Espectroscopia ultravioleta-visible (UV-Vis)

Analytical Chemistry

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Overview

Fuente: Laboratorio del Dr. B. Jill Venton - Universidad de Virginia

Espectroscopia ultravioleta-visible (UV-Vis) es uno de las más populares técnicas analíticas porque es muy versátil y capaz de detectar casi cualquier molécula. Con espectroscopía UV-Vis, la luz de UV-Vis se pasa a través de una muestra y se mide la transmitancia de la luz por una muestra. De la transmitancia (T), la absorbancia se puede calcular como A =-log (T). Un espectro de absorbancia se obtiene que muestra la absorbancia de un compuesto en diferentes longitudes de onda. La cantidad de la absorbancia a cualquier longitud de onda es debido a la estructura química de la molécula.

UV-Vis se puede utilizar de una manera cualitativa, para identificar grupos funcionales o confirmar la identidad de un compuesto haciendo coincidir el espectro de absorbancia. También puede ser utilizado de manera cuantitativa, como concentración del analito se relaciona la absorbancia con la ley de Beer. Espectroscopía UV-Vis se utiliza para cuantificar la cantidad de ADN o proteínas en una muestra, para análisis de aguas y como un detector para muchos tipos de cromatografía. Cinética de las reacciones químicas se miden también con espectroscopía UV-Vis tomando medidas repetidas de UV-Vis con el tiempo. UV-Vis son generalmente mediciones con un espectrofotómetro. UV-Vis es también un detector muy popular para otras técnicas analíticas como la cromatografía, pueden detectar muchos compuestos.

Por lo general, UV-Vis no es la técnica de espectroscopia más sensible, porque no mucha luz es absorbida sobre una longitud de ruta corta. Otras técnicas de espectroscopia tales como de fluorescencia tienen mayor sensibilidad, pero no son como generalmente aplicables, como la mayoría de las moléculas no es fluorescente. UV-Vis tiene una sensibilidad similar a otras mediciones de absorbancia, tales como espectroscopia de infrarrojo.

Cite this Video

JoVE Science Education Database. Fundamentos de la química analítica. Espectroscopia ultravioleta-visible (UV-Vis). JoVE, Cambridge, MA, (2017).

Principles

UV-Vis se denomina una técnica general porque la mayoría de las moléculas se absorbe en el rango de longitud de onda de UV-Vis. La UV se extiende de 100 – 400 nm y el espectro visible de 400-700 nm. El rango de 100 – 200 nm se llama UV profundo. Fuentes de luz son más difíciles de encontrar para esta gama, así que no es utilizado rutinariamente para las medidas de UV-Vis. Espectrómetros UV-Vis típico utilizan una lámpara de deuterio para Ultravioleta que produce luz de 170 – 375 nm y una lámpara de filamento de tungsteno para visible, que produce luz de 350 – 2.500 nm.

Cuando un fotón golpea una molécula y es absorbido, la molécula es promovida a un estado energético más excitado. Luz UV-visible tiene la suficiente energía para promocionar electrones a un estado electrónico más alto, desde el orbital molecular ocupado más alto (HOMO) al menor orbital molecular desocupado (LUMO). La diferencia de energía entre el HOMO y el LUMO se llama el boquete de la venda. Por lo general, estos orbitales se llaman vinculación y anti-bonding. La energía del fotón debe coincidir exactamente con el boquete de la venda de los fotones absorbidos. Así, las moléculas con estructuras químicas diferentes tienen huecos de banda de energía diferentes y diferentes espectros de absorción. Las transiciones más comunes que caen en el rango UV-Vis son π-π * y n - π *. Orbitarios del pi se presentan debido a dobles enlaces, y números orbitales son para los electrones de no enlace. Estrella de PI son orbitales pi de anti-bonding. Así, la mejor absorción de UV-Vis es por moléculas que contienen enlaces dobles. PI orbitarios adyacentes que están conectadas, llamado Conjugación, por lo general aumenta la absorción. Sigma-σ * transiciones, asociadas con enlaces sencillos, es una energía más alta y caen en el ultravioleta profundo, por lo que son menos útiles para el uso rutinario. La aparición de amplias bandas u hombros sobre la estructura de UV-Vis es debido a los numerosos Estados vibracionales y rotacionales de una molécula, que separan las lagunas de banda de energía de energías ligeramente diferentes.

Para moléculas con absorción en la región visible, los compuestos a menudo aparecerá coloreados. Sin embargo, una idea falsa común es que la longitud de onda del máximo de absorción (λmax) para un compuesto es el color que aparece. Un compuesto que aparece rojo no tiene mucha absorción en la región roja del espectro. En cambio, el λmáximo para un compuesto que parece rojo es verde. El color de un compuesto se presenta porque las longitudes de onda de la luz selectivamente se transmiten a través de la muestra, y por lo tanto no se absorben. Una rueda de color es útil para determinar qué color va a absorber un compuesto y qué rango el λmáximo será, como el color directamente a través de la rueda desde el color observado es el color que más absorbe.

La absorción sigue ley de Beer, A = εbC donde ε es el coeficiente de atenuación molar, b es la longitud de la ruta, y C es la concentración. El coeficiente de atenuación molar es la característica de un compuesto individual para absorber en una longitud de onda determinada y esta propiedad se debe a grupos funcionales, verbal, etcetera. Si un compuesto no tiene un alto coeficiente de atenuación, podría ser etiquetado con un grupo adecuado para aumentar su absorción. Longitud del camino generalmente se relaciona con el tamaño de la cubeta y es 1 cm en espectrofotómetros estándar.

UV-Vis se realiza en una variedad de instrumentos, desde Espectrofotómetros tradicionales a más lectores de placa moderna. La longitud de onda de absorbancia debe ser elegido, ya sea mediante un filtro o un monocromador. Un monocromador es un dispositivo que separa las longitudes de onda de luz espacial y luego coloca una rendija de salida donde es la longitud de onda deseada de la luz. Monocromadores pueden digitalizarse para proporcionar un espectro de absorbancia todo. Por otra parte, un instrumento de arreglo de diodos permite todos los colores de la luz transmitida a través de la muestra, entonces la luz se separa en diferentes longitudes de onda espacial y detecta el uso de fotodiodos. Instrumentos de arreglo de diodos reunir espectros completos más rápido, pero son más complicados y más caros.

Procedure

1. calibrar el espectrómetro

  1. Encienda el espectrómetro UV-Vis y las lámparas se caliente por un período adecuado de tiempo (alrededor de 20 min) para estabilizarlos.
  2. Llenar una cubeta con el solvente de la muestra y asegúrese de que el exterior esté limpio. Esto servirá como un espacio en blanco y ayudar a responsables de pérdidas de luz debido a la dispersión o la absorción por el disolvente.
  3. Coloque la cubeta en el espectrómetro. Asegúrese de alinear correctamente la cubeta, como a menudo la cubeta tiene dos caras, que sirven para la manipulación (puede ser acanalado) y no pretenden iluminar a través de.
  4. Se hace una medición para el espacio en blanco. La absorbancia debe ser mínima, pero cualquier absorbencia debe restarse de muestras futuras. Algunos instrumentos pueden almacenar los datos en blanco y realizar la resta automáticamente.

2. realizar un espectro de absorbancia

  1. Llene la cubeta con la muestra. Para asegurarse de que la transferencia es cuantitativa, enjuagar la cubeta dos veces con la muestra y luego llenarlo aproximadamente 3/4 completo. Asegúrese de que el exterior esté limpio de huellas digitales, etcetera.
  2. Coloque la cubeta en el espectrómetro en la dirección correcta.
  3. Cubrir la cubeta para evitar cualquier luz ambiental.
  4. Recoge un espectro de absorbancia al permitir que el instrumento para la exploración a través de diferentes longitudes de onda y recoger la absorbancia. La gama de longitud de onda se puede configurar con información sobre la muestra específica, sino un rango de 200 – 800 nm es estándar. Un instrumento de arreglo de diodos es capaz de recoger un espectro de absorbancia todo en una carrera.
  5. Del espectro de absorbancia recogidos, determinar el máximo de absorción (λmáx.). Repetir la colección de espectros para obtener una estimación de error en λmax.
  6. Para hacer una curva de calibración, recoger el espectro UV-Vis de una variedad de muestras de diferente concentración. Espectrómetros están a menudo limitados en rango lineal y no será capaces de medir un valor de absorbancia mayor que 1.5. Si los valores de absorbancia de la muestra están fuera del rango lineal del instrumento, diluir la muestra para obtener los valores dentro del rango lineal.

3. cinética experimentos con espectroscopía UV-Vis

  1. UV-Vis se puede utilizar para experimentos de cinética examinando el cambio de absorbancia con el tiempo. Para un experimento de cinética, tome una lectura inicial de la muestra.
  2. Agregar rápidamente el reactivo para iniciar la reacción química.
  3. Revuelve bien para mezclar con la muestra. Si se agrega una pequeña cantidad, esto se podría hacer en una cubeta. Alternativamente, mezclar el reactivo con la muestra y vierta rápidamente en una cubeta para una medición.
  4. Medir la absorbancia a la λmax para el analito de interés en el tiempo. Si utilizar el reactivo se mide (es decir la absorbancia esta subiendo porque hay menos reactivo a absorber), entonces el decaimiento indicará el orden de la reacción.
  5. Usando una curva de calibración, haga una parcela de tiempo de vs de concentración de analito, convertir el valor de absorbancia en concentración. A partir de ahí, este gráfico se puede caber con las ecuaciones apropiadas para determinar las constantes de velocidad de reacción.

Espectroscopia ultravioleta visible o UV-Vis, es uno de las más populares técnicas analíticas en el laboratorio.

En espectroscopía UV-Vis, la luz pasa a través de una muestra en una determinada longitud de onda en el ultravioleta o del espectro visible. Si la muestra absorbe parte de la luz, no toda la luz será pasar a través de, o transmitirse. Transmisión es el cociente de la intensidad de la luz transmitida a la luz del incidente y se relaciona a la absorbancia. La absorbancia puede utilizarse de una manera cuantitativa, para obtener la concentración de una muestra. También puede ser utilizado de una manera cualitativa, para identificar un compuesto combinando la absorbancia medida en un rango de longitudes de onda, llamado el espectro de absorbancia, a los datos publicados. Este video será introducir espectroscopía UV-Vis y demostrar su uso en el laboratorio en la determinación cinética de reacción y concentración de la muestra.

Cuando un fotón golpea una molécula y es absorbido, la molécula es promovida desde su estado en un estado de mayor energía. La diferencia de energía entre los dos es el boquete de la venda. La energía del fotón debe coincidir exactamente con el boquete de la venda en orden para el fotón sea absorbido. La estructura química determina el boquete de la venda; por lo tanto las moléculas cada tienen espectros de absorción único.

Absorbancia sigue la ley de Beer, que muestra los Estados es igual al coeficiente de atenuación molar veces la longitud de la ruta y la concentración. El coeficiente de atenuación molar está relacionada con la capacidad individual de los compuestos que absorben la luz de una longitud de onda específica. Longitud de la ruta se refiere a la distancia recorrida por la luz a través de la muestra, que normalmente es 1 cm para cubetas estándar. Ley de Beer se puede utilizar para calcular la concentración de la muestra, si la absortividad es conocida, o puede utilizar una curva de calibración.

UV-Vis se denomina una técnica general, como la mayoría de las moléculas absorbe la luz en el rango UV-visible de longitud de onda. La gama UV se extiende de 100 – 400 nm y las gamas del espectro visible de 400-700 nm. Sin embargo, espectrofotómetros más no operan en la gama ultravioleta profunda de 100 – 200 nm, como fuentes de luz en esta gama son caras. Espectrofotómetros UV-Vis la mayoría utilizan una lámpara de deuterio para la gama de UV, que produce luz de 170 – 375 nm y una lámpara de filamento de tungsteno para la gama visible, que produce luz de 350 – 2.500 nm.

Puesto que la fuente de luz es generalmente una lámpara con longitudes de onda amplia, la longitud de onda de absorbancia específica se selecciona mediante filtros o un monocromador. Un monocromador es un dispositivo que separa espacialmente las longitudes de onda de la luz y luego coloca una rendija de salida donde es la longitud de onda deseada de la luz. El monocromador puede analizarse en un rango de longitud de onda para proporcionar un espectro de absorbancia todo. Esto hace que la técnica útil para cuantificar e identificar una amplia gama de moléculas.

Ahora que han sido subrayados los fundamentos de la espectroscopía UV-Vis, permite echar un vistazo a un simple experimento de UV-Vis en el laboratorio.

Antes de comenzar la medición, encender el espectrofotómetro y permitir que las lámparas se caliente por un período adecuado de tiempo para estabilizarlos.

Preparar un espacio en blanco por llenar una cubeta limpia con el disolvente de la muestra y luego limpie el exterior con papel sin pelusa para quitar cualquier las huellas dactilares.

Asegúrese que la cubeta esté correctamente alineada con los lados acanalados de la ruta de la viga e inserte en el espectrofotómetro. Asegure la tapa para evitar que la luz ambiental en el sistema.

Medir la absorbancia del blanco en una longitud de onda, o en un rango de longitud de onda. Grabar o guardar la absorbancia, como debe ser restada de la absorbancia de la muestra.

A continuación, deseche el espacio en blanco y enjuagar la cubeta dos veces con la muestra. Luego, llene la cubeta aproximadamente 3/4 completo con muestra. Limpie el exterior de la cubeta, para que esté limpio y libre de huellas digitales.

Colocar la cubeta en el espectrofotómetro en la orientación correcta y la tapa.

Recoge una medida de absorbancia o espectro en la misma longitud de onda o longitud de onda como el espacio en blanco. Restar el espectro en blanco o la medición, si el instrumento no automáticamente lo hace.

Del espectro de absorbancia recogidos, determinar el máximo de absorbancia y λmax.

Para cuantificar la cantidad de analito en la muestra, cree una curva de calibración utilizando una gama de concentraciones conocidas de analito. Para más información sobre cómo construir y utilizar una curva de calibración, por favor ver el vídeo "curvas de calibración" de la colección.

La medida de absorbancia puede utilizarse también para calcular la cinética de la reacción midiendo el aumento o disminución de la concentración de compuestos a lo largo de la reacción. Comience tomando una lectura inicial de la muestra, azul tinte en este caso, en la absorbancia máxima antes de la reacción.

A continuación, rápidamente agregar el reactivo, bleach en este caso, para iniciar la reacción química. Removemos bien, para que se mezcla con la muestra.

Medir la absorbancia en el máximo de absorbancia en el tiempo.

Se muestra el espectro de absorbancia inicial de la muestra de colorante azul. Los colores de fondo muestran los colores de la luz en el espectro visible. El tinte azul tiene un máximo de absorbancia a unos 630 nm.

La cinética de la reacción entre el tinte azul y cloro se midió con el tiempo. La absorción de colorante azul disminuye con el tiempo, a medida que reacciona con el cloro. La absorbancia alcanza cerca de cero después de 300 s, indicando que la reacción ha casi completado. Para obtener más información sobre cinética y reacciones, por favor ver la enseñanza de las Ciencias JoVE video "leyes de tarifa de reacción".

Espectroscopía UV-Vis se utiliza pesadamente en muchas áreas de investigación para identificar o cuantificar una muestra.

Por ejemplo, espectroscopía UV-Vis se utiliza pesadamente en los campos biológicos para cuantificar la cantidad de proteína en una muestra. Un análisis de Bradford es a menudo utilizado para cuantificar proteínas, con la ayuda de un colorante. En primer lugar, se prepara una curva de calibración de concentraciones conocidas de proteína, normalmente utilizando albúmina sérica bovina, o BSA. Luego se añade colorante azul de Coomassie a cada uno de los estándares y la muestra. Luego se mide la absorbancia del complejo proteína-colorante a 595 nm.

Por otra parte, las proteínas pueden medirse directamente por su absorbancia a 280 nm. En este ejemplo, la concentración de proteína se cuantifica con un espectrofotómetro de ultra bajo volumen. Para muchas proteínas, una absorbancia de 1 corresponde a una concentración de 1 mg/mL.

Espectroscopía UV-Vis se utiliza también para cuantificar la cantidad de células bacterianas en un cultivo celular. Para esta medición, la absorbancia o densidad óptica se mide a 600 nm. Por lo general, una medición de OD600 de 1 indica la presencia de 8 x 108 células bacterianas por mL. Medición de la densidad celular durante el crecimiento de la cultura permite la determinación de la curva de crecimiento bacteriano y puede ayudar a identificar cuando una cultura está en su fase de crecimiento exponencial.

Óxido de nitrógeno y dióxido de nitrógeno o NOx, es un subproducto de escape de automóvil y puede ser perjudiciales para el medio ambiente porque es dañino el ozono troposférico. NOx se puede medir por la reacción con una solución de ácido sulfanílico y napthyl-etilendiamina. La solución resultante es una molécula de color de rosa coloreado tinte de azo, la intensidad de la que se correlaciona directamente a ninguna concentración dex . Esta concentración puede determinarse entonces usando un espectrofotómetro UV-Vis.

Sólo ha visto la introducción de Zeus a la espectroscopia UV-visible. Ahora debe comprender los conceptos básicos de operación de UV-Vis, cómo se mide una muestra usando un UV-Vis y cómo establecer una correlación entre la absorbancia a concentración de la muestra.

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Results

UV-Vis se puede utilizar para obtener un espectro de compuestos coloreados. En la figura 1A, se muestra el espectro de absorción de un colorante azul. El fondo muestra los colores de la luz en el espectro visible. El tinte azul tiene una absorbanciamáxima λ en naranja y rojo. Figura 1B muestra un espectro de un tinte rojo, con λmax en el verde.

Cinética puede ser medida de una parcela de la absorbancia a una longitud de onda en el tiempo. La figura 2 muestra un diagrama de la absorción de un colorante azul (a 630 nm) que reacciona con el cloro.

Figure 1
Figura 1. Espectros de absorción UV-Vis. A. azul tinte #1 tiene la máxima absorbancia en naranja y rojo. B. rojo tinte #40 tiene absorbancia máxima en el verde. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2. UV-Vis para cinética. Absorción de colorante azul #1 que reacciona con el cloro. La curva se puede caber con un decaimiento exponencial, que indica la cinética de primer orden. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Applications and Summary

UV-Vis se utiliza en muchos análisis químicos. Se utiliza para cuantificar la cantidad de proteína en una solución, como la mayoría de las proteínas absorbe fuertemente a 280 nm. Figura 3 muestra un ejemplo de los espectros de citocromo C, que tiene una alta absorbancia a 280 y 450 debido a un grupo hemo. UV-Vis también se utiliza como una técnica estándar para cuantificar la cantidad de ADN en una muestra, como todas las bases absorben fuertemente a 260 nm. RNA y proteínas también absorben a 260 nm, por lo que puede medir absorbancia a otras longitudes de onda para detectar interferencias. Específicamente, las proteínas se absorben fuertemente a 280 nm, por lo que la proporción de absorbancia a 280/260 puede dar una medida de la proporción de proteína a ADN en una muestra.

Simple mayoría de los análisis mide la absorbancia una longitud de onda a la vez. Sin embargo, información más química está presente si las mediciones se hacen en muchas longitudes de onda simultáneamente. Arreglo de diodos instrumentos captura toda la luz que se transmite, dividida la luz en diferentes colores mediante un prisma o una rejilla holográfica, y absorbancia a diferentes longitudes de onda es capturada en un arreglo lineal de fotodiodos. La ventaja de este método es útil para medir muchas moléculas diferentes simultáneamente.

Figure 3
Figura 3. Espectro UV-Vis de una proteína. El pico a 280 nm es indicativa de una proteína. El pico en el 450 es debido a la absorción del grupo hemo del citocromo C.

1. calibrar el espectrómetro

  1. Encienda el espectrómetro UV-Vis y las lámparas se caliente por un período adecuado de tiempo (alrededor de 20 min) para estabilizarlos.
  2. Llenar una cubeta con el solvente de la muestra y asegúrese de que el exterior esté limpio. Esto servirá como un espacio en blanco y ayudar a responsables de pérdidas de luz debido a la dispersión o la absorción por el disolvente.
  3. Coloque la cubeta en el espectrómetro. Asegúrese de alinear correctamente la cubeta, como a menudo la cubeta tiene dos caras, que sirven para la manipulación (puede ser acanalado) y no pretenden iluminar a través de.
  4. Se hace una medición para el espacio en blanco. La absorbancia debe ser mínima, pero cualquier absorbencia debe restarse de muestras futuras. Algunos instrumentos pueden almacenar los datos en blanco y realizar la resta automáticamente.

2. realizar un espectro de absorbancia

  1. Llene la cubeta con la muestra. Para asegurarse de que la transferencia es cuantitativa, enjuagar la cubeta dos veces con la muestra y luego llenarlo aproximadamente 3/4 completo. Asegúrese de que el exterior esté limpio de huellas digitales, etcetera.
  2. Coloque la cubeta en el espectrómetro en la dirección correcta.
  3. Cubrir la cubeta para evitar cualquier luz ambiental.
  4. Recoge un espectro de absorbancia al permitir que el instrumento para la exploración a través de diferentes longitudes de onda y recoger la absorbancia. La gama de longitud de onda se puede configurar con información sobre la muestra específica, sino un rango de 200 – 800 nm es estándar. Un instrumento de arreglo de diodos es capaz de recoger un espectro de absorbancia todo en una carrera.
  5. Del espectro de absorbancia recogidos, determinar el máximo de absorción (λmáx.). Repetir la colección de espectros para obtener una estimación de error en λmax.
  6. Para hacer una curva de calibración, recoger el espectro UV-Vis de una variedad de muestras de diferente concentración. Espectrómetros están a menudo limitados en rango lineal y no será capaces de medir un valor de absorbancia mayor que 1.5. Si los valores de absorbancia de la muestra están fuera del rango lineal del instrumento, diluir la muestra para obtener los valores dentro del rango lineal.

3. cinética experimentos con espectroscopía UV-Vis

  1. UV-Vis se puede utilizar para experimentos de cinética examinando el cambio de absorbancia con el tiempo. Para un experimento de cinética, tome una lectura inicial de la muestra.
  2. Agregar rápidamente el reactivo para iniciar la reacción química.
  3. Revuelve bien para mezclar con la muestra. Si se agrega una pequeña cantidad, esto se podría hacer en una cubeta. Alternativamente, mezclar el reactivo con la muestra y vierta rápidamente en una cubeta para una medición.
  4. Medir la absorbancia a la λmax para el analito de interés en el tiempo. Si utilizar el reactivo se mide (es decir la absorbancia esta subiendo porque hay menos reactivo a absorber), entonces el decaimiento indicará el orden de la reacción.
  5. Usando una curva de calibración, haga una parcela de tiempo de vs de concentración de analito, convertir el valor de absorbancia en concentración. A partir de ahí, este gráfico se puede caber con las ecuaciones apropiadas para determinar las constantes de velocidad de reacción.

Espectroscopia ultravioleta visible o UV-Vis, es uno de las más populares técnicas analíticas en el laboratorio.

En espectroscopía UV-Vis, la luz pasa a través de una muestra en una determinada longitud de onda en el ultravioleta o del espectro visible. Si la muestra absorbe parte de la luz, no toda la luz será pasar a través de, o transmitirse. Transmisión es el cociente de la intensidad de la luz transmitida a la luz del incidente y se relaciona a la absorbancia. La absorbancia puede utilizarse de una manera cuantitativa, para obtener la concentración de una muestra. También puede ser utilizado de una manera cualitativa, para identificar un compuesto combinando la absorbancia medida en un rango de longitudes de onda, llamado el espectro de absorbancia, a los datos publicados. Este video será introducir espectroscopía UV-Vis y demostrar su uso en el laboratorio en la determinación cinética de reacción y concentración de la muestra.

Cuando un fotón golpea una molécula y es absorbido, la molécula es promovida desde su estado en un estado de mayor energía. La diferencia de energía entre los dos es el boquete de la venda. La energía del fotón debe coincidir exactamente con el boquete de la venda en orden para el fotón sea absorbido. La estructura química determina el boquete de la venda; por lo tanto las moléculas cada tienen espectros de absorción único.

Absorbancia sigue la ley de Beer, que muestra los Estados es igual al coeficiente de atenuación molar veces la longitud de la ruta y la concentración. El coeficiente de atenuación molar está relacionada con la capacidad individual de los compuestos que absorben la luz de una longitud de onda específica. Longitud de la ruta se refiere a la distancia recorrida por la luz a través de la muestra, que normalmente es 1 cm para cubetas estándar. Ley de Beer se puede utilizar para calcular la concentración de la muestra, si la absortividad es conocida, o puede utilizar una curva de calibración.

UV-Vis se denomina una técnica general, como la mayoría de las moléculas absorbe la luz en el rango UV-visible de longitud de onda. La gama UV se extiende de 100 – 400 nm y las gamas del espectro visible de 400-700 nm. Sin embargo, espectrofotómetros más no operan en la gama ultravioleta profunda de 100 – 200 nm, como fuentes de luz en esta gama son caras. Espectrofotómetros UV-Vis la mayoría utilizan una lámpara de deuterio para la gama de UV, que produce luz de 170 – 375 nm y una lámpara de filamento de tungsteno para la gama visible, que produce luz de 350 – 2.500 nm.

Puesto que la fuente de luz es generalmente una lámpara con longitudes de onda amplia, la longitud de onda de absorbancia específica se selecciona mediante filtros o un monocromador. Un monocromador es un dispositivo que separa espacialmente las longitudes de onda de la luz y luego coloca una rendija de salida donde es la longitud de onda deseada de la luz. El monocromador puede analizarse en un rango de longitud de onda para proporcionar un espectro de absorbancia todo. Esto hace que la técnica útil para cuantificar e identificar una amplia gama de moléculas.

Ahora que han sido subrayados los fundamentos de la espectroscopía UV-Vis, permite echar un vistazo a un simple experimento de UV-Vis en el laboratorio.

Antes de comenzar la medición, encender el espectrofotómetro y permitir que las lámparas se caliente por un período adecuado de tiempo para estabilizarlos.

Preparar un espacio en blanco por llenar una cubeta limpia con el disolvente de la muestra y luego limpie el exterior con papel sin pelusa para quitar cualquier las huellas dactilares.

Asegúrese que la cubeta esté correctamente alineada con los lados acanalados de la ruta de la viga e inserte en el espectrofotómetro. Asegure la tapa para evitar que la luz ambiental en el sistema.

Medir la absorbancia del blanco en una longitud de onda, o en un rango de longitud de onda. Grabar o guardar la absorbancia, como debe ser restada de la absorbancia de la muestra.

A continuación, deseche el espacio en blanco y enjuagar la cubeta dos veces con la muestra. Luego, llene la cubeta aproximadamente 3/4 completo con muestra. Limpie el exterior de la cubeta, para que esté limpio y libre de huellas digitales.

Colocar la cubeta en el espectrofotómetro en la orientación correcta y la tapa.

Recoge una medida de absorbancia o espectro en la misma longitud de onda o longitud de onda como el espacio en blanco. Restar el espectro en blanco o la medición, si el instrumento no automáticamente lo hace.

Del espectro de absorbancia recogidos, determinar el máximo de absorbancia y λmax.

Para cuantificar la cantidad de analito en la muestra, cree una curva de calibración utilizando una gama de concentraciones conocidas de analito. Para más información sobre cómo construir y utilizar una curva de calibración, por favor ver el vídeo "curvas de calibración" de la colección.

La medida de absorbancia puede utilizarse también para calcular la cinética de la reacción midiendo el aumento o disminución de la concentración de compuestos a lo largo de la reacción. Comience tomando una lectura inicial de la muestra, azul tinte en este caso, en la absorbancia máxima antes de la reacción.

A continuación, rápidamente agregar el reactivo, bleach en este caso, para iniciar la reacción química. Removemos bien, para que se mezcla con la muestra.

Medir la absorbancia en el máximo de absorbancia en el tiempo.

Se muestra el espectro de absorbancia inicial de la muestra de colorante azul. Los colores de fondo muestran los colores de la luz en el espectro visible. El tinte azul tiene un máximo de absorbancia a unos 630 nm.

La cinética de la reacción entre el tinte azul y cloro se midió con el tiempo. La absorción de colorante azul disminuye con el tiempo, a medida que reacciona con el cloro. La absorbancia alcanza cerca de cero después de 300 s, indicando que la reacción ha casi completado. Para obtener más información sobre cinética y reacciones, por favor ver la enseñanza de las Ciencias JoVE video "leyes de tarifa de reacción".

Espectroscopía UV-Vis se utiliza pesadamente en muchas áreas de investigación para identificar o cuantificar una muestra.

Por ejemplo, espectroscopía UV-Vis se utiliza pesadamente en los campos biológicos para cuantificar la cantidad de proteína en una muestra. Un análisis de Bradford es a menudo utilizado para cuantificar proteínas, con la ayuda de un colorante. En primer lugar, se prepara una curva de calibración de concentraciones conocidas de proteína, normalmente utilizando albúmina sérica bovina, o BSA. Luego se añade colorante azul de Coomassie a cada uno de los estándares y la muestra. Luego se mide la absorbancia del complejo proteína-colorante a 595 nm.

Por otra parte, las proteínas pueden medirse directamente por su absorbancia a 280 nm. En este ejemplo, la concentración de proteína se cuantifica con un espectrofotómetro de ultra bajo volumen. Para muchas proteínas, una absorbancia de 1 corresponde a una concentración de 1 mg/mL.

Espectroscopía UV-Vis se utiliza también para cuantificar la cantidad de células bacterianas en un cultivo celular. Para esta medición, la absorbancia o densidad óptica se mide a 600 nm. Por lo general, una medición de OD600 de 1 indica la presencia de 8 x 108 células bacterianas por mL. Medición de la densidad celular durante el crecimiento de la cultura permite la determinación de la curva de crecimiento bacteriano y puede ayudar a identificar cuando una cultura está en su fase de crecimiento exponencial.

Óxido de nitrógeno y dióxido de nitrógeno o NOx, es un subproducto de escape de automóvil y puede ser perjudiciales para el medio ambiente porque es dañino el ozono troposférico. NOx se puede medir por la reacción con una solución de ácido sulfanílico y napthyl-etilendiamina. La solución resultante es una molécula de color de rosa coloreado tinte de azo, la intensidad de la que se correlaciona directamente a ninguna concentración dex . Esta concentración puede determinarse entonces usando un espectrofotómetro UV-Vis.

Sólo ha visto la introducción de Zeus a la espectroscopia UV-visible. Ahora debe comprender los conceptos básicos de operación de UV-Vis, cómo se mide una muestra usando un UV-Vis y cómo establecer una correlación entre la absorbancia a concentración de la muestra.

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