Imagerie d'échantillons biologiques avec microscopie optique et confocale

Biomedical Engineering

Your institution must subscribe to JoVE's Engineering collection to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Overview

Source: Peiman Shahbeigi-Roodposhti et Sina Shahbazmohamadi, Département de génie biomédical, Université du Connecticut, Storrs, Connecticut

Les microscopes optiques ont été autour depuis des siècles, et alors qu'ils ont atteint leur limitation théorique de la résolution il ya des décennies, de nouveaux équipements et techniques, telles que le traitement d'image confocale et numérique, ont créé de nouvelles niches dans le domaine de l'optique Imagerie. Les meilleurs microscopes optiques auront généralement une résolution jusqu'à 200 nm dans des conditions idéales. Cependant, les microscopes optiques sont limités par la diffraction des ondes, fonction de la longueur d'onde, qui est d'environ 500 nm pour la lumière visible. Bien que la résolution des microscopes optiques n'atteigne pas celle des microscopes électroniques, ils sont les outils les plus précieux dans l'imagerie des macrostructures biologiques et sont un aliment de base dans n'importe quel laboratoire biologique.

Dans les microscopes légers conventionnels, le signal produit à partir de l'objet imageur provient de toute l'épaisseur du spécimen, ce qui ne permet pas à la plupart d'entre eux d'être mis au point pour l'observateur. Cela provoque l'image d'avoir "flou hors de mise au point". Le microscope confocal, d'autre part, éclaire l'échantillon à travers un trou d'épingle, et est donc capable de filtrer la lumière floue d'en haut et en dessous du point de focalisation dans l'objet.

Cette démonstration offre une introduction à l'acquisition d'images à l'aide de méthodes de microscopie optique et confocale. Ici, un morceau sectionné du cerveau de souris sera étudié.  L'acquisition et l'analyse d'images, y compris les outils pour générer des cartes topographiques et des images composites, seront couvertes. Les avantages et les inconvénients des différentes méthodes d'imagerie en ce qui concerne la résolution, la profondeur de mise au point et le type d'échantillon seront également discutés. Le but de cette démonstration est de fournir plus d'informations sur les microscopes optiques et confocales afin de déterminer si ces modules de microscopie sont les mieux adaptés à un type d'échantillon biologique.

Cite this Video

JoVE Science Education Database. Génie biomédical. Imagerie d'échantillons biologiques avec microscopie optique et confocale. JoVE, Cambridge, MA, (2020).

Principles

Les microscopes optiques fonctionnent en utilisant au moins deux éléments de grossissement. La lentille principale, appelée l'objectif, détermine le grossissement total, et la lentille secondaire, appelée l'oculaire, concentre l'image virtuelle pour la visualisation. Le grossissement total est déterminé en multipliant les grossissements des deux lentilles. La focalisation de la lumière à travers ces sources, couplée à la focalisation de la lumière de la lampe sur l'échantillon, donne un plan de mise au point spécifié où le grossissement et la lumière de la lampe se rencontrent tous au même point, ce qui donne la meilleure résolution dans l'image. La figure ci-dessous montre comment le plan focal du spécimen est créé à travers les différentes lentilles. Les objets à l'extérieur du plan focal auront des faisceaux de lumière interférant à partir d'autres parties de l'échantillon en raison de la plus grande surface d'éclairage. Cela provoque le flou dans l'image. Par conséquent, pour se concentrer sur les différentes positions z d'un échantillon avec des hauteurs très variables, les tranches de z-direction doivent être déplacées dans le plan focal.

Figure 1
Figure 1. Lentilles de microscopie optique et plans focaux.

Les microscopes numériques fonctionnent sur le même principe que les micropscopes optiques, sauf qu'ils ne reposent pas sur un oculaire. C'est un microscope optique équipé d'un appareil photo numérique. L'appareil photo numérique agit comme un détecteur, et les images sont affichées sur un écran d'ordinateur. Ces microscopes sont idéaux pour l'analyse et la documentation des échantillons pendant la recherche et le développement (R-D), la fabrication et l'inspection, le contrôle de la qualité et l'assurance (QC/QA), ainsi que l'analyse des défaillances (FA). Ils offrent généralement des logiciels qui permettent aux utilisateurs d'analyser l'image de l'échantillon. La figure 2 montre une configuration numérique typique de microscope.

Figure 2
Figure 2. Principaux composants du microscope numérique.

Les principales composantes du système sont les :

  1. Moteur optique : Contient le capteur d'acquisition d'image et les lentilles pour zoomer sur l'image.
  2. Objectif : Acquiert et concentre la lumière de l'échantillon. Trois objectifs différents sont disponibles pour diverses tâches d'acquisition d'images.
  3. Étape de numérisation : Emplacement où l'échantillon doit être placé.
  4. Stand de microscope : Fournit le support pour le moteur optique et l'étape de balayage. Contrôle également la communication entre les composants attachés et l'ordinateur.
  5. Ordinateur : prend en charge les logiciels utilisateur et permet de visionnez les images sur l'écran.
  6. Contrôleur : Contrôle le microscope et le flux de travail à l'aide de gestes multi-touch et d'icônes sensibles au toucher et spécifiques au contexte. Les boutons de commande contrôlent la position d'image de zoom, de mise au point et de microscope.

Un microscope confocal, ou microscopie de balayage de laser confocal (CLSM), est un microscope avec la résolution optique et le contraste accrus. Confocal signifie « avoir la même attention ». L'objet et son image sont « confocals ».

Figure 3
Figure 3. Flou et son effet sur une image. L'image de gauche montre une image floue avec des bords flous. La bonne image montre le chemin de la lumière à travers la lentille lors de l'imagerie d'un échantillon qui est au point.

Contrairement aux microscopes à lumière générale qui illuminent et imagent l'ensemble de l'échantillon en vue, les microscopes confocals utilisent un sténopé entre l'étape de l'échantillon et le détecteur de sorte que seul un faisceau de lumière plus petit est focalisé à un niveau de profondeur étroite à la fois. Ainsi, la seule zone visible de l'échantillon est le point d'intérêt. Le microscope confocal scanne ensuite la surface de l'échantillon avec ce faisceau de lumière beaucoup plus focal (ou laser). Les données sont ensuite assemblées en une image 2D qui a une meilleure résolution que la microscopie optique classique. En outre, parce que la lumière est concentrée sur une gamme très étroite de hauteurs, l'utilisateur peut mettre différents plans au point que la direction Z est déplacé. Grâce à des techniques de traitement d'images et des logiciels d'automatisation microscopes confocal aider à la reconstruction 3D des images composites multi-plan ciblées.

Les microscopes confocals ont la capacité grâce au traitement d'image de donner des données de direction Z sur un échantillon qui n'était pas disponible auparavant en microcopie optique. Par exemple, dans la démonstration décrite ci-dessous, l'utilisateur peut définir les plages supérieures et inférieures de mise au point pour un échantillon, puis non seulement développer une carte thermique montrant les mesures de la direction z, mais aussi créer une image composite qui montre toutes les parties de l'image dans Se concentrer. Ces caractéristiques sont particulièrement utiles lors de l'obtention de données 3D sur un échantillon.

Figure 4
Figure 4. Principaux composants d'un microscope confocal.

Les principaux composants du microscope confocal comprennent :

  1. Scanner la tête avec un lecteur Z fin et 4 mégapixels, se tenir avec z-drive grossier
  2. Objectifs: 2.5x/ 5x/ 10x/ 20x/ 50x/ 100x
  3. Étapes : étape de balayage et étape fixe
  4. Système informatique : logiciel d'imagerie de système de PC
  5. Contrôleur: x, y, z mouvement

Procedure

1. Imagerie confocale

  1. Chargez l'échantillon sur la scène. Centrez-le sous l'objectif. Il ne doit pas dépasser la limitation de poids de l'étape, qui dans ce cas est de 5 kg. L'échantillon ne doit pas avoir plus de 100 mm d'épaisseur.
  2. Ouvrez le logiciel d'imagerie et sélectionnez « Créer de l'emploi ».
  3. Sous la colonne Topographies, choisissez le bouton assistant.
  4. Créez une image d'aperçu au grossissement le plus bas, 2.5X. Avant de changer les grossissements, assurez-vous que l'échantillon est au point en changeant la position Z jusqu'à ce que vous voyez une image claire. Cela peut être fait en poussant vers le bas ou en tirant vers le haut sur le manipulateur de microscope 3D. Le mouvement Z plus fin est atteint en engageant le bouton sur le côté, ce qui provoque une lumière bleue sur les bords.
  5. Augmentez lentement le grossissement de la lentille, en continuant à jouer avec l'intensité lumineuse et la mise au point jusqu'à ce que vous soyez au grossissement désiré. Si vous le souhaitez, choisissez un autre domaine d'intérêt en déplaçant la scène dans les directions x et y en utilisant le manipulateur.
  6. Une fois qu'une image d'aperçu est prise au grossissement bas, appuyez sur le bouton suivant pour passer à l'étape du point de référence. Si vous le souhaitez, spécifiez un certain point de référence pour des raisons de mesure (c.-à-d. le coin de l'échantillon), bien qu'à cette fin le point de référence par défaut soit très bien.
  7. Appuyez sur la flèche suivante pour passer à la partie suivante de l'assistant.
  8. Modifier l'objectif souhaité pour voir une résolution appropriée à votre échantillon. Dans ce cas, la lentille objective 50X est utilisée pour visualiser les cellules de l'échantillon. Le 50X est l'objectif qui est le plus proche de l'échantillon, donc progressivement passer à l'objectif 50X en veillant à ce qu'il ya encore de la place pour diminuer la distance de travail après l'objectif 20X.
  9. Sur la page "Measuring Range Definition", déplacez légèrement la position Z (en cliquant sur le bouton latéral sur le manipulateur pour des réglages fins) de sorte que seul le haut de l'échantillon est au point et cliquez sur "Set Last". Déplacez ensuite la scène dans la direction Z (vers le bas) jusqu'à ce que seul le bas de l'échantillon soit mis au point et appuyez sur "Set First". Assurez-vous que le nombre de tranches calculées ne dépasse pas 1000 ou que le programme échouera.
  10. Assurez-vous que l'intensité de la lumière ne sursatrate pas (cause pixels rouges) dans l'image à l'un des niveaux, puis a frappé fait. Cela prendra l'image de tomographie et d'ouvrir le logiciel de tomographie.
  11. Dans le logiciel de tomographie, ouvrez des onglets tels que l'onglet Études pour afficher les données en 3D et prendre des mesures dans l'espace 2D ou 3D.

2. Imagerie au microscope optique numérique

  1. Chargez l'échantillon sur la scène. Centrez l'échantillon sous la lentille. Le poids de l'échantillon ne doit pas dépasser la limitation de poids de l'étape, qui dans ce cas est de 4 kg. L'échantillon ne doit pas dépasser 12 cm.
  2. Ouvrez le logiciel d'imagerie.
  3. Sélectionnez un Job à partir de la liste des modèles fournis. Il est également possible de travailler en dehors d'un emploi en appuyant sur l'examen gratuit, ce qui vous permet d'étudier un échantillon en dehors d'un emploi.
  4. Acquérir une image de vue d'ensemble qui montre toute la scène. Cela servira de carte plus tard pour afficher la partie de l'échantillon qui est consultée. Lors de l'acquisition de l'image, utilisez le contrôleur pour changer la mise au point et la position de l'image.
  5. Placez un système de coordonnées. Le système de coordonnées par défaut est à partir du coin arrière gauche de la scène et est très bien pour cette application. Si l'échantillon est tordu, vous pouvez ajuster les coordonnées ici.
  6. Nommez l'échantillon et l'emploi, ce qui l'ajoute à la liste des emplois afin que d'autres utilisateurs puissent y retourner.
  7. Sélectionnez le bouton de l'appareil photo sous Acquérir. Prenez une image initiale, puis appuyez sur le bouton en direct lorsque vous naviguez dans l'échantillon.
  8. Déplacez la mise au point vers le bas jusqu'à ce que l'échantillon soit clairement au point. Il peut également être nécessaire d'ajuster l'éclairage sous l'onglet Éclairage et ouverture.
  9. Optimisez l'image avec les outils sous le panneau d'optimisation d'image. Vous pouvez jouer avec différents paramètres sous l'onglet Améliorations d'image, tels que l'inclinaison de l'objectif, les niveaux d'éclairage sur l'échantillon, et la luminosité et le contraste, jusqu'à ce que l'image ait la netteté désirée.
  10. Effectuez des mesures en appuyant sur l'outil Crayon sur le logiciel. De là, vous avez accès à plusieurs outils de mesure, y compris les distances, les angles et la zone. Utilisez la distance et les outils de zone pour mesurer la taille de l'échantillon.
  11. Passez à l'onglet Résultats de flux de travail et vérifiez la disposition du flux de travail pour configurer la mise en page du rapport
  12. Appuyez sur le bouton enregistrer pour enregistrer votre travail afin que d'autres puissent utiliser le même flux de travail.

La microscopie est une méthode largement utilisée pour imager la structure détaillée des échantillons. Les microscopes optiques, qui concentrent la lumière à travers une série de lentilles pour grossir les échantillons, sont utilisés depuis des siècles avec le premier microscope composé apparaissant au XVIIe siècle. Pendant ce temps, Antonie van Leeuwenhoek a été le premier à observer des bactéries, des levures, des globules rouges et la circulation dans les vaisseaux capillaires, apportant des contributions scientifiques importantes et ouvrant la voie à des progrès microscopiques.

Les microscopes optiques sont encore largement utilisés aujourd'hui dans la recherche et les milieux cliniques pour le diagnostic médical. Cependant, au cours des 60 dernières années, une microscopie confocale a vu le jour qui éclaire l'échantillon à travers un trou d'épingle pour augmenter la résolution optique et le contraste.

Cette vidéo illustrera les principes de fonctionnement de la microscopie optique et confocale, démontrera comment les images à haute résolution sont analysées et discutera de plusieurs applications de la microscopie dans le domaine du génie biomédical.

Commençons par discuter des principes fondamentaux de la microscopie confocale. La microscopie optique est basée sur le principe de concentrer la lumière sur un échantillon pour imager sa structure détaillée. Un microscope est formé de deux composants de grossissement; la lentille objective, qui concentre une image réelle d'un objet, et l'oculaire, qui concentre une image virtuelle agrandie avant qu'elle ne soit reçue par l'œil. Le grossissement total est atteint en multipliant les grossissements de ces deux lentilles.

La mise au point de la lumière donne un plan de mise au point spécifié où le grossissement et la lumière de la lampe se rencontrent tous au même point, ce qui donne la meilleure résolution dans l'image. Lorsqu'elle est à l'extérieur du plan focal, la zone d'éclairage est plus grande et les faisceaux lumineux interfèrent à partir d'autres parties de l'échantillon, ce qui provoque le flou de l'image. Lorsque les microscopes lumineux illuminent et imagent l'ensemble de l'échantillon en vue, un microscope confocal utilise un trou d'épingle entre l'étape de l'échantillon et le détecteur de sorte que seul un petit faisceau lumineux est focalisé à une profondeur étroite à la fois.

Par conséquent, la seule zone visible de l'échantillon, est le point d'orientation, fournissant une image bien résolue. Cependant, avec une résolution plus élevée, seule une petite partie de cet échantillon est imageà la fois. En déplaçant l'échantillon dans le plan X-Y, un balayage de raster de sa surface peut être exécuté. Pour chaque point de l'analyse, la mise au point est optimisée en ajustant la hauteur Z pour accéder à différents plans focaux. Cela garantit une résolution maximale point par point de l'échantillon d'image.

Maintenant, utilisons ces principes de microscopie et de résolution d'image pour imager un cerveau de souris à l'aide d'un microscope confocal et optique.

Après avoir examiné les principaux principes de la microscopie, nous allons maintenant effectuer une mesure à l'aide d'un microscope confocal. Tout d'abord, allumez le microscope à la station de travail informatique. Ensuite, chargez l'échantillon sur la scène et centrez-le sous la lentille. Maintenant, ouvrez le logiciel d'imagerie et sélectionnez créer un nouvel emploi. Passez à la colonne de topographie et choisissez le bouton assistant. Sélectionnez le grossissement le plus bas, qui pour ce microscope, est de 2,5x. Ensuite, utilisez le manipulateur de microscope 3D pour ajuster la position Z de l'échantillon et mettre l'échantillon au point. Appuyez sur le bouton sur le côté de sorte qu'une lumière bleue apparaît autour des bords. Cela permet un mouvement Z plus fin et la mise au point. Capturez maintenant une image d'aperçu.

Augmentez lentement le grossissement de la lentille et ajustez l'intensité lumineuse et la concentration pour obtenir le grossissement désiré. Utilisez le manipulateur 3D dans les directions X et Y pour sélectionner différents domaines d'intérêt sur l'échantillon. Une fois qu'une image est prise à faible grossissement, appuyez ensuite pour prendre un point de référence. Utilisez soit le point de référence par défaut, soit spécifiez un nouveau dans le coin de l'échantillon, puis appuyez ensuite. Maintenant, progressivement changer l'objectif à la résolution souhaitée pour l'échantillon. Pour cet échantillon, un objectif 20x est utilisé pour visualiser les cellules dans le tissu cérébral de la souris. Assurez-vous qu'il y a de la place pour réduire la distance de travail.

Pour définir la distance pour collecter des tranches, allez d'abord à la page de définition de la plage de mesure et utilisez le manipulateur 3D pour enfin ajuster l'échantillon dans la direction Z. Cliquez sur le dernier lorsque le haut de l'échantillon est au point et cliquez d'abord lorsque le bas de l'échantillon est au point. Assurez-vous que le nombre de tranches calculées ne dépasse pas 1 000 ou que le programme échouera. Vérifiez qu'il n'y a pas de pixels rouges, ce qui indique que l'intensité de la lumière est sursaturée.

Enfin, appuyez sur fait pour prendre l'image de tomographie. Lorsque le logiciel de tomographie s'ouvre, sélectionnez l'onglet études pour afficher les données en 3D et prendre des mesures 2D et 3D.

Maintenant permet de prendre une image à l'aide d'un microscope optique numérique. Tout d'abord, allumez le microscope et ouvrez le logiciel d'imagerie. Ensuite, chargez l'échantillon sur la scène et centrez-le sous la lentille. Lorsque le logiciel d'imagerie est ouvert, sélectionnez un emploi dans la liste des modèles ou choisissez un examen gratuit. Ensuite, acquérir une image de vue d'ensemble qui montre toute la scène. Utilisez le contrôleur pour modifier la mise au point et la position de l'image.

Une fois l'acquisition terminée, placez un système de coordonnées sur l'image. Le système de coordonnées par défaut se trouve au milieu de la scène. Pour plus de flexibilité, les coordonnées peuvent être modifiées manuellement.

Nommez ensuite l'échantillon et sélectionnez le bouton de l'appareil photo. Appuyez sur le bouton en direct lorsque vous naviguez dans l'échantillon et déplacez la mise au point vers le bas jusqu'à ce que l'échantillon soit clairement au point. Au besoin, utilisez l'onglet éclairage et ouverture pour ajuster l'éclairage. Ensuite, acquérir une image de l'échantillon.

Utilisez les outils sous le panneau d'optimisation de l'image, tels que l'inclinaison de la lentille, les niveaux d'éclairage sur l'échantillon, et la luminosité et le contraste dans l'image pour optimiser l'image à la netteté désirée. Maintenant, appuyez sur l'outil crayon pour effectuer des mesures. Utilisez la distance et les outils de zone pour mesurer la taille des cellules sur l'échantillon.

Enfin, allez à l'onglet flux de travail des résultats et configurez la mise en page du rapport. Appuyez sur le bouton enregistrer pour enregistrer l'emploi pour une analyse plus approfondie.

Maintenant permet d'analyser les images d'un cerveau de souris qui ont été prises avec des microscopes optiques confocaletetetet et numérique. L'image confocale à 50x grossissement est de haute résolution et fournit une mise au point profonde avec des niveaux de profondeur variables de l'information.

Sur la carte tomographique, le sommet de cet échantillon varie de un à neuf microns. Des caractéristiques telles que l'amplitude, le profil de rugosité et les paramètres de courbe peuvent être analysées plus en détail. Cependant, la diapositive entière du tissu cérébral sectionné peut être imaged utilisant un microscope optique numérique.

Zoom sur une section montre plus de détails de l'échantillon, mais à une résolution beaucoup plus faible que obtenue avec microscope confocal. Cet échantillon a été obtenu à 300x grossissement. Un logiciel dédié offre des outils pour mesurer les dimensions transversales, telles que le diamètre, ainsi que pour calculer la zone interne de la section.

La microscopie numérique, optique et confocale sont des outils standard utilisés dans diverses applications biomédicales. L'ophtalmose laser ou SLO est une technique d'imagerie non invasive qui est largement utilisée en ophtalmologie clinique pour diagnostiquer et surveiller le développement de maladies rétiniennes.

SLO produit des images stéréoscopiques à fort contraste qui visualisent la microglies. Les macrophages résidents de la rétine, qui sont impliqués dans plusieurs maladies rétiniennes. La microscopie confocale est également utilisée dans l'imagerie cellulaire vivante qui permet aux chercheurs de visualiser la fonction microscopique des cellules biologiques en temps réel.

Cette technique est utilisée pour étudier la migration cellulaire et la prolifération et la dynamique des protéines, entre autres. Ici, les récepteurs transmembrane s'ils ont été étiquetés avec des colorants fluorescents et leur colocalisation a été analysée à l'aide de l'imagerie par timelapse pour étudier l'internalisation des récepteurs.

Vous venez de regarder l'introduction de JoVE à la microscopie numérique, optique et confocale. Vous devez maintenant comprendre les principes de la microscopie et de la résolution d'images, comment utiliser les microscopes optiques et confocales pour imager des échantillons biologiques, et plusieurs applications de leur utilisation dans le domaine du génie biomédical.

Merci d'avoir regardé.

Results

Les images suivantes donnent un aperçu des résultats qui peuvent être obtenus d'un cerveau de souris à l'aide d'un microscope confocal. Ils montrent comment différents niveaux d'information peuvent être obtenus et comment une carte topographique des résultats révèle la hauteur de l'échantillon.

Figure 5
Figure 5: Images confocales au grossissement 50X montrant un cerveau de souris sectionné. L'image de gauche est une image composite qui prend tous les plans en cours de mise au point pendant la tomographie et crée une image haute résolution et profondément ciblée. L'image de droite montre la carte topographique de l'échantillon.

Figure 6
Figure 6: En tant qu'exemple représentatif des applications 3D du microscope confocal, un trou dans le plastique a été imagené et analysé. La carte topographique originale est sur la gauche et la reconstruction 3D est sur la droite.

Figure 7
Figure 7: Montre l'étendue de l'analyse logicielle ConfoMap pour l'observation d'un profil d'une reconstruction 3D. Les paramètres d'amplitude, le profil de rugosité, la caractérisation de la courbe sont affichés.

Les images suivantes donnent un aperçu des résultats qui peuvent être obtenus à partir de l'utilisation d'un microscope optique numérique sur la même tranche de cerveau de souris. Le microscope numérique donne un plus grand champ de vision, mais des images de faible résolution du microscope confocal, ce qui est idéal pour regarder de plus grands composants ou des structures biologiques. Le logiciel dispose d'outils d'analyse utiles pour mesurer l'échantillon.

Figure 8
Figure 8: Image d'aperçu montrant la tranche entière d'organe.

Figure 9
Figure 9: Zoomé à l'image d'un cerveau de souris sectionné. Voici un champ de vision de 300 microns obtenu avec un éclairage coaxial et ring mixte ainsi qu'une stabilisation électronique de l'image.

Figure 10
Figure 10: Démonstration des capacités de mesure du microscope optique numérique. Le diamètre de l'échantillon est mesuré sur la gauche, et un contour défini par l'utilisateur qui est utilisé pour calculer la zone interne du cerveau de souris sectionné est montré sur la droite. Ces outils sont utiles lors de l'analyse d'échantillons biologiques, qui peuvent ne pas avoir des bords qui sont les mêmes que les formes prédéfinies.

Applications and Summary

Dans cette démonstration, la profondeur de mise au point, le champ de vision et la résolution maximale et le grossissement des microscopes optiques et confocals ont été optimisés pour voir des échantillons biologiques. Cette démonstration a été conçue pour aider le participant à décider quel module de microscopie est le meilleur pour une certaine application. Les deux modes de microscopie ont des avantages dans l'analyse des échantillons biologiques pour leur facilité de préparation et des images composites à haute résolution.

Les applications pour la microscopie optique et confocale sont de grande portée. En raison de la préparation limitée de l'échantillon et de la capacité d'intégrer des plans de mouvement et d'utiliser des techniques de lumière au-dessus de l'échantillon, ces outils sont en mesure d'obtenir des informations à partir de la plupart des ensembles de données. La microscopie a été une option très populaire lors de l'imagerie des cellules vivantes, telles que celles traitées avec la fluorescence, mais les applications peuvent aller des surfaces d'imagerie des dispositifs biomédicaux à la détection des défauts et de la rugosité avant de les implanter dans le corps. La microscopie confocale et optique est la norme actuelle pour l'imagerie d'échantillons biologiques.

Enfin, la microscopie confocale offre une imagerie améliorée avec des techniques de fluorescence. Les fluorophores d'un échantillon ont une durée de vie limitée et peuvent s'agripper lorsqu'ils sont exposés à des quantités élevées de lumière. Dans la microscopie lumineuse traditionnelle, l'échantillon entier est éclairé pendant l'imagerie, ce qui se traduit par un blanchiment rapide de la photo. Cependant, puisque seule une infime partie de l'échantillon est illuminée en même temps avec une microscopie confocale, la durée de vie du fluorophore est plus longue et il y a moins de défis associés au blanchiment photo.

1. Imagerie confocale

  1. Chargez l'échantillon sur la scène. Centrez-le sous l'objectif. Il ne doit pas dépasser la limitation de poids de l'étape, qui dans ce cas est de 5 kg. L'échantillon ne doit pas avoir plus de 100 mm d'épaisseur.
  2. Ouvrez le logiciel d'imagerie et sélectionnez « Créer de l'emploi ».
  3. Sous la colonne Topographies, choisissez le bouton assistant.
  4. Créez une image d'aperçu au grossissement le plus bas, 2.5X. Avant de changer les grossissements, assurez-vous que l'échantillon est au point en changeant la position Z jusqu'à ce que vous voyez une image claire. Cela peut être fait en poussant vers le bas ou en tirant vers le haut sur le manipulateur de microscope 3D. Le mouvement Z plus fin est atteint en engageant le bouton sur le côté, ce qui provoque une lumière bleue sur les bords.
  5. Augmentez lentement le grossissement de la lentille, en continuant à jouer avec l'intensité lumineuse et la mise au point jusqu'à ce que vous soyez au grossissement désiré. Si vous le souhaitez, choisissez un autre domaine d'intérêt en déplaçant la scène dans les directions x et y en utilisant le manipulateur.
  6. Une fois qu'une image d'aperçu est prise au grossissement bas, appuyez sur le bouton suivant pour passer à l'étape du point de référence. Si vous le souhaitez, spécifiez un certain point de référence pour des raisons de mesure (c.-à-d. le coin de l'échantillon), bien qu'à cette fin le point de référence par défaut soit très bien.
  7. Appuyez sur la flèche suivante pour passer à la partie suivante de l'assistant.
  8. Modifier l'objectif souhaité pour voir une résolution appropriée à votre échantillon. Dans ce cas, la lentille objective 50X est utilisée pour visualiser les cellules de l'échantillon. Le 50X est l'objectif qui est le plus proche de l'échantillon, donc progressivement passer à l'objectif 50X en veillant à ce qu'il ya encore de la place pour diminuer la distance de travail après l'objectif 20X.
  9. Sur la page "Measuring Range Definition", déplacez légèrement la position Z (en cliquant sur le bouton latéral sur le manipulateur pour des réglages fins) de sorte que seul le haut de l'échantillon est au point et cliquez sur "Set Last". Déplacez ensuite la scène dans la direction Z (vers le bas) jusqu'à ce que seul le bas de l'échantillon soit mis au point et appuyez sur "Set First". Assurez-vous que le nombre de tranches calculées ne dépasse pas 1000 ou que le programme échouera.
  10. Assurez-vous que l'intensité de la lumière ne sursatrate pas (cause pixels rouges) dans l'image à l'un des niveaux, puis a frappé fait. Cela prendra l'image de tomographie et d'ouvrir le logiciel de tomographie.
  11. Dans le logiciel de tomographie, ouvrez des onglets tels que l'onglet Études pour afficher les données en 3D et prendre des mesures dans l'espace 2D ou 3D.

2. Imagerie au microscope optique numérique

  1. Chargez l'échantillon sur la scène. Centrez l'échantillon sous la lentille. Le poids de l'échantillon ne doit pas dépasser la limitation de poids de l'étape, qui dans ce cas est de 4 kg. L'échantillon ne doit pas dépasser 12 cm.
  2. Ouvrez le logiciel d'imagerie.
  3. Sélectionnez un Job à partir de la liste des modèles fournis. Il est également possible de travailler en dehors d'un emploi en appuyant sur l'examen gratuit, ce qui vous permet d'étudier un échantillon en dehors d'un emploi.
  4. Acquérir une image de vue d'ensemble qui montre toute la scène. Cela servira de carte plus tard pour afficher la partie de l'échantillon qui est consultée. Lors de l'acquisition de l'image, utilisez le contrôleur pour changer la mise au point et la position de l'image.
  5. Placez un système de coordonnées. Le système de coordonnées par défaut est à partir du coin arrière gauche de la scène et est très bien pour cette application. Si l'échantillon est tordu, vous pouvez ajuster les coordonnées ici.
  6. Nommez l'échantillon et l'emploi, ce qui l'ajoute à la liste des emplois afin que d'autres utilisateurs puissent y retourner.
  7. Sélectionnez le bouton de l'appareil photo sous Acquérir. Prenez une image initiale, puis appuyez sur le bouton en direct lorsque vous naviguez dans l'échantillon.
  8. Déplacez la mise au point vers le bas jusqu'à ce que l'échantillon soit clairement au point. Il peut également être nécessaire d'ajuster l'éclairage sous l'onglet Éclairage et ouverture.
  9. Optimisez l'image avec les outils sous le panneau d'optimisation d'image. Vous pouvez jouer avec différents paramètres sous l'onglet Améliorations d'image, tels que l'inclinaison de l'objectif, les niveaux d'éclairage sur l'échantillon, et la luminosité et le contraste, jusqu'à ce que l'image ait la netteté désirée.
  10. Effectuez des mesures en appuyant sur l'outil Crayon sur le logiciel. De là, vous avez accès à plusieurs outils de mesure, y compris les distances, les angles et la zone. Utilisez la distance et les outils de zone pour mesurer la taille de l'échantillon.
  11. Passez à l'onglet Résultats de flux de travail et vérifiez la disposition du flux de travail pour configurer la mise en page du rapport
  12. Appuyez sur le bouton enregistrer pour enregistrer votre travail afin que d'autres puissent utiliser le même flux de travail.

La microscopie est une méthode largement utilisée pour imager la structure détaillée des échantillons. Les microscopes optiques, qui concentrent la lumière à travers une série de lentilles pour grossir les échantillons, sont utilisés depuis des siècles avec le premier microscope composé apparaissant au XVIIe siècle. Pendant ce temps, Antonie van Leeuwenhoek a été le premier à observer des bactéries, des levures, des globules rouges et la circulation dans les vaisseaux capillaires, apportant des contributions scientifiques importantes et ouvrant la voie à des progrès microscopiques.

Les microscopes optiques sont encore largement utilisés aujourd'hui dans la recherche et les milieux cliniques pour le diagnostic médical. Cependant, au cours des 60 dernières années, une microscopie confocale a vu le jour qui éclaire l'échantillon à travers un trou d'épingle pour augmenter la résolution optique et le contraste.

Cette vidéo illustrera les principes de fonctionnement de la microscopie optique et confocale, démontrera comment les images à haute résolution sont analysées et discutera de plusieurs applications de la microscopie dans le domaine du génie biomédical.

Commençons par discuter des principes fondamentaux de la microscopie confocale. La microscopie optique est basée sur le principe de concentrer la lumière sur un échantillon pour imager sa structure détaillée. Un microscope est formé de deux composants de grossissement; la lentille objective, qui concentre une image réelle d'un objet, et l'oculaire, qui concentre une image virtuelle agrandie avant qu'elle ne soit reçue par l'œil. Le grossissement total est atteint en multipliant les grossissements de ces deux lentilles.

La mise au point de la lumière donne un plan de mise au point spécifié où le grossissement et la lumière de la lampe se rencontrent tous au même point, ce qui donne la meilleure résolution dans l'image. Lorsqu'elle est à l'extérieur du plan focal, la zone d'éclairage est plus grande et les faisceaux lumineux interfèrent à partir d'autres parties de l'échantillon, ce qui provoque le flou de l'image. Lorsque les microscopes lumineux illuminent et imagent l'ensemble de l'échantillon en vue, un microscope confocal utilise un trou d'épingle entre l'étape de l'échantillon et le détecteur de sorte que seul un petit faisceau lumineux est focalisé à une profondeur étroite à la fois.

Par conséquent, la seule zone visible de l'échantillon, est le point d'orientation, fournissant une image bien résolue. Cependant, avec une résolution plus élevée, seule une petite partie de cet échantillon est imageà la fois. En déplaçant l'échantillon dans le plan X-Y, un balayage de raster de sa surface peut être exécuté. Pour chaque point de l'analyse, la mise au point est optimisée en ajustant la hauteur Z pour accéder à différents plans focaux. Cela garantit une résolution maximale point par point de l'échantillon d'image.

Maintenant, utilisons ces principes de microscopie et de résolution d'image pour imager un cerveau de souris à l'aide d'un microscope confocal et optique.

Après avoir examiné les principaux principes de la microscopie, nous allons maintenant effectuer une mesure à l'aide d'un microscope confocal. Tout d'abord, allumez le microscope à la station de travail informatique. Ensuite, chargez l'échantillon sur la scène et centrez-le sous la lentille. Maintenant, ouvrez le logiciel d'imagerie et sélectionnez créer un nouvel emploi. Passez à la colonne de topographie et choisissez le bouton assistant. Sélectionnez le grossissement le plus bas, qui pour ce microscope, est de 2,5x. Ensuite, utilisez le manipulateur de microscope 3D pour ajuster la position Z de l'échantillon et mettre l'échantillon au point. Appuyez sur le bouton sur le côté de sorte qu'une lumière bleue apparaît autour des bords. Cela permet un mouvement Z plus fin et la mise au point. Capturez maintenant une image d'aperçu.

Augmentez lentement le grossissement de la lentille et ajustez l'intensité lumineuse et la concentration pour obtenir le grossissement désiré. Utilisez le manipulateur 3D dans les directions X et Y pour sélectionner différents domaines d'intérêt sur l'échantillon. Une fois qu'une image est prise à faible grossissement, appuyez ensuite pour prendre un point de référence. Utilisez soit le point de référence par défaut, soit spécifiez un nouveau dans le coin de l'échantillon, puis appuyez ensuite. Maintenant, progressivement changer l'objectif à la résolution souhaitée pour l'échantillon. Pour cet échantillon, un objectif 20x est utilisé pour visualiser les cellules dans le tissu cérébral de la souris. Assurez-vous qu'il y a de la place pour réduire la distance de travail.

Pour définir la distance pour collecter des tranches, allez d'abord à la page de définition de la plage de mesure et utilisez le manipulateur 3D pour enfin ajuster l'échantillon dans la direction Z. Cliquez sur le dernier lorsque le haut de l'échantillon est au point et cliquez d'abord lorsque le bas de l'échantillon est au point. Assurez-vous que le nombre de tranches calculées ne dépasse pas 1 000 ou que le programme échouera. Vérifiez qu'il n'y a pas de pixels rouges, ce qui indique que l'intensité de la lumière est sursaturée.

Enfin, appuyez sur fait pour prendre l'image de tomographie. Lorsque le logiciel de tomographie s'ouvre, sélectionnez l'onglet études pour afficher les données en 3D et prendre des mesures 2D et 3D.

Maintenant permet de prendre une image à l'aide d'un microscope optique numérique. Tout d'abord, allumez le microscope et ouvrez le logiciel d'imagerie. Ensuite, chargez l'échantillon sur la scène et centrez-le sous la lentille. Lorsque le logiciel d'imagerie est ouvert, sélectionnez un emploi dans la liste des modèles ou choisissez un examen gratuit. Ensuite, acquérir une image de vue d'ensemble qui montre toute la scène. Utilisez le contrôleur pour modifier la mise au point et la position de l'image.

Une fois l'acquisition terminée, placez un système de coordonnées sur l'image. Le système de coordonnées par défaut se trouve au milieu de la scène. Pour plus de flexibilité, les coordonnées peuvent être modifiées manuellement.

Nommez ensuite l'échantillon et sélectionnez le bouton de l'appareil photo. Appuyez sur le bouton en direct lorsque vous naviguez dans l'échantillon et déplacez la mise au point vers le bas jusqu'à ce que l'échantillon soit clairement au point. Au besoin, utilisez l'onglet éclairage et ouverture pour ajuster l'éclairage. Ensuite, acquérir une image de l'échantillon.

Utilisez les outils sous le panneau d'optimisation de l'image, tels que l'inclinaison de la lentille, les niveaux d'éclairage sur l'échantillon, et la luminosité et le contraste dans l'image pour optimiser l'image à la netteté désirée. Maintenant, appuyez sur l'outil crayon pour effectuer des mesures. Utilisez la distance et les outils de zone pour mesurer la taille des cellules sur l'échantillon.

Enfin, allez à l'onglet flux de travail des résultats et configurez la mise en page du rapport. Appuyez sur le bouton enregistrer pour enregistrer l'emploi pour une analyse plus approfondie.

Maintenant permet d'analyser les images d'un cerveau de souris qui ont été prises avec des microscopes optiques confocaletetetet et numérique. L'image confocale à 50x grossissement est de haute résolution et fournit une mise au point profonde avec des niveaux de profondeur variables de l'information.

Sur la carte tomographique, le sommet de cet échantillon varie de un à neuf microns. Des caractéristiques telles que l'amplitude, le profil de rugosité et les paramètres de courbe peuvent être analysées plus en détail. Cependant, la diapositive entière du tissu cérébral sectionné peut être imaged utilisant un microscope optique numérique.

Zoom sur une section montre plus de détails de l'échantillon, mais à une résolution beaucoup plus faible que obtenue avec microscope confocal. Cet échantillon a été obtenu à 300x grossissement. Un logiciel dédié offre des outils pour mesurer les dimensions transversales, telles que le diamètre, ainsi que pour calculer la zone interne de la section.

La microscopie numérique, optique et confocale sont des outils standard utilisés dans diverses applications biomédicales. L'ophtalmose laser ou SLO est une technique d'imagerie non invasive qui est largement utilisée en ophtalmologie clinique pour diagnostiquer et surveiller le développement de maladies rétiniennes.

SLO produit des images stéréoscopiques à fort contraste qui visualisent la microglies. Les macrophages résidents de la rétine, qui sont impliqués dans plusieurs maladies rétiniennes. La microscopie confocale est également utilisée dans l'imagerie cellulaire vivante qui permet aux chercheurs de visualiser la fonction microscopique des cellules biologiques en temps réel.

Cette technique est utilisée pour étudier la migration cellulaire et la prolifération et la dynamique des protéines, entre autres. Ici, les récepteurs transmembrane s'ils ont été étiquetés avec des colorants fluorescents et leur colocalisation a été analysée à l'aide de l'imagerie par timelapse pour étudier l'internalisation des récepteurs.

Vous venez de regarder l'introduction de JoVE à la microscopie numérique, optique et confocale. Vous devez maintenant comprendre les principes de la microscopie et de la résolution d'images, comment utiliser les microscopes optiques et confocales pour imager des échantillons biologiques, et plusieurs applications de leur utilisation dans le domaine du génie biomédical.

Merci d'avoir regardé.

JoVE Science Education is free through June 15th 2020.

RECOMMEND JoVE