הדמיה דגימות ביולוגיות עם מיקרוסקופיה אופטית וקונפוקל

מיקרוסקופים אופטיים פועלים באמצעות לפחות שני אלמנטים של הגדלה. העדשה הראשית, הנקראת המטרה, קובעת את ההגדלה הכוללת, והעדשה המשנית, הנקראת העין, ממקדת את התמונה הווירטואלית לצפייה. ההגדלה הכוללת נקבעת על ידי הכפלת ההגדלות של שתי העדשות. מיקוד האור דרך מקורות אלה, יחד עם מיקוד האור מהמנורה אל המדגם, נותנים מישור מסוים של מיקוד שבו ההגדלה ואור המנורה נפגשים כולם באותה נקודה, המעניקה את הרזולוציה הטובה ביותר בתמונה. הדמות שלהלן מדגימה כיצד מישור המוקד של הדגימה נוצר דרך העדשות השונות. לחפצים מחוץ למישור המוקד יהיו קרני אור המפריעות מחלקים אחרים של הדגימה בשל שטח התאורה הגדול יותר. פעולה זו גורמת לטשטוש בתמונה. לכן, כדי להתמקד במיקומי z שונים של מדגם עם גבהים שונים במידה רבה, פרוסות כיוון z חייבות להיות מועברות לתוך מישור המוקד.

איור 1. עדשות מיקרוסקופיה אופטיות ומישורי מוקד.

מיקרוסקופים דיגיטליים פועלים על אותו עיקרון כמו מיקרוסקופים אופטיים, אלא שהם אינם מסתמכים על עין. זה מיקרוסקופ אופטי המצויד במצלמה דיגיטלית. המצלמה הדיגיטלית פועלת כגלאי, ותמונות מוצגות על צג מחשב. מיקרוסקופים אלה אידיאליים לניתוח ותיעוד של דגימות במהלך מחקר ופיתוח (מו"פ), ייצור ובדיקה, בקרת איכות וביטחון (QC/QA), כמו גם ניתוח כשלים (FA). הם בדרך כלל מציעים תוכנה המאפשרת למשתמשים לנתח את התמונה לדוגמה. איור 2 מציג הגדרת מיקרוסקופ דיגיטלי טיפוסית.

איור 2. המרכיבים העיקריים של מיקרוסקופ דיגיטלי.

המרכיבים העיקריים של המערכת הם:

1. מנוע אופטי: מכיל את חיישן רכישת התמונה ואת העדשות להגדלה בתמונה.
2. מטרה: רוכש וממקד את האור מהדגימה. שלוש מטרות שונות זמינות עבור משימות שונות לרכישת תמונות.
3. שלב הסריקה: מיקום המיקום שבו יש למקם את הדגימה.
4. מעמד מיקרוסקופ: מספק את התמיכה עבור המנוע האופטי ושלב הסריקה. שולט גם בתקשורת בין הרכיבים המצורפים לבין המחשב.
5. מחשב: תומך בתוכנת משתמש ומאפשר הצגה של תמונות בצג.
6. בקר: שולט במיקרוסקופ ובזרימת העבודה באמצעות מחוות מרובות מגע וסמלים רגישים להקשר. ידיות הבקרה שולטות במיקום תמונת הזום, המוקד והמיקרוסקופ.

מיקרוסקופ קונפוקלי, או מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי (CLSM), הוא מיקרוסקופ עם רזולוציה אופטית מוגברת וניגודיות. קונפוקל פירושו "בעל אותו המיקוד". האובייקט ודמותו הם "קונפוקליים".

איור 3. טשטוש והשפעתה על תמונה. התמונה השמאלית מציגה תמונת מיקוד עם קצוות מטושטשים. התמונה הנכונה מדגימה את נתיב האור דרך העדשה בעת הדמיה של דגימה שנמצאת במוקד.

בניגוד למיקרוסקופי אור כלליים המאירים ומציתים את המדגם כולו בתצוגה, מיקרוסקופים קונפוקליים משתמשים בחור סיכה בין שלב הדגימה לגלאי, כך שרק קרן אור קטנה יותר ממוקדת ברמת עומק צרה אחת בכל פעם. לפיכך, האזור הגלוי היחיד של המדגם הוא נקודת המוקד. המיקרוסקופ הקונפוקל אז רסטר סורק את פני השטח של המדגם עם זה הרבה יותר ממוקד של אור (או לייזר). לאחר מכן הנתונים מורכבים לתמונה 2D אחת עם רזולוציה טובה יותר מאשר מיקרוסקופיה אופטית קלאסית. כמו כן, מכיוון שהאור מתמקד בטווח גבהים צר מאוד, המשתמש יכול לשים מישורים שונים בפוקוס כאשר כיוון Z מועבר. באמצעות טכניקות עיבוד תמונה ומיקרוסקופים קונפוקליים של תוכנות אוטומציה מסייעים בשחזור תלת-ממדי של תמונות מרוכבים ממוקדות מרובות מישורים.

למיקרוסקופים קונפוקליים יש את היכולת באמצעות עיבוד תמונה לתת נתוני כיוון Z על מדגם שבעבר לא היה זמין במיקרוסקופיה אופטית. לדוגמה, בהדגמה המתוארת להלן, המשתמש יכול להגדיר את הטווחים העליונים והתחתונים של המוקד עבור מדגם, ולאחר מכן לא רק לפתח מפת חום המציגה מדידות של כיוון z, אלא גם ליצור תמונה מורכבת המציגה את כל חלקי התמונה במוקד. תכונות אלה שימושיות במיוחד בעת קבלת נתונים תלת-ממדיים אודות דוגמה.

איור 4. המרכיבים העיקריים של מיקרוסקופ קונפוקלי.

המרכיבים העיקריים של המיקרוסקופ הקונפוקלי כוללים:

1. סרוק את הראש עם כונן Z משובח ומצלמת 4 מגה פיקסל, עומד עם כונן Z גס
2. מטרות: 2.5x / 5x / 10x / 20x / 50x / 100x
3. שלבים: שלב סריקה ושלב קבוע
4. מערכת מחשב: תוכנת הדמיית מערכת מחשב
5. בקר: x, Y, תנועת z

1. הדמיה קונפוקלית

1. טען את הדגימה על הבמה. מרכז אותו מתחת לעדשה. זה לא יעלה על מגבלת המשקל של השלב, אשר במקרה זה הוא 5 ק"ג. המדגם לא צריך להיות יותר מ 100 מ"מ עובי.
2. פתח את תוכנת ההדמיה ובחר "צור משימה".
3. תחת העמודה טופוגרפיות, בחר בלחצן המסייע.
4. צור תמונת מבט כוללת בהגדלה הנמוכה ביותר, פי 2.5. לפני החלפת ההגדלות, ודא שהדגימה נמצאת במוקד על-ידי שינוי מיקום Z עד שתראה תמונה ברורה. זה יכול להיעשות על ידי דחיפה למטה או משיכה על מניפולטור מיקרוסקופ 3D. תנועת Z עדינה יותר מושגת על-ידי עיסוק בכפתור בצד, מה שגורם לאור כחול סביב הקצוות.
5. הגדל לאט את הגדלת העדשה, משחק ברציפות עם עוצמת האור ואת המוקד עד שאתה בהגדלה הרצויה. אם תרצה, בחר אזור עניין אחר על-ידי הזזת הבמה בכיווני x ו- y באמצעות המניפולטור.
6. לאחר שתמונת מבט כולל נלקחת בהגדלה הנמוכה, לחץ על הלחצן הבא כדי להמשיך לשלב נקודת ההתייחסות. אם תרצה, ציין נקודת התייחסות מסוימת לצורך מדידה (כלומר, פינת המדגם), אם כי לשם כך נקודת ההתייחסות המוגדרת כברירת מחדל היא בסדר.
7. הקש על החץ הבא כדי להמשיך לחלק הבא של האשף.
8. שנה את המטרה כרצונך כדי לראות פתרון המתאים לדגימה שלך. במקרה זה, העדשה האובייקטיבית 50X משמשת להדמיה של התאים במדגם. ה- 50X היא העדשה הקרובה ביותר לדגימה, ולכן עברו בהדרגה ליעד 50X המבטיחים שעדיין יש מקום להקטין את מרחק העבודה לאחר עדשת 20X.
9. בדף "הגדרת טווח מדידה", הזז מעט את מיקום Z (לחיצה על לחצן הצד במניפולטור להתאמות עדינות) כך שרק החלק העליון של המדגם נמצא בפוקוס ולחץ על "הגדר אחרון". לאחר מכן הזז את השלב בכיוון Z (כלפי מטה) עד שרק החלק התחתון של המדגם נמצא במוקד ולחץ על "קבע ראשון". ודא שמספר הפרוסות המחושב אינו עולה על 1000 או שהתוכנית תיכשל.
10. ודא שעוצמת האור אינה רוויה יתר על המידה (לגרום לפיקסלים אדומים) בתמונה בכל אחת מההקלות ולאחר מכן תבוצע. פעולה זו תיקח את תמונת הטומוגרפיה ותפתח את תוכנת הטומוגרפיה.
11. בתוכנת טומוגרפיה, פתח כרטיסיות כגון הכרטיסיה Studies כדי להציג את הנתונים בתלת-ממד ולנקוט מדידות בשטח 2D או תלת-ממדי.

2. הדמיית מיקרוסקופ אופטי דיגיטלי

1. טען את הדגימה על הבמה. מרכז את הדגימה מתחת לעדשה. משקל המדגם לא יעלה על מגבלת המשקל של השלב, אשר במקרה זה הוא 4 ק"ג. המדגם צריך להיות לא יותר מ 12 ס"מ.
2. פתח את תוכנת ההדמיה.
3. בחר משימה מרשימת התבניות שסופקו. אפשר גם לעבוד מחוץ לעבודה על ידי לחיצה על בדיקה חופשית, המאפשרת לך ללמוד מדגם מחוץ לעבודה.
4. השג תמונת מבט כולל המציגה את כל הבמה. פעולה זו תשמש כמפה בהמשך כדי להציג את החלק של המדגם הנצפה. בעת רכישת התמונה, השתמש בבקר כדי לשנות את המוקד ואת מיקום התמונה.
5. מקם מערכת קואורדינטות. מערכת הקואורדינטות המוגדרת כברירת מחדל היא מהפינה האחורית-שמאלית של הבמה והיא בסדר עבור יישום זה. אם המדגם עקום, אתה יכול להתאים את הקואורדינטות כאן.
6. תן שם לדוגמה ולמשימה, פעולה זו מוסיפה אותה לרשימת המשימות כך שמשתמשים אחרים יוכלו לחזור אליה.
7. בחר בלחצן המצלמה תחת רכוש. קח תמונה ראשונית ולאחר מכן לחץ על לחצן חי בעת ניווט בדוגמה.
8. הזז את המוקד כלפי מטה עד שהדגימה נמצאת בבירור במוקד. ייתכן שיהיה צורך גם להתאים את התאורה תחת לשונית תאורה וצמצם".
9. מטב את התמונה בעזרת הכלים מתחת לחלוני 'מיטוב תמונה'. ניתן לשחק עם פרמטרים שונים תחת הכרטיסיה 'שיפורי תמונה', כגון הטיית העדשה, רמות התאורה במדגם, הבהירות וניגודיות, עד שהתמונה תקבל את החדות הרצויה.
10. בצע מדידות על-ידי הקשה על הכלי Pencil בתוכנה. משם, יש לך גישה למספר כלי מדידה, כולל מרחקים, זוויות ואזור. השתמש בכלי המרחק והאזור כדי למדוד את גודל המדגם.
11. עבור לכרטיסיה זרימת עבודה של תוצאות ובדוק את פריסת זרימת העבודה כדי לקבוע את תצורת הפריסה של הדוח
12. הקש על לחצן השמירה כדי לשמור את המשימה שלך כדי שאחרים יוכלו להשתמש באותה זרימת עבודה.

התמונות הבאות נותנות סקירה כללית של תוצאות שניתן להשיג של מוח עכבר באמצעות מיקרוסקופ קונפוקל. הם מראים כיצד ניתן להשיג רמות שונות של מידע וכיצד מפה טופוגרפית של התוצאות חושפת את גובה המדגם.

איור 5: תמונות קונפוקליות בהגדלה של פי 50 המציגות מוח עכבר בחתך. התמונה משמאל היא תמונה מורכבת שלוקחת את כל המישורים בפוקוס במהלך טומוגרפיה ויוצרת תמונה אחת ברזולוציה גבוהה וממוקדת עמוקות. התמונה מימין מציגה את המפה הטופוגרפית של המדגם.

איור 6: כדוגמה מייצגת טובה יותר ליישומי תלת-ממד של המיקרוסקופ הקונפוקל, התמונה ונותחה חור בפלסטיק. המפה הטופוגרפית המקורית נמצאת משמאל ושחזור תלת-ממד נמצא מימין.

איור 7: מציג את היקף ניתוח התוכנה של ConfoMap לצפייה בפרופיל משחזור תלת-ממדי. הפרמטרים משרעת, פרופיל חספוס, אפיון עקום מוצגים.

התמונות הבאות נותנות סקירה כללית של תוצאות שניתן להשיג משימוש במיקרוסקופ אופטי דיגיטלי על אותה פרוסת מוח עכבר. המיקרוסקופ הדיגיטלי מעניק שדה ראייה גדול יותר אך תמונות ברזולוציה נמוכה יותר מהמיקרוסקופ הקונפוקלי, שהוא אידיאלי להסתכל על רכיבים גדולים יותר או מבנים ביולוגיים. התוכנה כוללת כלי ניתוח שימושיים למדידת המדגם.

איור 8: תמונת סקירה המציגה פרוסת איבר שלמה.

איור 9: הגדלה בתמונה של מוח עכבר בחתך. הנה שדה ראייה של 300 מיקרון המתקבל עם תאורת קואקסיאלי וטבעת מעורבת, כמו גם ייצוב תמונה אלקטרוני.

איור 10: הדגמת יכולות המדידה של המיקרוסקופ האופטי הדיגיטלי. קוטר המדגם נמדד בצד שמאל, וחלוקה לרמות המוגדרת על-ידי המשתמש המשמשת לחישוב האזור הפנימי של מוח העכבר החלקי מוצגת בצד ימין. כלים אלה שימושיים בעת ניתוח דגימות ביולוגיות, שייתכן שאין להן קצוות זהים לצורות מוגדרות מראש.

בהדגמה זו, עומק המיקוד, שדה הראייה והרזולוציה המקסימלית וההגדלה של מיקרוסקופים אופטיים וקונפוקלים היו מותאמים לצפייה בדגימות ביולוגיות. הדגמה זו נועדה לעזור למשתתף להחליט איזה מודול מיקרוסקופיה הוא הטוב ביותר עבור יישום מסוים. לשני מצבי המיקרוסקופיה יש יתרונות בניתוח דגימות ביולוגיות על קלות ההכנה שלהם ותמונות מרוכבים ברזולוציה גבוהה.

היישומים למיקרוסקופיה אופטית וקונפוקל הם מרחיקי לכת. בשל ההכנה המדגם המוגבלת והיכולת לשלב מישורי תנועה ולהשתמש בטכניקות אור מעל לדגימה, כלים אלה מסוגלים להשיג מידע מרוב ערכות הנתונים. מיקרוסקופיה הייתה אפשרות פופולרית מאוד כאשר הדמיית תאים חיים, כגון אלה שטופלו בפלואורסצנטיות, אך היישומים יכולים לנוע בין משטחי הדמיה של מכשירים ביו-רפואיים לגילוי פגמים וחספוס לפני השתלתם בגוף. מיקרוסקופיה קונפוקלית ואופטית הם הסטנדרט הנוכחי עבור דגימות ביולוגיות הדמיה.

לבסוף, מיקרוסקופיה קונפוקלית מציעה הדמיה משופרת עם טכניקות פלואורסצנטיות. פלואורופורים במדגם יש חיים מוגבלים והוא יכול תמונה אקונומיקה כאשר נחשף כמויות גבוהות של אור. במיקרוסקופיה אור מסורתית, המדגם כולו מואר במהלך הדמיה, אשר גורמת להלבנה מהירה של תמונות. עם זאת, מאז רק חלק זעיר של המדגם מואר בבת אחת עם מיקרוסקופיה קונפוקלית, החיים של פלואורופור הוא ארוך יותר ויש פחות אתגרים הקשורים להלבנה תמונה.