los geles pueden colocarse sobre papel blanco o amarillo para proporcionar un fondo que contraste para destacar las bandas de ADN (figura 2).

Figure 1
Figura 1. Un gel destained que separan las bandas de ADN. Gel de agarosa después de electroforesis en gel de agarosa en caja de luz UV.

Figure 2
Figura 2. Diagrama de los lugares conocidos para el promotor 35S y terminador NOS DNA. La presencia o ausencia de una banda de bp 200 en carril 5 indica si o no la comida de prueba contiene OMG.

Carril 1: Alimentos no-GMO con las cartillas de la planta 455 bp
Carril 2: Alimentos no-GMO con las cartillas de OMG Ninguna banda
Carril 3: Comida de prueba con las cartillas de la planta 455 bp
Carril 4: Comida de prueba con las cartillas de OMG 200 bp o no banda
Lane 5: Plantilla de GMO-positivo con las cartillas de la planta 455 bp
Carril 6: Plantilla de GMO-positivo con las cartillas de OMG 200 bp
Carril 7: Regla de peso molecular PCR 1.000, 700, 500, 200, 100 bp

Tabla 3. Tamaños de banda muestra de PCR (pares de bases (bp)).

Applications and Summary

La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) se utiliza para amplificar la DNA, permitiendo una amplia gama de pruebas de ADN lab. Un área de pruebas ahora posible con PCR es identificar los organismos modificados genéticamente por la prueba de presencia o ausencia de la DNA secuencias utilizados en la modificación genética de cultivos alimenticios. Típicamente, un cultivo es modificado genéticamente para conferir una ventaja contra impedimentos naturales al rendimiento ideal, por ejemplo, las plagas (figura 3), enfermedades, las condiciones de sequía (figura 4), etcetera. Ya que la ventaja se obtiene mediante la inserción de material genético de una especie diferente en el cultivo de la planta DNA, salud humana potencial y los riesgos ambientales se han identificado con el uso de organismos modificados genéticamente. Una preocupación ambiental es la capacidad de la ADN genéticamente modificado para cambiarse sin querer a través de procesos de polinización, que podrían conducir a transgénicos ADN entrando en que los genomas de cultivos destinados a venderse como no transgénicos.

Figure 3
Figura 3. Larvas de escarabajo de Colorado, devorando hojas de patata.

Figure 4
Figura 4. Maíz destruida por la sequía.

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1. extracción de ADN de muestras de alimentos

  1. Añadir 500 μl de la matriz de mezcla PCR comprado a cada uno de los 2 tubos de tapón de rosca con una pipeta de transferencia o micropipeta de volumen ajustable de 200-1.000 μl. Pipetee hacia arriba y hacia abajo con la pipeta entre cada alícuota para mezclar uniformemente la matriz de la polimerización en cadena.
  2. Etiquetar un tubo de tapón de rosca "sin transgénicos" y otra "prueba".
  3. Pesar 0,5 g de alimentos no-GMO certificados y poner en el mortero.
  4. Añadir 2,5 mL de agua destilada y moler con mortero por 2 min formar una mezcla.
  5. Añadir otros 2,5 mL de agua destilada y continuar la molienda con mortero hasta que la mezcla se convierte en lo suficientemente suave para pipeta.
  6. Extraiga con pipeta 50 μl de mezcla de suelo al tubo de tapón de rosca conteniendo 500 μl de premezcla de PCR con la etiqueta "no-OGM" usando la marca de 50-μL en una pipeta graduada. Tapar el tubo.
  7. Repita los pasos 1.3 – 1.6 para preparar la muestra de alimento.
  8. Extraiga con pipeta 50 μl de mezcla de alimentos de prueba de suelo al tubo de tapón de rosca etiquetado como "prueba". Tapar el tubo.
  9. Vortex no-GMO alimentos y prueba PCR tubos para tubos de 1 min y coloque en baño de agua de 95 ° C durante 5 minutos. Si no se dispone de ningún vórtice, flick el tubo varias veces para mezclar antes de colocar en baño de agua.
  10. Colocar tubos en una centrífuga durante 5 minutos. Debe formar una pelotilla sólida en la parte inferior del tubo. Si el pellet no está formado después de 5 min, centrifugar nuevamente por intervalos de 2 min hasta que se forme de la pelotilla.
  11. Tubos pueden ser utilizados inmediatamente para PCR o almacenados en el refrigerador hasta por 1 semana.

2. Ajuste de reacciones de PCR

  1. Número de tubos de PCR 1 – 6 y les inicial. El número debe corresponder a los siguientes contenidos del tubo aparece en la tabla 1.
  2. Coloque cada tubo PCR marcado en un porta de microtubo con las tapas abiertas.
  3. Usando una punta nueva para cada adición, agregar 20 μl de la cartilla que se indica en la tabla 1 para cada tubo PCR. Tubos con tapón.
  4. Usando una punta nueva para cada tubo, agregar 20 μl de la muestra de ADN indicada en la tabla 1 para cada tubo de PCR, asegurándose de que la pipeta solo partir del sobrenadante y evitando el sedimento sólido en la parte inferior de los tubos.
  5. Después de cada muestra de ADN se pipetea en el tubo correspondiente de polimerización en cadena, utilice la pipeta para mezclar ADN y cartilla pipeteando suavemente de arriba abajo; volver a tapar los tubos.
  6. Colocar tubos PCR en termociclador y programa al cycler para:
    Desnaturalizar inicial: 1 ciclo a 94 ° C por 2 min.
    Amplificación: 40 ciclos a 94 ° C por 1 min (desnaturalizar), 59 ° C por 1 min (recocido) y 72 ° C por 2 min (extensión).
    Extensión final: 1 ciclo a 72 ° C durante 10 minutos.
    Hold: 4 ° C indefinidamente.

3 Preparación del Gel de agarosa al 3%

  1. Con laboratorio o cinta adhesiva, cinta firmemente de los extremos abiertos de la bandeja de gel. Asegúrese de cinta está sellada en los bordes de la bandeja para evitar que la agarosa fundida escaparse hacia fuera.
  2. Pesar 3 g de agarosa en un erlenmeyer de 250 mL o más grande.
  3. Añadir 100 mL de tampón de x TAE 1 (comprado o preparado de concentrado).
  4. Usando una placa magnética con una barra de agitación, calentar el vaso de precipitados hasta que la agarosa se disuelva completamente en el búfer y la solución hierve y se vuelve claro. Alternativamente, puede utilizarse un horno de microondas por colocar la taza en el horno y calefacción para intervalos de 30 s, usando una varilla de agitación para mezclar cada 10 s, repitiendo hasta que la mezcla está hirviendo y vueltas claro.
  5. Invertir un matraz Erlenmeyer de 50 mL dentro de la abertura del frasco de 250 mL para actuar como un reflujo, impidiendo la evaporación de solución de agarosa.
  6. Deje que la solución de agarosa enfriar a 60 ° C y verter 30-50 mL en cada bandeja de gel con cinta.
  7. Coloque un peine de gel en el primer par de muescas para crear pozos de gel.
  8. Deje el gel se enfríe completamente antes de retirar la cinta y peine. Gel se solidifique y vuelta de claro a turbio cuando listo, aproximadamente 10-20 minutos.

4. electroforesis de los productos PCR

  1. Un gel de agarosa 3% hecha de antemano sobre una bandeja de gel o utilice una bandeja de gel que se ha utilizado para lanzar un gel de agarosa 3% vertido.
  2. Deslice la bandeja de gel en la cámara de electroforesis con los pozos más cercanos al extremo del cátodo (negro).
  3. Vierta 1 buffer de x TAE en la cámara, lo suficiente para tener 2 mm de tampón sobre la parte superior de la bandeja de gel.
  4. Obtener tubos PCR de Termociclador y lugar en soporte para microtubo.
  5. Utilizando una punta de pipeta nueva cada vez, añadir 10 μl de compra anaranjado G carga del tinte (LD) para cada muestra y mezclar bien.
  6. Carga 20 μl de la regla de peso molecular y 20 μl de cada muestra en el gel en el orden indican (tabla 2).
  7. Electroforesis del gel del funcionamiento durante 30 min a 100 V.
  8. Retire la bandeja de gel de gel cámara y deslice para quitar de la bandeja. Coloque el gel en una bandeja de tinción.
  9. Sumergir el gel en la mancha de gel ADN adquirida durante 5 min., agitando cuidadosamente la bandeja para ayudar a distribuir la tinción en el gel.
  10. Transferir el gel a un recipiente de lavado y enjuague con agua corriente (40-55 ° C) para aproximadamente 10 s.
  11. Desmanchar por 3 x el lavado en agua caliente del grifo durante 6 min con suave agitación para obtener mejores resultados. Si es necesario, continuar la extracción en agua caliente hasta que se alcanza el contraste deseado.
Número de tubo Cartilla de Muestra de ADN
1 Primer planta de 20 μl (verde) Control de alimentos no-GMO 20 μl ADN
2 Cartilla GMO 20 μl (rojo) Control de alimentos no-GMO 20 μl ADN
3 Primer planta de 20 μl (verde) Comida de prueba 20 μl ADN
4 Cartilla GMO 20 μl (rojo) Comida de prueba 20 μl ADN
5 Primer planta de 20 μl (verde) Control positivo de GMO 20 μl ADN
6 Cartilla GMO 20 μl (rojo) Control positivo de GMO 20 μl ADN

Tabla 1. Lista de los números de tubo adecuado, imprimaciones y muestras de ADN.

Pozo 1 1 control de alimentos no-GMO con planta primers 20 μl de la muestra.
Pozo 2 2 control de alimentos no-GMO con GMO primers 20 μl de la muestra.
Pozo 3 3 alimentos de prueba con planta primers 20 μl de la muestra.
Pozo 4 4 alimentos de prueba con GMO primers 20 μl de la muestra.
Pozo 5 5 ADN positivo GMO con planta primers 20 μl de la muestra.
Pozo 6 6 ADN positivo GMO con GMO primers 20 μl de la muestra.
Pozo 7 Peso molecular PCR regla 20 μl.
Pozo 8 Deje en blanco.

Tabla 2. El orden adecuado para cargar 20 μl de la regla de peso molecular y 20 μl de cada muestra en el gel.

Los alimentos genéticamente modificados son productos que contienen un ingrediente o ingredientes cuyo ADN ha sido alterado específicamente. Presencia de estas modificaciones puede ser detectado usando una técnica llamada reacción en cadena de la polimerasa.

Modificación genética de los alimentos ha sido una cuestión controvertida debido a problemas de debates sobre salud y seguridad ambiental. La capacidad de detectar genéticamente alterada ADN en muestras de alimentos de interés permite para tomar decisiones educadas sobre los peligros de seguridad y el potencial de usar genéticamente modificado organismos u OMG, suministros de alimentos.

La reacción en cadena de polimerasa, o PCR, es utilizado para amplificar alimentos ADN para determinar la presencia o ausencia de secuencias genéticamente modificadas. Electroforesis en gel de tira de ADN amplificado a través de una matriz de gel de agarosa y separa las bandas de DNA de diferentes tamaños que corresponden a los marcadores modificados o no modificados. Estos son entonces comparados con grupos control de los alimentos que contienen OGM, o sea modificación libre.

Este video ilustra los principios de detección de ADN modificado genéticamente de los alimentos las muestras, cómo extraer ADN y amplificación de marcadores utilizados en el proceso de modificación genética y cómo se puede establecer la presencia o ausencia de OGM en muestras de alimentos.

Reacción en cadena de polimerasa identifica secuencias de ADN que se han insertado en los alimentos genéticamente modificados. El ADN es una molécula relativamente estable, así viable conveniente para la amplificación de fragmentos de ADN pueden ser aislados incluso de altamente procesados productos como frituras de maíz o hamburguesas vegetales.
Un pequeño número de secuencias de ADN reguladoras se utiliza para controlar la expresión de los genes insertados, por lo que estas secuencias están presentes en la mayoría de los cultivos transgénicos. Este procedimiento identifica dos de los más comúnmente utilizados, el promotor del gen 35S y el gene del synthase del nopaline terminator. La secuencia de 35S es un promotor fuerte y cuando un gen insertado unidad constante, altos niveles de expresión. El terminador de la sintasa de nopaline es incluido para detener la transcripción del gen insertado en el punto final deseado.

Polimerización en cadena implica repetitivas de calefacción y refrigeración de ciclos en un termociclador, una máquina que controla bien la temperatura de los tubos de reacción de PCR. Calentar la muestra a 94 ° C produce filamentos de la DNA desnaturalizar y separar. Rápido enfriamiento a entre 45 y 65 °C permite cartillas templar a los filamentos de ADN separados. Finalmente, el calentamiento a 72 °C permite la enzima Taq polimerasa extiende los cebadores y la duplicación completa de la región de destino.

Planta comprada cartilla se agrega a cada muestra y amplificará en las muestras que contienen ADN de la planta. Plantillas positivo OMG 35S y NOS sirven para proporcionar un control positivo de los OMG. Un certificado no-GMO se utiliza como control negativo. Si cualquiera de estas reacciones de control muestran bandas inesperadas, puede confiables en los resultados de las muestras de prueba.

ADN amplificado se ejecuta a través de un gel de agarosa por electroforesis. Productos de PCR son mezclados con un colorante y cargados en pozos. ADN está cargado negativamente y cuando carga en el gel en el extremo del cátodo de la cámara se moverá hacia el final del ánodo cuando se aplica corriente. Grandes fragmentos de ADN no se pueden mover como fácilmente mediante el gel de matriz así quedará más cercana al cátodo, mientras que secuencias más pequeñas se mueven hacia el extremo del ánodo, dando por resultado la separación de ADN de diferentes tamaño en distintas bandas.

Después de la electroforesis, coloración del gel ayuda a visualizar bandas separadas de ADN.

Ahora que estamos familiarizados con los principios de detección de OGM y el uso de PCR y electroforesis para la identificación de organismos modificados genéticamente, echemos un vistazo de cómo esto puede llevarse a cabo en el laboratorio.

Una vez que se han identificado los productos de interés, el análisis pueden comenzar. Para extraer el ADN, tomar dos ciegas limpia tubos y en cada una de estas transferencia 500 μL del reactivo de aislamiento de ADN adquirido, asegurándose de pipetear la mezcla hacia arriba y hacia abajo entre alícuotas para mezclar uniformemente el reactivo. Etiqueta de uno de lo tubos "no-OGM" y la otra "prueba".

A continuación, pesar 0,5 g de alimentos no-GMO certificados y coloque en un mortero limpio. Añadir 2,5 mL de agua destilada y moler con el mortero por 2 min formar una mezcla. Añadir otro 2,5 mL de agua destilada y continuar moliendo la mezcla hasta que esté lo suficientemente suave para pipetear.

Pipetee 50 μL de la mezcla de no-GMO conocido para el "no-GMO" etiquetado ciegas tubo que contiene el reactivo de aislamiento de ADN. Ahora añadir 50 μL de la mezcla de muestra de alimentos de prueba a ciegas tubo marcado "Prueba". Vórtice los dos tubos que contienen las muestras de alimentos y reactivo de la DNA durante 1 minuto. A continuación, coloque los tubos en un baño de agua a 95 ° C durante 5 minutos. Finalmente, coloque los tubos en la centrífuga durante 5 minutos. Sobre la examinación, una pelotilla sólida debe ser formada en la parte inferior del tubo. Si no se forma una pelotilla después de 5 min, centrifugar nuevamente por intervalos de 2 min hasta que se forme de la pelotilla. Las muestras ahora pueden ser utilizadas inmediatamente para PCR o almacenadas en el refrigerador hasta por 1 semana.

Primeros, tubos PCR de número seis. Estos números corresponderán a los contenidos del tubo aparece en la tabla. Coloque cada uno de los tubos de PCR etiquetados en un porta de microtubo con las tapas abiertas.

Usando una punta nueva para cada adición, agregar 20 cartilla μL indicados en la tabla a cada tubo PCR. A continuación añadir 20 μL de las muestras de ADN indicada en la tabla a cada tubo PCR. Pipetee hacia arriba y hacia abajo para mezclar. Para muestras de alimentos peletizadas, asegúrese de pipeta sólo desde el sobrenadante y evitar el sólido precipitado en la parte inferior de los tubos. Por último, colocar los tubos PCR en un termociclador y programarlo a través de la calefacción y refrigeración los pasos indicados en la tabla.

Colocar un gel de agarosa al 3% en la cámara de electroforesis con los pozos más cercanos al extremo del cátodo. Añadir Tampón TAE en la cámara de cubierta de 2 mm por encima de la bandeja del gel. Recoger los tubos PCR en el termociclador y colocarlos en un soporte de microtubo. Utilizando una punta de pipeta nueva cada vez, añadir 10 μL de ADN adquirido carga colorante a cada muestra y mezclar bien.

Usando una punta nueva cada vez, cargar los pocillos del gel de agarosa con 20 μL de peso molecular ruler en un pozo y 20 μL de cada muestra en los pocillos subsiguientes, como se indica en esta tabla. Establezca la cámara de electroforesis a 100 V durante 30 minutos.

Una vez que el gel ha terminado funcionando, desconecte la cámara del gel, retire la bandeja y coloque el gel en una bandeja de tinción. Sumergir el gel en comprado 100 x mancha de gel durante 5 minutos, sacudiendo la bandeja suavemente para distribuir el tinte. Una vez teñido, transferir el gel a un recipiente de lavado y enjuague con agua corriente para aproximadamente 10 s. Destain lavándolo tres veces en agua caliente durante 3 minutos cada uno, cada uno con una agitación suave para obtener mejores resultados. Si es necesario, continuar la extracción en agua caliente hasta que se alcanza el contraste deseado.

La presencia o ausencia de una banda de bp 200 en carril 4 indica si la comida de prueba contiene OMG. Los iniciadores de planta determinan si el ADN de plantas fue extraído con éxito de la muestra. El control de alimentos no-GMO es un indicador de resultados falsos positivos, ocurriera. Si el control de alimentos no-GMO sale positivo, significa la PCR fue contaminada en algún momento. El control de la plantilla de GMO-positivo es un indicador de falsos negativos. Si el control de la plantilla de GMO-positiva no ampliar, hay un problema con la reacción de PCR y puede confiar en un resultado de GMO-negativo de la comida de prueba.

Geles se pueden colocar sobre un papel blanco o amarillo para proporcionar fondo de contraste para destacar las bandas de ADN, o mayor contraste se puede lograr utilizando una caja de luz UV.

La posibilidad de probar los productos alimenticios o productos de ingredientes genéticamente modificados es pertinente para un número de aplicaciones científicas o reglamentarias.

Hay algunas pruebas de que ADN transgénico de cultivos modificados genéticamente puede convertirse en río en los genomas de poblaciones silvestres de cultivos. Por ejemplo, polinizadores pueden facilitar a esta transferencia fertilizando salvaje-tipo plantas con polen de un origen genéticamente modificado. Esta es una preocupación, como los impactos de la diseminación de estos genes insertados en los ecosistemas en su conjunto no se entienden bien. PCR prueba de poblaciones silvestres puede proporcionar datos sobre la potencial difusión y éxito en la contención, de inserciones de genéticas.

Falta de etiquetado o el etiquetado incorrecto de ingredientes genéticamente modificados puede ser un problema de consumo. Esto puede ser debido a la preferencia del consumidor de consumo o introducción potencial de alergenos durante el proceso de GM, aunque este último es controvertido. En algunos países, ingredientes genéticamente modificados deben figurar en el acondicionamiento de los alimentos. Juntas directivas en estos países pueden utilizar PCR pruebas para comprobar la precisión de etiquetado de alimentos.

Que la modificación genética introducida a un cultivo confiere resistencia a plaguicidas, algunos estudios han expresado preocupación por la producción de "súper malezas". Esencialmente, estos pueden ser cualquier planta no inicialmente destinado a la modificación que se obtiene la resistencia a pesticidas a través de mecanismos como introgresión o hibridación. Estas plantas se pueden entonces capaces de difundir con más éxito y ser más difíciles de controlar que los sin el inserto. PCR prueba de modificación genética puede ayudar a destacar y seguir tales poblaciones potenciales para determinar si esta extensión podría resultar problemática.

Sólo ha visto introducción de Zeus para pruebas de alimentos transgénicos. Ahora debe comprender los principios detrás de identificar los alimentos genéticamente modificados mediante PCR, cómo extraer y amplificar ADN de los alimentos y cómo determinar si la muestra de alimento se ha modificado genéticamente. ¡Gracias por ver!

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