抗体生成:ハイブリドーマを用いたモノクローナル抗体の産生

Immunology

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Concepts

ソース: フランシス V. シャアスタッド1,2, ホイットニー・スワンソン2,3,トーマス・S・グリフィス1,2,3,4
1ミネソタ大学、ミネアポリス、MN 55455
2ミネソタ大学免疫学センター,ミネアポリス,MN 55455
3ミネソタ大学泌尿器科,ミネアポリス,MN 55455
4ミネソタ大学、ミネアポリス、MN 55455

ポリクローナル抗体は、抗原または複数の抗原の異なる抗原決定基に対して向けられた抗体のコレクションとして定義される(1)。ポリクローナル抗体は生体分子を同定するための強力なツールですが、1つの重要な制限があります - 抗原決定基を共有する抗原を区別することができません。例えば、ウシ血清アルブミンを使用して動物を免疫する場合、異なる表面Igを持つB細胞は、ウシ血清アルブミン上の異なる抗原決定要因に応答する。その結果、抗血清中の抗体の混合物が得られます。ウシ血清アルブミンは、タンパク質の進化的に保存された領域でヒト血清アルブミンといくつかのエピトープを共有するので、この抗ウシ血清アルブミン抗血清もヒト血清アルブミンと反応します。したがって、この抗血清は、ウシとヒト血清アルブミンを区別するのに有用ではないであろう。

ポリクローナル抗セラの特異性の問題を克服するためにいくつかのアプローチが取られています。1つは、固定化抗原のクロマトグラフィーカラムを通して抗血清を通過させることによって不要な抗体を吸収することである(2)。この方法は退屈であり、しばしば不要な抗体を完全に除去することができません。別のアプローチは、個々の抗体産生B細胞を単離し、培養中にそれらを拡大することです。しかし、ほとんどの正常な未形質細胞と同様に、B細胞は長期培養では生存しない。

培養中に生き残るB細胞の不能を克服するために、1つのアプローチは骨髄腫-B細胞ハイブリドーマを調製することである。1847年、ヘンリー・ベンス・ジョーンズは、リンパ球腫瘍である多発性骨髄腫患者が大量の抗体を産生することを発見しました(3)。これらの患者のB細胞は悪性になり、制御不能に成長している。悪性B細胞は単一のクローンに由来するので、それらは同一であり、単一のタイプの抗体(すなわち、モノクローナル抗体、またはmAb)のみを産生する。しかし、これらの骨髄腫細胞のほとんどは、未知の特異性の抗体を産生する。1975年、骨髄腫細胞をB細胞に融合することにより、セザール・ミルシュタインとジョージ・コーラーは、インビトロで無期限に培養し、既知の抗原特異性のモノクローナル抗体を無制限に産生できるハイブリドーマの産生に成功しました(4)。彼らのアプローチの背後にある根拠は、骨髄腫細胞の不滅の特性とB細胞の産生特性を組み合わせることである。彼らの技術は抗体産生に革命を起こさせ、モノクローナル抗体を用いた生体分子の同定と精製のための強力な手段を提供する。

一般に、モノクローナル抗体を調製するには数ヶ月を要する。一般的な手順には、次の手順が含まれます。

  1. 抗体電化剤の免疫とスクリーニング
  2. 抗体産生B細胞と骨髄腫細胞の融合
  3. ハイブリドーマの選択的増殖
  4. 所望のモノクローナル抗体を産生するためのハイブリドーマのスクリーニング
  5. 希釈を制限することによりクローニング - 細胞が統計的に1未満の細胞を96ウェルプレートのウェルに追加することを可能にするために濃度に希釈されるプロセス。いくつかの井戸は0セルで終わり、いくつかは1セルを持つことになります。1細胞で播種された井戸は、最終的に細胞のモノクローナル集団に成長します。
  6. ハイブリドーマの増殖とモノクローナル抗体の調製

このプロトコルは、ハイブリドーマの成長およびモノクローナル抗体の調製の最後のステップに焦点を当てています。抗体は、硫酸アンモニウム沈殿(しばしば塩漬けと呼ばれる)によって培養上清から精製される- 溶液からタンパク質を除去する一般的に使用される方法である。溶液中のタンパク質は、水素結合を形成し、他の親水性相互作用と共に、露出した極性およびイオン基を通る水と共に形成する。小さく、高荷電性の高いイオン(アンモニウムや硫酸塩など)を添加すると、これらの基は、水に結合するためのタンパク質と競合します。これは、タンパク質から水分子を除去し、その溶解性を減少させ、タンパク質の沈殿をもたらす。

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JoVE Science Education Database. 免疫 学. 抗体生成:ハイブリドーマを用いたモノクローナル抗体の産生. JoVE, Cambridge, MA, (2020).

Procedure

注:無菌細胞培養技術は、抗体精製工程まで(例えば、バイオセーフティキャビネット内)無菌方法でハイブリドーマ細胞および培方を取り扱う場合に維持されるべきである。

1. 凍結ハイブリドーマ細胞の解凍

  1. 凍結したハイブリドーマ細胞を含むバイアルを37°Cの水浴で解凍するまでインキュベートします(約2分)。
  2. 完全なRPMIの10 mLを含む15 mL円錐管に解凍細胞を加える(RPMIは10%の胎児牛血清、100 U/mLペニシリン、100 μg/mLストレプトマイシン、1M mMピルビン酸ナトリウム、1x非必須アミノ酸、50μM 2-Mercapeを補充した)。
  3. 1200 RPMで5分間遠心分離機を使用して、汚染された凍結媒体を洗い流します。
  4. 遠心分離後、液体上清を廃棄し、5mLフレッシュコンプリートRPMIで細胞ペレットを再懸濁する。次いで、15mL完全RPMIを含むT75組織培養フラスコに細胞を添加する(RPMIの最終体積は20mLである)。
  5. 5%CO2で37°Cで標準的なインキュベーターで細胞を成長させます。培養中の細胞は非付着性である。

2. ハイブリドーマ拡張

  1. フラスコが~80%コンフルエントになるまで、約3日間細胞を膨張させます。
    注:この時間は、細胞の開始数と、異なる細胞の増殖速度の固有の違いに基づいて異なる場合があります。細胞が指数関数的な成長段階にあることは重要です。
  2. 最初のフラスコが約80%の合流に達したら、この最初のT75フラスコから細胞を取り出し、円錐遠心管に入れ、細胞をペレットにスピン(5分間1200 RPM)する。
  3. 完全なRPMIの6 mLで細胞を再懸濁し、次いで3つの新しいT75フラスコ(18 mL RPMIを含む2 mL/フラスコ)に細胞懸濁液を分配する。これら3つのT75フラスコを37°Cで37°Cでインキュベートし、5%CO2で約80%のコンフルエントになるまでインキュベートします(これは約3日かかります)。

3. 無血液中の抗体産生

注:この時点で、細胞は、ハイブリドーマ細胞株の増殖のために設計された無血清培地で成長を継続する準備ができています。このプロトコルでは、HB101サプリメント製品を含む市販のHB Basal液体媒体を使用しています。

  1. 3つのT75フラスコ(約80%合流)のそれぞれからの細胞を収集し、遠心分離(5分間1200 RPM)を行います。
  2. 各T75フラスコからの細胞ペレットを10mL補充HB101無血清培地に再懸濁し、次いでHB101無血清を補充した2つのT225フラスコに添加した(すなわち、各フラスコに~220-240 mL HB101を含む6つのフラスコのそれぞれに5mL細胞懸濁液)。
  3. T225フラスコおよびHB101培養中の細胞を37°Cで37°Cで5%CO2で3週間、または細胞が死に始めるまで増殖し続ける。細胞は、これらの3週間の間にmAbを産生し、培養培地に分泌している。細胞が死に始めると、彼らはもはやmAbを産生していません。

4. 抗体精製 - 1日目

注:この時点で、無菌性を維持する必要はないので、無菌的な方法でメディアを取り扱う(例えば、バイオセーフティキャビネット内)必要はない。さらに、ハイブリドーマは「BSL2レベル」の薬剤とは見なされない。

  1. フラスコから固定角度ローター用のチューブにメディアを注ぎます。10,000 RPMで固定角度ローターで遠心分離機でチューブを8分間回転させます。このステップは、培養上清から細胞破片を除去するように設計されている。
    注:チューブのサイズは、使用するローターによって異なります。覚えておくべき重要なことは、遠心分離の前にローターが適切にバランスをとっていることを確認するために、チューブ内で同じボリュームを持つことです。メディアのボリューム全体が一度に遠心分離機に収まらない可能性があります。残りのメディアは、後で同じチューブを使用して遠心分離されます(ステップ4.5)。
  2. 氷に囲まれたバケツに攪拌バー付きの2Lプラスチックビーカーを準備します。かき混ぜるプレートの上に置きます。
  3. 1Lボトルに500mLフィルタートップを取り付けます。適切なチューブを介して真空にボトルトップフィルターユニットを取り付けます。
  4. ステップ4.1(まだハイブリドーマ細胞によって産生されるmAbを含む)から上清をフィルタートップに注ぎます。
  5. メディアからセルデブリをペレットするために同じチューブセットを使用し続けます(ペレットは構築し続けます)。フィルタートップがいっぱいになり、上清の別のバッチが注ぐ準備ができるまで、真空を実行するのを待ちます。フィルターを乾かしたり、フィルタリングが非常に遅くなることをしないでください。
  6. 1Lボトルが満杯に近づいたら、フィルタートップを取り外し、ステップ4.2で調製した2Lビーカーに上清を注ぎます。フィルタトップを再接続します。ボリュームを追跡します。
  7. すべてのメディアが処理されるまで、遠心分離とろ過の手順を繰り返します。
  8. 濾過された上清を1L当たり硫酸アンモニウム295gを測定する。攪拌しながら、次の数時間(15分ごとに〜25g)にわたって上清に硫酸アンモニウムをゆっくりと加え、望ましくないタンパク質を沈殿させる可能性のある高濃度の硫酸アンモニウム塩を防ぎます。
  9. 硫酸アンモニウムをすべて加えたら、ビーカーをホイルで覆い、攪拌プレートで4°C(例えば、ウォークイン冷蔵庫または冷蔵庫)に移動します。一晩かき混ぜる。溶液の一定の撹拌は、塩を可溶化するために必要であるが、長時間の撹拌は、表面/空気界面で溶液中のタンパク質の変性につながることができます。
  10. 固定角度ローターを使用してチューブを洗浄します。

5. 抗体精製 - 2日目

  1. 2Lビーカーから上清を含む硫酸アンモニウムをチューブに注ぎ、固定角度ローターを使用します。ブレーキなしで20分間6500 RPMの固定角度ローターで遠心分離機で回転します。
  2. 真空は上清を吸引し、ペレットが柔らかくなるように吸い上げないように注意してください。同じチューブセットを使用して、上清を含む硫酸アンモニウムからペレットを収集し続けます。
  3. 最後の吸引の後、各ペレット(抗体を含む)を~1 mlのPBSで再中断する。
  4. 大量のPBSに対する透析により、沈殿したmAb溶液から硫酸アンモニウムを除去する。これを行うには、まずmAb溶液の各mLについて約1インチの透析チューブ(例えば、Membra-Cel MD25-14 MWCO 12,000-14,000ダルトンカットオフセルロース透析チューブ)を切断します。dH2O. チューブの一方の端に結び目を結び、dH2O で塗りつぶして、ノットが漏れていないことを確認します。チューブから空のdH2O。
  5. チューブにピペットPBS/抗体溶液。チューブを追加の0.25 ml PBSですすいで、チューブに移します。
  6. オレンジ色の透析クリップで、チューブの上部を可能な限り溶液の近くに固定します。
  7. チューブの上部を4Lビーカーの外側の上部にテープで留めします。チューブの充填部分をビーカーに掛けます。ビーカーにPBSを充填し、攪拌バーを追加します。
  8. 4°Cで約8時間かき混ぜる。
  9. ビーカー内のPBSを新鮮なPBSに交換し、さらに2回約8時間かき混ぜます。
  10. 抗体をチューブから15mlまたは50mlの円錐管に移します。1200 RPMで5分間遠心分離機を形成した可能性のある沈殿物を除去する。上清を新鮮なチューブに移します。
  11. 抗体1:20のアリコートをPBS(5 μl抗体+95 μl PBS)で希釈する。280 nmで分光光度計(PBSでブランク)で抗体濃度を定量します。消滅係数 (ε) 1.43 を使用します。濃度は次のように計算されます。

  12. 抗体をスクリューキャップバイアルにアリコートし、-80°Cで保存します。

抗体は研究と診断のための強力なツールであり、多くの場合、大量に生産する必要があります。

抗体を生成する最初のステップは、目的の抗原を宿主動物に注入することです。抗原は宿主のB細胞を活性化し、その抗原に特異的な抗体を産生し放出する。そして、標的抗体の存在に対する宿主動物の抗セラの定期的なスクリーニングが行われ、ELISAまたは別の検出方法を用いて行われる。検出されると、B細胞を含む宿主動物の脾臓が除去される。脾臓からのすべてのB細胞が分離された場合、これは目的の抗原に抗体を分泌している集団を含むべきである。この集団は、各細胞が抗原の異なるエピトープに結合する可能性が高いため、独自の個体およびユニークな抗体を生成するため、ポリクローナルと呼ばれる。

モノクローナル抗体を生成するには、1つの特異的エピトープを認識するために挙げられた抗体を、所望の抗体を産生する個々のB細胞を最初に単離して培養しなければならない。残念ながら、B細胞は培養において十分に生き残れない。そこで、このハードルを克服するために、科学者はB細胞と不滅の骨髄腫細胞を融合させ、ハイブリドーマを生み出します。これらの細胞は、ハイブリドーマのみが抗体を増殖および放出することを可能にする選択的培地で増殖する。ここでも、培地は所望の抗体に対してELISAなどの方法を用いてスクリーニングされる。それが検出されると、ハイブリドーマは、親培養の連続希釈である希釈を制限するというプロセスを介してクローニングされ、単一細胞がスクリーニングプレートの井戸に播種されるはずです。これにより、単一の親細胞からのハイブリドーマの増殖が可能であり、所望の抗体のみを放出するモノクローナル細胞株が得られた。これらのモノクローナルラインは、組織培養フラスコ中に膨張し、大量のモノクローナル抗体を産生することができる。この後、細胞が死に始めると、抗体は硫酸アンモニウムを含む培地から沈殿させることができる。通常、溶液中では、抗体は親水性相互作用を介して水と相互作用する。しかし、アンモニウムと硫酸塩は、抗体から水分子を分離する高帯電イオンであり、抗体の溶解度を低下させ、沈殿させる原因となる。

まず、材料のリストを確認し、プロトコルのすべてのメディア、消耗品、および作業面を準備します。

次に、水風呂の電源を入れ、摂氏37度に設定します。次に、15 ミリリットルの円錐チューブに 10 ミリリットルの完全な RPMI を追加し、完全な RPMI を 15 ミリリットルの完全な RPMI を T75 細胞培養フラスコに追加し、それらを脇に置きます。注意を使用し、適切な個人用保護具を着用し、液体窒素貯蔵からハイブリドーマ細胞を含む凍結バイアルを除去する。バイアル内部の圧力を解放するには、キャップを少し緩めます。今、慎重に水浴中のバイアルをインキュベートし、キャップが汚染の可能性を最小限に抑えるために水面の上に残っていることを確認します。細胞がほぼ解凍されると、通常約2分かかりますが、バイアルを組織培養フードに移動させます。

次に、キャップを取り外す前に、70%のエタノールでバイアルの外側を拭きます。滅菌ピペットを使用して、完全なRPMI培地の10ミリリットルを含む円錐形のチューブに細胞を移します。次に、1200 RPMでチューブを5分間遠心分離します。遠心分離後、チューブをティッシュフードに戻し、エタノールでチューブの外側を拭きます。ペレットを邪魔することなく、上清を廃棄し、新鮮な完全なRPMI培地の5ミリリットルを追加し、ゆっくりと上下にピペットを再懸濁します。次に、細胞をT75細胞培養フラスコに移し、フラスコを5%の二酸化炭素インキュベーターの中に37°Cで入します。細胞が約80%の合流に達することを可能にし、通常は約3日かかります。ハイブリドーマ細胞は非付着性であり、培地中に懸濁して成長する。十分な合流に達するまでの時間は、生細胞の開始数および使用されるハイブリドーマ細胞のタイプに基づいて変化しうる。

細胞が十分に結合したら、無菌の25ミリリットルのピペットを使用して、培養フラスコから円錐遠心管に移します。1200 RPMで5分間遠心分離により細胞をペレットする。細胞が遠心分離機にある間、3つの新しいT75細胞培養フラスコのそれぞれに完全なRPMIの18ミリリットルを加え、これらを脇に置きます。遠心分離後、上清を取り出し、完全なRPMIの6ミリリットルで細胞ペレットを穏やかに再中断します。次に、3つの新しい細胞培養フラスコのそれぞれに2ミリリットルの細胞懸濁液を加える。最後に、フラスコを5%の二酸化炭素と37°Cに設定したインキュベーターに入れ、フラスコが約80%のコンフルエントになるまでインキュベートします(約3日間)。

この時点で、細胞は、HB101サプリメントを含有する市販のHB基底液体培地などのハイブリドーマ細胞株用に設計された無血清培地中で成長を継続する準備ができている。各細胞培養フラスコから円錐遠心管に細胞を移し、1200 RPMで遠心分離によって細胞を5分間ペレットします。さて、6つの225センチメートル平方細胞培養フラスコのそれぞれに230ミリリットルの補充されたHB101無血清培地を追加し、それらを脇に置きます。遠心分離が完了したら、上清を取り除き、補充されたHB101培地の10ミリリットルで各ペレットを再中断する。次に、各細胞培養フラスコに、細胞懸濁液の5ミリリットルを添加する。フラスコを5%の二酸化炭素インキュベーターに37°Cに入れ、約3週間細胞の成長を続けます。この間、細胞は目的とするモノクローナル抗体を培養培地に産生して放出し、細胞が死に始めると抗体は精製の準備が整います。

抗体含有培養培養培養剤から細胞破片を除去するには、培養フラスコの内容物を固定角度ローター用のチューブに注ぎます。チューブをローターに入れ、遠心分離の前に適切にバランスを取っていることを確認します。チューブを 10,000 RPM で 8 分間回転させます。サンプルが遠心分離している間、アイスバケツに攪拌棒を持つ2リットルのプラスチックビーカーを置き、その後、攪拌プレートにアイスバケツを置きます。

次に、500ミリリットルのフィルタートップを1リットルのボトルに取り付けます。適切なチューブを使用して、このボトルトップフィルターユニットを家の真空に取り付けます。次いで、抗体を含む上清をフィルタートップに注ぐ。残りの培電分を遠心分離して、細胞破片を抗体含有上清から分離する。フィルタートップが上清でいっぱいになったら、真空を始めます。その後、1リットルの回収ボトルが満杯に近づいたら、フィルタートップを取り外し、濾過した上清を氷の上2リットルビーカーに注ぎます。すべての上清が処理されるまでろ過手順を繰り返します。

すべてのサンプルが処理されると、濾過された上清の1リットル当たり295グラムの硫酸アンモニウムの重量を量る。攪拌プレートを開始し、ゆっくりと次の数時間にわたって上清に硫酸アンモニウムを追加します。これは、望ましくないタンパク質が沈殿する可能性のある硫酸アンモニウム塩の局所的な高濃度を防ぎます。硫酸アンモニウムをすべて加えたら、ビーカーをホイルで覆い、攪拌プレートと一緒に4°Cの冷たい部屋に移動し、抗体溶液を一晩かき混ぜるように設定します。

翌朝、2リットルビーカーから硫酸アンモニウム含有抗体溶液を固定角ローター用のクリーンチューブに注ぎます。チューブを6500 RPMで20分間遠心分離し、チューブの底部に抗体をペレットする。次に、真空は上清を吸引し、柔らかいペレットを吸引しないように注意を用く。同じチューブセットを使用して、硫酸アンモニウム含有上清の残りの部分からペレット抗体を回収し続けます。最後の吸引後、PBSの約1ミリリットルで各抗体ペレットを再中断する。

抗体溶液から硫酸アンモニウムを除去するには、まず抗体溶液の各ミリリットルに対して約1インチの透析チューブを切断する。次に、蒸留水でチューブを拭き、チューブの一方の端に結び目を結び付します。チューブに蒸留水を充填し、結び目からの漏れを確認します。数分後に漏れがない場合は、チューブから水を空にします。

次に、抗体溶液をチューブにピペットする。可能な限り多くの抗体を回収するには、PBSの追加の0.25ミリリットルでチューブをすすぎ、チューブにも転送します。透析クリップで、チューブの上部を可能な限り溶液の近くに固定します。次に、チューブの上部を4リットルビーカーの外側の上部にテープで留め、チューブの充填部分をビーカーにぶら下がします。さて、ビーカーを摂氏4度の冷たい部屋に持って行き、かき混ぜる皿の上に置きます。PBSでビーカーを上部に充填し、攪拌バーを追加します。チューブと溶液を約8時間一晩かき混ぜます。翌朝、ビーカーのPBSを新鮮なPBSに交換し、ビーカーを残して約8時間再びかき混ぜます。その晩、最後の1回を繰り返します。午前中に透析チューブを開き、チューブから15ミリリットルの円錐管に抗体溶液を移します。透析中に形成された可能性のある沈殿物を除去するには、1200 RPMでチューブを5分間遠心分離します。最後に、上清を新鮮なチューブに移します。

抗体濃度を定量するために、まず抗体アリコートから95マイクロリットルのPBSに5マイクロリットルを添加して20倍希釈を行う。次に、希釈した抗体をキュベットにピペットし、分光光度計を使用して280ナノメートルの濃度を記録します。次に、示した式を用いて抗体濃度を算出する。最後に、抗体名、濃度、調製日、および該当する場合は、バッチ番号および実験者名を有するラベルスクリューキャップバイアルを、次いで標識されたスクリューキャップバイアルに抗体をアリコートする。これらは必要になるまでマイナス80度で貯えることができる。

例えば、120G8アンチマウスCD317またはPDCA-1ハイブリドーマラインを用いた収量は44~99.6ミリグラムで、通常は平均67.3ミリグラムの量が得られます。同じハイブリドーマ細胞株を用いた各産生実行は、最後に利用可能なモノクローナル抗体の量においてわずかに異なる可能性があることに注意することが重要である。

Results

このプロトコルを使用して、いくつかの異なるハイブリドーマを持つ以下の結果を得ました。

ハイブリドーマ: RB6-BC5 (ラット抗マウス Ly6C/Ly6G (Gr1) IgG2b, κ mAb)
OD280- 1.103
(1.103/1.43)(20) = 15.42 mg/mL

ハイブリドーマ: GK1.5 (ラット抗マウス CD4 IgG2b, κ mAb)
OD280 - 0.485
(0.485/1.43)(20) = 6.78 mg/mL

ハイブリドーマ:2.43(ラットアンチマウスCD8 IgG2b、κ mAb)
OD280 - 0.209
(0.209/1.43)(20) = 2.92 mg/mL

これらはすべて結果の例であり、同じハイブリドーマを持つ各生産実行は、最後に利用可能なmAbの量がわずかに異なる可能性があることを注意することが重要です。

Applications and Summary

上記の手順は、ハイブリドーマ培養上清からモノクローナル抗体を精製するための簡単で簡単な方法です。しかし、硫酸アンモニウムは、培養上清にある可能性のある他のタンパク質を沈殿させることを覚えておくことが重要です。その結果、吸光度測定から決定される抗体濃度が推定される。ユーザーは、SDS-ポリアクリルアミドゲル上で少量を実行することによって透析サンプルの純度を評価することを望むことができる。ハイブリドーマによって産生されるmAbは、この方法論を用いて一度精製され、様々な方法で使用することができる。上記のRB6-BC5、GK1.5、および2.43 mAbは、マウスにおいて、それぞれ好中球、CD4T細胞、およびCD8 T細胞の生体内枯渇に使用される。このプロトコルを使用して製造および精製された他のmAbは、フローサイトメトリー(蛍石に結合した場合、または二次Abと組み合わせて使用する場合)、ELISA、またはウェスタンブロッティングに使用することができる。

References

  1. Lipman NS, Jackson LR, Trudel LJ, Weis-Garcia F. Monoclonal versus polyclonal antibodies: distinguishing characteristics, applications, and information resources. ILAR Journal, 46 (3), 258-268 (2005).
  2. Arora S, Ayyar BV, O'Kennedy R. Affinity chromatography for antibody purification Methods Mol Biol. 1129, 497-516 (2014).
  3. Henry BJ. On a new substance occurring in the urine of a patient with mollities ossium. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. 138, 55-62 (1848).
  4. Köhler G and Milstein C. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity". Nature. 256, 495-497 (1975).

注:無菌細胞培養技術は、抗体精製工程まで(例えば、バイオセーフティキャビネット内)無菌方法でハイブリドーマ細胞および培方を取り扱う場合に維持されるべきである。

1. 凍結ハイブリドーマ細胞の解凍

  1. 凍結したハイブリドーマ細胞を含むバイアルを37°Cの水浴で解凍するまでインキュベートします(約2分)。
  2. 完全なRPMIの10 mLを含む15 mL円錐管に解凍細胞を加える(RPMIは10%の胎児牛血清、100 U/mLペニシリン、100 μg/mLストレプトマイシン、1M mMピルビン酸ナトリウム、1x非必須アミノ酸、50μM 2-Mercapeを補充した)。
  3. 1200 RPMで5分間遠心分離機を使用して、汚染された凍結媒体を洗い流します。
  4. 遠心分離後、液体上清を廃棄し、5mLフレッシュコンプリートRPMIで細胞ペレットを再懸濁する。次いで、15mL完全RPMIを含むT75組織培養フラスコに細胞を添加する(RPMIの最終体積は20mLである)。
  5. 5%CO2で37°Cで標準的なインキュベーターで細胞を成長させます。培養中の細胞は非付着性である。

2. ハイブリドーマ拡張

  1. フラスコが~80%コンフルエントになるまで、約3日間細胞を膨張させます。
    注:この時間は、細胞の開始数と、異なる細胞の増殖速度の固有の違いに基づいて異なる場合があります。細胞が指数関数的な成長段階にあることは重要です。
  2. 最初のフラスコが約80%の合流に達したら、この最初のT75フラスコから細胞を取り出し、円錐遠心管に入れ、細胞をペレットにスピン(5分間1200 RPM)する。
  3. 完全なRPMIの6 mLで細胞を再懸濁し、次いで3つの新しいT75フラスコ(18 mL RPMIを含む2 mL/フラスコ)に細胞懸濁液を分配する。これら3つのT75フラスコを37°Cで37°Cでインキュベートし、5%CO2で約80%のコンフルエントになるまでインキュベートします(これは約3日かかります)。

3. 無血液中の抗体産生

注:この時点で、細胞は、ハイブリドーマ細胞株の増殖のために設計された無血清培地で成長を継続する準備ができています。このプロトコルでは、HB101サプリメント製品を含む市販のHB Basal液体媒体を使用しています。

  1. 3つのT75フラスコ(約80%合流)のそれぞれからの細胞を収集し、遠心分離(5分間1200 RPM)を行います。
  2. 各T75フラスコからの細胞ペレットを10mL補充HB101無血清培地に再懸濁し、次いでHB101無血清を補充した2つのT225フラスコに添加した(すなわち、各フラスコに~220-240 mL HB101を含む6つのフラスコのそれぞれに5mL細胞懸濁液)。
  3. T225フラスコおよびHB101培養中の細胞を37°Cで37°Cで5%CO2で3週間、または細胞が死に始めるまで増殖し続ける。細胞は、これらの3週間の間にmAbを産生し、培養培地に分泌している。細胞が死に始めると、彼らはもはやmAbを産生していません。

4. 抗体精製 - 1日目

注:この時点で、無菌性を維持する必要はないので、無菌的な方法でメディアを取り扱う(例えば、バイオセーフティキャビネット内)必要はない。さらに、ハイブリドーマは「BSL2レベル」の薬剤とは見なされない。

  1. フラスコから固定角度ローター用のチューブにメディアを注ぎます。10,000 RPMで固定角度ローターで遠心分離機でチューブを8分間回転させます。このステップは、培養上清から細胞破片を除去するように設計されている。
    注:チューブのサイズは、使用するローターによって異なります。覚えておくべき重要なことは、遠心分離の前にローターが適切にバランスをとっていることを確認するために、チューブ内で同じボリュームを持つことです。メディアのボリューム全体が一度に遠心分離機に収まらない可能性があります。残りのメディアは、後で同じチューブを使用して遠心分離されます(ステップ4.5)。
  2. 氷に囲まれたバケツに攪拌バー付きの2Lプラスチックビーカーを準備します。かき混ぜるプレートの上に置きます。
  3. 1Lボトルに500mLフィルタートップを取り付けます。適切なチューブを介して真空にボトルトップフィルターユニットを取り付けます。
  4. ステップ4.1(まだハイブリドーマ細胞によって産生されるmAbを含む)から上清をフィルタートップに注ぎます。
  5. メディアからセルデブリをペレットするために同じチューブセットを使用し続けます(ペレットは構築し続けます)。フィルタートップがいっぱいになり、上清の別のバッチが注ぐ準備ができるまで、真空を実行するのを待ちます。フィルターを乾かしたり、フィルタリングが非常に遅くなることをしないでください。
  6. 1Lボトルが満杯に近づいたら、フィルタートップを取り外し、ステップ4.2で調製した2Lビーカーに上清を注ぎます。フィルタトップを再接続します。ボリュームを追跡します。
  7. すべてのメディアが処理されるまで、遠心分離とろ過の手順を繰り返します。
  8. 濾過された上清を1L当たり硫酸アンモニウム295gを測定する。攪拌しながら、次の数時間(15分ごとに〜25g)にわたって上清に硫酸アンモニウムをゆっくりと加え、望ましくないタンパク質を沈殿させる可能性のある高濃度の硫酸アンモニウム塩を防ぎます。
  9. 硫酸アンモニウムをすべて加えたら、ビーカーをホイルで覆い、攪拌プレートで4°C(例えば、ウォークイン冷蔵庫または冷蔵庫)に移動します。一晩かき混ぜる。溶液の一定の撹拌は、塩を可溶化するために必要であるが、長時間の撹拌は、表面/空気界面で溶液中のタンパク質の変性につながることができます。
  10. 固定角度ローターを使用してチューブを洗浄します。

5. 抗体精製 - 2日目

  1. 2Lビーカーから上清を含む硫酸アンモニウムをチューブに注ぎ、固定角度ローターを使用します。ブレーキなしで20分間6500 RPMの固定角度ローターで遠心分離機で回転します。
  2. 真空は上清を吸引し、ペレットが柔らかくなるように吸い上げないように注意してください。同じチューブセットを使用して、上清を含む硫酸アンモニウムからペレットを収集し続けます。
  3. 最後の吸引の後、各ペレット(抗体を含む)を~1 mlのPBSで再中断する。
  4. 大量のPBSに対する透析により、沈殿したmAb溶液から硫酸アンモニウムを除去する。これを行うには、まずmAb溶液の各mLについて約1インチの透析チューブ(例えば、Membra-Cel MD25-14 MWCO 12,000-14,000ダルトンカットオフセルロース透析チューブ)を切断します。dH2O. チューブの一方の端に結び目を結び、dH2O で塗りつぶして、ノットが漏れていないことを確認します。チューブから空のdH2O。
  5. チューブにピペットPBS/抗体溶液。チューブを追加の0.25 ml PBSですすいで、チューブに移します。
  6. オレンジ色の透析クリップで、チューブの上部を可能な限り溶液の近くに固定します。
  7. チューブの上部を4Lビーカーの外側の上部にテープで留めします。チューブの充填部分をビーカーに掛けます。ビーカーにPBSを充填し、攪拌バーを追加します。
  8. 4°Cで約8時間かき混ぜる。
  9. ビーカー内のPBSを新鮮なPBSに交換し、さらに2回約8時間かき混ぜます。
  10. 抗体をチューブから15mlまたは50mlの円錐管に移します。1200 RPMで5分間遠心分離機を形成した可能性のある沈殿物を除去する。上清を新鮮なチューブに移します。
  11. 抗体1:20のアリコートをPBS(5 μl抗体+95 μl PBS)で希釈する。280 nmで分光光度計(PBSでブランク)で抗体濃度を定量します。消滅係数 (ε) 1.43 を使用します。濃度は次のように計算されます。

  12. 抗体をスクリューキャップバイアルにアリコートし、-80°Cで保存します。

抗体は研究と診断のための強力なツールであり、多くの場合、大量に生産する必要があります。

抗体を生成する最初のステップは、目的の抗原を宿主動物に注入することです。抗原は宿主のB細胞を活性化し、その抗原に特異的な抗体を産生し放出する。そして、標的抗体の存在に対する宿主動物の抗セラの定期的なスクリーニングが行われ、ELISAまたは別の検出方法を用いて行われる。検出されると、B細胞を含む宿主動物の脾臓が除去される。脾臓からのすべてのB細胞が分離された場合、これは目的の抗原に抗体を分泌している集団を含むべきである。この集団は、各細胞が抗原の異なるエピトープに結合する可能性が高いため、独自の個体およびユニークな抗体を生成するため、ポリクローナルと呼ばれる。

モノクローナル抗体を生成するには、1つの特異的エピトープを認識するために挙げられた抗体を、所望の抗体を産生する個々のB細胞を最初に単離して培養しなければならない。残念ながら、B細胞は培養において十分に生き残れない。そこで、このハードルを克服するために、科学者はB細胞と不滅の骨髄腫細胞を融合させ、ハイブリドーマを生み出します。これらの細胞は、ハイブリドーマのみが抗体を増殖および放出することを可能にする選択的培地で増殖する。ここでも、培地は所望の抗体に対してELISAなどの方法を用いてスクリーニングされる。それが検出されると、ハイブリドーマは、親培養の連続希釈である希釈を制限するというプロセスを介してクローニングされ、単一細胞がスクリーニングプレートの井戸に播種されるはずです。これにより、単一の親細胞からのハイブリドーマの増殖が可能であり、所望の抗体のみを放出するモノクローナル細胞株が得られた。これらのモノクローナルラインは、組織培養フラスコ中に膨張し、大量のモノクローナル抗体を産生することができる。この後、細胞が死に始めると、抗体は硫酸アンモニウムを含む培地から沈殿させることができる。通常、溶液中では、抗体は親水性相互作用を介して水と相互作用する。しかし、アンモニウムと硫酸塩は、抗体から水分子を分離する高帯電イオンであり、抗体の溶解度を低下させ、沈殿させる原因となる。

まず、材料のリストを確認し、プロトコルのすべてのメディア、消耗品、および作業面を準備します。

次に、水風呂の電源を入れ、摂氏37度に設定します。次に、15 ミリリットルの円錐チューブに 10 ミリリットルの完全な RPMI を追加し、完全な RPMI を 15 ミリリットルの完全な RPMI を T75 細胞培養フラスコに追加し、それらを脇に置きます。注意を使用し、適切な個人用保護具を着用し、液体窒素貯蔵からハイブリドーマ細胞を含む凍結バイアルを除去する。バイアル内部の圧力を解放するには、キャップを少し緩めます。今、慎重に水浴中のバイアルをインキュベートし、キャップが汚染の可能性を最小限に抑えるために水面の上に残っていることを確認します。細胞がほぼ解凍されると、通常約2分かかりますが、バイアルを組織培養フードに移動させます。

次に、キャップを取り外す前に、70%のエタノールでバイアルの外側を拭きます。滅菌ピペットを使用して、完全なRPMI培地の10ミリリットルを含む円錐形のチューブに細胞を移します。次に、1200 RPMでチューブを5分間遠心分離します。遠心分離後、チューブをティッシュフードに戻し、エタノールでチューブの外側を拭きます。ペレットを邪魔することなく、上清を廃棄し、新鮮な完全なRPMI培地の5ミリリットルを追加し、ゆっくりと上下にピペットを再懸濁します。次に、細胞をT75細胞培養フラスコに移し、フラスコを5%の二酸化炭素インキュベーターの中に37°Cで入します。細胞が約80%の合流に達することを可能にし、通常は約3日かかります。ハイブリドーマ細胞は非付着性であり、培地中に懸濁して成長する。十分な合流に達するまでの時間は、生細胞の開始数および使用されるハイブリドーマ細胞のタイプに基づいて変化しうる。

細胞が十分に結合したら、無菌の25ミリリットルのピペットを使用して、培養フラスコから円錐遠心管に移します。1200 RPMで5分間遠心分離により細胞をペレットする。細胞が遠心分離機にある間、3つの新しいT75細胞培養フラスコのそれぞれに完全なRPMIの18ミリリットルを加え、これらを脇に置きます。遠心分離後、上清を取り出し、完全なRPMIの6ミリリットルで細胞ペレットを穏やかに再中断します。次に、3つの新しい細胞培養フラスコのそれぞれに2ミリリットルの細胞懸濁液を加える。最後に、フラスコを5%の二酸化炭素と37°Cに設定したインキュベーターに入れ、フラスコが約80%のコンフルエントになるまでインキュベートします(約3日間)。

この時点で、細胞は、HB101サプリメントを含有する市販のHB基底液体培地などのハイブリドーマ細胞株用に設計された無血清培地中で成長を継続する準備ができている。各細胞培養フラスコから円錐遠心管に細胞を移し、1200 RPMで遠心分離によって細胞を5分間ペレットします。さて、6つの225センチメートル平方細胞培養フラスコのそれぞれに230ミリリットルの補充されたHB101無血清培地を追加し、それらを脇に置きます。遠心分離が完了したら、上清を取り除き、補充されたHB101培地の10ミリリットルで各ペレットを再中断する。次に、各細胞培養フラスコに、細胞懸濁液の5ミリリットルを添加する。フラスコを5%の二酸化炭素インキュベーターに37°Cに入れ、約3週間細胞の成長を続けます。この間、細胞は目的とするモノクローナル抗体を培養培地に産生して放出し、細胞が死に始めると抗体は精製の準備が整います。

抗体含有培養培養培養剤から細胞破片を除去するには、培養フラスコの内容物を固定角度ローター用のチューブに注ぎます。チューブをローターに入れ、遠心分離の前に適切にバランスを取っていることを確認します。チューブを 10,000 RPM で 8 分間回転させます。サンプルが遠心分離している間、アイスバケツに攪拌棒を持つ2リットルのプラスチックビーカーを置き、その後、攪拌プレートにアイスバケツを置きます。

次に、500ミリリットルのフィルタートップを1リットルのボトルに取り付けます。適切なチューブを使用して、このボトルトップフィルターユニットを家の真空に取り付けます。次いで、抗体を含む上清をフィルタートップに注ぐ。残りの培電分を遠心分離して、細胞破片を抗体含有上清から分離する。フィルタートップが上清でいっぱいになったら、真空を始めます。その後、1リットルの回収ボトルが満杯に近づいたら、フィルタートップを取り外し、濾過した上清を氷の上2リットルビーカーに注ぎます。すべての上清が処理されるまでろ過手順を繰り返します。

すべてのサンプルが処理されると、濾過された上清の1リットル当たり295グラムの硫酸アンモニウムの重量を量る。攪拌プレートを開始し、ゆっくりと次の数時間にわたって上清に硫酸アンモニウムを追加します。これは、望ましくないタンパク質が沈殿する可能性のある硫酸アンモニウム塩の局所的な高濃度を防ぎます。硫酸アンモニウムをすべて加えたら、ビーカーをホイルで覆い、攪拌プレートと一緒に4°Cの冷たい部屋に移動し、抗体溶液を一晩かき混ぜるように設定します。

翌朝、2リットルビーカーから硫酸アンモニウム含有抗体溶液を固定角ローター用のクリーンチューブに注ぎます。チューブを6500 RPMで20分間遠心分離し、チューブの底部に抗体をペレットする。次に、真空は上清を吸引し、柔らかいペレットを吸引しないように注意を用く。同じチューブセットを使用して、硫酸アンモニウム含有上清の残りの部分からペレット抗体を回収し続けます。最後の吸引後、PBSの約1ミリリットルで各抗体ペレットを再中断する。

抗体溶液から硫酸アンモニウムを除去するには、まず抗体溶液の各ミリリットルに対して約1インチの透析チューブを切断する。次に、蒸留水でチューブを拭き、チューブの一方の端に結び目を結び付します。チューブに蒸留水を充填し、結び目からの漏れを確認します。数分後に漏れがない場合は、チューブから水を空にします。

次に、抗体溶液をチューブにピペットする。可能な限り多くの抗体を回収するには、PBSの追加の0.25ミリリットルでチューブをすすぎ、チューブにも転送します。透析クリップで、チューブの上部を可能な限り溶液の近くに固定します。次に、チューブの上部を4リットルビーカーの外側の上部にテープで留め、チューブの充填部分をビーカーにぶら下がします。さて、ビーカーを摂氏4度の冷たい部屋に持って行き、かき混ぜる皿の上に置きます。PBSでビーカーを上部に充填し、攪拌バーを追加します。チューブと溶液を約8時間一晩かき混ぜます。翌朝、ビーカーのPBSを新鮮なPBSに交換し、ビーカーを残して約8時間再びかき混ぜます。その晩、最後の1回を繰り返します。午前中に透析チューブを開き、チューブから15ミリリットルの円錐管に抗体溶液を移します。透析中に形成された可能性のある沈殿物を除去するには、1200 RPMでチューブを5分間遠心分離します。最後に、上清を新鮮なチューブに移します。

抗体濃度を定量するために、まず抗体アリコートから95マイクロリットルのPBSに5マイクロリットルを添加して20倍希釈を行う。次に、希釈した抗体をキュベットにピペットし、分光光度計を使用して280ナノメートルの濃度を記録します。次に、示した式を用いて抗体濃度を算出する。最後に、抗体名、濃度、調製日、および該当する場合は、バッチ番号および実験者名を有するラベルスクリューキャップバイアルを、次いで標識されたスクリューキャップバイアルに抗体をアリコートする。これらは必要になるまでマイナス80度で貯えることができる。

例えば、120G8アンチマウスCD317またはPDCA-1ハイブリドーマラインを用いた収量は44~99.6ミリグラムで、通常は平均67.3ミリグラムの量が得られます。同じハイブリドーマ細胞株を用いた各産生実行は、最後に利用可能なモノクローナル抗体の量においてわずかに異なる可能性があることに注意することが重要である。

JoVE Science Education is free through June 15th 2020.

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