Extracción de sonicación de biomarcadores lípidos de sedimento

Earth Science

Your institution must subscribe to JoVE's Environmental Sciences collection to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 1 hour trial to JoVE!





By clicking "Submit", you agree to our policies.

 

Overview

Fuente: Laboratorio de Jeff Salacup - Universidad de Massachusetts Amherst

El material que comprende la participación «orgánica» salón de cualquier ecosistema (hojas, hongos, corteza, tejido; Figura 1) difiere fundamentalmente del material de la parte "inorgánico" inertes (rocas y sus minerales constituyentes, oxígeno, agua, metales). Material orgánico contiene carbono ligado a una serie de otras moléculas de carbono e hidrógeno (figura 2), que la distingue de la materia inorgánica. Gama de amplia Valencia del carbono (3:56) permite formar hasta cuatro enlaces covalentes separados con vecinos átomos, generalmente C, H, O, N, S y P. También pueden compartir hasta tres enlaces covalentes con un único otro átomo, como el enlace triple en el grupo cianuro o nitrilo, a menudo venenosas. En los últimos años 4,6 billones, esta flexibilidad ha conducido a una increíble variedad de estructuras químicas, que pueden variar en tamaño, complejidad, polaridad, forma y función. El campo científico de la geoquímica orgánica se refiere a la identificación y caracterización de toda la gama de compuestos orgánicos detectables, llamados biomarcadores, producidos por la vida en este planeta, así como otros, a través del tiempo geológico.

Figure 1
Figura 1. Material orgánico, tales como árboles, hojas y musgos, son químicamente y visualmente distintas de material inorgánico, como el pavimento.

Cite this Video

JoVE Science Education Database. Fundamentos de la ciencia de la tierra. Extracción de sonicación de biomarcadores lípidos de sedimento. JoVE, Cambridge, MA, (2017).

Principles

Extracción mediante sonicación es el método más simple y menos costoso de obtener un total de lípidos extracto (TLE) de una muestra determinada, y la recuperación asociada a este método es a la par con otras técnicas más sofisticadas. Utiliza un baño de ultrasonidos para agitar una muestra en un frasco en presencia de disolventes orgánicos. Biomarcadores en la muestra se disuelven en la fase orgánica basada en las reglas de solubilidad, que con los compuestos orgánicos, son controladas principalmente por la polaridad de los biomarcadores y el solvente. Esto es resumido por el supuesto "como disuelve como' la regla, por el que relativamente apolar biomarcadores (aquellos que contienen exclusivamente C y H; isopreno) disuelvan en solventes apolar (tales como hexano, polaridad = 0.1) y más biomarcadores polar (aquellos que contienen O, N, S, P; thioureas glicerol glicerol-tetraethers (GDGT)) se disuelven en solventes polares más (tales como metanol o diclorometano, polaridad = 5.1 y 3.1). De hecho, este es el primer paso en que la separación de los diferentes grupos de biomarcadores puede lograrse mediante la introducción de una serie de solventes, de apolar a polar, cada uno extrae más compuestos polares de la muestra. Los solventes de extractos secuenciales de un sedimento blanco pueden así analizados por separado o en combinación para formar un extracto total de lípidos (TLE) que puede ser purificado más adelante.

El primer paso en la paleoclimatología es recoger o extraer, los biomarcadores del sedimento se encuentran en. Muestras ambientales están compuestas de componentes no orgánicos, tales como minerales, agua y metales y compuestos orgánicos que son creados por los organismos vivos en la zona. Antes de que estos componentes orgánicos pueden utilizarse por los científicos para aclarar información sobre el pasado, debe eliminarse de su entorno. Sonicación, que utiliza ondas de ultrasonido, es el más simple y menos costoso de estas técnicas.

Este video es parte de una serie de extracción, purificación y análisis de los sedimentos. Se ilustran la extracción por ultrasonido y presentar algunas aplicaciones del método.

Debido a la amplia gama de biomarcadores, no hay solo solvente optimizado para extraer de todos ellos. Esto es resumido por el supuesto "como disuelve como' la regla, por el que relativamente apolar moléculas se disuelven en solventes apolar como el diclorometano, y más las moléculas polares se disuelven en disolventes más polares como metanol. Mezclas de disolventes para la extracción de lípidos específicos o grupos de lípidos se optimizan generalmente empírico.

Para acelerar la extracción y producción del aumento, se utiliza un sistema de sonicación para aplicar ultrasonido - ondas con frecuencias mayores que 20 kHz, junto con la mezcla de solvente. Cuando estas ondas con la fase líquida orgánica, causan la formación de microburbujas de breve duración de vapores de solventes que rápidamente crecen y colapsan. En colapso, estas burbujas liberan una tremenda cantidad de energía como esquileo mecánico, facilitando solubilización de lípidos y aumentar dramáticamente la eficiencia de extracción.

Después de que el ultrasonido asistida proceso de extracción por solvente, el resultado es un crudo Extracto de preparación, llamada un extracto total de lípidos, que se somete a la purificación adicional para permitir el examen cualitativo y cuantitativo de las firmas de lípidos. Ahora que comprende algunos de los principios fundamentales detrás de extracción por sonicación, permite echar un vistazo a un protocolo de cómo se realiza el procedimiento.

Recoger los materiales de muestra necesario de un lugar elegido. Algunos ejemplos son sedimentos marinos y lacustres, terrestres suelos, cultivos microbianos, u hojas de la planta. Material recogido se congela durante la noche. A continuación es liofilizado en secador de congelación de 2 a 3 días. Triturar y homogeneizar los liófilos antes de la extracción con un solvente-enjuagar el mortero y una maja. Para eliminar contaminantes orgánicos, quema el borosilicato requiere vidrio pipetas, frascos y latas de pesaje en un horno. Después de permitir que el vidrio se enfríe en el horno, lavar las herramientas de metal con una mezcla de diclorometano y metanol. Una vez que la muestra y la cristalería están preparados, puede comenzar el procedimiento de sonicación.

Desde este paso, todos los envases y cristalería deben ser quemado antes de su uso. Coloque la bandeja de pesaje en una báscula y Tara. Enjuague el espátula de laboratorio con la mezcla de solvente, entonces, utilizarla para transferencia de una masa adecuada de liofilizado, homogeneizada de la muestra en la bandeja de pesaje y registrar la masa. Cuidadosamente transfiera la muestra pesada en un frasco etiquetado. Con la botella de squirt de DCM:MeOH, agregar suficiente que la muestra está cubierta por 1 a 2 cm del solvente y tapa el frasco. Coloque el frasco en un estante resistente al agua, ahora listo para la sonicación. Coloque la rejilla directamente en el baño de sonicación. Compruebe que el nivel del agua en el baño de sonicación es sólo lo suficientemente profundo como para sumergir los frascos de muestra hasta la parte superior del solvente de extracción. Someter a ultrasonidos durante 30 minutos a temperatura ambiente. Después de la sonicación, saque la rejilla del sonicador. Deje los frascos para permitir que el sedimento colocar para ocurrir.

Eliminar la fase de diclorometano-metanol superior del frasco de extracción utilizando una pipeta y bulbo y transferir a otro vial previamente pesado y etiquetado. Repita el proceso de sonicación un total de tres veces para cada muestra. Recoger los extractos en un frasco. Permite muestras extraídas secar en sus frascos, tapas y en la capilla, cubierto ligeramente con un trozo de papel de aluminio. Etiqueta como 'residuo extraído' y guárdelo en el solvente de extracción. Ahora que los biomarcadores han sido extraídos, debe purificarse antes de análisis pueden llevarse a cabo.

Sonicación acelera varios procesos de extracción por solvente y es ampliamente utilizado en estudios geoquímicos. Muchos arqueólogos trabajan con geoquímicos con el fin de reconstruir las circunstancias ambientales y culturales bajo las cuales vivieron civilizaciones humanas antiguas. Cerámica, uno de los inventos humanos más antiguos, cuando desenterró, para contener fósiles moleculares residual de vino, arroz u otros contenidos que se almacenan una vez dentro se puede encontrar.

Descubrir los indicios químicos de las sustancias absorbidas en las superficies, pequeñas muestras de la cerámica se sonicó en presencia de solventes orgánicos y compuestos extraídos pueden ser posteriormente identificadas abajo por métodos espectroscópicos. Este tipo de análisis ayuda a los arqueólogos detectan los tipos de recursos que estaban disponibles para las poblaciones antiguas y reconstruir las condiciones de su hábitat.

Microalgas fotosintéticas se encuentran en los ecosistemas marinos y agua dulce. Porque crecen en medios a base de agua de mar y su cultura ocupa áreas considerablemente menores, ellos son ahora ampliamente estudiando como una alternativa prometedora a las plantas terrestres para la producción de biocombustibles.

Para extraer los lípidos de una biomasa microalgal, estos investigadores describen una extracción por solventes asistida por sonicación. Cavitación acústica durante la sonicación efectivamente altera las paredes celulares rígidas de microalgas para liberar a los lípidos. Estas técnicas ayudan a la caracterización de microalgas nuevo del ambiente para la producción de petróleo no fuentes de energía.

Sólo ha visto la introducción de Zeus a Sonication-Assisted extracción de biomarcadores de los sedimentos. Los siguientes videos explican cómo el extracto se purifica aún más para el análisis.

¡Gracias por ver!

Procedure

<>

1. recoger el material necesario

  1. Muestras (hojas, suciedad, hongos, corteza, tejido), generalmente congelado, liofilizado, aplastado y homogeneizada antes de la extracción, extraída en grupos para maximizar la eficiencia. Extraer tres muestras.
  2. Dependiendo del tamaño de la muestra, deben utilizarse frascos con volúmenes que van de 4-60 mL. Para este experimento, se utilizan frascos de vidrio de borosilicato (40 mL) y casquillos seguros solvente. Viales, pipetas de vidrio de borosilicato y latas de pesaje deben ser quemado a 550 ° C antes de 6 h asegurar el retiro de posibles contaminantes orgánicos.
  3. Diclorometano y metanol son comunes en los laboratorios de geoquímica orgánicos más. Se utilizan individualmente para limpiar instrumentos de laboratorio y cristalería antes de usar. Una mezcla de diclorometano (DCM) en metanol (MeOH; 9:1) se utiliza en muchos laboratorios para extraer eficientemente biomarcadores con un amplio rango de polaridades. Disolventes deben estar libres de contaminantes orgánicos.
  4. Utilizar un baño de sonicación a temperatura ambiente. Una gama de tamaños de sonicador y sonicación con o sin calor están disponibles en tiendas de equipamiento científico mayor.
  5. Estantes de vial, que deben ser resistente al agua, se colocará en el baño de sonicación.
  6. Solvente había aprobado Campana química.

2. preparación de muestra

  1. Coloque una combustión peso de lata en la escala de laboratorio y Tara.
  2. Enjuague el espátula de laboratorio con solvente, luego utilizar para transferir una masa adecuada de muestra en la bandeja de pesaje y registrar la masa.
    1. La masa de la muestra varía en función de su contenido de materia orgánica. Materia orgánica relativamente magro material (barro marino) puede requerir varios gramos, mientras que el material rico de materia orgánica (tejido foliar) puede requerir mucho menos.
  3. Transferir todo el material en la bandeja de pesaje en una combustión, vial previamente pesado y etiquetado. Tapa el frasco y luego tire de la bandeja de pesaje.
  4. Realice los pasos 2.1-2.3 para cada muestra que se extrae.

3. extracción

  1. Utilizando una pipeta de pre-combustión y bulbo, transferir 20 mL de la mezcla de DCM:MeOH (9:1) en cada frasco (vial debe ser aproximadamente medio lleno). Tapar los frascos antes de pasar a la siguiente muestra, para no evaporar los solventes volátiles.
    1. Las volatilidades de DCM y MeOH son diferentes. Evaporación del disolvente de extracción por cubetas destapado tiene la habilidad de cambiar su polaridad y así la extracción.
  2. Coloque los frascos de muestra en un rack de frasco resistente al agua.
  3. Compruebe que el nivel de agua en el baño de sonicación es sólo lo suficientemente profundo como para sumergir los frascos de muestra hasta la parte superior del solvente de extracción. Demasiada agua puede causar los frascos flotar; muy poca agua puede dejar las muestras de ser bien agitado.
  4. Coloque la rejilla del frasco con las muestras en él directamente en el baño de sonicación.
  5. Someter a ultrasonidos durante 30 min a temperatura ambiente.
  6. Quitar el estante de la muestra del sonicador. Si la extracción de sedimentos, que establece por 30 min permitir colocar a ocurrir. Si otro grupo de muestras de extracción, poner en sonicador en este momento.
  7. Retire la mezcla de DCM:MeOH del frasco de extracción, utilizando un pre combustión pipeta y bulbo, e inserto en otro previamente había pesado, pre-quemado y había etiquetado frasco 40 mL.
  8. Repita 3 3.1-3.7 x para todas las muestras.
  9. Permite muestras extraídas secar en sus frascos, tapas y en la capilla, cubierto ligeramente con un trozo de papel de aluminio. La etiqueta como 'residuo extraído' y almacenar.
  10. Los extractos combinados para cada muestra de la etiqueta como 'TLE'.

Results

Al final de la extracción, un extracto total de lípidos (TLE) para cada muestra es evidente. Cada frasco contiene la materia orgánica extraíble de un sedimento, suelo o tejido vegetal. Ahora se pueden analizar estos TLEs y sus componentes químicos identifican y cuantificaron.

Applications and Summary

Diferentes clases de biomarcadores imparten información sobre aspectos específicos del sistema terrestre. Por ejemplo, en su infancia, geoquímica orgánica fue referido principalmente a la formación, la migración y la alteración del petróleo, y muchas de las herramientas químicas geoquímicos orgánicos utilizan hoy en día se basan en las investigaciones iniciales. Fue a través de la investigación de una clase de compuestos llamados isoprenoides, tener un patrón repetitivo de cinco carbono (figura 2), los científicos descubrió petróleo había compuesto químicamente alterados restos de antiguos productores primarios, como el plancton en el océano (conversión a petróleo, figura 3) o pantanos de la turba en la tierra (carbón, figura 4). Químicos en grandes empresas petroleras utilizan los ratios de una variedad de compuestos, cada uno con su propio índice conocido de alteración, para estimar cuántos años petróleo, donde proviene, y si valió la pena explotar. En la actualidad, se están descubriendo nuevos biomarcadores, identificado y caracterizado en modernas y antiguas muestras analizadas en los laboratorios de geoquímica orgánica del mundo. Muchas de las aplicaciones actuales tratan de extraer información ambiental de biomarcadores obtenidos en las muestras modernas (hojas, tierra, microbios, las muestras de agua, etc.) para ampliar la utilidad de los biomarcadores para sedimentos antiguos en un intento de reconstruir los climas, ambientes y ecosistemas del pasado. Por ejemplo, la distribución de un grupo de biomarcadores llamada thioureas glicerol glicerol-tetraethers (GDGTs para el cortocircuito), producido por un conjunto de arqueas y bacterias, se encontraron en sedimentos modernos para cambiar de manera predecible en respuesta a la temperatura del aire o el agua. Por lo tanto, puede utilizarse la distribución de estos biomarcadores en sedimentos antiguos, o a través de una serie de sedimentos de edad conocida, para reconstruir el aire y el agua de temperatura nuevo varios millones de años.

Figure 2
Figura 2. Isopreno está formado por cinco átomos de carbono y dos dobles enlaces. Cuando se suman en la reacción de biosíntesis, pueden formar moléculas complejas de diagnósticos para la presencia de la vida. Por ejemplo, 2, 6,10,15,19-pentamethyleicosane, que se encuentran comúnmente en esteras de cianobacterias.

Figure 3
Figura 3. Iluminación de plancton en Maldives. Foto de PawelG de derechos de autor.

Figure 4
Figura 4. Pantano de la turba a 4.500 m de altitud en los Andes del Ecuador. Copyright Dr. Morley Read

<>

1. recoger el material necesario

  1. Muestras (hojas, suciedad, hongos, corteza, tejido), generalmente congelado, liofilizado, aplastado y homogeneizada antes de la extracción, extraída en grupos para maximizar la eficiencia. Extraer tres muestras.
  2. Dependiendo del tamaño de la muestra, deben utilizarse frascos con volúmenes que van de 4-60 mL. Para este experimento, se utilizan frascos de vidrio de borosilicato (40 mL) y casquillos seguros solvente. Viales, pipetas de vidrio de borosilicato y latas de pesaje deben ser quemado a 550 ° C antes de 6 h asegurar el retiro de posibles contaminantes orgánicos.
  3. Diclorometano y metanol son comunes en los laboratorios de geoquímica orgánicos más. Se utilizan individualmente para limpiar instrumentos de laboratorio y cristalería antes de usar. Una mezcla de diclorometano (DCM) en metanol (MeOH; 9:1) se utiliza en muchos laboratorios para extraer eficientemente biomarcadores con un amplio rango de polaridades. Disolventes deben estar libres de contaminantes orgánicos.
  4. Utilizar un baño de sonicación a temperatura ambiente. Una gama de tamaños de sonicador y sonicación con o sin calor están disponibles en tiendas de equipamiento científico mayor.
  5. Estantes de vial, que deben ser resistente al agua, se colocará en el baño de sonicación.
  6. Solvente había aprobado Campana química.

2. preparación de muestra

  1. Coloque una combustión peso de lata en la escala de laboratorio y Tara.
  2. Enjuague el espátula de laboratorio con solvente, luego utilizar para transferir una masa adecuada de muestra en la bandeja de pesaje y registrar la masa.
    1. La masa de la muestra varía en función de su contenido de materia orgánica. Materia orgánica relativamente magro material (barro marino) puede requerir varios gramos, mientras que el material rico de materia orgánica (tejido foliar) puede requerir mucho menos.
  3. Transferir todo el material en la bandeja de pesaje en una combustión, vial previamente pesado y etiquetado. Tapa el frasco y luego tire de la bandeja de pesaje.
  4. Realice los pasos 2.1-2.3 para cada muestra que se extrae.

3. extracción

  1. Utilizando una pipeta de pre-combustión y bulbo, transferir 20 mL de la mezcla de DCM:MeOH (9:1) en cada frasco (vial debe ser aproximadamente medio lleno). Tapar los frascos antes de pasar a la siguiente muestra, para no evaporar los solventes volátiles.
    1. Las volatilidades de DCM y MeOH son diferentes. Evaporación del disolvente de extracción por cubetas destapado tiene la habilidad de cambiar su polaridad y así la extracción.
  2. Coloque los frascos de muestra en un rack de frasco resistente al agua.
  3. Compruebe que el nivel de agua en el baño de sonicación es sólo lo suficientemente profundo como para sumergir los frascos de muestra hasta la parte superior del solvente de extracción. Demasiada agua puede causar los frascos flotar; muy poca agua puede dejar las muestras de ser bien agitado.
  4. Coloque la rejilla del frasco con las muestras en él directamente en el baño de sonicación.
  5. Someter a ultrasonidos durante 30 min a temperatura ambiente.
  6. Quitar el estante de la muestra del sonicador. Si la extracción de sedimentos, que establece por 30 min permitir colocar a ocurrir. Si otro grupo de muestras de extracción, poner en sonicador en este momento.
  7. Retire la mezcla de DCM:MeOH del frasco de extracción, utilizando un pre combustión pipeta y bulbo, e inserto en otro previamente había pesado, pre-quemado y había etiquetado frasco 40 mL.
  8. Repita 3 3.1-3.7 x para todas las muestras.
  9. Permite muestras extraídas secar en sus frascos, tapas y en la capilla, cubierto ligeramente con un trozo de papel de aluminio. La etiqueta como 'residuo extraído' y almacenar.
  10. Los extractos combinados para cada muestra de la etiqueta como 'TLE'.

A subscription to JoVE is required to view this article.
You will only be able to see the first 20 seconds.

RECOMMEND JoVE