Extraction de sonication de biomarqueurs lipidiques de sédiments

Earth Science

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Overview

Source : Laboratoire de Jeff Sanoussi - University of Massachusetts Amherst

Le matériel comprenant la part « bio » vie de l’écosystème (feuilles, champignons, écorce, tissu ; La figure 1) diffère fondamentalement de la matière de la part de « inorganique » non biologiques (roches et leurs constituants minéraux, oxygène, eau, métaux). Matière organique contient du carbone lié à une série d’autres molécules de carbone et d’hydrogène (Figure 2), ce qui le distingue de matières inorganiques. Gamme de large de Valence du carbone (03:56) lui permet de se former jusqu'à quatre liaisons covalentes séparés avec voisins atomes, habituellement C, H, O, N, S et P. Il peut également partager jusqu'à trois liaisons covalentes avec un seul autre atome, comme la triple liaison dans le groupe cyanure ou nitrile, souvent toxique. Durant les dernières années de 4,6 milliards, cette flexibilité a entraîné un extraordinaire éventail de structures chimiques, qui peuvent varier en taille, la complexité, polarité, forme et fonction. Le domaine scientifique de la géochimie organique traite de l’identification et la caractérisation de l’ensemble des composés organiques détectable, appelé biomarqueurs, produites par la vie sur cette planète, ainsi que d’autres, par le biais de temps géologiques.

Figure 1
La figure 1. Les matières organiques, comme les arbres, les feuilles et mousses, sont chimiquement et visuellement distincte de matières inorganiques, tels que de la chaussée.

Cite this Video

JoVE Science Education Database. L'essentiel de la science de la terre. Extraction de sonication de biomarqueurs lipidiques de sédiments. JoVE, Cambridge, MA, (2017).

Principles

Extraction par sonication est la méthode la plus simple et moins coûteuse d’obtenir un total de lipides (TLE) extrait un échantillon donné, et la récupération associée à cette méthode est comparable à d’autres techniques plus sophistiquées. Il utilise une cuve à ultrasons pour agiter un échantillon dans un flacon en présence de solvant organique. Biomarqueurs contenues dans l’échantillon se dissolvent dans la phase organique basée sur les règles de solubilité, qui, avec des composés organiques, sont régis principalement par la polarité de la biomarqueurs et le solvant. C’est résumée par la soi-disant « comme se dissout comme » règle, auquel cas relativement biomarqueurs apolaire (celles qui contiennent exclusivement C et H ; isoprène) se dissolvent dans les solvants apolaires (comme l’hexane, polarité = 0,1) et des biomarqueurs polaires plus (ceux contenant O, N, S, P ; glycérol glycérol-dialkyl-tetraethers (GDGT)) se dissolvent dans les solvants polaires plus (comme le méthanol ou dichlorométhane, polarité = 5.1 et 3.1). En fait, c’est la première étape à qui la séparation des différents groupes de biomarqueurs est possible via l’introduction d’une série de solvants, d’apolaire à polaire, l’extraction de composés polaires plus en plus de l’échantillon. Les solvants extraits séquentielle d’un sédiment de cible donc peuvent être analysés séparément ou combinés pour former un extrait de lipides totaux (TLE) qui peut être purifié par la suite.

La première étape en paléoclimatologie consiste à collecter, ou d’un extrait, les biomarqueurs de sédiments qu’ils sont trouvent dans. Les échantillons environnementaux sont composés de composants non organiques, tels que les minéraux, l’eau et les métaux et des composants organiques qui sont créés par des organismes vivants dans la région. Avant ces composants organiques peuvent être utilisés par les scientifiques afin d’élucider les informations sur le passé, ils doivent être retirés de leur environnement. La sonication, qui utilise des ondes ultrasoniques, est la plus simple et la moins chère de ces techniques.

Cette vidéo fait partie d’une série sur les lipides extraction, purification et analyse des sédiments. Il va illustrer extraction lipides par échographie et présenter quelques applications de la méthode.

Vu le large éventail des biomarqueurs, il n’y a aucun solvant unique optimisé pour extraire tous les. Ceci est résumé par ce qu’on appelle « comme se dissout comme » règle, auquel cas relativement molécules apolaires se dissolvent dans les solvants apolaires comme le dichlorométhane, et plusieurs molécules polaires se dissolvent dans les solvants polaires plus comme le méthanol. Des mélanges de solvants pour l’extraction des lipides spécifiques ou des groupes de lipides sont généralement optimisés d’empiriquement.

Pour accélérer l’extraction et augmenter le rendement, un système de sonication sert à appliquer par ultrasons - vagues avec des fréquences supérieures à 20 kHz, en conjonction avec le mélange de solvants. Lorsque ces ondes Contactez la phase organique liquide, ils provoquent la formation de microbulles éphémère de vapeurs de solvants qui rapidement se développer et de s’effondrer. S’effondrer, ces bulles sortir une énorme quantité d’énergie sous cisaillement mécanique, faciliter la solubilisation de lipides et d’augmenter considérablement l’efficacité de l’extraction.

Après l’échographie assistée par processus d’extraction par solvant, le résultat est un brut extrait préparation, appelée un extrait lipidique total, qui est soumis à une purification plus poussée pour permettre un examen qualitatif et quantitatif des signatures de lipides. Maintenant que vous comprenez certains des grands principes derrière l’extraction des lipides par sonication, jetons un oeil à un protocole pour la façon dont la procédure est exécutée.

Récupérer les matériaux de l’échantillon nécessaire depuis un endroit choisi. Quelques exemples sont les sédiments lacustres et marins, les sols terrestres, les cultures microbiennes, ou feuilles des plantes. Matériel collecté est gelé pendant la nuit. Suite à cela elle est lyophilisée dans un gel sèche pendant 2 à 3 jours. Écraser et homogénéiser les échantillons lyophilisés avant l’extraction avec un solvant rincée mortier et un pilon. Pour enlever les contaminants organiques, brûler le borosilicate nécessaire verre pipettes, flacons et bidons de pesage dans un four. Après avoir laissé la verrerie refroidir dans le four, rincer les outils en métal avec un mélange de dichlorométhane et le méthanol. Une fois l’échantillon et la verrerie sont préparés, la procédure de sonication peut commencer.

De cette étape, tous les conteneurs et la verrerie doivent être consommé avant utilisation. Placer l’étain pesée sur une balance et la tare. Rincer la spatule de laboratoire avec le mélange de solvant, puis, il permet de transférer une masse appropriée d’échantillon homogénéisé lyophilisé dans le moule de pesage et d’enregistrer la masse. Transvaser avec soin l’échantillon pesé dans un flacon étiqueté. À l’aide du vaporisateur de DCM:MeOH, ajouter assez que l’échantillon est couverte par 1 à 2 cm du solvant et boucher le flacon. Placez la cuvette sur un support imperméable à l’eau, maintenant prêt pour la sonication. Placez la grille directement dans le bain de la sonication. Vérifiez que le niveau d’eau dans le bain de sonication est juste assez profond pour plonger les flacons d’échantillon jusqu’au sommet du solvant d’extraction. Laisser agir pendant 30 minutes à température ambiante. Après la sonication, enlever le panier le sonicateur. Laisser les flacons pour permettre des sédiments s’installer pour se produire.

Supprimer la phase supérieure de dichlorométhane-méthanol de la fiole d’extraction à l’aide d’une pipette et une ampoule et transférer dans un autre flacon préalablement pesé et étiqueté. Répétez le processus de sonication trois fois au total pour chaque échantillon. Rassembler les extraits dans un flacon. Permettre des échantillons extraits sécher dans leurs flacons, bouchons et dans la hotte, couverts sans serrer avec un morceau de papier d’aluminium. Qualifier de « résidus extraits » et les stocker dans le solvant d’extraction. Maintenant que les biomarqueurs ont été extraites, elles doivent être purifiées avant analyse puisse avoir lieu.

Sonication accélère plusieurs procédés d’extraction par solvant et est largement utilisée dans les études géochimiques. De nombreux archéologues travaillent avec géochimistes afin de reconstituer les circonstances environnementales et culturelles dans lesquelles vivaient les premières civilisations humaines. Poterie, une des plus anciennes inventions humaines, lorsque mis au jour, peut être trouvé à contiennent des fossiles moléculaires résiduelles de vin, riz ou autres éléments qui ont été une fois stockés dans.

Pour y dénicher des preuves chimiques des substances absorbées sur les surfaces, petits échantillons de poterie sont sonication en présence de solvants organiques et les composés extraits peuvent être par la suite identifié en aval par des méthodes spectroscopiques. Ce type d’analyse permet archéologues détecter les types de ressources qui étaient disponibles pour les populations anciennes et reconstituer les conditions de leur habitat.

Les microalgues photosynthétiques se trouvent dans les écosystèmes marins et d’eau douce. Parce qu’ils poussent dans des milieux à base d’eau de mer et leur culture occupe des zones beaucoup plus petites, ils sont maintenant largement étudiées comme une alternative prometteuse pour les plantes terrestres pour la production de biocarburants.

Pour extraire les lipides d’une biomasse d’algues microscopiques, ces chercheurs décrivent une extraction par solvant assistée par sonication. Cavitation acoustique au cours de la sonication perturbe efficacement les parois cellulaires rigides microalgues afin de libérer des lipides. Ces techniques d’aide la caractérisation de microalgues nouveaux de l’environnement pour la production de sources non pétroliers de l’énergie.

Vous avez juste regardé introduction de JoVE Sonication-Assisted Extraction de biomarqueurs dans les sédiments. Les vidéos suivantes vont expliquera comment l’extrait est purifié pour l’analyse.

Merci de regarder !

Procedure

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1. rassemblez le matériel nécessaire

  1. Échantillons (feuilles, terre, champignons, écorce, tissus), généralement congelé, lyophilisé, écrasés et homogénéisé avant l’extraction, extraite en groupes afin de maximiser l’efficacité. Extrait de trois échantillons.
  2. Selon la taille de l’échantillon, les flacons avec des volumes allant de 4 à 60 mL peuvent être utilisés. Pour cette expérience, les flacons en verre de borosilicate (40 mL) et solvants sécuritaires casquettes sont utilisés. Flacons, pipettes en verre borosilicate et boîtes de pesage doivent être brûlé à 550 ° C pour garantir l’élimination des contaminants organiques possibles avant 6 h.
  3. Dichlorométhane et le méthanol sont courantes dans les laboratoires de géochimie organiques plus. Ils sont utilisés individuellement pour rincer les outils de laboratoire et de la verrerie avant utilisation. Un mélange de dichlorométhane (DCM) de méthanol (MeOH ; 9:1) est utilisé dans nombreux laboratoires d’extraire efficacement des biomarqueurs avec un large éventail de polarités. Solvants doivent être exempts de contaminants organiques.
  4. Utiliser un bain d’eau de sonication à température ambiante. Une gamme de tailles sonicateur et sonication avec ou sans chaleur sont disponibles auprès de revendeurs de matériel scientifique majeur.
  5. Racks de flacon, qui doivent être imperméable à l’eau, seront placés dans le bain de la sonication.
  6. Solvant approuvé hotte chimique.

2. préparation de l’échantillon

  1. Placez une tible pesant étain sur l’échelle du laboratoire, puis tare.
  2. Rincer la spatule de laboratoire avec le solvant, puis utilisez-la pour transférer une masse appropriée de l’échantillon dans l’étain pesage et enregistrer la masse.
    1. La masse de l’échantillon varie en fonction de sa teneur en matière organique. Matière organique relativement maigre matériel (boue marine) peut exiger plusieurs grammes, tandis que la matière organique riche matériel (tissus foliaires) peut-être nécessiter beaucoup moins.
  3. Transférer la totalité de la matière dans l’étain pesage dans un consommé, flacon préalablement pesé et étiqueté. Boucher le flacon, puis jetez l’étain de pesage.
  4. Effectuez les étapes 2.1 à 2.3 pour chaque échantillon à extraire.

3. extraction

  1. À l’aide d’une pipette de pre-tible et ampoule, transférer environ 20 mL du mélange (9:1) DCM:MeOH dans chaque flacon (flacon devrait être environ moitié plein). Reboucher les flacons avant de passer à l’échantillon suivant, afin que les solvants volatils s’évapore pas.
    1. Les volatilités de DCM et MeOH sont différentes. Évaporation du solvant d’extraction en raison de l’échantillon non plafonnés flacons a la capacité de changer sa polarité et donc l’extraction.
  2. Placer les flacons d’échantillon dans un support imperméable à l’eau flacon.
  3. Vérifiez que le niveau d’eau dans le bain de sonication n’est pas assez profond pour submerger les flacons d’échantillon jusqu’au sommet du solvant d’extraction. Trop d’eau peut causer les flacons à flotter ; trop peu d’eau peut arrêter des échantillons provenant d’être agité correctement.
  4. Placez la grille de flacon avec les échantillons à elle directement dans le bain de la sonication.
  5. Laisser agir pendant 30 min à température ambiante.
  6. Retirez le panier de l’échantillon du sonicateur. Si l’extraction des sédiments, laissez-le durcir durant 30 min permettre la décantation se produise. S’extraire un autre ensemble d’échantillons, mise en sonicateur en ce moment.
  7. Retirez le mélange de DCM:MeOH de la fiole d’extraction, à l’aide d’une pipette de pre-tible et l’ampoule, et insérer dans une autre préalablement pesé, pré-tible et étiqueté flacon de 40 mL.
  8. Répétez 3 3.1 à 3.7 x pour tous les échantillons.
  9. Permettre des échantillons extraits sécher dans leurs flacons, bouchons et dans la hotte, couverts sans serrer avec un morceau de papier d’aluminium. Qualifier de « résidus extraits » et stocker.
  10. Les extraits combinés pour chaque échantillon de qualifier de « TLE ».

Results

À la fin de l’extraction, un extrait de lipides totaux (TLE) pour chaque échantillon est évident. Chaque flacon contient de la matière organique extractible de sédiment, sol ou des tissus végétaux. Ces DFIT peut désormais être analysés et leurs constituants chimiques identifiés et quantifiés.

Applications and Summary

Différentes classes de biomarqueurs communiquer des informations sur des aspects spécifiques du système terrestre. Par exemple, à ses débuts, géochimie organique était essentiellement chargé de la formation, la migration et transformation du pétrole, et plusieurs des outils chimiques organiques géochimistes utilisent aujourd'hui sont basées sur ces enquêtes initiales. C’est grâce à l’enquête d’une classe de composés appelés isoprénoïdes, ayant un motif répétitif de cinq carbone (Figure 2), que les scientifiques pétrole découvert comprend les vestiges chimiquement modifiés des anciens producteurs primaires, comme le plancton dans l’océan (conversion en pétrole, Figure 3) ou les tourbières sur terre (charbon, Figure 4). Chimistes de grandes compagnies pétrolières utilisé les rapports des divers composés, chacun avec son propre taux connu d’altération, d’estimer comment vieux pétroliers était, où il vient, et si cela valait la peine d’exploiter. Aujourd'hui, nouveaux biomarqueurs sont découverts, identifié et caractérisé en anciens et modernes des échantillons analysés dans les laboratoires de la géochimie organique dans le monde entier. Bon nombre des applications actuelles cherchent à extraire des informations environnementales de biomarqueurs obtenus dans les échantillons modernes (feuilles, terre, microbes, des échantillons d’eau, etc.) afin d’étendre l’utilité du biomarqueur sédiments anciens dans le but de reconstituer les climats, les environnements et les écosystèmes du passé. Par exemple, la distribution d’un groupe de biomarqueurs appelée glycérol-dialkyl glycérol-tetraethers (GDGTs en abrégé), produites par une suite d’archaea et bactéries, ont été trouvés dans des sédiments modernes pour changer d’une manière prévisible en réponse à la température de l’air ou l’eau. La distribution de ces biomarqueurs dans les sédiments anciens peut donc être utilisée, ou à travers une série de sédiments d’âge connu, de reconstituer l’air et l’eau température retour de plusieurs millions d’années.

Figure 2
Figure 2. Isoprène compose de cinq atomes de carbone et deux doubles liaisons. Lorsque additionnées dans les réactions de biosynthèse, ils peuvent former des molécules complexes diagnostiques pour la présence de la vie. Par exemple, 2, 6,10,15,19-pentamethyleicosane, trouve couramment dans les tapis de cyanobactéries.

Figure 3
Figure 3. Illumination du plancton au Maldives. Crédits Photo PawelG.

Figure 4
Figure 4. Tourbière à 4 500 m d’altitude dans les Andes équatoriennes. Copyright Dr Morley Read

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1. rassemblez le matériel nécessaire

  1. Échantillons (feuilles, terre, champignons, écorce, tissus), généralement congelé, lyophilisé, écrasés et homogénéisé avant l’extraction, extraite en groupes afin de maximiser l’efficacité. Extrait de trois échantillons.
  2. Selon la taille de l’échantillon, les flacons avec des volumes allant de 4 à 60 mL peuvent être utilisés. Pour cette expérience, les flacons en verre de borosilicate (40 mL) et solvants sécuritaires casquettes sont utilisés. Flacons, pipettes en verre borosilicate et boîtes de pesage doivent être brûlé à 550 ° C pour garantir l’élimination des contaminants organiques possibles avant 6 h.
  3. Dichlorométhane et le méthanol sont courantes dans les laboratoires de géochimie organiques plus. Ils sont utilisés individuellement pour rincer les outils de laboratoire et de la verrerie avant utilisation. Un mélange de dichlorométhane (DCM) de méthanol (MeOH ; 9:1) est utilisé dans nombreux laboratoires d’extraire efficacement des biomarqueurs avec un large éventail de polarités. Solvants doivent être exempts de contaminants organiques.
  4. Utiliser un bain d’eau de sonication à température ambiante. Une gamme de tailles sonicateur et sonication avec ou sans chaleur sont disponibles auprès de revendeurs de matériel scientifique majeur.
  5. Racks de flacon, qui doivent être imperméable à l’eau, seront placés dans le bain de la sonication.
  6. Solvant approuvé hotte chimique.

2. préparation de l’échantillon

  1. Placez une tible pesant étain sur l’échelle du laboratoire, puis tare.
  2. Rincer la spatule de laboratoire avec le solvant, puis utilisez-la pour transférer une masse appropriée de l’échantillon dans l’étain pesage et enregistrer la masse.
    1. La masse de l’échantillon varie en fonction de sa teneur en matière organique. Matière organique relativement maigre matériel (boue marine) peut exiger plusieurs grammes, tandis que la matière organique riche matériel (tissus foliaires) peut-être nécessiter beaucoup moins.
  3. Transférer la totalité de la matière dans l’étain pesage dans un consommé, flacon préalablement pesé et étiqueté. Boucher le flacon, puis jetez l’étain de pesage.
  4. Effectuez les étapes 2.1 à 2.3 pour chaque échantillon à extraire.

3. extraction

  1. À l’aide d’une pipette de pre-tible et ampoule, transférer environ 20 mL du mélange (9:1) DCM:MeOH dans chaque flacon (flacon devrait être environ moitié plein). Reboucher les flacons avant de passer à l’échantillon suivant, afin que les solvants volatils s’évapore pas.
    1. Les volatilités de DCM et MeOH sont différentes. Évaporation du solvant d’extraction en raison de l’échantillon non plafonnés flacons a la capacité de changer sa polarité et donc l’extraction.
  2. Placer les flacons d’échantillon dans un support imperméable à l’eau flacon.
  3. Vérifiez que le niveau d’eau dans le bain de sonication n’est pas assez profond pour submerger les flacons d’échantillon jusqu’au sommet du solvant d’extraction. Trop d’eau peut causer les flacons à flotter ; trop peu d’eau peut arrêter des échantillons provenant d’être agité correctement.
  4. Placez la grille de flacon avec les échantillons à elle directement dans le bain de la sonication.
  5. Laisser agir pendant 30 min à température ambiante.
  6. Retirez le panier de l’échantillon du sonicateur. Si l’extraction des sédiments, laissez-le durcir durant 30 min permettre la décantation se produise. S’extraire un autre ensemble d’échantillons, mise en sonicateur en ce moment.
  7. Retirez le mélange de DCM:MeOH de la fiole d’extraction, à l’aide d’une pipette de pre-tible et l’ampoule, et insérer dans une autre préalablement pesé, pré-tible et étiqueté flacon de 40 mL.
  8. Répétez 3 3.1 à 3.7 x pour tous les échantillons.
  9. Permettre des échantillons extraits sécher dans leurs flacons, bouchons et dans la hotte, couverts sans serrer avec un morceau de papier d’aluminium. Qualifier de « résidus extraits » et stocker.
  10. Les extraits combinés pour chaque échantillon de qualifier de « TLE ».

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