Chromatographie sur colonne

Organic Chemistry

Your institution must subscribe to JoVE's Chemistry collection to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 1 hour trial to JoVE!





By clicking "Submit", you agree to our policies.

 

Overview

Source : Laboratoire du Dr Jimmy Franco - Merrimack College

Chromatographie sur colonne est l’une des techniques plus utiles pour la purification de composés. Cette technique utilise une phase stationnaire, ce qui est emballée dans une colonne, et une phase mobile qui traverse la colonne. Cette technique exploite la différence de polarité entre composés, ce qui permet des molécules à séparer simpliste. 1 les deux phases stationnaires plus courantes pour chromatographie sur colonne sont le gel de silice (SiO2) et alumine (Al2O3), avec le plus couramment utilisé des phases mobiles en solvants organiques. 2 le point choisi pour la phase mobile dépendent de la polarité des molécules étant purifié. Les composés polaires plus exigent généralement des solvants polaires plus afin de faciliter le passage des molécules à travers la phase stationnaire. Une fois achevé le processus de purification le solvant peut être retiré des fractions collectées à l’aide d’un évaporateur rotatif à céder le matériel isolé.

Cite this Video

JoVE Science Education Database. L'essentiel de la chimie organique. Chromatographie sur colonne. JoVE, Cambridge, MA, (2017).

Principles

Le mélange de l’échantillon est placé sur le dessus de la colonne et absorbé sur la partie supérieure de la phase stationnaire. Par la suite, la phase mobile est appliquée à la colonne et utilisée pour éluer le mélange à travers la phase stationnaire. Chromatographie sur colonne exploite la polarité d’une molécule pour séparer les composés. La différence de polarité mène aux variations du taux auquel les molécules traversent la colonne qui sépare efficacement les composés entre eux. La phase mobile est recueillie en petites fractions dans des éprouvettes comme il élué au large de la colonne, permettant ainsi l’isolement et la purification des composés. Enfin, le solvant est supprimé à l’aide d’un évaporateur rotatif pour donner les composés isolés.

Polyvalence et la commodité de la chromatographie sur colonne a fait une des techniques plus couramment utilisés pour la purification de composés. Contrairement à la recristallisation (autre couramment utilisé la technique de purification) composés purifiés par chromatographie sur colonne n’ont pas à être solide. Chromatographie sur colonne est également capable d’isoler un certain nombre de composés d’un mélange. Un autre avantage du chromatographe de colonne est que très peu de choses doit être connu sur les propriétés physiques du composé afin d’utiliser cette méthode de purification, ce qui rend cette technique très utile lorsque la synthèse ou d’isoler de nouveaux composés, dont on connaît mal les composés.

Solvant

Le taux auquel un composé parcourt la colonne dépend fortement de la phase mobile utilisée. En règle générale, la plus polaire le solvant le plus rapidement les composés passeront au travers de la colonne. Les solvants polaires ont une plus grande affinité pour la phase solide, en limitant les interactions entre les composés et la phase solide, permettant les composés éluer plus rapidement. Attention il faut s’assurer que le système de solvant choisi pour la chromatographie sur colonne a la polarité appropriée pour créer la séparation entre les composés dans le mélange. Le choix du solvant est crucial à une séparation réussie à l’aide de la chromatographie sur colonne. Pour identifier un système optimal de solvant, une série d’expériences de chromatographie (TLC) de couche mince se fasse avant d’effectuer l’expérience de chromatographie sur colonne. Dans certains cas, il peut être nécessaire d’utiliser un système de solvants binaire.

Sélection d’un système de solvants

  1. Identifier un système de solvants qui produit un facteur de retard (Rf ) entre 0,2 et 0,3 pour le composé désiré sur une plaque de TLC.
  2. Commence par l’acétate d’éthyle ou dichlorométhane comme phase mobile pour l’expérience de TLC.
    1. Si la Rf est supérieure à 0,3, essayez moins solvant polaire, comme l’hexane. Si la Rf est inférieure à 0,2, essayez d’ajouter une petite quantité d’un solvant polaire comme le méthanol.
    2. Le système de solvant optimal peut exiger un mélange des deux solvants.
    3. Être prudent méthanol de ne pas utiliser plus de 10 % comme phase mobile pour une colonne de silice.

Procedure

1. le Gel de silice lisier

  1. Verser le gel de silice dans un erlenmeyer. Le poids de l’emballage doit être à peu près 50 fois celui de l’échantillon étant séparé. Si les composés séparés ont des valeurs de Rf très semblables, il peut exiger à l’aide d’une grande quantité de silice par échantillon, c’est le cas dans cet exemple.
    1. Placer 10 g de silice dans l’erlenmeyer, étant donné que 50 mg d’échantillon (45 mg de fluorénone et 5 mg de tétraphénylporphyrine) sont être isolé.
  2. Ajouter le système de solvant (hexane/dichlorométhane, 70 % : 30 %) dans l’erlenmeyer contenant le gel de silice. Ajouter suffisamment de solvant pour s’assurer que le gel de silice est bien solvaté. La silice se dissout pas, mais le mélange sera visuellement perceptible quand solvatés. Après avoir ajouté le solvant agiter l’erlenmeyer pour s’assurer que toute la silice est bien solvatés.

2. préparation de la colonne

  1. Sélectionnez la colonne de taille appropriée. Généralement, la colonne doit être remplie à mi-chemin avec du lisier de gel de silice. Plus l’échantillon étant purifiée, plus la colonne requis.
  2. Branchez le bas de la colonne avec un morceau de laine de verre. En utilisant une longue tige, assurez-vous que la laine soit solidement logée dans le bas de la colonne, juste au-dessus du robinet d’arrêt.
  3. Une fois que la laine est fermement en place, appliquer une mince couche de sable sur la laine de verre.
    Remarque : Si la colonne est équipée de fritte de verre au-dessus du robinet d’arrêt, cette étape devrait être supprimée.
  4. Fixer la colonne en position verticale à une position de l’anneau.
  5. À l’aide d’un entonnoir, verser doucement le coulis préparé de gel de silice dans la colonne. Vous devrez peut-être ajouter le solvant supplémentaire pour transférer la boue de l’erlenmeyer à la colonne. À l’aide d’une pipette, rincer tout gel de silice qui se colle aux parois de la colonne.
    1. Comme le gel de silice s’installe dans la colonne, tapoter délicatement les côtés de la colonne pour que le gel de silice emballe hermétiquement et exclut les bulles d’air.
  6. Ouvrir le robinet et laisser solvant s’écouler dans un erlenmeyer jusqu'à juste avant le gel de silice et le solvant avant de répondre. Le gel de silice ne devrait jamais aller sec jusqu'à ce que la procédure est terminée.
  7. Étalez une fine couche de sable sur le dessus du gel de silice (Figure 1). À l’aide d’une pipette, rincer tout sable qui peut avoir coincé aux côtés de la colonne.
  8. Drain de solvants supplémentaires jusqu'à ce que le sable est sec, mais pas jusqu'à la couche de gel de silice.

Figure 1
La figure 1. Le programme d’installation approprié pour une chromatographie sur colonne expérimenter avant l’addition de l’échantillon.

3. ajouter l’échantillon à la colonne

  1. Dissoudre l’échantillon dans la plus petite quantité de solvant possible (en utilisant le même solvant qui servait à fabriquer le lisier de gel de silice).
  2. À l’aide d’une pipette, ajouter doucement l’échantillon vers le haut de la colonne.
  3. Une fois que l’échantillon a été appliqué à la partie supérieure de la colonne, ouvrir le robinet et laisser le solvant s’écouler à travers la couche de sable mais pas la couche de gel de silice. Une très petite quantité de solvant permet d’arroser tout échantillon qui peut-être se sont accrochés aux parois de la colonne. Drainer ce solvant supplémentaire par le biais de la couche de sable aussi bien.

4. à élution de l’échantillon dans la colonne

  1. À l’aide d’une pipette, ajouter très doucement de 4 à 5 mL de solvant d’une façon qui ne perturbe pas la couche de sable.
  2. Placez un entonnoir au sommet de la colonne et très lentement et doucement remplir le reste de la colonne avec le solvant.
  3. Ouvrir le robinet et laisser le solvant s’écouler à travers la colonne.
  4. Commencer à percevoir la phase mobile, tel qu’il s’écoule de la colonne dans des éprouvettes.
    1. Tubes de test devraient être placés dans un tube à essai rack de manière séquentielle.
  5. Ajouter solvant supplémentaire vers le haut de la colonne si nécessaire jusqu'à ce que tous les composés désirés ont élué de la colonne.

5. récupérer les constituants

  1. Si les composés sont colorés, puis ils sont visuellement reconnaissables. Toutefois, si les composés sont incolores, ils devront être identifiés à l’aide d’ulta-visible (UV) ultra-violette (si les composés contiennent la conjugaison) ou avec la tache appropriée. La pureté des composés peut être vérifiée à l’aide de la chromatographie sur couche mince.
  2. Identifier les tubes qui contiennent les composés désirés.
  3. Fusionner toutes les fractions qui contiennent les composés isolés désiré dans un ballon (RB) préalablement pesé. Procéder ainsi pour chaque composé étant isolé.
  4. Laisser évaporer le solvant en plaçant le ballon RB sur l’évaporateur rotatif.
  5. Une fois la totalité du solvant a été supprimé, peser le RB avec produit séché et soustraire le poids initial de la RB pour obtenir un rendement.

Chromatographie sur colonne est une méthode de purification polyvalent utilisée pour séparer les composés présents dans une solution. Un mélange de solution est porté par un solvant à travers une colonne contenant un adsorbant solide, appelé la phase stationnaire. Le mélange de solvant et l’échantillon est appelé la phase mobile.

Molécules dans la phase mobile voyagent à travers la colonne à des vitesses différentes, basé sur leurs propriétés chimiques et leur affinité pour la phase stationnaire. Ainsi, chaque composé quitte la colonne à un autre moment. Une fois que les composés ont été séparées et purifiées, elles peuvent être traitées ultérieurement ou sont prêts à être distribué. Cette vidéo va mettre en place les bases de la chromatographie sur colonne, puis démontrer la technique avec la purification de composés organiques.

En chromatographie sur colonne, molécules s’adsorbent réversible à la phase stationnaire comme ils traversent la colonne, ce qui ralentit leur progression. Les composés interagissant faiblement avec la phase stationnaire sont plus rapides à la sortie de la colonne, ou éluer. Composés qui interagissent fortement avec la phase stationnaire sont plus lents à éluer. La phase stationnaire est un adsorbant poudre ou gel tels que le gel de silice ou alumine. Gel de silice et d’alumine sont très polaires afin qu’ils interagissent fortement avec des solvants et de composés polaires et faiblement molécules non polaires. La phase stationnaire est chargée dans la colonne comme une bouillie avec le solvant et est ensuite emballée par coulant solvant à travers la phase stationnaire. Lorsqu’elles sont correctement emballées, la phase stationnaire est homogène de haut en bas et contient aucune bulle d’air ou des plaques sèches, comme inégale flux causée par ces irrégularités interfère avec la séparation des composés. Le solvant, ou comme éluant, est typiquement un solvant organique provenant d’un réservoir. En général, les solvants non polaires éluer seulement composés non polaires, considérant que les solvants polaires éluer les composés polaires et non polaires. Si un mélange contient des composés de polarité différente, une série de solvants de plus en plus polaires peut servir à éluer tous les composés d’intérêt. Le débit de la phase mobile est généralement contrôlé par un robinet en bas de la colonne. Pauses du débit sont gardés à un minimum afin d’éviter la diffusion des composés. La phase mobile quittant la colonne, appelée l’éluat, est recueillie dans les fractions de préserver la séparation des composés. Maintenant que vous comprenez les principes de la chromatographie sur colonne, Let ' s go grâce à une procédure pour la purification d’un mélange de composés organiques.

Pour commencer la procédure, obtenir l’équipement tel que mentionné dans le texte. Peser un ballon à fond rond pour chacun des composés isolés et enregistrer la masse. Ensuite, peser l’échantillon et le dissoudre dans le volume minimal de solvant nécessaire. Le solvant approprié devrait être prédéterminé à l’aide de la chromatographie sur couche mince. La valeur de Rf doit être entre 0,2 et 0,3. Ensuite, déterminer la quantité de gel de silice requis pour la phase stationnaire, basée sur le poids sec de l’échantillon et la différence de distance de migration des composés d’intérêt basé sur la présélection de TLC. Versez la quantité appropriée de gel de silice dans un erlenmeyer. Ajouter le solvant pour le gel de silice, jusqu'à ce que la boue est translucide et se déplace librement quand le ballon est tourbillonnait. Ensuite, sélectionnez une colonne assez grande pour que le gel de silice il comblera à mi-chemin. Si la colonne ne possède pas de fritte de verre, placer la laine de verre dans la colonne et pressez-le fermement vers le bas avec une longue tige. Couvrir la laine de verre avec environ 2 cm de sable pour empêcher l’en passant par la laine de verre de silice. Sous une hotte fixer la colonne à un support de bague, permettant un espace suffisant ci-dessous pour accueillir les tubes à essai.

Placez un entonnoir dans la colonne, puis assurez-vous que le robinet est fermé. Verser la pâte dans la colonne, tapotant doucement les parties que la boue s’installe pour exclure les bulles d’air. Rincer l’entonnoir, fiole et parois de la colonne avec le solvant de transférer la totalité du gel dans la colonne.

Placez un erlenmeyer sous la colonne. Ouvrir le robinet et laisser le solvant s’écouler dans le ballon jusqu'à ce que le niveau de solvant est juste au dessus du gel de silice et puis fermez le robinet d’arrêt. Versez environ 2 cm de sable sur le gel. Rincer doucement vers le bas de n’importe quel sable collé sur les côtés de la colonne avec le solvant. Égoutter le solvant au besoin si le sable est le plus souvent sec, mais la silice reste entièrement recouvert.

Pour démarrer la séparation, ajouter l’échantillon à la colonne sans déranger le sable. Utiliser des petites portions de solvant pour rincer à n’importe quel échantillon adhèrent aux parois colonne et pour rincer le récipient à échantillon. Soutirer avec précaution le solvant jusqu'à ce que le niveau est juste au-dessus de la silice. Puis, avec une pipette, ajouter doucement 4 – 5 mL de solvant sans déranger la couche de sable. Placez un entonnoir dans la colonne et remplir lentement avec le solvant. Enlever le ballon et le remplacer par un tube à essai marqué. Avec le premier tube à essai en place, ouvrir le robinet et recueillir l’éluat jusqu'à ce que le tube est presque plein.

Poursuivre la collecte de fractions jusqu'à ce que tous les composés désirés ont été éluées, procéder dans l’ordre à travers les tubes à essai marqués. Lorsque vous avez terminé, fermez le robinet d’arrêt.

Pour chacun des composés isolés, combiner les fractions pures dans un ballon à fond rond préalablement pesé. Éliminer le solvant de la fiole sur un évaporateur rotatif et peser le ballon à fond rond contenant le composé sec. Pour plus d’informations, voir la vidéo de cette collection sur l’évaporateur rotatif.

Cet exemple contenue un mélange de tétraphénylporphyrine, ou PPT et fluorénone. Le PPT de pourpre rougeâtre foncé est élué tout d’abord, suivie de la fluorénone jaune. La pureté de chaque composé isolé a été confirmée par spectroscopie RMN.

Chromatographie sur colonne est utilisé dans la purification et l’analyse dans une variété de domaines scientifiques.

Chromatographie liquide haute performance ou HPLC, est une forme de chromatographie sur colonne qui fournit l’excellente séparation entre les composés et peut intégrer des détecteurs spécialisés comme un détecteur de rayonnement pour les molécules radiomarquées. Par CLHP, un phospholipide radioactif peut facilement être isolé à partir d’un mélange de beaucoup d’autres même si elle représente un faible pourcentage du mélange. Cette information peut aider à élucider la production, réglementation et aux fonctions de nombreuses biomolécules importantes.

Chromatographie flash est une variante de la chromatographie sur colonne, dans laquelle la phase mobile se déplace à travers la colonne sous la pression d’air ou de gaz, plutôt que par le seul écoulement par gravité.

Cela crée un débit plus rapide, réduisant au minimum de diffusion pour une meilleure séparation. Le composé désiré est recueilli en quelques fractions de pures et concentrées, comme indiqué par chromatographie sur couche mince, résultant dans la pureté et l’excellent rendement après la purification.

L’appareil habituel de colonne n’est pas approprié pour séparer les petits volumes, mais certains mélanges ne sont pas compatibles avec des techniques spécialisées telles que l’HPLC. Purification à petite échelle est effectuée avec des colonnes de pipette de verre, avec une ampoule de pipette utilisée pour chromatographie flash à petite échelle. Ceci est particulièrement utile lors de la préparation d’un échantillon de techniques de purification spécialisés ou comme une étape finale après purification à grande échelle.

Vous avez juste regardé introduction de Jupiter à la chromatographie sur colonne. Vous devez maintenant être familiarisé avec les principes de la chromatographie sur colonne, une procédure pour chromatographie sur colonne de gel de silice et certaines applications de la technique.

Merci de regarder !

Results

L’échantillon contenant un mélange de tétraphénylporphyrine (PPT, 5 mg) et de la fluorénone (45 mg) ont été séparé avec succès et chaque composé a été isolé. Le PPT élué tout d’abord la colonne comme une bande de pourpre-rougeâtre foncée et la fluorénone élué par la suite la colonne comme une bande jaune ()Figure 2). Les fractions éluées ont été recueillies dans des éprouvettes et identifiées par leurs couleurs distinctives (Figure 3). Les fractions contenant les composés isolés ont été fusionnées dans RBs distincts et le solvant a été supprimé à l’aide d’un évaporateur rotatif PPT extrêmement pur et fluorénone. La pureté des composés chromatographiés a été validée par la spectroscopie de résonance magnétique nucléaire (RMN). Composés peuvent en outre être vérifiées par point de fusion, mais seulement si le point de fusion pour le composé désiré a été défini précédemment.

Figure 2
Figure 2. Comme les composés traversent la phase stationnaire, qu'ils commencent à se séparer. Dans cette expérience le PPT (bande rougeâtre-pourpre sombre) traverse la colonne un peu plus vite que la fluorénone (bande jaune).

Figure 3
La figure 3. Comme les composés éluer au large de la colonne, ils sont recueillis dans des éprouvettes. Les composés étant séparées dans cette expérience sont colorés, donc ils peuvent être identifiés visuellement.

Applications and Summary

Résumé

Chromatographie sur colonne est une méthode pratique et polyvalente pour la purification de composés. Cette méthode sépare composés basés sur la polarité. En exploitant les différences dans la polarité des molécules, chromatographie sur colonne peut séparer simpliste de composés par la vitesse à laquelle les composés traversent la phase stationnaire de la colonne. Un des avantages de la chromatographie sur colonne (surtout comparé à la recristallisation) est que très peu sur les composés doivent être connus avant le processus de purification. L’autre avantage de la chromatographie sur colonne, c’est qu’il peut être utilisé pour purifier les solides et les huiles, tandis que la recristallisation ne peut servir à purifier les solides. Cette technique permet également d’isoler un certain nombre de composés d’un mélange.

Applications

Chromatographie sur colonne est une des méthodes plus pratiques et largement utilisés pour la purification de composés. Souvent, les réactions synthétiques produira plusieurs produits et par chromatographie sur colonne peut être utilisé pour isoler chacun des composés pour un examen plus approfondi. Chromatographie sur colonne est extrêmement précieuse lors de synthèse ou d’isoler de nouveaux composés, comme très peu de choses doit être connu sur un composé et ses "propriétés physiques avant le processus de purification.

L’industrie pharmaceutique utilise régulièrement la chromatographie sur colonne pour purifier les composés dans le cadre de son processus de développement de drogue stade précoce. 3 souvent dans ces chercheurs d’étapes préliminaires va construire des bibliothèques de composés autour d’un composé de plomb, puis ensuite utiliser par chromatographie sur colonne pour purifier les composés nouvellement synthétisées. 4 l’utilisation extensive et la polyvalence de cette technique de purification a incité les enseignants à intégrer la technique dans les programmes de premier cycle. 5, 6

References

  1. Mayo, D. W.; Pike, R. M.; Forbes, D. C., Microscale organic laboratory : with multistep and multiscale syntheses. 5th ed.; J. Wiley & Sons: Hoboken, NJ; p xxi, 681 p (2011).
  2. Armarego, W. L. F.; Chai, C. L. L., Purification of laboratory chemicals. 5th ed.; Butterworth-Heinemann: Amsterdam; Boston; p xv, 609 p (2003).
  3. Silverman, R. B.; Holladay, M. W., The organic chemistry of drug design and drug action. Third edition / ed.; Elsevier/AP, Academic Press, is an imprint of Elsevier: Amsterdam ; Boston; p xviii, 517 pages (2014).
  4. Mortensen, D. S.; Perrin-Ninkovic, S. M.; Shevlin, G.; Elsner, J.; Zhao, J.; Whitefield, B. et. al. Optimization of a Series of Triazole Containing Mammalian Target of Rapamycin (mTOR) Kinase Inhibitors and the Discovery of CC-115. Journal of Medicinal Chemistry (2015).
  5. Davies, D. R.; Johnson, T. M., Isolation of Three Components from Spearmint Oil: An Exercise in Column and Thin-Layer Chromatography. Journal of Chemical Education,84 (2), 318 (2007).
  6. Taber, D. F.; Hoerrner, R. S., Column chromatography: Isolation of caffeine. Journal of Chemical Education, 68 (1), 73 (1991).

1. le Gel de silice lisier

  1. Verser le gel de silice dans un erlenmeyer. Le poids de l’emballage doit être à peu près 50 fois celui de l’échantillon étant séparé. Si les composés séparés ont des valeurs de Rf très semblables, il peut exiger à l’aide d’une grande quantité de silice par échantillon, c’est le cas dans cet exemple.
    1. Placer 10 g de silice dans l’erlenmeyer, étant donné que 50 mg d’échantillon (45 mg de fluorénone et 5 mg de tétraphénylporphyrine) sont être isolé.
  2. Ajouter le système de solvant (hexane/dichlorométhane, 70 % : 30 %) dans l’erlenmeyer contenant le gel de silice. Ajouter suffisamment de solvant pour s’assurer que le gel de silice est bien solvaté. La silice se dissout pas, mais le mélange sera visuellement perceptible quand solvatés. Après avoir ajouté le solvant agiter l’erlenmeyer pour s’assurer que toute la silice est bien solvatés.

2. préparation de la colonne

  1. Sélectionnez la colonne de taille appropriée. Généralement, la colonne doit être remplie à mi-chemin avec du lisier de gel de silice. Plus l’échantillon étant purifiée, plus la colonne requis.
  2. Branchez le bas de la colonne avec un morceau de laine de verre. En utilisant une longue tige, assurez-vous que la laine soit solidement logée dans le bas de la colonne, juste au-dessus du robinet d’arrêt.
  3. Une fois que la laine est fermement en place, appliquer une mince couche de sable sur la laine de verre.
    Remarque : Si la colonne est équipée de fritte de verre au-dessus du robinet d’arrêt, cette étape devrait être supprimée.
  4. Fixer la colonne en position verticale à une position de l’anneau.
  5. À l’aide d’un entonnoir, verser doucement le coulis préparé de gel de silice dans la colonne. Vous devrez peut-être ajouter le solvant supplémentaire pour transférer la boue de l’erlenmeyer à la colonne. À l’aide d’une pipette, rincer tout gel de silice qui se colle aux parois de la colonne.
    1. Comme le gel de silice s’installe dans la colonne, tapoter délicatement les côtés de la colonne pour que le gel de silice emballe hermétiquement et exclut les bulles d’air.
  6. Ouvrir le robinet et laisser solvant s’écouler dans un erlenmeyer jusqu'à juste avant le gel de silice et le solvant avant de répondre. Le gel de silice ne devrait jamais aller sec jusqu'à ce que la procédure est terminée.
  7. Étalez une fine couche de sable sur le dessus du gel de silice (Figure 1). À l’aide d’une pipette, rincer tout sable qui peut avoir coincé aux côtés de la colonne.
  8. Drain de solvants supplémentaires jusqu'à ce que le sable est sec, mais pas jusqu'à la couche de gel de silice.

Figure 1
La figure 1. Le programme d’installation approprié pour une chromatographie sur colonne expérimenter avant l’addition de l’échantillon.

3. ajouter l’échantillon à la colonne

  1. Dissoudre l’échantillon dans la plus petite quantité de solvant possible (en utilisant le même solvant qui servait à fabriquer le lisier de gel de silice).
  2. À l’aide d’une pipette, ajouter doucement l’échantillon vers le haut de la colonne.
  3. Une fois que l’échantillon a été appliqué à la partie supérieure de la colonne, ouvrir le robinet et laisser le solvant s’écouler à travers la couche de sable mais pas la couche de gel de silice. Une très petite quantité de solvant permet d’arroser tout échantillon qui peut-être se sont accrochés aux parois de la colonne. Drainer ce solvant supplémentaire par le biais de la couche de sable aussi bien.

4. à élution de l’échantillon dans la colonne

  1. À l’aide d’une pipette, ajouter très doucement de 4 à 5 mL de solvant d’une façon qui ne perturbe pas la couche de sable.
  2. Placez un entonnoir au sommet de la colonne et très lentement et doucement remplir le reste de la colonne avec le solvant.
  3. Ouvrir le robinet et laisser le solvant s’écouler à travers la colonne.
  4. Commencer à percevoir la phase mobile, tel qu’il s’écoule de la colonne dans des éprouvettes.
    1. Tubes de test devraient être placés dans un tube à essai rack de manière séquentielle.
  5. Ajouter solvant supplémentaire vers le haut de la colonne si nécessaire jusqu'à ce que tous les composés désirés ont élué de la colonne.

5. récupérer les constituants

  1. Si les composés sont colorés, puis ils sont visuellement reconnaissables. Toutefois, si les composés sont incolores, ils devront être identifiés à l’aide d’ulta-visible (UV) ultra-violette (si les composés contiennent la conjugaison) ou avec la tache appropriée. La pureté des composés peut être vérifiée à l’aide de la chromatographie sur couche mince.
  2. Identifier les tubes qui contiennent les composés désirés.
  3. Fusionner toutes les fractions qui contiennent les composés isolés désiré dans un ballon (RB) préalablement pesé. Procéder ainsi pour chaque composé étant isolé.
  4. Laisser évaporer le solvant en plaçant le ballon RB sur l’évaporateur rotatif.
  5. Une fois la totalité du solvant a été supprimé, peser le RB avec produit séché et soustraire le poids initial de la RB pour obtenir un rendement.

Chromatographie sur colonne est une méthode de purification polyvalent utilisée pour séparer les composés présents dans une solution. Un mélange de solution est porté par un solvant à travers une colonne contenant un adsorbant solide, appelé la phase stationnaire. Le mélange de solvant et l’échantillon est appelé la phase mobile.

Molécules dans la phase mobile voyagent à travers la colonne à des vitesses différentes, basé sur leurs propriétés chimiques et leur affinité pour la phase stationnaire. Ainsi, chaque composé quitte la colonne à un autre moment. Une fois que les composés ont été séparées et purifiées, elles peuvent être traitées ultérieurement ou sont prêts à être distribué. Cette vidéo va mettre en place les bases de la chromatographie sur colonne, puis démontrer la technique avec la purification de composés organiques.

En chromatographie sur colonne, molécules s’adsorbent réversible à la phase stationnaire comme ils traversent la colonne, ce qui ralentit leur progression. Les composés interagissant faiblement avec la phase stationnaire sont plus rapides à la sortie de la colonne, ou éluer. Composés qui interagissent fortement avec la phase stationnaire sont plus lents à éluer. La phase stationnaire est un adsorbant poudre ou gel tels que le gel de silice ou alumine. Gel de silice et d’alumine sont très polaires afin qu’ils interagissent fortement avec des solvants et de composés polaires et faiblement molécules non polaires. La phase stationnaire est chargée dans la colonne comme une bouillie avec le solvant et est ensuite emballée par coulant solvant à travers la phase stationnaire. Lorsqu’elles sont correctement emballées, la phase stationnaire est homogène de haut en bas et contient aucune bulle d’air ou des plaques sèches, comme inégale flux causée par ces irrégularités interfère avec la séparation des composés. Le solvant, ou comme éluant, est typiquement un solvant organique provenant d’un réservoir. En général, les solvants non polaires éluer seulement composés non polaires, considérant que les solvants polaires éluer les composés polaires et non polaires. Si un mélange contient des composés de polarité différente, une série de solvants de plus en plus polaires peut servir à éluer tous les composés d’intérêt. Le débit de la phase mobile est généralement contrôlé par un robinet en bas de la colonne. Pauses du débit sont gardés à un minimum afin d’éviter la diffusion des composés. La phase mobile quittant la colonne, appelée l’éluat, est recueillie dans les fractions de préserver la séparation des composés. Maintenant que vous comprenez les principes de la chromatographie sur colonne, Let ' s go grâce à une procédure pour la purification d’un mélange de composés organiques.

Pour commencer la procédure, obtenir l’équipement tel que mentionné dans le texte. Peser un ballon à fond rond pour chacun des composés isolés et enregistrer la masse. Ensuite, peser l’échantillon et le dissoudre dans le volume minimal de solvant nécessaire. Le solvant approprié devrait être prédéterminé à l’aide de la chromatographie sur couche mince. La valeur de Rf doit être entre 0,2 et 0,3. Ensuite, déterminer la quantité de gel de silice requis pour la phase stationnaire, basée sur le poids sec de l’échantillon et la différence de distance de migration des composés d’intérêt basé sur la présélection de TLC. Versez la quantité appropriée de gel de silice dans un erlenmeyer. Ajouter le solvant pour le gel de silice, jusqu'à ce que la boue est translucide et se déplace librement quand le ballon est tourbillonnait. Ensuite, sélectionnez une colonne assez grande pour que le gel de silice il comblera à mi-chemin. Si la colonne ne possède pas de fritte de verre, placer la laine de verre dans la colonne et pressez-le fermement vers le bas avec une longue tige. Couvrir la laine de verre avec environ 2 cm de sable pour empêcher l’en passant par la laine de verre de silice. Sous une hotte fixer la colonne à un support de bague, permettant un espace suffisant ci-dessous pour accueillir les tubes à essai.

Placez un entonnoir dans la colonne, puis assurez-vous que le robinet est fermé. Verser la pâte dans la colonne, tapotant doucement les parties que la boue s’installe pour exclure les bulles d’air. Rincer l’entonnoir, fiole et parois de la colonne avec le solvant de transférer la totalité du gel dans la colonne.

Placez un erlenmeyer sous la colonne. Ouvrir le robinet et laisser le solvant s’écouler dans le ballon jusqu'à ce que le niveau de solvant est juste au dessus du gel de silice et puis fermez le robinet d’arrêt. Versez environ 2 cm de sable sur le gel. Rincer doucement vers le bas de n’importe quel sable collé sur les côtés de la colonne avec le solvant. Égoutter le solvant au besoin si le sable est le plus souvent sec, mais la silice reste entièrement recouvert.

Pour démarrer la séparation, ajouter l’échantillon à la colonne sans déranger le sable. Utiliser des petites portions de solvant pour rincer à n’importe quel échantillon adhèrent aux parois colonne et pour rincer le récipient à échantillon. Soutirer avec précaution le solvant jusqu'à ce que le niveau est juste au-dessus de la silice. Puis, avec une pipette, ajouter doucement 4 – 5 mL de solvant sans déranger la couche de sable. Placez un entonnoir dans la colonne et remplir lentement avec le solvant. Enlever le ballon et le remplacer par un tube à essai marqué. Avec le premier tube à essai en place, ouvrir le robinet et recueillir l’éluat jusqu'à ce que le tube est presque plein.

Poursuivre la collecte de fractions jusqu'à ce que tous les composés désirés ont été éluées, procéder dans l’ordre à travers les tubes à essai marqués. Lorsque vous avez terminé, fermez le robinet d’arrêt.

Pour chacun des composés isolés, combiner les fractions pures dans un ballon à fond rond préalablement pesé. Éliminer le solvant de la fiole sur un évaporateur rotatif et peser le ballon à fond rond contenant le composé sec. Pour plus d’informations, voir la vidéo de cette collection sur l’évaporateur rotatif.

Cet exemple contenue un mélange de tétraphénylporphyrine, ou PPT et fluorénone. Le PPT de pourpre rougeâtre foncé est élué tout d’abord, suivie de la fluorénone jaune. La pureté de chaque composé isolé a été confirmée par spectroscopie RMN.

Chromatographie sur colonne est utilisé dans la purification et l’analyse dans une variété de domaines scientifiques.

Chromatographie liquide haute performance ou HPLC, est une forme de chromatographie sur colonne qui fournit l’excellente séparation entre les composés et peut intégrer des détecteurs spécialisés comme un détecteur de rayonnement pour les molécules radiomarquées. Par CLHP, un phospholipide radioactif peut facilement être isolé à partir d’un mélange de beaucoup d’autres même si elle représente un faible pourcentage du mélange. Cette information peut aider à élucider la production, réglementation et aux fonctions de nombreuses biomolécules importantes.

Chromatographie flash est une variante de la chromatographie sur colonne, dans laquelle la phase mobile se déplace à travers la colonne sous la pression d’air ou de gaz, plutôt que par le seul écoulement par gravité.

Cela crée un débit plus rapide, réduisant au minimum de diffusion pour une meilleure séparation. Le composé désiré est recueilli en quelques fractions de pures et concentrées, comme indiqué par chromatographie sur couche mince, résultant dans la pureté et l’excellent rendement après la purification.

L’appareil habituel de colonne n’est pas approprié pour séparer les petits volumes, mais certains mélanges ne sont pas compatibles avec des techniques spécialisées telles que l’HPLC. Purification à petite échelle est effectuée avec des colonnes de pipette de verre, avec une ampoule de pipette utilisée pour chromatographie flash à petite échelle. Ceci est particulièrement utile lors de la préparation d’un échantillon de techniques de purification spécialisés ou comme une étape finale après purification à grande échelle.

Vous avez juste regardé introduction de Jupiter à la chromatographie sur colonne. Vous devez maintenant être familiarisé avec les principes de la chromatographie sur colonne, une procédure pour chromatographie sur colonne de gel de silice et certaines applications de la technique.

Merci de regarder !

A subscription to JoVE is required to view this article.
You will only be able to see the first 20 seconds.

RECOMMEND JoVE