Génération d'anticorps : Production d'anticorps monoclonaux à l'aide d'hybridomas

Immunology

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Concepts

Source : Frances V. Sjaastad1,2, Whitney Swanson2,3, et Thomas S. Griffith1,2,3,4
1 Microbiologie, immunologie et programme d'études supérieures en biologie du cancer, Université du Minnesota, Minneapolis, MN 55455
2 Center for Immunology, Université du Minnesota, Minneapolis, MN 55455
3 Département d'urologie, Université du Minnesota, Minneapolis, MN 55455
4 Centre du cancer maçonnique, Université du Minnesota, Minneapolis, MN 55455

Les anticorps polyclonales sont définis comme une collection d'anticorps dirigés contre différents déterminants antigéniques d'un antigène ou de plusieurs antigènes (1). Bien que les anticorps polyclonales soient de puissants outils pour identifier les molécules biologiques, il existe une limitation importante : ils sont incapables de faire la distinction entre les antigènes qui partagent des déterminants antigéniques. Par exemple, lorsque l'albumine de sérum bovin est utilisée pour immuniser un animal, les cellules B avec une surface différente Ig répondront à différents déterminants antigéniques sur l'albumine de sérum bovin. Le résultat est un mélange d'anticorps dans l'antisérum. Parce que l'albumine de sérum bovin partage quelques épitopes avec l'albumine de sérum humain dans les régions évolutivement conservées de la protéine, cet antisérum anti-bovin d'albumine de sérum de sérum réagira également avec l'albumine humaine de sérum. Par conséquent, cet antisérum ne sera pas utile pour distinguer entre les albumines de sérum bovine s'il y a des sérides.

Plusieurs approches ont été adoptées pour surmonter la question de la spécificité de l'antisera polyclonal. L'un est en absorbant les anticorps indésirables en passant l'antisérum à travers une colonne de chromatographie d'antigènes immobilisés (2). Cette méthode est fastidieuse et souvent incapable d'enlever complètement les anticorps indésirables. Une autre approche consiste à isoler les cellules B productrices d'anticorps individuelles et à les étendre en culture. Cependant, comme la plupart des cellules normales non transformées, les cellules B ne survivent pas dans la culture à long terme.

Pour surmonter l'incapacité des cellules B à survivre en culture, une approche consiste à préparer un hybridome de cellules myélome-B. En 1847, Henry Bence-Jones a découvert que les patients atteints de myélome multiple, une tumeur lymphoïde, ont produit une grande quantité d'anticorps (3). Les cellules B dans ces patients sont devenues malignes et se développent incontrôlables. Étant donné que les cellules B malignes sont dérivées d'un seul clone, elles sont identiques et ne produisent qu'un seul type d'anticorps(c.-à-d.un anticorps monoclonal, ou mAb). Cependant, la plupart de ces cellules de myélome produisent des anticorps de spécificités inconnues. En 1975, en fusionnant une cellule de myélome en cellule B, Cesar Milstein et Georges Kohler ont réussi à produire un hybridoma qui peut être cultivé indéfiniment in vitro et produit un nombre illimité d'anticorps monoclonaux de spécificité antigénique connue (4). La raison d'être de leur approche est de combiner les propriétés immortelles de la cellule myélome et les propriétés productrices d'anticorps de la cellule B. Leur technique a révolutionné la production d'anticorps et fournit un puissant moyen d'identification et de purification des molécules biologiques à l'aide d'anticorps monoclonaux.

En général, la préparation d'un anticorps monoclonal nécessite plusieurs mois. La procédure générale comprend les étapes suivantes :

  1. Vaccination et dépistage du dispositif d'anticorps
  2. Fusion de cellules B productrices d'anticorps et de cellules myélomes
  3. Croissance sélective de l'hybridoma
  4. Dépistage des hybridomas pour la production de l'anticorps monoclonal souhaité
  5. Le clonage en limitant la dilution - un processus par lequel les cellules sont diluées à une concentration pour permettre statistiquement d'ajouter moins de 1 cellule aux puits d'une plaque de 96 puits. Certains puits se retrouveront avec 0 cellules et certains auront 1 cellule. Les puits avec ensedus avec 1 cellule finiront par se développer dans une population monoclonale de cellules.
  6. Croissance de l'hybridome et préparation des anticorps monoclonaux

Ce protocole se concentre sur la dernière étape - la croissance de l'hybridome et la préparation de l'anticorps monoclonal. L'anticorps est purifié du supernatant de culture par la précipitation de sulfate d'ammonium (souvent appelée salage) - une méthode couramment utilisée pour enlever des protéines d'une solution. Les protéines en solution forment des liaisons d'hydrogène, ainsi que d'autres interactions hydrophiles, avec l'eau à travers leurs groupes polaires et ioniques exposés. Lorsque des concentrations de petits ions très chargés (comme l'ammonium ou le sulfate) sont ajoutées, ces groupes rivalisent avec les protéines pour se lier à l'eau. Cela élimine les molécules d'eau de la protéine et diminue sa solubilité, ce qui entraîne des précipitations de la protéine.

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JoVE Science Education Database. Immunologie. Génération d'anticorps : Production d'anticorps monoclonaux à l'aide d'hybridomas. JoVE, Cambridge, MA, (2020).

Procedure

Note: La technique de culture des cellules stériles doit être maintenue lors de la manipulation des cellules hybridome et des milieuis de manière stérile (p. ex., dans un cabinet de biosécurité) jusqu'aux étapes de purification des anticorps.

1. Dégeler les cellules hybrides congelées

  1. Incuber le flacon contenant les cellules d'hybridome congelées dans un bain d'eau à 37 oC jusqu'à ce qu'il soit juste décongelé (environ 2 minutes).
  2. Ajouter les cellules décongelées à un tube conique de 15 ml contenant 10 ml de RPMI complet (RPMI complété à 10 % de sérum bovin fœtal, 100 U/mL de pénicilline, 100 streptomycines g/mL, 1 mM de pyruvate de sodium, 1x acides aminés non essentiels, 50 M M 2-Mercaptoethanol, 10 mM HEPES).
  3. Centrifugeuse pendant 5 min à 1200 tr/min pour laver les supports de congélation contaminants.
  4. Après centrifugation, jetez le supernatant liquide et suspendez à nouveau le granule cellulaire dans un RPMI complet frais de 5 ml. Ensuite, ajoutez les cellules à un flacon de culture tissulaire T75 contenant 15 ml de RPMI complet (volume final de RPMI est de 20 ml).
  5. Cultivez les cellules dans un incubateur standard à 37oC avec 5% de CO2. Les cellules ne sont pas adhérentes en culture.

2. Expansion d'Hybridoma

  1. Laisser les cellules se développer pendant environ 3 jours jusqu'à ce que le flacon soit un confluent de 80 %.
    Note: Cette durée peut varier en fonction du nombre de cellules de départ, ainsi que des différences inhérentes dans les taux de croissance des différentes cellules. Il est important que les cellules soient dans la phase de croissance exponentielle.
  2. Une fois que le flacon initial atteint 80% de confluence, retirer les cellules de ce flacon Initial T75, placer dans un tube de centrifugeuse conique et tourner (1200 tr/min pendant 5 min) pour granuler les cellules.
  3. Resuspendre les cellules en 6 ml de RPMI complet, puis distribuer la suspension cellulaire en trois nouveaux flacons T75 (2 mL/flacon contenant 18 mL de RPMI). Incuber ces trois flacons T75 à 37oC avec 5% de CO2 jusqu'à ce qu'ils soient environ 80% de confluents (cela devrait prendre environ 3 jours).

3. Production d'anticorps dans le milieu sans sérum

Note: À ce stade, les cellules sont prêtes à poursuivre leur croissance dans un milieu sans sérum conçu pour la croissance des lignées cellulaires hybridome. Dans ce protocole, nous utilisons le milieu HB Basal Liquid disponible dans le commerce, disponible dans le commerce, contenant le produit DE supplément HB101.

  1. Les cellules de chacun des trois flacons T75 (à 80 % de confluence) sont collectées et centrifuges (1200 tr/min pendant 5 min).
  2. Le granule cellulaire de chaque flacon T75 est resuspendu dans un milieu sans sérum HB101 complété de 10 ml, puis ajouté à deux flacons T225 complétés HB101 sans sérum (c.-à-d. une suspension cellulaire de 5 ml dans chacun des 6 flacons contenant 220-240 mL HB101 dans chaque flacon).
  3. Continuer à cultiver les cellules dans les flacons T225 et hb101 à 37 oC avec 5 % de CO2 pendant trois semaines, ou jusqu'à ce que les cellules commencent à mourir. Les cellules produisent du mAb pendant ces 3 semaines et le sécrètent dans le milieu de culture. Une fois que les cellules commencent à mourir, elles ne produisent plus de mAb.

4. Purification d'anticorps - Jour 1

Note: À ce stade, la stérilité n'a pas besoin d'être maintenue, de sorte que la manipulation des médias d'une manière stérile (p. ex., dans un cabinet de biosécurité) n'est pas nécessaire. En outre, les hybridomas ne sont pas considérés comme un agent de « niveau BSL2 ».

  1. Verser les supports des flacons dans des tubes pour un rotor à angle fixe. Faire tourner les tubes dans une centrifugeuse avec un rotor à angle fixe à 10 000 tr/min pendant 8 minutes. Cette étape est conçue pour enlever les débris cellulaires du supernatant de culture.
    Note: La taille des tubes peut varier en fonction du rotor utilisé. La chose importante à retenir est d'avoir le même volume dans les tubes pour s'assurer que le rotor est correctement équilibré avant la centrifugation. Il est probable que le volume entier des médias ne s'insèrera pas dans la centrifugeuse en même temps. Les supports restants seront centrifuges plus tard (étape 4.5) à l'aide des mêmes tubes.
  2. Préparer un bécher en plastique de 2 L avec une barre à remuer dans un seau entouré de glace. Déposer sur une plaque à remuer.
  3. Fixer un dessus de filtre de 500 ml sur une bouteille de 1 L. Fixez l'unité supérieure de filtre de bouteille à l'aspirateur de maison par l'intermédiaire du tube approprié.
  4. Verser le supernatant de l'étape 4.1 (qui contient encore le mAb produit par les cellules hybridotomes) dans le dessus du filtre.
  5. Continuer à utiliser le même ensemble de tubes pour granuler les débris de cellules du support (le granule continuera à construire). Attendez d'exécuter le vide jusqu'à ce que le dessus du filtre est plein et un autre lot de supernatant est prêt à verser. Ne laissez pas le filtre sécher ou le filtrage deviendra très lent.
  6. Lorsque la bouteille de 1L est presque pleine, retirez le dessus du filtre et versez le supernatant dans un bécher de 2 L préparé à l'étape 4.2. Rattache le dessus du filtre. Gardez une trace du volume.
  7. Répétez les étapes de centrifugation et de filtration jusqu'à ce que tous les supports soient traités.
  8. Mesurer 295g de sulfate d'ammonium par 1L de supernatant filtré recueilli. En remuant, ajoutez lentement le sulfate d'ammonium au supernatant au cours des deux prochaines heures (25 g toutes les 15 minutes) pour éviter une forte concentration localisée de sel de sulfate d'ammonium qui peut provoquer des protéines indésirables à précipiter.
  9. Une fois que tout le sulfate d'ammonium a été ajouté, couvrir le bécher de papier d'aluminium et déplacer avec la plaque à remuer à 4 oC (p. ex., réfrigérateur sans rendez-vous ou chambre froide). Remuer toute la nuit. L'agitation constante de la solution est nécessaire pour solubiliser le sel, mais l'agitation prolongée peut conduire à la dénaturation des protéines dans la solution à l'interface surface/air.
  10. Laver les tubes à l'aide du rotor à angle fixe.

5. Purification d'anticorps - Jour 2

  1. Verser le sulfate d'ammonium contenant le supernatant du bécher 2L dans des tubes pour un rotor à angle fixe. Tourner en centrifugeuse avec rotor à angle fixe à 6500 tr/min pendant 20 minutes sans frein.
  2. Aspirez l'aspirateur le supernatant, en prenant soin de ne pas aspirer le granule car il sera doux. Continuer à utiliser le même ensemble de tubes pour recueillir les granulés du sulfate d'ammonium contenant un supernatant.
  3. Après la dernière aspiration, resuspendre chaque granule (qui contient des anticorps) en 1 ml de PBS.
  4. Retirez le sulfate d'ammonium de la solution mAb précipitée par dialyse contre de grands volumes de PBS. Pour ce faire, coupez d'abord environ 1 pouce de tube de dialyse (p. ex., Membra-Cel MD25-14 MWCO 12 000-14 000 tubes de dialyse de coupure Dalton) pour chaque mL de solution mAb. Mouillez le tube avec dH2O. Attachez un noeud à une extrémité de la tubulure et remplissez avec dH2O pour vérifier que le noeud ne fuit pas. Vide dH2O de la tubulure.
  5. Pipette PBS/solution d'anticorps dans le tube. Rincer les tubes avec un PBS supplémentaire de 0,25 ml et transférer dans la tuyauterie.
  6. Fixez le haut du tube aussi près que possible de la solution avec un clip de dialyse orange.
  7. Ruban adhésif le dessus de la tubulure sur le dessus extérieur d'un bécher de 4 L. Laisser la partie remplie de la tubulure s'accrocher au bécher. Remplir le bécher avec pbS et ajouter une barre d'agitation.
  8. Remuer pendant la nuit pendant 8 heures à 4oC.
  9. Remplacer le PBS dans le bécher par du PBS frais et remuer pendant 8 heures deux fois de plus.
  10. Transférer l'anticorps de la tuyauterie dans des tubes coniques de 15 ou 50 ml. Centrifugeuse pendant 5 minutes à 1200 tr/min pour enlever tout précipité qui pourrait s'être formé. Transférer le supernatant dans un tube frais.
  11. Diluer un aliquot d'anticorps 1:20 avec PBS (5 'l anticorps '95 'l PBS). Quantitate la concentration d'anticorps avec un spectrophotomètre (blanc avec PBS) à 280 nm. Utiliser un coefficient d'extinction de 1,43. La concentration est calculée comme

  12. Aliquot l'anticorps dans les flacons de bouchon à vis et stocker à -80 oC.

Les anticorps sont un outil puissant pour la recherche et le diagnostic, ce qui signifie qu'il est souvent nécessaire de les produire en grandes quantités.

La première étape pour générer des anticorps est d'injecter l'antigène d'intérêt dans un animal hôte. L'antigène active les cellules B de l'hôte qui produisent et libèrent ensuite des anticorps spécifiques à cet antigène. Ensuite, un dépistage régulier de l'antisera de l'animal hôte pour détecter la présence de l'anticorps cible est effectué, à l'aide d'ELISA ou d'une autre méthode de détection. Une fois qu'il est détecté, la rate de l'animal hôte, qui contient les cellules B, est enlevée. Si toutes les cellules B de la rate sont maintenant isolées, cela devrait inclure une population qui sécrètent des anticorps à l'antigène d'intérêt. Nous nous référons à cette population comme polyclonal, parce que chaque cellule probablement liée à un épitope différent de l'antigène, et donc, a généré son propre anticorps individuel et unique.

Pour générer des anticorps monoclonaux, les anticorps élevés pour reconnaître un épitope spécifique, la cellule B individuelle qui produit l'anticorps désiré doivent d'abord être isolés et cultivés. Malheureusement, les cellules B ne survivent pas bien en culture. Ainsi, pour surmonter cet obstacle, les scientifiques fusionnent les cellules B avec des cellules de myélome immortelles, résultant en hybridomas. Ces cellules sont ensuite cultivées dans un milieu sélectif qui ne permet aux hybridomes de croître et de libérer des anticorps. Encore une fois, le milieu est examiné à l'aide d'une méthode telle que ELISA pour l'anticorps désiré. Une fois qu'il est détecté, les hybridomas sont clonés par un processus appelé dilution limitante, une dilution sérielle de la culture mère, qui devrait avoir comme conséquence les cellules simples étant ensecées dans les puits d'une plaque de criblage. Cela permet la croissance d'hybridomas à partir d'une cellule monoparentale, donnant une lignée cellulaire monoclonale qui ne libère que l'anticorps désiré. Ces lignées monoclonales peuvent être étendues dans des flacons de culture tissulaire pour produire de grandes quantités d'anticorps monoclonaux. Après cela, comme les cellules commencent à mourir, les anticorps peuvent être précipités à partir du milieu avec du sulfate d'ammonium. Normalement, en solution, les anticorps interagissent avec l'eau par le biais d'interactions hydrophiles. Cependant, l'ammonium et le sulfate sont des ions très chargés qui séparent les molécules d'eau des anticorps, diminuant la solubilité des anticorps et les faisant précipiter.

Pour commencer, vérifiez d'abord la liste des matériaux et préparez tous les supports, fournitures et surfaces de travail pour le protocole.

Ensuite, allumez un bain d'eau et placez-le à 37 degrés Celsius. Ensuite, ajoutez 10 millilitres de RPMI complet à un tube conique de 15 millilitres et 15 millilitres de RPMI complet à un flacon de culture cellulaire T75 et les mettre de côté. En utilisant la prudence et en portant l'équipement de protection individuelle approprié, retirez le flacon congelé contenant des cellules d'hybridome du stockage d'azote liquide. Pour relâcher la pression à l'intérieur du flacon, desserrer légèrement le bouchon. Maintenant, incubez soigneusement le flacon dans le bain d'eau, en s'assurant que le bouchon reste au-dessus de la surface de l'eau pour minimiser les risques de contamination. Lorsque les cellules sont presque décongelées, ce qui prend généralement environ deux minutes, déplacez le flacon vers le capuchon de culture tissulaire.

Ensuite, essuyez l'extérieur de la fiole avec 70% d'éthanol avant d'enlever le bouchon. À l'aide d'une pipette stérile, transférer les cellules dans le tube conique qui contient 10 millilitres de milieu complet RPMI. Ensuite, centrifuger le tube pendant cinq minutes à 1200 tr/min. Après centrifugation, déplacez le tube vers le capot tissulaire et essuyez l'extérieur du tube avec de l'éthanol. Sans déranger la pastille, jetez le supernatant, puis ajoutez cinq millilitres de frais complet RPMI moyen et doucement pipette de haut en bas pour resuspendre. Ensuite, transférez les cellules dans le flacon de culture cellulaire T75 et placez le flacon à l'intérieur d'un incubateur de dioxyde de carbone de 5 % à 37 degrés Celsius. Permettre aux cellules d'atteindre environ 80% de confluence, ce qui prend habituellement environ trois jours. Notez que les cellules hybridotomes ne sont pas adhérentes et se développeront suspendues dans le milieu. Le temps d'atteindre une confluence suffisante peut varier en fonction du nombre de départ de cellules vivantes et du type de cellule hybride utilisée.

Une fois que les cellules sont suffisamment confluentes, utilisez une pipette stérile de 25 millilitres pour les transférer du flacon de culture dans un tube conique de centrifugeuse. Pelleter les cellules par centrifugation à 1200 tr/min pendant cinq minutes. Tandis que les cellules sont dans la centrifugeuse, ajoutez 18 millilitres de RPMI complet dans chacun de trois nouveaux flacons de culture de cellules de T75 et de les mettre de côté. Après centrifugation, retirer le supernatant et resuspendre doucement la pastille cellulaire en six millilitres de RPMI complet. Ensuite, ajoutez deux millilitres de la suspension cellulaire dans chacun des trois nouveaux flacons de culture cellulaire. Enfin, placez les flacons dans un incubateur réglé à 5% de dioxyde de carbone et 37 degrés Celsius et incubez jusqu'à ce que les flacons soient environ 80% confluents, environ trois jours.

À ce stade, les cellules sont prêtes à poursuivre leur croissance dans le milieu sans sérum conçu pour les lignées cellulaires hybridome, tels que le milieu liquide basal HB disponible dans le commerce contenant le supplément HB101. Transférer les cellules de chaque flacon de culture cellulaire dans des tubes coniques de centrifugeuse, puis granuler les cellules par centrifugation à 1200 tr/min pendant cinq minutes. Maintenant, ajoutez 230 millilitres de milieu sans sérum HB101 complété dans chacun des six flacons de culture cellulaire de 225 centimètres carrés et réservez-les. Lorsque la centrifugation est terminée, retirer le supernatant et resuspendre chaque granule dans 10 millilitres de milieu HB101 complété. Ensuite, dans chaque flacon de culture cellulaire, ajouter cinq millilitres de la suspension cellulaire. Placez les flacons dans l'incubateur de dioxyde de carbone de 5 % à 37 degrés Celsius et continuez à cultiver les cellules pendant environ trois semaines. Pendant ce temps, les cellules produiront et libéreront l'anticorps monoclonal d'intérêt dans le milieu de culture et l'anticorps sera prêt pour la purification quand les cellules commenceront à mourir.

Pour enlever les débris cellulaires du support culturel contenant des anticorps, versez le contenu des flacons de culture dans des tubes pour un rotor à angle fixe. Placez les tubes dans le rotor et assurez-vous qu'il est bien équilibré avant la centrifugation. Faites tourner les tubes à 10 000 tr/min pendant huit minutes. Pendant que les échantillons sont centrifuging, placez un bécher en plastique de deux litres avec une barre d'agitation dans un seau à glace et puis mettez le seau à glace sur une plaque à remuer.

Ensuite, attachez un dessus de filtre de 500 millilitres à une bouteille d'un litre. Fixez cette unité de filtre supérieure de bouteille à un vide de maison utilisant le tube approprié. Ensuite, versez le supernatant qui contient l'anticorps dans le dessus du filtre. Centrifuger le support restant pour séparer les débris cellulaires du supernatant contenant des anticorps. Lorsque le dessus du filtre est plein de supernatant, démarrer le vide. Ensuite, lorsque la bouteille de collecte d'un litre est presque pleine, retirez le dessus du filtre et versez le supernatant filtré dans le bécher de deux litres sur la glace. Répétez les étapes de filtration jusqu'à ce que tout le supernatant soit traité.

Lorsque tout l'échantillon a été traité, peser 295 grammes de sulfate d'ammonium par un litre de supernatant filtré. Démarrer la plaque d'agitation et ajouter lentement le sulfate d'ammonium au supernatant au cours des deux prochaines heures. Ceci empêche une concentration élevée localisée de sel de sulfate d'ammonium qui peut causer des protéines non désirées pour précipiter. Une fois que tout le sulfate d'ammonium a été ajouté, couvrir le bécher avec du papier d'aluminium et le déplacer, avec la plaque d'agitation, à une chambre froide à quatre degrés Celsius et le mettre à remuer la solution d'anticorps pendant la nuit.

Le lendemain matin, versez la solution d'anticorps contenant du sulfate d'ammonium du bécher de deux litres dans des tubes propres pour le rotor à angle fixe. Centrifuger les tubes à 6500 tr/min pendant 20 minutes sans casser pour granuler l'anticorps au fond des tubes. Ensuite, aspirez à l'aspiration du supernatant, en utilisant la prudence de ne pas aspirer la boulette molle. Continuer à utiliser le même ensemble de tubes pour recueillir l'anticorps granulé du reste du supernatant contenant du sulfate d'ammonium. Après la dernière aspiration, suspendre chaque granule d'anticorps dans environ un millilitre de PBS.

Pour enlever le sulfate d'ammonium de la solution d'anticorps, coupez d'abord environ un pouce de tube de dialyse pour chaque millilitre de solution d'anticorps. Ensuite, essuyez le tube avec de l'eau distillée et attachez un noeud à une extrémité de la tubulure. Remplissez le tube d'eau distillée pour vérifier s'il y a des fuites dans le noeud. S'il n'y a pas de fuite après quelques minutes, videz l'eau hors de la tubulure.

Ensuite, pipette la solution d'anticorps dans le tube. Pour récupérer autant d'anticorps que possible, rincez les tubes avec 0,25 millilitre supplémentaire de PBS et transférez-le également sur le tube. Fixez le haut du tube aussi près que possible de la solution avec un clip de dialyse. Ensuite, ruban adhésif le haut de la tuyauterie sur le dessus extérieur d'un bécher de quatre litres avec la partie remplie de la tuyauterie accrochée dans le bécher. Maintenant, prenez le bécher à la chambre froide de quatre degrés Celsius et placez-le sur une plaque à remuer. Remplissez le bécher vers le haut avec PBS et ajoutez une barre d'agitation. Laisser le tube et la solution remuer toute la nuit pendant environ huit heures. Le lendemain matin, remplacer le PBS dans le bécher par du PBS frais, puis laisser le bécher remuer à nouveau pendant environ huit heures. Plus tard dans la soirée, répétez le processus une dernière fois. Le matin, ouvrez le tube de dialyse, puis transférez la solution d'anticorps de la tuyauterie aux tubes coniques de 15 millilitres. Pour enlever tout précipité qui pourrait s'être formé pendant la dialyse, centrifuger les tubes pendant cinq minutes à 1200 tr/min. Enfin, transférer le supernatant dans des tubes frais.

Pour quantifier la concentration d'anticorps, faites d'abord une dilution 20 fois en ajoutant cinq microlitres d'un aliquot d'anticorps à 95 microlitres de PBS. Ensuite, pipette l'anticorps dilué dans une cuvette et utiliser un spectrophotomètre pour enregistrer la concentration à 280 nanomètres. Ensuite, calculez la concentration d'anticorps à l'aide de la formule indiquée. Enfin, étiquetez les flacons de bouchon de vis avec le nom de l'anticorps, la concentration, la date de préparation et, le cas échéant, le numéro de lot et le nom de l'expérimentateur, puis aliquot l'anticorps dans les flacons de bouchon de vis étiquetés. Ceux-ci peuvent être stockés à moins 80 degrés Celsius jusqu'à ce que nécessaire.

Les rendements d'exemple utilisant la ligne d'hybridome anti-souris CD317 ou PDCA-1 de 120G8 variaient entre 44 et 99,6 milligrammes, ce qui donne généralement, en moyenne, 67,3 milligrammes de quantité. Il est important de noter que chaque production avec la même lignée cellulaire hybride peut être légèrement différente dans la quantité d'anticorps monoclonal disponibles à la fin.

Results

En utilisant ce protocole, nous avons obtenu les résultats suivants avec plusieurs hybridomas différents:

Hybridoma: RB6-BC5 (rat anti-souris Ly6C/Ly6G (Gr1) IgG2b, mAb)
OD280 - 1.103
(1.103/1.43) (20) 15,42 mg/mL

Hybridoma: GK1.5 (rat anti-souris CD4 IgG2b, mAb)
OD280 - 0,485
(0.485/1.43) (20) 6,78 mg/mL

Hybridoma: 2.43 (rat anti-souris CD8 IgG2b, mAb)
OD280 - 0,209
(0.209/1.43) (20) 2,92 mg/mL

Ce sont tous des exemples de résultats, et il est important de noter que chaque production avec le même hybridoma peut être légèrement différente dans la quantité de mAb disponible à la fin.

Applications and Summary

La procédure décrite ci-dessus est un moyen simple et direct de purifier les anticorps monoclonaux de la culture hybridome supernatant. Il est important de se rappeler, cependant, que le sulfate d'ammonium précipitera d'autres protéines qui peuvent être dans le supernatant de culture. Par conséquent, les concentrations d'anticorps déterminées à partir des mesures d'absorption sont des estimations. L'utilisateur peut souhaiter évaluer la pureté de l'échantillon dialysé en exécutant une petite quantité sur un gel SDS-polyacrylamide. Le mAb produit par un hybridoma, une fois purifié à l'aide de cette méthodologie, peut être utilisé de diverses façons. Les RB6-BC5, GK1.5 et 2,43 mAb décrits ci-dessus sont couramment utilisés pour l'épuisement in vivo des neutrophiles, des lymphocytes T CD4 et des lymphocytes T CD8, respectivement, chez les souris. D'autres mAb produits et purifiés à l'aide de ce protocole peuvent être utilisés pour la cytométrie du débit (lorsqu'il est conjugué à un fluorophore ou en conjonction avec un Ab secondaire), ELISA, ou le ballonnement occidental.

References

  1. Lipman NS, Jackson LR, Trudel LJ, Weis-Garcia F. Monoclonal versus polyclonal antibodies: distinguishing characteristics, applications, and information resources. ILAR Journal, 46 (3), 258-268 (2005).
  2. Arora S, Ayyar BV, O'Kennedy R. Affinity chromatography for antibody purification Methods Mol Biol. 1129, 497-516 (2014).
  3. Henry BJ. On a new substance occurring in the urine of a patient with mollities ossium. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. 138, 55-62 (1848).
  4. Köhler G and Milstein C. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity". Nature. 256, 495-497 (1975).

Note: La technique de culture des cellules stériles doit être maintenue lors de la manipulation des cellules hybridome et des milieuis de manière stérile (p. ex., dans un cabinet de biosécurité) jusqu'aux étapes de purification des anticorps.

1. Dégeler les cellules hybrides congelées

  1. Incuber le flacon contenant les cellules d'hybridome congelées dans un bain d'eau à 37 oC jusqu'à ce qu'il soit juste décongelé (environ 2 minutes).
  2. Ajouter les cellules décongelées à un tube conique de 15 ml contenant 10 ml de RPMI complet (RPMI complété à 10 % de sérum bovin fœtal, 100 U/mL de pénicilline, 100 streptomycines g/mL, 1 mM de pyruvate de sodium, 1x acides aminés non essentiels, 50 M M 2-Mercaptoethanol, 10 mM HEPES).
  3. Centrifugeuse pendant 5 min à 1200 tr/min pour laver les supports de congélation contaminants.
  4. Après centrifugation, jetez le supernatant liquide et suspendez à nouveau le granule cellulaire dans un RPMI complet frais de 5 ml. Ensuite, ajoutez les cellules à un flacon de culture tissulaire T75 contenant 15 ml de RPMI complet (volume final de RPMI est de 20 ml).
  5. Cultivez les cellules dans un incubateur standard à 37oC avec 5% de CO2. Les cellules ne sont pas adhérentes en culture.

2. Expansion d'Hybridoma

  1. Laisser les cellules se développer pendant environ 3 jours jusqu'à ce que le flacon soit un confluent de 80 %.
    Note: Cette durée peut varier en fonction du nombre de cellules de départ, ainsi que des différences inhérentes dans les taux de croissance des différentes cellules. Il est important que les cellules soient dans la phase de croissance exponentielle.
  2. Une fois que le flacon initial atteint 80% de confluence, retirer les cellules de ce flacon Initial T75, placer dans un tube de centrifugeuse conique et tourner (1200 tr/min pendant 5 min) pour granuler les cellules.
  3. Resuspendre les cellules en 6 ml de RPMI complet, puis distribuer la suspension cellulaire en trois nouveaux flacons T75 (2 mL/flacon contenant 18 mL de RPMI). Incuber ces trois flacons T75 à 37oC avec 5% de CO2 jusqu'à ce qu'ils soient environ 80% de confluents (cela devrait prendre environ 3 jours).

3. Production d'anticorps dans le milieu sans sérum

Note: À ce stade, les cellules sont prêtes à poursuivre leur croissance dans un milieu sans sérum conçu pour la croissance des lignées cellulaires hybridome. Dans ce protocole, nous utilisons le milieu HB Basal Liquid disponible dans le commerce, disponible dans le commerce, contenant le produit DE supplément HB101.

  1. Les cellules de chacun des trois flacons T75 (à 80 % de confluence) sont collectées et centrifuges (1200 tr/min pendant 5 min).
  2. Le granule cellulaire de chaque flacon T75 est resuspendu dans un milieu sans sérum HB101 complété de 10 ml, puis ajouté à deux flacons T225 complétés HB101 sans sérum (c.-à-d. une suspension cellulaire de 5 ml dans chacun des 6 flacons contenant 220-240 mL HB101 dans chaque flacon).
  3. Continuer à cultiver les cellules dans les flacons T225 et hb101 à 37 oC avec 5 % de CO2 pendant trois semaines, ou jusqu'à ce que les cellules commencent à mourir. Les cellules produisent du mAb pendant ces 3 semaines et le sécrètent dans le milieu de culture. Une fois que les cellules commencent à mourir, elles ne produisent plus de mAb.

4. Purification d'anticorps - Jour 1

Note: À ce stade, la stérilité n'a pas besoin d'être maintenue, de sorte que la manipulation des médias d'une manière stérile (p. ex., dans un cabinet de biosécurité) n'est pas nécessaire. En outre, les hybridomas ne sont pas considérés comme un agent de « niveau BSL2 ».

  1. Verser les supports des flacons dans des tubes pour un rotor à angle fixe. Faire tourner les tubes dans une centrifugeuse avec un rotor à angle fixe à 10 000 tr/min pendant 8 minutes. Cette étape est conçue pour enlever les débris cellulaires du supernatant de culture.
    Note: La taille des tubes peut varier en fonction du rotor utilisé. La chose importante à retenir est d'avoir le même volume dans les tubes pour s'assurer que le rotor est correctement équilibré avant la centrifugation. Il est probable que le volume entier des médias ne s'insèrera pas dans la centrifugeuse en même temps. Les supports restants seront centrifuges plus tard (étape 4.5) à l'aide des mêmes tubes.
  2. Préparer un bécher en plastique de 2 L avec une barre à remuer dans un seau entouré de glace. Déposer sur une plaque à remuer.
  3. Fixer un dessus de filtre de 500 ml sur une bouteille de 1 L. Fixez l'unité supérieure de filtre de bouteille à l'aspirateur de maison par l'intermédiaire du tube approprié.
  4. Verser le supernatant de l'étape 4.1 (qui contient encore le mAb produit par les cellules hybridotomes) dans le dessus du filtre.
  5. Continuer à utiliser le même ensemble de tubes pour granuler les débris de cellules du support (le granule continuera à construire). Attendez d'exécuter le vide jusqu'à ce que le dessus du filtre est plein et un autre lot de supernatant est prêt à verser. Ne laissez pas le filtre sécher ou le filtrage deviendra très lent.
  6. Lorsque la bouteille de 1L est presque pleine, retirez le dessus du filtre et versez le supernatant dans un bécher de 2 L préparé à l'étape 4.2. Rattache le dessus du filtre. Gardez une trace du volume.
  7. Répétez les étapes de centrifugation et de filtration jusqu'à ce que tous les supports soient traités.
  8. Mesurer 295g de sulfate d'ammonium par 1L de supernatant filtré recueilli. En remuant, ajoutez lentement le sulfate d'ammonium au supernatant au cours des deux prochaines heures (25 g toutes les 15 minutes) pour éviter une forte concentration localisée de sel de sulfate d'ammonium qui peut provoquer des protéines indésirables à précipiter.
  9. Une fois que tout le sulfate d'ammonium a été ajouté, couvrir le bécher de papier d'aluminium et déplacer avec la plaque à remuer à 4 oC (p. ex., réfrigérateur sans rendez-vous ou chambre froide). Remuer toute la nuit. L'agitation constante de la solution est nécessaire pour solubiliser le sel, mais l'agitation prolongée peut conduire à la dénaturation des protéines dans la solution à l'interface surface/air.
  10. Laver les tubes à l'aide du rotor à angle fixe.

5. Purification d'anticorps - Jour 2

  1. Verser le sulfate d'ammonium contenant le supernatant du bécher 2L dans des tubes pour un rotor à angle fixe. Tourner en centrifugeuse avec rotor à angle fixe à 6500 tr/min pendant 20 minutes sans frein.
  2. Aspirez l'aspirateur le supernatant, en prenant soin de ne pas aspirer le granule car il sera doux. Continuer à utiliser le même ensemble de tubes pour recueillir les granulés du sulfate d'ammonium contenant un supernatant.
  3. Après la dernière aspiration, resuspendre chaque granule (qui contient des anticorps) en 1 ml de PBS.
  4. Retirez le sulfate d'ammonium de la solution mAb précipitée par dialyse contre de grands volumes de PBS. Pour ce faire, coupez d'abord environ 1 pouce de tube de dialyse (p. ex., Membra-Cel MD25-14 MWCO 12 000-14 000 tubes de dialyse de coupure Dalton) pour chaque mL de solution mAb. Mouillez le tube avec dH2O. Attachez un noeud à une extrémité de la tubulure et remplissez avec dH2O pour vérifier que le noeud ne fuit pas. Vide dH2O de la tubulure.
  5. Pipette PBS/solution d'anticorps dans le tube. Rincer les tubes avec un PBS supplémentaire de 0,25 ml et transférer dans la tuyauterie.
  6. Fixez le haut du tube aussi près que possible de la solution avec un clip de dialyse orange.
  7. Ruban adhésif le dessus de la tubulure sur le dessus extérieur d'un bécher de 4 L. Laisser la partie remplie de la tubulure s'accrocher au bécher. Remplir le bécher avec pbS et ajouter une barre d'agitation.
  8. Remuer pendant la nuit pendant 8 heures à 4oC.
  9. Remplacer le PBS dans le bécher par du PBS frais et remuer pendant 8 heures deux fois de plus.
  10. Transférer l'anticorps de la tuyauterie dans des tubes coniques de 15 ou 50 ml. Centrifugeuse pendant 5 minutes à 1200 tr/min pour enlever tout précipité qui pourrait s'être formé. Transférer le supernatant dans un tube frais.
  11. Diluer un aliquot d'anticorps 1:20 avec PBS (5 'l anticorps '95 'l PBS). Quantitate la concentration d'anticorps avec un spectrophotomètre (blanc avec PBS) à 280 nm. Utiliser un coefficient d'extinction de 1,43. La concentration est calculée comme

  12. Aliquot l'anticorps dans les flacons de bouchon à vis et stocker à -80 oC.

Les anticorps sont un outil puissant pour la recherche et le diagnostic, ce qui signifie qu'il est souvent nécessaire de les produire en grandes quantités.

La première étape pour générer des anticorps est d'injecter l'antigène d'intérêt dans un animal hôte. L'antigène active les cellules B de l'hôte qui produisent et libèrent ensuite des anticorps spécifiques à cet antigène. Ensuite, un dépistage régulier de l'antisera de l'animal hôte pour détecter la présence de l'anticorps cible est effectué, à l'aide d'ELISA ou d'une autre méthode de détection. Une fois qu'il est détecté, la rate de l'animal hôte, qui contient les cellules B, est enlevée. Si toutes les cellules B de la rate sont maintenant isolées, cela devrait inclure une population qui sécrètent des anticorps à l'antigène d'intérêt. Nous nous référons à cette population comme polyclonal, parce que chaque cellule probablement liée à un épitope différent de l'antigène, et donc, a généré son propre anticorps individuel et unique.

Pour générer des anticorps monoclonaux, les anticorps élevés pour reconnaître un épitope spécifique, la cellule B individuelle qui produit l'anticorps désiré doivent d'abord être isolés et cultivés. Malheureusement, les cellules B ne survivent pas bien en culture. Ainsi, pour surmonter cet obstacle, les scientifiques fusionnent les cellules B avec des cellules de myélome immortelles, résultant en hybridomas. Ces cellules sont ensuite cultivées dans un milieu sélectif qui ne permet aux hybridomes de croître et de libérer des anticorps. Encore une fois, le milieu est examiné à l'aide d'une méthode telle que ELISA pour l'anticorps désiré. Une fois qu'il est détecté, les hybridomas sont clonés par un processus appelé dilution limitante, une dilution sérielle de la culture mère, qui devrait avoir comme conséquence les cellules simples étant ensecées dans les puits d'une plaque de criblage. Cela permet la croissance d'hybridomas à partir d'une cellule monoparentale, donnant une lignée cellulaire monoclonale qui ne libère que l'anticorps désiré. Ces lignées monoclonales peuvent être étendues dans des flacons de culture tissulaire pour produire de grandes quantités d'anticorps monoclonaux. Après cela, comme les cellules commencent à mourir, les anticorps peuvent être précipités à partir du milieu avec du sulfate d'ammonium. Normalement, en solution, les anticorps interagissent avec l'eau par le biais d'interactions hydrophiles. Cependant, l'ammonium et le sulfate sont des ions très chargés qui séparent les molécules d'eau des anticorps, diminuant la solubilité des anticorps et les faisant précipiter.

Pour commencer, vérifiez d'abord la liste des matériaux et préparez tous les supports, fournitures et surfaces de travail pour le protocole.

Ensuite, allumez un bain d'eau et placez-le à 37 degrés Celsius. Ensuite, ajoutez 10 millilitres de RPMI complet à un tube conique de 15 millilitres et 15 millilitres de RPMI complet à un flacon de culture cellulaire T75 et les mettre de côté. En utilisant la prudence et en portant l'équipement de protection individuelle approprié, retirez le flacon congelé contenant des cellules d'hybridome du stockage d'azote liquide. Pour relâcher la pression à l'intérieur du flacon, desserrer légèrement le bouchon. Maintenant, incubez soigneusement le flacon dans le bain d'eau, en s'assurant que le bouchon reste au-dessus de la surface de l'eau pour minimiser les risques de contamination. Lorsque les cellules sont presque décongelées, ce qui prend généralement environ deux minutes, déplacez le flacon vers le capuchon de culture tissulaire.

Ensuite, essuyez l'extérieur de la fiole avec 70% d'éthanol avant d'enlever le bouchon. À l'aide d'une pipette stérile, transférer les cellules dans le tube conique qui contient 10 millilitres de milieu complet RPMI. Ensuite, centrifuger le tube pendant cinq minutes à 1200 tr/min. Après centrifugation, déplacez le tube vers le capot tissulaire et essuyez l'extérieur du tube avec de l'éthanol. Sans déranger la pastille, jetez le supernatant, puis ajoutez cinq millilitres de frais complet RPMI moyen et doucement pipette de haut en bas pour resuspendre. Ensuite, transférez les cellules dans le flacon de culture cellulaire T75 et placez le flacon à l'intérieur d'un incubateur de dioxyde de carbone de 5 % à 37 degrés Celsius. Permettre aux cellules d'atteindre environ 80% de confluence, ce qui prend habituellement environ trois jours. Notez que les cellules hybridotomes ne sont pas adhérentes et se développeront suspendues dans le milieu. Le temps d'atteindre une confluence suffisante peut varier en fonction du nombre de départ de cellules vivantes et du type de cellule hybride utilisée.

Une fois que les cellules sont suffisamment confluentes, utilisez une pipette stérile de 25 millilitres pour les transférer du flacon de culture dans un tube conique de centrifugeuse. Pelleter les cellules par centrifugation à 1200 tr/min pendant cinq minutes. Tandis que les cellules sont dans la centrifugeuse, ajoutez 18 millilitres de RPMI complet dans chacun de trois nouveaux flacons de culture de cellules de T75 et de les mettre de côté. Après centrifugation, retirer le supernatant et resuspendre doucement la pastille cellulaire en six millilitres de RPMI complet. Ensuite, ajoutez deux millilitres de la suspension cellulaire dans chacun des trois nouveaux flacons de culture cellulaire. Enfin, placez les flacons dans un incubateur réglé à 5% de dioxyde de carbone et 37 degrés Celsius et incubez jusqu'à ce que les flacons soient environ 80% confluents, environ trois jours.

À ce stade, les cellules sont prêtes à poursuivre leur croissance dans le milieu sans sérum conçu pour les lignées cellulaires hybridome, tels que le milieu liquide basal HB disponible dans le commerce contenant le supplément HB101. Transférer les cellules de chaque flacon de culture cellulaire dans des tubes coniques de centrifugeuse, puis granuler les cellules par centrifugation à 1200 tr/min pendant cinq minutes. Maintenant, ajoutez 230 millilitres de milieu sans sérum HB101 complété dans chacun des six flacons de culture cellulaire de 225 centimètres carrés et réservez-les. Lorsque la centrifugation est terminée, retirer le supernatant et resuspendre chaque granule dans 10 millilitres de milieu HB101 complété. Ensuite, dans chaque flacon de culture cellulaire, ajouter cinq millilitres de la suspension cellulaire. Placez les flacons dans l'incubateur de dioxyde de carbone de 5 % à 37 degrés Celsius et continuez à cultiver les cellules pendant environ trois semaines. Pendant ce temps, les cellules produiront et libéreront l'anticorps monoclonal d'intérêt dans le milieu de culture et l'anticorps sera prêt pour la purification quand les cellules commenceront à mourir.

Pour enlever les débris cellulaires du support culturel contenant des anticorps, versez le contenu des flacons de culture dans des tubes pour un rotor à angle fixe. Placez les tubes dans le rotor et assurez-vous qu'il est bien équilibré avant la centrifugation. Faites tourner les tubes à 10 000 tr/min pendant huit minutes. Pendant que les échantillons sont centrifuging, placez un bécher en plastique de deux litres avec une barre d'agitation dans un seau à glace et puis mettez le seau à glace sur une plaque à remuer.

Ensuite, attachez un dessus de filtre de 500 millilitres à une bouteille d'un litre. Fixez cette unité de filtre supérieure de bouteille à un vide de maison utilisant le tube approprié. Ensuite, versez le supernatant qui contient l'anticorps dans le dessus du filtre. Centrifuger le support restant pour séparer les débris cellulaires du supernatant contenant des anticorps. Lorsque le dessus du filtre est plein de supernatant, démarrer le vide. Ensuite, lorsque la bouteille de collecte d'un litre est presque pleine, retirez le dessus du filtre et versez le supernatant filtré dans le bécher de deux litres sur la glace. Répétez les étapes de filtration jusqu'à ce que tout le supernatant soit traité.

Lorsque tout l'échantillon a été traité, peser 295 grammes de sulfate d'ammonium par un litre de supernatant filtré. Démarrer la plaque d'agitation et ajouter lentement le sulfate d'ammonium au supernatant au cours des deux prochaines heures. Ceci empêche une concentration élevée localisée de sel de sulfate d'ammonium qui peut causer des protéines non désirées pour précipiter. Une fois que tout le sulfate d'ammonium a été ajouté, couvrir le bécher avec du papier d'aluminium et le déplacer, avec la plaque d'agitation, à une chambre froide à quatre degrés Celsius et le mettre à remuer la solution d'anticorps pendant la nuit.

Le lendemain matin, versez la solution d'anticorps contenant du sulfate d'ammonium du bécher de deux litres dans des tubes propres pour le rotor à angle fixe. Centrifuger les tubes à 6500 tr/min pendant 20 minutes sans casser pour granuler l'anticorps au fond des tubes. Ensuite, aspirez à l'aspiration du supernatant, en utilisant la prudence de ne pas aspirer la boulette molle. Continuer à utiliser le même ensemble de tubes pour recueillir l'anticorps granulé du reste du supernatant contenant du sulfate d'ammonium. Après la dernière aspiration, suspendre chaque granule d'anticorps dans environ un millilitre de PBS.

Pour enlever le sulfate d'ammonium de la solution d'anticorps, coupez d'abord environ un pouce de tube de dialyse pour chaque millilitre de solution d'anticorps. Ensuite, essuyez le tube avec de l'eau distillée et attachez un noeud à une extrémité de la tubulure. Remplissez le tube d'eau distillée pour vérifier s'il y a des fuites dans le noeud. S'il n'y a pas de fuite après quelques minutes, videz l'eau hors de la tubulure.

Ensuite, pipette la solution d'anticorps dans le tube. Pour récupérer autant d'anticorps que possible, rincez les tubes avec 0,25 millilitre supplémentaire de PBS et transférez-le également sur le tube. Fixez le haut du tube aussi près que possible de la solution avec un clip de dialyse. Ensuite, ruban adhésif le haut de la tuyauterie sur le dessus extérieur d'un bécher de quatre litres avec la partie remplie de la tuyauterie accrochée dans le bécher. Maintenant, prenez le bécher à la chambre froide de quatre degrés Celsius et placez-le sur une plaque à remuer. Remplissez le bécher vers le haut avec PBS et ajoutez une barre d'agitation. Laisser le tube et la solution remuer toute la nuit pendant environ huit heures. Le lendemain matin, remplacer le PBS dans le bécher par du PBS frais, puis laisser le bécher remuer à nouveau pendant environ huit heures. Plus tard dans la soirée, répétez le processus une dernière fois. Le matin, ouvrez le tube de dialyse, puis transférez la solution d'anticorps de la tuyauterie aux tubes coniques de 15 millilitres. Pour enlever tout précipité qui pourrait s'être formé pendant la dialyse, centrifuger les tubes pendant cinq minutes à 1200 tr/min. Enfin, transférer le supernatant dans des tubes frais.

Pour quantifier la concentration d'anticorps, faites d'abord une dilution 20 fois en ajoutant cinq microlitres d'un aliquot d'anticorps à 95 microlitres de PBS. Ensuite, pipette l'anticorps dilué dans une cuvette et utiliser un spectrophotomètre pour enregistrer la concentration à 280 nanomètres. Ensuite, calculez la concentration d'anticorps à l'aide de la formule indiquée. Enfin, étiquetez les flacons de bouchon de vis avec le nom de l'anticorps, la concentration, la date de préparation et, le cas échéant, le numéro de lot et le nom de l'expérimentateur, puis aliquot l'anticorps dans les flacons de bouchon de vis étiquetés. Ceux-ci peuvent être stockés à moins 80 degrés Celsius jusqu'à ce que nécessaire.

Les rendements d'exemple utilisant la ligne d'hybridome anti-souris CD317 ou PDCA-1 de 120G8 variaient entre 44 et 99,6 milligrammes, ce qui donne généralement, en moyenne, 67,3 milligrammes de quantité. Il est important de noter que chaque production avec la même lignée cellulaire hybride peut être légèrement différente dans la quantité d'anticorps monoclonal disponibles à la fin.

JoVE Science Education is free through June 15th 2020.

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