광학 및 공초점 현미경을 사용한 생물학적 시료 이미징

광학 현미경은 배율의 적어도 두 개의 요소를 사용하여 기능합니다. 목표라고 하는 기본 렌즈는 총 배율을 결정하고, 접피스라고 불리는 보조 렌즈는 볼 수 있는 가상 이미지에 초점을 맞춥니다. 총 배율은 두 렌즈의 배율을 곱하여 결정됩니다. 이러한 소스를 통해 빛의 초점, 샘플에 램프에서 빛의 초점과 함께, 배율과 램프 빛이 모두 같은 지점에서 만나는 초점의 지정된 평면을 제공, 이는 이미지에서 최고의 해상도를 제공합니다. 아래 그림은 다른 렌즈를 통해 표본의 초점 평면이 어떻게 만들어지는지 보여줍니다. 초점 평면 외부의 물체는 조명의 더 큰 영역으로 인해 샘플의 다른 부분에서 간섭하는 빛의 빔을 갖게 됩니다. 이렇게 하면 이미지의 흐림이 발생합니다. 따라서 높이가 크게 다른 샘플의 다른 z 위치에 집중하려면 z 방향 슬라이스를 초점 평면으로 이동해야 합니다.

그림 1. 광학 현미경 렌즈 및 초점 비행기.

디지털 현미경은 접지에 의존하지 않는다는 것을 제외하고는 광학 현미경과 동일한 원리로 작동합니다. 디지털 카메라가 장착된 광학 현미경입니다. 디지털 카메라는 감지기 역할을 하며 이미지는 컴퓨터 모니터에 표시됩니다. 이러한 현미경은 연구 개발(R&D), 제조 및 검사, 품질 관리 및 보증(QC/QA), 고장 분석(FA) 동안 샘플의 분석 및 문서화에 이상적입니다. 일반적으로 사용자가 샘플 이미지를 분석할 수 있는 소프트웨어를 제공합니다. 도 2는 일반적인 디지털 현미경 설정을 나타낸다.

그림 2. 디지털 현미경의 주요 구성 요소.

시스템의 주요 구성 요소는 다음과 같습니다.

1. 광학 엔진: 이미지를 확대하기 위한 이미지 수집 센서와 렌즈가 포함되어 있습니다.
2. 목표: 샘플에서 빛을 획득하고 집중합니다. 다양한 이미지 수집 작업에는 세 가지 목표를 사용할 수 있습니다.
3. 스캐닝 단계: 샘플을 배치할 위치입니다.
4. 현미경 스탠드: 광학 엔진 및 스캐닝 스테이지에 대한 지원을 제공합니다. 또한 연결된 구성 요소와 컴퓨터 간의 통신을 제어합니다.
5. 컴퓨터: 사용자 소프트웨어를 지원하고 모니터에서 이미지를 볼 수 있습니다.
6. 컨트롤러: 멀티 터치 제스처와 터치 감지, 컨텍스트별 아이콘을 사용하여 현미경 및 워크플로우를 제어합니다. 제어 노브는 줌, 초점 및 현미경 이미지 위치를 제어합니다.

공초점 현미경, 또는 공초점 레이저 스캐닝 현미경 (CLSM) 증가 광학 해상도 및 대비를 가진 현미경이다. 공초점은 "같은 초점을 갖는"것을 의미합니다. 개체와 이미지는 "공초점"입니다.

그림 3. 흐림과 이미지에 미치는 영향. 왼쪽 이미지는 흐리게 된 가장자리가 있는 포커스 이미지의 아웃을 보여줍니다. 올바른 이미지는 초점시 샘플을 이미징할 때 렌즈를 통한 빛의 경로를 보여줍니다.

전체 샘플을 비추고 이미지화하는 일반적인 광 현미경과는 달리, 공초점 현미경은 샘플 단계와 검출기 사이의 핀홀을 활용하여 더 작은 빛 빔만 한 번에 하나의 좁은 깊이 레벨에 초점을 맞춥니다. 따라서, 시료의 유일한 가시 영역은 인포커스 포인트이다. 공초점 현미경은 그 때 광선의 이 훨씬 더 집중한 광선 (또는 레이저)로 견본의 표면을 검사합니다. 그런 다음 데이터는 고전적인 광학 현미경 검사보다 더 나은 해상도를 가지는 하나의 2D 이미지로 조립됩니다. 또한 빛이 매우 좁은 높이 범위에 초점을 맞추고 있기 때문에 Z 방향이 이동함에 따라 사용자는 서로 다른 평면을 집중할 수 있습니다. 이미지 처리 기술과 자동화 소프트웨어를 통해 공초점 현미경은 다중 평면 중심의 복합 이미지의 3D 재구성에 도움이됩니다.

공초점 현미경은 이전에 광학 현미경검사에서 사용할 수 없었던 샘플에 대한 Z 방향 데이터를 제공하는 이미지 처리를 통해 능력을 가지고 있습니다. 예를 들어, 아래 설명된 데모에서 사용자는 샘플에 대한 상하 초점 범위를 정의한 다음 z 방향의 측정을 보여주는 열 맵을 개발할 뿐만 아니라 이미지의 모든 부분을 초점으로 보여주는 복합 이미지를 만들 수 있습니다. 이러한 기능은 샘플에 대한 3D 데이터를 얻을 때 특히 유용합니다.

그림 4. 공초점 현미경의 주요 구성 요소.

공초점 현미경의 주요 구성 요소는 다음을 포함합니다.

1. 미세한 Z 드라이브와 4메가픽셀 카메라로 머리를 스캔하고 거친 Z 드라이브로 서 있습니다.
2. 목표: 2.5x/ 5x/ 10x/ 20x/ 50x/100x
3. 스테이지: 스캐닝 스테이지 및 고정 스테이지
4. 컴퓨터 시스템: PC 시스템 이미징 소프트웨어
5. 컨트롤러: x, y, z 모션

1. 공초점 이미징

1. 샘플을 스테이지에 로드합니다. 렌즈 아래에 중앙을 가두어 두세요. 이 경우 5kg인 스테이지의 중량 제한을 초과해서는 안됩니다. 샘플은 두께가 100mm 이상이어야 합니다.
2. 이미징 소프트웨어를 열고 "작업 만들기"를 선택합니다.
3. 도포그래피 열에서 도우미 단추를 선택합니다.
4. 가장 낮은 배율인 2.5배에서 개요 이미지를 만듭니다. 배율을 전환하기 전에 명확한 이미지가 표시될 때까지 Z 위치를 변경하여 샘플이 초점을 맞추고 있는지 확인합니다. 이것은 3D 현미경 조작기에서 아래로 밀거나 당겨서 행해질 수 있습니다. 미세한 Z 모션은 측면의 버튼을 참여시켜 가장자리 주위에 파란색 표시등이 표시됩니다.
5. 렌즈 배율을 천천히 증가시키고 원하는 배율에 있을 때까지 빛의 강도와 초점으로 지속적으로 연주합니다. 원하는 경우 조작기사용으로 x 및 y 방향으로 스테이지를 이동하여 다른 관심 영역을 선택합니다.
6. 개요 이미지를 낮은 배율로 촬영하면 다음 버튼을 눌러 참조 점 단계로 진행합니다. 원하는 경우, 측정을 위해 특정 기준점을 지정(즉, 샘플의 모서리), 그러나 이 목적을 위해 기본 기준점은 괜찮습니다.
7. 다음 화살표를 누르고 마법사의 다음 부분으로 이동합니다.
8. 원하는 대로 목표를 변경하여 샘플에 적합한 해상도를 확인합니다. 이 경우, 50X 객관적렌즈는 샘플내의 세포를 시각화하는 데 사용된다. 50X는 샘플에 가장 가까운 렌즈이므로 점차 50X 목표까지 이동하여 20X 렌즈 이후 작업 거리를 줄일 수 있는 공간이 남아 있습니다.
9. "범위 정의 측정" 페이지에서 Z 위치를 약간 이동(미세 조정을 위해 조작기의 측면 단추를 클릭)만 샘플의 맨 위에 초점을 맞추고 "마지막 설정"을 클릭합니다. 그런 다음 샘플의 맨 아래에만 초점을 맞출 때까지 Z 방향으로 스테이지(아래쪽)로 이동하여 "먼저 설정"을 누릅니다. 계산된 조각 수가 1000을 초과하지 않거나 프로그램이 실패하는지 확인합니다.
10. 빛의 강도가 이미지의 과포화(빨간색 픽셀 원인)를 과포화하지 않는지 확인한 다음 수행된 적중을 확인합니다. 이렇게 하면 단층 촬영 이미지가 있고 단층 촬영 소프트웨어를 엽니다.
11. 단층 촬영 소프트웨어에서는 스터디 탭과 같은 탭을 열어 3D로 데이터를 보고 2D 또는 3D 공간에서 측정합니다.

2. 디지털 광학 현미경 이미징

1. 샘플을 스테이지에 로드합니다. 렌즈 아래에 있는 샘플을 중심으로 합니다. 샘플 무게는 스테이지의 중량 제한을 초과해서는 안되며, 이 경우 4kg입니다. 샘플은 12cm 이하여야 합니다.
2. 이미징 소프트웨어를 엽니다.
3. 제공된 템플릿 목록에서 작업을 선택합니다. 또한 직업 밖에서 샘플을 공부할 수 있는 무료 시험을 눌러 작업 외부에서 작업할 수도 있습니다.
4. 전체 스테이지를 보여 주는 개요 이미지를 획득합니다. 이것은 나중에 볼 샘플의 일부를 표시하는 맵으로 사용할 것입니다. 이미지를 수집하는 동안 컨트롤러를 사용하여 초점과 이미지 위치를 변경합니다.
5. 좌표 계를 배치합니다. 기본 좌표 시스템은 스테이지의 왼쪽 모서리에서 이며이 응용 프로그램에 대 한 괜찮습니다. 샘플이 비뚤어진 경우 여기에서 좌표를 조정할 수 있습니다.
6. 샘플과 작업의 이름을 지정하면 다른 사용자가 다시 작업으로 돌아갈 수 있도록 작업 목록에 추가됩니다.
7. 획득에서 카메라 버튼을 선택합니다. 초기 이미지를 촬영한 다음 샘플을 탐색할 때 라이브 버튼을 누릅니다.
8. 샘플이 명확하게 초점을 맞출 때까지 포커스를 아래로 이동합니다. 조명 및 조리개 탭 에서 조명을 조정해야 할 수도 있습니다.
9. 이미지 최적화 패널 아래의 도구로 이미지를 최적화합니다. 이미지가 원하는 바삭함을 가지기 전까지는 렌즈의 기울기, 샘플의 조명 레벨, 밝기 및 대비와 같은 이미지 향상 탭 아래에 다양한 매개 변수로 재생할 수 있습니다.
10. 소프트웨어의 연필 도구를 눌러 측정을 수행합니다. 거기에서 거리, 각도 및 영역을 포함한 여러 측정 도구에 액세스할 수 있습니다. 거리 및 영역 도구를 사용하여 샘플크기를 측정합니다.
11. 결과 워크플로 탭으로 이동하여 워크플로 레이아웃을 확인하여 보고서 레이아웃을 구성합니다.
12. 저장 버튼을 탭하여 다른 사용자가 동일한 워크플로를 사용할 수 있도록 작업을 저장합니다.

다음 이미지는 공초점 현미경을 사용하여 마우스 뇌의 얻을 수있는 결과의 개요를 제공합니다. 그들은 정보의 다양한 수준을 얻을 수있는 방법과 결과의 지형지도가 샘플의 높이를 보여주는 방법을 보여줍니다.

그림 5: 50X 배율에서 공초점 이미지는 절개 마우스 뇌를 보여 주어. 왼쪽의 이미지는 단층 촬영 중에 모든 초점 평면을 가져와 고해상도와 깊이 초점을 맞춘 이미지를 만드는 합성 이미지입니다. 오른쪽 이미지는 샘플의 지형맵을 보여줍니다.

그림 6: 공초점 현미경의 3D 응용 프로그램의 더 나은 대표적인 예로, 플라스틱의 구멍을 이미지화하고 분석했다. 원래 지형지도는 왼쪽에 있고 3D 재구성은 오른쪽에 있습니다.

그림 7: 3D 재구성에서 프로파일을 관찰하기 위한 ConfoMap 소프트웨어 분석의 정도를 보여 주어 있습니다. 진폭 파라미터, 거칠기 프로파일, 곡선 특성화가 표시됩니다.

다음 이미지는 동일한 마우스 뇌 슬라이스에 디지털 광학 현미경을 사용하여 얻을 수있는 결과의 개요를 제공합니다. 디지털 현미경은 더 큰 구성 요소 또는 생물학적 구조를 보는 데 이상적인 공초점 현미경에서 더 큰 시야하지만 낮은 해상도 의 이미지를 제공합니다. 이 소프트웨어는 샘플을 측정하기위한 유용한 분석 도구가 있습니다.

그림 8: 전체 장기 슬라이스를 보여주는 개요 이미지입니다.

그림 9: 절개 마우스 뇌의 이미지를 확대. 다음은 혼합 동축 및 링 조명뿐만 아니라 전자 이미지 안정화로 얻은 300 미크로른 시야입니다.

그림 10: 디지털 광학 현미경의 측정 기능을 시연합니다. 샘플의 직경은 왼쪽에 측정되고, 절개된 마우스 뇌의 내부 영역을 계산하는 데 사용되는 사용자 정의 윤곽선이 오른쪽에 나타난다. 이러한 도구는 미리 정의된 셰이프와 동일한 모서리가 없을 수 있는 생물학적 샘플을 분석할 때 유용합니다.

이 데모에서는 생체 샘플을 보기 위해 초점 심도, 시야 및 최대 해상도 및 광학 및 공초점 현미경의 배율에 최적화되었습니다. 이 데모는 참가자가 특정 응용 분야에 가장 적합한 현미경 모듈을 결정하는 데 도움이 되도록 설계되었습니다. 현미경 검사법의 두 가지 모드는 제제의 용이성과 고해상도 복합 이미지의 용이성을 위해 생물학적 샘플을 분석하는 장점이 있습니다.

광학 및 공초점 현미경 검사법에 대한 응용 프로그램은 광범위합니다. 제한된 샘플 준비와 동작 평면을 통합하고 샘플 위의 조명 기술을 사용하는 기능 으로 인해 이러한 도구는 대부분의 데이터 세트에서 정보를 얻을 수 있습니다. 현미경 검사는 형광으로 취급된 것과 같은 살아있는 세포를 화상 진찰할 때 아주 대중적인 선택권이었습니다, 그러나 응용은 바디에 이식하기 전에 결점 및 거칠기를 검출하는 생물 의학 장치의 화상 진상 표면에서 구역수색할 수 있습니다. 공초점 및 광학 현미경 검사는 화상 진찰 생물학 견본을 위한 현재 표준입니다.

마지막으로, 공초점 현미경 검사는 형광 기술로 향상된 화상 진찰을 제공합니다. 샘플의 형광은 수명이 제한되어 있으며 높은 양의 빛에 노출되면 사진 표백을 할 수 있습니다. 전통적인 빛 현미경 검사에서, 전체 견본은 빠른 사진 표백결과로 화상 진찰 도중 조명됩니다. 그러나, 시료의 극히 일부만 공초점 현미경검사법으로 한 번에 조명되기 때문에, 불소포의 수명은 더 길고 사진 표백과 관련된 도전이 적습니다.