柱层析法

Organic Chemistry

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Overview

资料来源: 实验室的博士吉米 · 佛朗哥-梅里马克大学

柱层析法是最有用的技术,纯化化合物之一。这种技术利用一个平稳的阶段,装在列和通过列中的流动相。这项技术利用极性化合物,允许轻便分离分子之间的差异。1两个最常见色谱固定相用于柱层析硅胶 (SiO2),氧化铝 (Al2O3),最常见的是用有机溶剂移动阶段。2 solvent(s) 为流动相选择都依赖被纯化分子的极性。通常更多极性化合物需要更多的极性溶剂以便利通道的分子通过固定相。纯化过程完成溶剂可以从使用旋转蒸发仪产生孤立的材料收集馏分中删除。

Cite this Video

JoVE Science Education Database. 有机化学精要. 柱层析法. JoVE, Cambridge, MA, (2018).

Principles

样品混合物是安置在列的顶部和吸收到顶部的固定相上。随后,流动相是应用于列和用于洗脱通过固定相混合。柱层析法利用分子极性分离的化合物。在极性差异导致分子穿越了列,这有效地分离开来另一个化合物的速率的差异。流动相收集在试管中的小分数作为它洗脱了列,从而使分离和纯化化合物。最后,用旋转蒸发仪产生孤立的 ④,去除了溶剂。

柱层析的多功能性和便利性使得净化化合物的使用最广泛的技术之一。与再结晶 (另一种常用净化技术) 不同化合物与柱层析纯化不必是固体。柱层析法也是有能力的一些孤立的化合物的混合物。柱色谱法的另一个优点是,很少需要有关化合物的物理属性被使用这种方法提纯,使这种技术合成或隔离新化合物,其中知之甚少 ④ 时非常有价值。

溶剂

一种化合物遍历列率是高度依赖于正在使用的流动相。通常情况下,更多极性化合物将通过列的溶剂得越快。极性溶剂有固相,限制 ④ 与固相,之间的相互作用使化合物洗脱更快更大的亲和力。必须小心以确保选择的柱色谱溶剂系统已创建分离混合物中化合物之间的适当极性。溶剂的选择是成功分离柱层析法的关键。要确定最佳的溶剂体系,应执行柱色谱试验之前进行一系列的薄层色谱法 (TLC) 实验。在某些情况下可能有必要使用二元溶剂体系。

选择一个溶剂系统

  1. 在薄层板上所需要的化合物为 0.2-0.3 之间确定产生阻滞因子 (Rf ) 溶剂体系。
  2. 用乙酸乙酯或二氯甲烷开始作为流动相薄层色谱法实验。
    1. 如果Rf大于 0.3,试着少极性的溶剂,如正己烷。如果Rf小于 0.2,可以尝试添加极少量的极性溶剂,如甲醇。
    2. 最佳的溶剂系统可能需要两种溶剂的混合物。
    3. 作为流动相硅胶柱会小心不使用超过 10%的甲醇。

Procedure

1.硅胶浆

  1. 硅凝胶倒入锥形瓶。包装材料的重量应该是大约 50 x 被分离的样品。如果被分离的化合物有很相似的Rf值,它可能需要使用更大数额的每个样品,在此示例中是二氧化硅。
    1. 白炭黑在锥形瓶,因为 50 毫克的样品 (45 毫克的芴酮和四苯基卟啉 5mg) 被隔离的地方 10 克。
  2. 添加溶剂体系 (正己烷/二氯甲烷,70%: 30%) 到锥形瓶含硅凝胶。添加足够的溶剂,以确保所有的硅胶是很好的溶剂。硅不会解散,但混合物将是明显的视觉时溶剂化。一旦已添加溶剂漩涡锥形瓶,以确保所有的白炭黑是很好的溶剂。

2.柱的制备

  1. 选择适当大小的列。通常列应填充硅胶浆的一半左右。被净化的较大样本、 较大所需的列。
  2. 插头用一块玻璃羊毛栏的底部。使用长杆,确保羊毛牢牢嵌入在上方旋塞阀栏的底部。
  3. 一旦羊毛坚定地到位,在玻璃羊毛适用一层薄薄的沙子。
    注:如果列配备玻璃熔块以上旋塞阀,应省略这一步。
  4. 夹紧中环站的垂直位置的列。
  5. 轻轻地用一个漏斗,倒入列对硅胶在准备好的浆料。您可能需要添加额外的溶剂要的料浆输送从锥形瓶到的列。使用吸管,洗下来任何列的双方坚持的硅胶。
    1. 随着硅凝胶沉淀在列中,轻轻地敲列的两侧以确保硅胶包紧紧,排除了任何的气泡。
  6. 打开旋塞阀和允许溶剂排入清洁的锥形瓶才匆匆硅胶和溶剂的前面见面。硅凝胶,绝不应干燥过程完成之前。
  7. 放一层薄薄的沙子硅胶 (图 1)。使用吸管,洗下来可能会有一些粘列的任何砂。
  8. 直到沙子是干的但不是到硅胶层流失任何额外的溶剂。

Figure 1
图 1。柱层析的适当设置实验前样品的加法。

3.向列添加示例

  1. 溶解样品溶剂可能 (使用相同的溶剂,被用来制造硅胶浆) 的最小金额。
  2. 轻轻地用移液管,将示例添加到列的顶部。
  3. 一旦样品已应用于列的顶部,打开旋塞阀和允许溶剂排出的砂层但不是硅胶层。使用非常少量的溶剂冲洗任何可能有紧紧抓住列的两侧的样品。排水砂层以及通过这额外的溶剂。

4.洗脱样品通过列

  1. 使用吸管,非常温柔地以不打扰的砂层的方式添加 4 — — 5 毫升的溶剂。
  2. 在列的顶部放置一个漏斗,慢慢地,轻轻地用溶剂填充列的其余部分。
  3. 打开旋塞阀和允许溶剂排出的列。
  4. 开始收集流动相,因为它从列流入试管。
    1. 试管应放在试管架以连续的方式。
  5. 列的顶部添加额外的溶剂,直到所有所需的化合物有从柱上洗脱。

5.回收成分

  1. 如果有色化合物,,我想他们可以直观地标识。然而,如果化合物都是无色的他们将不得不使用 ulta 可见 (UV) 光 (如果化合物含有共轭) 来标识或与适当的污点。可以用薄层色谱法验证化合物的纯度。
  2. 确定包含所需的 ④ 的试管。
  3. 合并所有包含所需的孤立的 ④ 进预先称量的圆底 (RB) 烧瓶的分数。为每个化合物做这。
  4. 通过将 RB 瓶放置在旋转蒸发器蒸发掉的溶剂。
  5. 一旦所有的溶剂已被删除,权衡与干燥后的产品 RB 和减去初始重量的 RB 来获得收益。

柱层析法是一种用于分离化合物在溶液中的多功能净化方法。混合溶液被通过溶剂通过一个包含吸附剂的固体,称为固定相的列。复合溶剂和样品的混合物称为流动相。

在流动相中分子穿越列在不同的利率,基于它们的化学特性和它们对固定相的亲和力。因此,每种化合物退出列在不同的时间。一旦被分离和纯化化合物他们可以进一步加工或准备分布。这个视频将介绍基本的柱层析,然后演示的有机物净化技术。

在柱层析、 分子可逆吸附到固定相在它们流经列,从而拖慢了他们的进步。交互与固定相的化合物能更快地退出列,或洗脱。的互动强烈与固定相的化合物都是慢洗脱。固定相是吸附剂粉或凝胶硅胶或氧化铝等。硅胶和氧化铝是强极性的所以他们强烈的互动与极性化合物和溶剂,和弱与非极性分子。固定相是加载到列作为浆与溶剂,然后包装的流动通过固定相溶剂。当妥善包装,固定相是从顶部到底部均匀和包含没有气泡或干燥的修补程序,因为这些违规行为所造成的非均匀流动会干扰化合物的分离。溶剂或淋洗液,通常是从水库提供一种有机溶剂。一般情况下,非极性溶剂只洗脱非极性化合物,而极性溶剂洗脱极性和非极性化合物。如果一种混合物含有显著不同极性化合物,一系列日益极性溶剂可用于洗脱所有感兴趣的化合物。流动相流速通常受控制旋塞阀在列的底部。流中的停顿是减至最低,避免扩散的化合物。流动相离开柱,洗脱,收集在分数保持分离的化合物。既然你了解柱层析的原理,通过纯化有机成分的混合物的过程吧。

若要开始执行的步骤,获取设备如所述的文本。权衡每种化合物被孤立和记录质量的圆底烧瓶。接下来,秤量该样本和溶解在溶剂所需的最低数量。应使用薄层色谱法预先确定适当的溶剂。Rf值应为 0.2-0.3 之间。然后,确定硅胶固定阶段基于干重的样品和基于薄层预筛选的感兴趣的化合物迁移距离的差异所需的量。锥形瓶中倒入适量的硅凝胶。溶剂添加硅胶,直到浆是半透明和自由移动,当烧瓶打旋。接下来,选择足够大硅胶将填补它一半的列。如果列没有玻璃熔块,放入列玻璃棉和坚定地按它的长杆底部。盖约 2 厘米的沙子来防止硅玻璃羊毛穿过玻璃羊毛。在通风橱里夹紧环的立场,允许足够的空间下面以适应测试管柱。

一个漏斗放入列和确保旋塞阀关闭。在浆料倒入列,轻轻地敲打面浆落定排除气泡。冲洗漏斗、 长颈瓶和墙壁的溶剂中,将所有的凝胶转移到列的列。

列下锥形瓶的地方。打开旋塞阀,并使溶剂排进瓶子里,直到溶剂量只是高于硅胶,然后关闭旋塞阀。倒入约 2 厘米厚的沙子上凝胶。轻轻地冲洗下来任何列的两侧与溶剂粘砂。流失的溶剂根据需要所以沙子大多是干的但硅仍然是完全覆盖。

若要开始分离,样品向列添加没有令人不安的沙子。冲洗下来秉承列墙任何样品,并冲洗掉样品容器使用溶剂的小的部分。仔细排水溶剂,直到水平是上方的二氧化硅。然后,使用吸管,轻轻地将添加 4 — — 5 毫升的溶剂而不会干扰的砂层。放入列一个漏斗,慢慢地装满溶剂。烧瓶中删除并替换标记的试管。第一次测试管到位,打开旋塞阀和收集洗脱液,直到测试管几乎已满。

继续收集馏分,直到被洗脱了所有所需的化合物,通过标记试管按顺序进行。完成后,关闭旋塞阀。

为每个化合物,结合预加权的圆底烧瓶中纯的分数。从对旋转蒸发瓶除去溶剂,然后权衡包含干式复合的圆底烧瓶。更多的信息,请参阅关于旋转蒸发的此集合的视频。

此示例包含四苯基卟啉,或 TPP 和芴酮的混合物。黑暗的红紫色 TPP 洗脱第一,其次是黄芴酮。核磁共振波谱法证实了每个孤立的化合物的纯度。

柱层析法用于纯化和分析在不同的科学领域。

高性能液相色谱法或高效液相色谱法,是一种提供优秀分离化合物之间的柱层析和可以纳入专门的探测器,如放射性标记分子的辐射探测器。使用高效液相色谱法,放射性标记的磷脂可轻松分离混合物的许多其他人即使它弥补了小 %的混合物。此信息可以帮助阐明生产,调节和许多重要的生物分子的功能。

柱层析法是柱色谱流动相流经列在空气或气体的压力下,而不是由重力流独自一个变种。

这将创建流动速度快、 尽量减少扩散的更好的分离。如图所示,用薄层色谱法,导致优秀后纯化收率和纯度,在少数几种纯净而集中馏分,收集所需要的化合物。

通常柱仪并不适用于分离小卷,但一些混合物并不兼容等高效液相色谱法的专门技术。小型净化玻璃移液管柱被用移液管灯泡,适用于小型闪存色谱。准备一个样本为专门的净化技术或大规模纯化后的最后一步时,这是特别有用。

你刚看了柱层析的朱庇特的简介。你现在应该熟悉的柱层析法、 硅胶柱层析、 程序和技术的一些应用原则。

谢谢观赏 !

Results

成功分离了含有四苯基卟啉 (TPP,5 毫克) 和芴酮 (45 毫克) 的混合物样品,每种化合物已被隔离。TPP 洗脱第一列作为一个暗紫色红乐队和芴酮洗脱列作为一个黄色的乐队图 2)。洗脱收集在试管中,由他们与众不同的色彩 (图 3)。包含分离得到的化合物的分数被合并到单独的 RBs 和溶剂中移除了使用旋转蒸发仪起高度纯净 TPP 和芴酮。Chromatographed 化合物的纯度由核磁共振 (NMR) 进行了验证。如果为所需的 ④ 熔点先前已经确定,另外可通过熔点,但只验证化合物。

Figure 2
图 2。由于化合物遍历固定相他们开始分离。在这个实验中 TPP (暗紫色红带) 穿过列略快于芴酮 (黄色带)。

Figure 3
图 3为化合物洗脱剂列被收集在试管里。在这个实验中分离的化合物被上色,所以他们可以直观地标识。

Applications and Summary

摘要

柱层析法是净化化合物的方便和灵活的方法。此方法分离基于极性的化合物。利用分子的极性的差异,柱层析法可以轻便分隔各个化合物化合物遍历列的固定相的速率。柱层析 (特别是当相比再结晶) 的好处之一是,很少需要净化过程之前已知的化合物。对柱层析法的另一个优势是,它可以用于净化固体和油,而再结晶不仅可以用于净化固体。这种技术也可以用于分离化合物从混合物的数目。

应用程序

柱层析法是净化化合物最方便和广泛使用的方法之一。通常情况下,合成反应会产生多个产品和柱层析法可用于隔离每个化合物作进一步检验。柱层析是极其宝贵的当合成或分离化合物,因为很少需要了解一种化合物及其 ' 之前的净化过程的物理性能。

制药业经常利用柱层析分离纯化化合物作为其早期阶段的药物开发过程的一部分。3通常情况下的在这些初步阶段研究人员将构建图书馆周围的铅化合物,化合物,然后随后用柱层析净化新合成的化合物。4的广泛使用和多功能性的此种净化技术促使教育工作者将技术纳入本科课程。5,6

References

  1. Mayo, D. W.; Pike, R. M.; Forbes, D. C., Microscale organic laboratory : with multistep and multiscale syntheses. 5th ed.; J. Wiley & Sons: Hoboken, NJ; p xxi, 681 p (2011).
  2. Armarego, W. L. F.; Chai, C. L. L., Purification of laboratory chemicals. 5th ed.; Butterworth-Heinemann: Amsterdam; Boston; p xv, 609 p (2003).
  3. Silverman, R. B.; Holladay, M. W., The organic chemistry of drug design and drug action. Third edition / ed.; Elsevier/AP, Academic Press, is an imprint of Elsevier: Amsterdam ; Boston; p xviii, 517 pages (2014).
  4. Mortensen, D. S.; Perrin-Ninkovic, S. M.; Shevlin, G.; Elsner, J.; Zhao, J.; Whitefield, B. et. al. Optimization of a Series of Triazole Containing Mammalian Target of Rapamycin (mTOR) Kinase Inhibitors and the Discovery of CC-115. Journal of Medicinal Chemistry (2015).
  5. Davies, D. R.; Johnson, T. M., Isolation of Three Components from Spearmint Oil: An Exercise in Column and Thin-Layer Chromatography. Journal of Chemical Education,84 (2), 318 (2007).
  6. Taber, D. F.; Hoerrner, R. S., Column chromatography: Isolation of caffeine. Journal of Chemical Education, 68 (1), 73 (1991).

1.硅胶浆

  1. 硅凝胶倒入锥形瓶。包装材料的重量应该是大约 50 x 被分离的样品。如果被分离的化合物有很相似的Rf值,它可能需要使用更大数额的每个样品,在此示例中是二氧化硅。
    1. 白炭黑在锥形瓶,因为 50 毫克的样品 (45 毫克的芴酮和四苯基卟啉 5mg) 被隔离的地方 10 克。
  2. 添加溶剂体系 (正己烷/二氯甲烷,70%: 30%) 到锥形瓶含硅凝胶。添加足够的溶剂,以确保所有的硅胶是很好的溶剂。硅不会解散,但混合物将是明显的视觉时溶剂化。一旦已添加溶剂漩涡锥形瓶,以确保所有的白炭黑是很好的溶剂。

2.柱的制备

  1. 选择适当大小的列。通常列应填充硅胶浆的一半左右。被净化的较大样本、 较大所需的列。
  2. 插头用一块玻璃羊毛栏的底部。使用长杆,确保羊毛牢牢嵌入在上方旋塞阀栏的底部。
  3. 一旦羊毛坚定地到位,在玻璃羊毛适用一层薄薄的沙子。
    注:如果列配备玻璃熔块以上旋塞阀,应省略这一步。
  4. 夹紧中环站的垂直位置的列。
  5. 轻轻地用一个漏斗,倒入列对硅胶在准备好的浆料。您可能需要添加额外的溶剂要的料浆输送从锥形瓶到的列。使用吸管,洗下来任何列的双方坚持的硅胶。
    1. 随着硅凝胶沉淀在列中,轻轻地敲列的两侧以确保硅胶包紧紧,排除了任何的气泡。
  6. 打开旋塞阀和允许溶剂排入清洁的锥形瓶才匆匆硅胶和溶剂的前面见面。硅凝胶,绝不应干燥过程完成之前。
  7. 放一层薄薄的沙子硅胶 (图 1)。使用吸管,洗下来可能会有一些粘列的任何砂。
  8. 直到沙子是干的但不是到硅胶层流失任何额外的溶剂。

Figure 1
图 1。柱层析的适当设置实验前样品的加法。

3.向列添加示例

  1. 溶解样品溶剂可能 (使用相同的溶剂,被用来制造硅胶浆) 的最小金额。
  2. 轻轻地用移液管,将示例添加到列的顶部。
  3. 一旦样品已应用于列的顶部,打开旋塞阀和允许溶剂排出的砂层但不是硅胶层。使用非常少量的溶剂冲洗任何可能有紧紧抓住列的两侧的样品。排水砂层以及通过这额外的溶剂。

4.洗脱样品通过列

  1. 使用吸管,非常温柔地以不打扰的砂层的方式添加 4 — — 5 毫升的溶剂。
  2. 在列的顶部放置一个漏斗,慢慢地,轻轻地用溶剂填充列的其余部分。
  3. 打开旋塞阀和允许溶剂排出的列。
  4. 开始收集流动相,因为它从列流入试管。
    1. 试管应放在试管架以连续的方式。
  5. 列的顶部添加额外的溶剂,直到所有所需的化合物有从柱上洗脱。

5.回收成分

  1. 如果有色化合物,,我想他们可以直观地标识。然而,如果化合物都是无色的他们将不得不使用 ulta 可见 (UV) 光 (如果化合物含有共轭) 来标识或与适当的污点。可以用薄层色谱法验证化合物的纯度。
  2. 确定包含所需的 ④ 的试管。
  3. 合并所有包含所需的孤立的 ④ 进预先称量的圆底 (RB) 烧瓶的分数。为每个化合物做这。
  4. 通过将 RB 瓶放置在旋转蒸发器蒸发掉的溶剂。
  5. 一旦所有的溶剂已被删除,权衡与干燥后的产品 RB 和减去初始重量的 RB 来获得收益。

柱层析法是一种用于分离化合物在溶液中的多功能净化方法。混合溶液被通过溶剂通过一个包含吸附剂的固体,称为固定相的列。复合溶剂和样品的混合物称为流动相。

在流动相中分子穿越列在不同的利率,基于它们的化学特性和它们对固定相的亲和力。因此,每种化合物退出列在不同的时间。一旦被分离和纯化化合物他们可以进一步加工或准备分布。这个视频将介绍基本的柱层析,然后演示的有机物净化技术。

在柱层析、 分子可逆吸附到固定相在它们流经列,从而拖慢了他们的进步。交互与固定相的化合物能更快地退出列,或洗脱。的互动强烈与固定相的化合物都是慢洗脱。固定相是吸附剂粉或凝胶硅胶或氧化铝等。硅胶和氧化铝是强极性的所以他们强烈的互动与极性化合物和溶剂,和弱与非极性分子。固定相是加载到列作为浆与溶剂,然后包装的流动通过固定相溶剂。当妥善包装,固定相是从顶部到底部均匀和包含没有气泡或干燥的修补程序,因为这些违规行为所造成的非均匀流动会干扰化合物的分离。溶剂或淋洗液,通常是从水库提供一种有机溶剂。一般情况下,非极性溶剂只洗脱非极性化合物,而极性溶剂洗脱极性和非极性化合物。如果一种混合物含有显著不同极性化合物,一系列日益极性溶剂可用于洗脱所有感兴趣的化合物。流动相流速通常受控制旋塞阀在列的底部。流中的停顿是减至最低,避免扩散的化合物。流动相离开柱,洗脱,收集在分数保持分离的化合物。既然你了解柱层析的原理,通过纯化有机成分的混合物的过程吧。

若要开始执行的步骤,获取设备如所述的文本。权衡每种化合物被孤立和记录质量的圆底烧瓶。接下来,秤量该样本和溶解在溶剂所需的最低数量。应使用薄层色谱法预先确定适当的溶剂。Rf值应为 0.2-0.3 之间。然后,确定硅胶固定阶段基于干重的样品和基于薄层预筛选的感兴趣的化合物迁移距离的差异所需的量。锥形瓶中倒入适量的硅凝胶。溶剂添加硅胶,直到浆是半透明和自由移动,当烧瓶打旋。接下来,选择足够大硅胶将填补它一半的列。如果列没有玻璃熔块,放入列玻璃棉和坚定地按它的长杆底部。盖约 2 厘米的沙子来防止硅玻璃羊毛穿过玻璃羊毛。在通风橱里夹紧环的立场,允许足够的空间下面以适应测试管柱。

一个漏斗放入列和确保旋塞阀关闭。在浆料倒入列,轻轻地敲打面浆落定排除气泡。冲洗漏斗、 长颈瓶和墙壁的溶剂中,将所有的凝胶转移到列的列。

列下锥形瓶的地方。打开旋塞阀,并使溶剂排进瓶子里,直到溶剂量只是高于硅胶,然后关闭旋塞阀。倒入约 2 厘米厚的沙子上凝胶。轻轻地冲洗下来任何列的两侧与溶剂粘砂。流失的溶剂根据需要所以沙子大多是干的但硅仍然是完全覆盖。

若要开始分离,样品向列添加没有令人不安的沙子。冲洗下来秉承列墙任何样品,并冲洗掉样品容器使用溶剂的小的部分。仔细排水溶剂,直到水平是上方的二氧化硅。然后,使用吸管,轻轻地将添加 4 — — 5 毫升的溶剂而不会干扰的砂层。放入列一个漏斗,慢慢地装满溶剂。烧瓶中删除并替换标记的试管。第一次测试管到位,打开旋塞阀和收集洗脱液,直到测试管几乎已满。

继续收集馏分,直到被洗脱了所有所需的化合物,通过标记试管按顺序进行。完成后,关闭旋塞阀。

为每个化合物,结合预加权的圆底烧瓶中纯的分数。从对旋转蒸发瓶除去溶剂,然后权衡包含干式复合的圆底烧瓶。更多的信息,请参阅关于旋转蒸发的此集合的视频。

此示例包含四苯基卟啉,或 TPP 和芴酮的混合物。黑暗的红紫色 TPP 洗脱第一,其次是黄芴酮。核磁共振波谱法证实了每个孤立的化合物的纯度。

柱层析法用于纯化和分析在不同的科学领域。

高性能液相色谱法或高效液相色谱法,是一种提供优秀分离化合物之间的柱层析和可以纳入专门的探测器,如放射性标记分子的辐射探测器。使用高效液相色谱法,放射性标记的磷脂可轻松分离混合物的许多其他人即使它弥补了小 %的混合物。此信息可以帮助阐明生产,调节和许多重要的生物分子的功能。

柱层析法是柱色谱流动相流经列在空气或气体的压力下,而不是由重力流独自一个变种。

这将创建流动速度快、 尽量减少扩散的更好的分离。如图所示,用薄层色谱法,导致优秀后纯化收率和纯度,在少数几种纯净而集中馏分,收集所需要的化合物。

通常柱仪并不适用于分离小卷,但一些混合物并不兼容等高效液相色谱法的专门技术。小型净化玻璃移液管柱被用移液管灯泡,适用于小型闪存色谱。准备一个样本为专门的净化技术或大规模纯化后的最后一步时,这是特别有用。

你刚看了柱层析的朱庇特的简介。你现在应该熟悉的柱层析法、 硅胶柱层析、 程序和技术的一些应用原则。

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