Microscopía de inmunofluorescencia: Tinción de inmunofluorescencia de secciones de tejido incrustado por parafina

Immunology

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Concepts

Fuente: Thomas Chaffee1, Thomas S. Griffith2,3,4y Kathryn L. Schwertfeger1,3,4
1 Departamento de Medicina y Patología de Laboratorio, Universidad de Minnesota, Minneapolis, MN 55455
2 Departamento de Urología, Universidad de Minnesota, Minneapolis, MN 55455
3 Centro De Cáncer Masónico, Universidad de Minnesota, Minneapolis, MN 55455
4 Centro de Inmunología, Universidad de Minnesota, Minneapolis, MN 55455

Los análisis patológicos de las secciones tisulares se pueden utilizar para obtener una mejor comprensión de la estructura normal del tejido y contribuir a nuestra comprensión de los mecanismos de la enfermedad. Las biopsias de tejido, ya sea de pacientes o de modelos experimentales in vivo, a menudo se conservan fijando en formalina o paraformaldehida e incrustando en cera de parafina. Esto permite el almacenamiento a largo plazo y la sección de los tejidos. Los tejidos se cortan en secciones delgadas (5 m) utilizando un microtome y las secciones se adhieren a los portaobjetos de vidrio. Las secciones de los tejidos se pueden teñir con anticuerpos, que permiten la detección de proteínas específicas dentro de las secciones de tejido. La tinción con anticuerpos conjugados con fluoróforos (también conocidos como fluorocromos) - compuestos que emiten luz a longitudes de onda específicas cuando excitan por un láser - se conoce como inmunofluorescencia. La capacidad de detectar proteínas dentro de una sección puede proporcionar información como la heterogeneidad del tipo celular dentro del tejido, la activación de vías de señalización específicas y la expresión de biomarcadores. Dependiendo de los fluoróforos utilizados y el tipo de microscopio disponible para el análisis, se pueden utilizar múltiples colores, lo que permite el análisis multiplexado de los objetivos.

El siguiente protocolo describe los pasos básicos involucrados en la tinción de inmunofluorescencia de las secciones de tejido incrustado de parafina. Es importante tener en cuenta que este protocolo no incluirá ningún detalle sobre la fijación del tejido, el proceso de incrustación de parafina o la sección de los tejidos. Una vez que los tejidos han sido seccionados y colocados en diapositivas de vidrio, se rehidratan a través de una serie de incubaciones de etanol calificado (EtOH). Las secciones se incuban con un reactivo de bloqueo para reducir la unión no específica de anticuerpos a la sección tisular. Las secciones se incuban con un anticuerpo primario que puede o no ser etiquetado directamente con un fluoróforo. Si el anticuerpo primario no está etiquetado directamente, las secciones se incuban con un anticuerpo secundario etiquetado con un fluoróforo. Diferentes anticuerpos pueden requerir diferentes condiciones de tinción, por lo que se incluyen sugerencias para la optimización de los anticuerpos. Después del lavado para eliminar todos los anticuerpos no unidos, las diapositivas se montan con medios que contienen DAPI para etiquetar fluorescentemente el núcleo. Una vez que el medio de montaje se ha secado, las diapositivas se pueden crear imágenes utilizando un microscopio con láseres que pueden detectar los diferentes fluoróforos.

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JoVE Science Education Database. Inmunología. Microscopía de inmunofluorescencia: Tinción de inmunofluorescencia de secciones de tejido incrustado por parafina. JoVE, Cambridge, MA, (2020).

Procedure

1. Configuración

  1. El protocolo de tinción típico implica los siguientes pasos:
    1. Rehidratar las secciones de tejido en las diapositivas utilizando una serie de etanoles clasificados.
    2. Incubar las secciones tisulares con un tampón de bloqueo, lo que ayudará a bloquear la unión no específica de anticuerpos al tejido y reducir la fluorescencia de fondo.
    3. Extracción del tampón de bloqueo e incubación de la sección en anticuerpo primario, momento en el que el anticuerpo unirá su objetivo de péptido.
    4. Extracción del anticuerpo primario y lavado extenso de las secciones en tampón de lavado.
    5. Incubar las secciones con anticuerpo secundario para permitir la unión al anticuerpo primario, si el anticuerpo primario no está etiquetado directamente con un fluoróforo y se requiere un anticuerpo secundario.
    6. Lavar el anticuerpo secundario de las diapositivas.
    7. Montaje de las diapositivas en los medios de montaje y permitiendo que se sequen antes de la visualización en un microscopio fluorescente.
  2. Se necesitan los siguientes elementos: portaobjetos (vidrio o plástico), frascos, pipetas, pluma de papá, cámara húmeda, resbalones de cubierta y medios de montaje con DAPI.
  3. El xileno se utiliza para la rehidratación de diapositivas. El xileno es peligroso y debe utilizarse en una campana de humos junto con un EPP adecuado, incluidos guantes y una capa de laboratorio.
  4. Recetas para búferes, soluciones y reactivos
    1. Etanoles clasificados
      Etanol - 160 mL 200 proof EtOH y 40mL ddH2O
      Etanol - 140 mL 200 proof EtOH y 60mL ddH2O
    2. Solución de recuperación de antígenos
      Citrato de sodio de 10 mM, pH 6,0
    3. Bloqueo del búfer
      100 l Suero del animal huésped del que se hizo el anticuerpo secundario
      900 L 1X PBS
      Nota: Este es el volumen de 10 secciones; ajustar el volumen para aproximadamente 100 l de búfer por sección, según sea necesario.
    4. Tampón de lavado (1X PBS)

2. Protocolo

  1. Rehidratación con xilenos y etanoles
    1. Coloque las diapositivas en un portaobjetos y, a continuación, sumerja las diapositivas en la solución de isómeros de xileno 100%, asegurándose de que las diapositivas estén completamente cubiertas con solución.
    2. Incubar diapositivas en los isómeros 100% de xileno durante 3 min. Repita dos veces para un total de 3 incubaciones separadas. Asegúrese de limpiar la portaobjetos con una toalla de papel antes de transferirla a una nueva solución para minimizar la contaminación.
      Nota: Se recomienda que estas incubaciones se realicen en tres recipientes separados.
    3. Incubar diapositivas en 100% EtOH durante 2 min. Repetir dos veces para un total de 3 incubaciones separadas.
      Nota: Se recomienda que estas incubaciones se realicen en tres recipientes separados.
    4. Incubar toboganes en 95% EtOH durante 2 min.
    5. Incubar toboganes en 80% EtOH durante 2 min.
    6. Incubar toboganes en 70% EtOH durante 2 min.
    7. Incubar diapositivas en 1X PBS durante 5 min.
  2. (Opcional) Recuperación de antígenos para desenmascarar epítopos reconocidos por el anticuerpo primario
    Nota 1: Este procedimiento depende en gran medida del anticuerpo utilizado y se recomienda que se realicen los procedimientos de optimización inicial para determinar el requisito de recuperación de antígenos.
    Nota 2: Este procedimiento no se realizó con la tinción F4/80 que se muestra a continuación. El requisito para la recuperación de antígenos debe optimizarse con cada nuevo anticuerpo.
    1. Coloque los portaobjetos en un soporte de plástico o de vidrio resistente al calor y asegúrese de que el bastidor esté lleno de portaobjetos para garantizar una distribución uniforme del calor. Las diapositivas en blanco se pueden utilizar si hay menos muestras que ranuras en el bastidor.
    2. Coloque el bastidor en 1000 ml de solución de desenmascaramiento de antígeno en el vaso de precipitados 2L - 10 mL antígeno material de desenmascaramiento a 990 ml de agua.
    3. Microondas a fuego alto durante 20 minutos en total, asegúrese de que los portaobjetos permanezcan cubiertos con agua.
    4. Diapositivas frías durante 20 minutos en vaso de precipitados.
    5. Lave la rejilla deslizante en portaobjetos que contenga ddH2O durante 5 min cada uno. Repita dos veces para un total de 3 incubaciones separadas usandoddH2 O fresco cada vez. Los portaobjetos se pueden lavar en el mismo portaobjetos durante cada lavado.
    6. Incubar diapositivas en 1X PBS durante 5 min.
  3. Círculo de secciones con una pluma de papá. Esto permitirá el uso de un volumen mínimo de tampones necesarios para cubrir las secciones de tejido. No permita que las secciones de tejido se sequen.
  4. Agregue el búfer de bloqueo a cada sección. La cantidad de tampón necesaria para cubrir la sección variará dependiendo del tamaño de la sección, pero podría oscilar entre 25-500 l. Se debe utilizar suficiente tampón para formar un cordón que cubra toda la superficie de la sección, incluidos los bordes.
    Nota: La elección del tampón de bloqueo puede variar dependiendo del anticuerpo que se esté utilizando. Por ejemplo, se puede utilizar un 10% de suero del animal huésped en el que se elevó el anticuerpo secundario para reducir la unión no específica del anticuerpo secundario (por ejemplo, se puede utilizar suero de cabra normal si el anticuerpo secundario se crió en cabra). Se debe realizar la optimización del búfer de bloqueo para cada anticuerpo primario. Para manchar secciones tumorales mamarias con F4/80, se utilizó 0,1 ml de suero de cabra normal al 10% en PBS.
  5. Incubar las secciones en tampón de bloqueo en una cámara humidificada durante 1 hora a temperatura ambiente o 4oC hasta 24 horas. La cámara humidificada garantiza que las secciones no se sequen.
  6. Retire el búfer de bloqueo drenándolo de la diapositiva. Alternativamente, el tampón de bloqueo se puede quitar con una pipeta, aunque tenga cuidado de no tocar la sección con la punta de la pipeta.
  7. Diluir el anticuerpo primario en el tampón de bloqueo.
    Nota: Deberá determinarse la dilución correcta para cada anticuerpo y tipo de muestra. La optimización incluiría realizar una serie de diluciones para identificar la tinción óptima. Para manchar las secciones tumorales mamarias con F4/80, las secciones de tejido se incubaron durante la noche a 4oC en anticuerpos anti-F4/80 de rata de 0,1 ml diluidos 1:100 en suero de cabra normal al 1% en PBS.
  8. Añadir el anticuerpo primario a cada sección e incubar en una cámara humidificada durante un máximo de 16 horas (durante la noche) a 4oC. Deje al menos una sección en el tampón de bloqueo sin anticuerpo primario para servir como control, lo que ayudará a identificar la unión no específica por el anticuerpo secundario.
  9. Escurra el anticuerpo primario o el tampón de bloqueo de la sección y lave las secciones con PBS colocando diapositivas en el portaobjetos y colocándolo en un portaobjetos con 1 PBS. Lavar 3 veces durante 10 minutos cada vez.
  10. Diluir el anticuerpo secundario 1:200 en el tampón de bloqueo. La dilución se puede optimizar dependiendo del anticuerpo secundario.
  11. Añadir el anticuerpo secundario a todas las secciones, incluido el control, e incubar durante 1 hora en una cámara humidificada protegida de la luz.
  12. Escurrir el anticuerpo secundario de las secciones y lavar 3 veces en PBS durante 10 minutos cada vez.
  13. Agregue 2-3 gotas de soporte de montaje que contengan DAPI a las diapositivas y coloque un cubreobjetos en las muestras. Si el soporte de montaje no es un tipo de soporte de secado rápido, puede ser necesario sellar los bordes de la corredera con cera de parafina derretida o esmalte de uñas para evitar fugas y mantener las muestras a largo plazo.
  14. Deje que las diapositivas se sequen durante la noche en la oscuridad e idee las secciones con un microscopio fluorescente.

3. Análisis de datos y resultados

  1. Las secciones manchadas se analizan con un microscopio fluorescente. Los detalles específicos de la captura y el análisis de imágenes dependerán de las especificaciones del microscopio y del software utilizado para realizar el análisis. Normalmente, las imágenes se pueden tomar como imágenes de un solo color y superponerse para generar imágenes multicolor. El porcentaje de celdas positivas se puede cuantificar contando el número de celdas manchadas positivamente y dividiendo por el número total de celdas manchadas de DAPI dentro de una sección. Para la tinción F4/80 de secciones de tumores mamarios, utilizando el software Leica Application Suite, versión 3.8, en la pestaña Adquirir y en el modo de adquisición de superposición de imágenes, se habilitaron ambos DAPI y RFP. Exposición, Ganancia, y Gamma se ajustaron (20.0 ms, 1.0x, y 1.53 respectivamente para DAPI y 944.2 ms, 1.0x, y 1.08 respectivamente para RFP), aunque esto varía entre los experimentos. El botón Adquirir superposición se utilizó para crear imágenes superpuestas de las exposiciones DAPI y RFP.
  2. La imagen siguiente(Figura 1) muestra un ejemplo de imagen de inmunofluorescencia de una sección tumoral manchada con F4/80, que detecta un antígeno en macrófagos y otras células mieloides. La sección se montó con medios de montaje que contienen DAPI y los núcleos se muestran en azul.

La función de una proteína en una célula depende en gran medida de su correcta localización dentro de la célula. La microscopía de inmunofluorescencia es un método mediante el cual una proteína se puede visualizar dentro de las células utilizando tintes fluorescentes. Un tinte fluorescente es un fluoróforo, es decir, una molécula que absorbe la energía de la luz a una longitud de onda específica mediante un proceso llamado excitación, y luego libera inmediatamente la energía en una longitud de onda diferente, conocida como emisión.

Los colorantes fluorescentes se conjugan con un anticuerpo específico del objetivo y se introducen en las células o tejidos cultivados mediante inmunomanchas. Cuando este anticuerpo primario se une a la proteína de interés, la proteína se etiqueta con el tinte fluorescente. Alternativamente, el tinte fluorescente se puede conjugar con un anticuerpo secundario, en lugar del anticuerpo primario, y el anticuerpo secundario se une al complejo de anticuerpos primarios de proteína para etiquetar el objetivo. Después de eso, la muestra se sella en un medio de montaje antidescolorpara para preservar el etiquetado de fluorescencia y luego está lista para la toma de imágenes en un microscopio de fluorescencia.

Un microscopio de fluorescencia está equipado con una potente fuente de luz. El haz de luz pasa primero a través de un filtro de excitación, que permite que sólo la luz en la longitud de onda de excitación pase a través. La luz de excitación llega entonces a un espejo especializado, llamado espejo dicroro o divisor de haz, que está diseñado para reflejar selectivamente la longitud de onda de excitación hacia una lente objetivo. A continuación, la lente enfoca la luz en una pequeña región de la muestra. Al llegar a la muestra, la luz excita a los fluoróforos, que luego emiten la energía de la luz a una longitud de onda diferente. Esta luz se transmite de vuelta a través de la lente objetivo al espejo dicroico. Dado que la longitud de onda de emisión es diferente de la longitud de onda de excitación, el espejo dicroico permite que la luz de emisión pase a través. Luego, pasa a través de un segundo filtro, llamado filtro de emisión, que elimina la luz de cualquier otra longitud de onda que pueda estar presente. Después de eso, los rayos de luz ahora llegan al ocular o a la cámara, donde presentan una imagen magnificada creada a partir de la luz emitida por los fluoróforos específicos. Esta imagen representa la ubicación de la proteína de interés dentro de la célula.

Los colorantes fluorescentes de unión al ADN se utilizan a menudo junto con la inmunomancha para etiquetar los núcleos como un punto de referencia dentro de las células. Múltiples fluoróforos diferentes, con diferentes longitudes de onda de emisión de excitación, se pueden utilizar para diferentes proteínas dentro de la misma muestra para comparar la localización de las proteínas.

Este vídeo muestra el procedimiento para la tinción inmunofluorescente de una proteína de interés en una muestra de tejido seguida de la toma de imágenes de la muestra en un microscopio de fluorescencia.

Antes de comenzar el proceso de tinción, las secciones, que se deshidrataron durante el proceso de incrustación, deben rehidratarse. Para ello, primero, coloque las diapositivas en un portaobjetos y luego sumerja completamente las diapositivas en isómeros 100% xlenos. Deje que las diapositivas se incuban durante tres minutos. A continuación, retire los portaobjetos del recipiente, limpie cualquier exceso de Xileno con una toalla de papel y colóquelos en un nuevo baño de Xileno en un recipiente nuevo, durante otros tres minutos. Repita esta incubación cada vez en un nuevo recipiente con xileno fresco y limpiando los portaobjetos con toallas de papel antes de transferirlo al nuevo recipiente, para un total de tres incubaciones. A continuación, incubar las secciones en una serie de soluciones de etanol calificadas, comenzando con 100% etanol durante dos minutos. Limpie la portaobjetos con una toalla de papel y transfiera las diapositivas a un nuevo recipiente de etanol 100% durante otros dos minutos. Continúe el ciclo de lavado, limpiando el exceso de etanol con una toalla de papel y transfiriendo los portaobjetos a un baño nuevo, siguiendo las concentraciones indicadas de etanol durante el tiempo especificado. Después del lavado final de etanol, sacuda el exceso de solución e incubar los portaobjetos en 1X PBS durante cinco minutos.

Para comenzar el proceso de tinción, primero, circule las secciones con un lápiz PAP para identificar el área mínima que los búferes necesitan cubrir. Una vez que las secciones estén claramente marcadas en la diapositiva, agregue 100 microlitros de amortiguador de bloqueo a cada diapositiva, asegurándose de cubrir toda la superficie de la sección. Después de que los tejidos estén cubiertos con tampón de bloqueo, coloque los portaobjetos en una cámara humidificada. Deje que los toboganes se incuban durante una hora a temperatura ambiente.

Después del tiempo de incubación deseado, retire el tampón de bloqueo drenándolo de la diapositiva. A continuación, diluir el anticuerpo primario en el tampón de bloqueo. Para una dilución de 1:100, agregue 990 microlitros de tampón de bloqueo a un tubo centrífugo de 1,5 mililitros, seguido de 10 microlitros del anticuerpo primario al mismo tubo. Etiquete una diapositiva como un control y, a continuación, agregue 100 microlitros de búfer de bloqueo. Este control ayudará a identificar cualquier unión no específica del anticuerpo secundario. Ahora, agregue 100 microlitros de tampón de anticuerpos primarios a las diapositivas restantes. Incubar las secciones durante la noche en una cámara humidificada a cuatro grados centígrados, en la oscuridad.

Después de la incubación durante la noche, retire las secciones de la cámara y drene el anticuerpo primario de cada diapositiva y el tampón de bloqueo del control. Coloque las diapositivas en una portaobjetos y luego lávelas tres veces en 1X PBS durante diez minutos cada una. Mientras las diapositivas se lavan en 1X PBS, diluya el anticuerpo secundario en el tampón de bloqueo. Para una dilución de 1:200, agregue 995 microlitros de tampón de bloqueo a un tubo de 1,5 mililitros, seguido de cinco microlitros del anticuerpo secundario al mismo tubo. Añadir el anticuerpo secundario a todas las secciones, incluido el control, e incubarlos durante una hora en una cámara humidificada protegida de la luz. Cuando suene el temporizador, retire las diapositivas de la incubadora. Escurra el anticuerpo secundario de las secciones. Una vez que se retire el anticuerpo secundario, coloque los portaobjetos en un portaobjetos y luego sumerja completamente los portaobjetos en 1X PBS durante 10 minutos, protegidos de la luz. Repita este lavado tres veces, usando 1X PBS fresco para cada lavado. Después de los lavados, agregue de dos a tres gotas de soporte de montaje que contengan DAPI a cada diapositiva y coloque una cubierta de vidrio en las muestras. Deje que las diapositivas se sequen durante la noche en un lugar oscuro antes de tomar imágenes de las secciones con un endoscopio fluorescente.

Durante la toma de imágenes, los detalles de la captura de imágenes dependerán del microscopio y el software específicos disponibles. Sin embargo, en este ejemplo en particular, el software Leica Application Suite, Versión 3. 8, se utiliza para realizar el análisis. Con este programa, haga clic en la pestaña Adquirir y en el modo Adquisición de superposición de imágenes, habilite DAPI y RFP. A continuación, ajuste la exposición, la ganancia y la gamma para DAPI y RFP, tomando una inicial utilizando los ajustes predeterminados definidos por el software y, a continuación, optimizando el brillo modificando el tiempo de exposición y la ganancia, teniendo en cuenta que los ajustes óptimos mínimos son para evitar la saturación de la imagen y el fotoblanqueo de las muestras. Gamma se puede modificar para optimizar las áreas más oscuras de una imagen.

Una vez ajustados los ajustes, pulse el botón Adquirir superposición para crear imágenes superpuestas de las exposiciones DAPI y RFP. Esta imagen de ejemplo, capturada con la técnica demostrada, muestra una sección de tumor mamario del ratón, manchada con el anticuerpo F4/80, que detecta un antígeno, representado en rojo, en macrófagos y otras células mieloides. Desde que se utilizó el medio de montaje que contiene DAPI, los núcleos se muestran en azul. Los datos de la imagen proporcionarán información sobre la intensidad y localización de la proteína dentro de la sección de tejido.

Por ejemplo, en la imagen del tumor manchado con F4/80, se observa la tinción de la superficie celular de este antígeno. Estos datos también pueden proporcionar información sobre la frecuencia de poblaciones celulares específicas dentro de la sección de tejido. Esto se puede cuantificar contando el número de celdas manchadas positivamente, aquí se muestraen en rojo, y comparando eso con la población total de celdas, mostrada en azul, y calculando la frecuencia usando la siguiente ecuación.

Results

Figure 1
Figura 1:Tinción F4/80 de una sección tumoral mamaria. Después de la fijación, un tumor mamario del ratón fue seccionado y manchado con anti-F4/80 y montado usando un medio de montaje que contiene DAPI. La tinción se muestra mediante la mancha de superficie celular F4/80 en rojo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Los datos obtenidos a partir de la imagen proporcionarán información sobre la intensidad y localización de la expresión de la proteína de interés dentro de la sección tisular. Dependiendo de la proteína que se esté examinando, estos datos también podrían proporcionar información sobre la frecuencia de poblaciones celulares específicas dentro de la sección de tejido. Esto se puede cuantificar contando el número de células manchadas positivamente y comparando con la población celular total.

Applications and Summary

La inmunofluorescencia permite la investigación de la expresión proteica y la localización en el contexto de una sección tisular. Esta técnica se puede utilizar para entender cómo los tejidos cambian en el contexto de la enfermedad mediante el examen de la localización de proteínas o el número celular en los tejidos normales y enfermos. Los cambios en la localización o en los patrones de expresión se pueden determinar y vincular a atributos específicos de los ejemplos.

References

  1. Im K, Mareninov S., Diaz MFP, Yong WH. An Introduction to Performing Immunofluorescence Staining. Yong W. (eds) Biobanking. Methods in Molecular Biology. 1897, Humana Press, New York, NY (2019)
  2. Ramos-Vara JA. Principles and Methods of Immunohistochemistry. Gautier JC. (eds) Drug Safety Evaluation. Methods in Molecular Biology. 1641, Humana Press, New York, NY (2017)
  3. Donaldson JG. Immunofluorescence Staining. Current protocols in Cell Biology. 69 (1):1 4.3.1-4.3.7. (2015)

1. Configuración

  1. El protocolo de tinción típico implica los siguientes pasos:
    1. Rehidratar las secciones de tejido en las diapositivas utilizando una serie de etanoles clasificados.
    2. Incubar las secciones tisulares con un tampón de bloqueo, lo que ayudará a bloquear la unión no específica de anticuerpos al tejido y reducir la fluorescencia de fondo.
    3. Extracción del tampón de bloqueo e incubación de la sección en anticuerpo primario, momento en el que el anticuerpo unirá su objetivo de péptido.
    4. Extracción del anticuerpo primario y lavado extenso de las secciones en tampón de lavado.
    5. Incubar las secciones con anticuerpo secundario para permitir la unión al anticuerpo primario, si el anticuerpo primario no está etiquetado directamente con un fluoróforo y se requiere un anticuerpo secundario.
    6. Lavar el anticuerpo secundario de las diapositivas.
    7. Montaje de las diapositivas en los medios de montaje y permitiendo que se sequen antes de la visualización en un microscopio fluorescente.
  2. Se necesitan los siguientes elementos: portaobjetos (vidrio o plástico), frascos, pipetas, pluma de papá, cámara húmeda, resbalones de cubierta y medios de montaje con DAPI.
  3. El xileno se utiliza para la rehidratación de diapositivas. El xileno es peligroso y debe utilizarse en una campana de humos junto con un EPP adecuado, incluidos guantes y una capa de laboratorio.
  4. Recetas para búferes, soluciones y reactivos
    1. Etanoles clasificados
      Etanol - 160 mL 200 proof EtOH y 40mL ddH2O
      Etanol - 140 mL 200 proof EtOH y 60mL ddH2O
    2. Solución de recuperación de antígenos
      Citrato de sodio de 10 mM, pH 6,0
    3. Bloqueo del búfer
      100 l Suero del animal huésped del que se hizo el anticuerpo secundario
      900 L 1X PBS
      Nota: Este es el volumen de 10 secciones; ajustar el volumen para aproximadamente 100 l de búfer por sección, según sea necesario.
    4. Tampón de lavado (1X PBS)

2. Protocolo

  1. Rehidratación con xilenos y etanoles
    1. Coloque las diapositivas en un portaobjetos y, a continuación, sumerja las diapositivas en la solución de isómeros de xileno 100%, asegurándose de que las diapositivas estén completamente cubiertas con solución.
    2. Incubar diapositivas en los isómeros 100% de xileno durante 3 min. Repita dos veces para un total de 3 incubaciones separadas. Asegúrese de limpiar la portaobjetos con una toalla de papel antes de transferirla a una nueva solución para minimizar la contaminación.
      Nota: Se recomienda que estas incubaciones se realicen en tres recipientes separados.
    3. Incubar diapositivas en 100% EtOH durante 2 min. Repetir dos veces para un total de 3 incubaciones separadas.
      Nota: Se recomienda que estas incubaciones se realicen en tres recipientes separados.
    4. Incubar toboganes en 95% EtOH durante 2 min.
    5. Incubar toboganes en 80% EtOH durante 2 min.
    6. Incubar toboganes en 70% EtOH durante 2 min.
    7. Incubar diapositivas en 1X PBS durante 5 min.
  2. (Opcional) Recuperación de antígenos para desenmascarar epítopos reconocidos por el anticuerpo primario
    Nota 1: Este procedimiento depende en gran medida del anticuerpo utilizado y se recomienda que se realicen los procedimientos de optimización inicial para determinar el requisito de recuperación de antígenos.
    Nota 2: Este procedimiento no se realizó con la tinción F4/80 que se muestra a continuación. El requisito para la recuperación de antígenos debe optimizarse con cada nuevo anticuerpo.
    1. Coloque los portaobjetos en un soporte de plástico o de vidrio resistente al calor y asegúrese de que el bastidor esté lleno de portaobjetos para garantizar una distribución uniforme del calor. Las diapositivas en blanco se pueden utilizar si hay menos muestras que ranuras en el bastidor.
    2. Coloque el bastidor en 1000 ml de solución de desenmascaramiento de antígeno en el vaso de precipitados 2L - 10 mL antígeno material de desenmascaramiento a 990 ml de agua.
    3. Microondas a fuego alto durante 20 minutos en total, asegúrese de que los portaobjetos permanezcan cubiertos con agua.
    4. Diapositivas frías durante 20 minutos en vaso de precipitados.
    5. Lave la rejilla deslizante en portaobjetos que contenga ddH2O durante 5 min cada uno. Repita dos veces para un total de 3 incubaciones separadas usandoddH2 O fresco cada vez. Los portaobjetos se pueden lavar en el mismo portaobjetos durante cada lavado.
    6. Incubar diapositivas en 1X PBS durante 5 min.
  3. Círculo de secciones con una pluma de papá. Esto permitirá el uso de un volumen mínimo de tampones necesarios para cubrir las secciones de tejido. No permita que las secciones de tejido se sequen.
  4. Agregue el búfer de bloqueo a cada sección. La cantidad de tampón necesaria para cubrir la sección variará dependiendo del tamaño de la sección, pero podría oscilar entre 25-500 l. Se debe utilizar suficiente tampón para formar un cordón que cubra toda la superficie de la sección, incluidos los bordes.
    Nota: La elección del tampón de bloqueo puede variar dependiendo del anticuerpo que se esté utilizando. Por ejemplo, se puede utilizar un 10% de suero del animal huésped en el que se elevó el anticuerpo secundario para reducir la unión no específica del anticuerpo secundario (por ejemplo, se puede utilizar suero de cabra normal si el anticuerpo secundario se crió en cabra). Se debe realizar la optimización del búfer de bloqueo para cada anticuerpo primario. Para manchar secciones tumorales mamarias con F4/80, se utilizó 0,1 ml de suero de cabra normal al 10% en PBS.
  5. Incubar las secciones en tampón de bloqueo en una cámara humidificada durante 1 hora a temperatura ambiente o 4oC hasta 24 horas. La cámara humidificada garantiza que las secciones no se sequen.
  6. Retire el búfer de bloqueo drenándolo de la diapositiva. Alternativamente, el tampón de bloqueo se puede quitar con una pipeta, aunque tenga cuidado de no tocar la sección con la punta de la pipeta.
  7. Diluir el anticuerpo primario en el tampón de bloqueo.
    Nota: Deberá determinarse la dilución correcta para cada anticuerpo y tipo de muestra. La optimización incluiría realizar una serie de diluciones para identificar la tinción óptima. Para manchar las secciones tumorales mamarias con F4/80, las secciones de tejido se incubaron durante la noche a 4oC en anticuerpos anti-F4/80 de rata de 0,1 ml diluidos 1:100 en suero de cabra normal al 1% en PBS.
  8. Añadir el anticuerpo primario a cada sección e incubar en una cámara humidificada durante un máximo de 16 horas (durante la noche) a 4oC. Deje al menos una sección en el tampón de bloqueo sin anticuerpo primario para servir como control, lo que ayudará a identificar la unión no específica por el anticuerpo secundario.
  9. Escurra el anticuerpo primario o el tampón de bloqueo de la sección y lave las secciones con PBS colocando diapositivas en el portaobjetos y colocándolo en un portaobjetos con 1 PBS. Lavar 3 veces durante 10 minutos cada vez.
  10. Diluir el anticuerpo secundario 1:200 en el tampón de bloqueo. La dilución se puede optimizar dependiendo del anticuerpo secundario.
  11. Añadir el anticuerpo secundario a todas las secciones, incluido el control, e incubar durante 1 hora en una cámara humidificada protegida de la luz.
  12. Escurrir el anticuerpo secundario de las secciones y lavar 3 veces en PBS durante 10 minutos cada vez.
  13. Agregue 2-3 gotas de soporte de montaje que contengan DAPI a las diapositivas y coloque un cubreobjetos en las muestras. Si el soporte de montaje no es un tipo de soporte de secado rápido, puede ser necesario sellar los bordes de la corredera con cera de parafina derretida o esmalte de uñas para evitar fugas y mantener las muestras a largo plazo.
  14. Deje que las diapositivas se sequen durante la noche en la oscuridad e idee las secciones con un microscopio fluorescente.

3. Análisis de datos y resultados

  1. Las secciones manchadas se analizan con un microscopio fluorescente. Los detalles específicos de la captura y el análisis de imágenes dependerán de las especificaciones del microscopio y del software utilizado para realizar el análisis. Normalmente, las imágenes se pueden tomar como imágenes de un solo color y superponerse para generar imágenes multicolor. El porcentaje de celdas positivas se puede cuantificar contando el número de celdas manchadas positivamente y dividiendo por el número total de celdas manchadas de DAPI dentro de una sección. Para la tinción F4/80 de secciones de tumores mamarios, utilizando el software Leica Application Suite, versión 3.8, en la pestaña Adquirir y en el modo de adquisición de superposición de imágenes, se habilitaron ambos DAPI y RFP. Exposición, Ganancia, y Gamma se ajustaron (20.0 ms, 1.0x, y 1.53 respectivamente para DAPI y 944.2 ms, 1.0x, y 1.08 respectivamente para RFP), aunque esto varía entre los experimentos. El botón Adquirir superposición se utilizó para crear imágenes superpuestas de las exposiciones DAPI y RFP.
  2. La imagen siguiente(Figura 1) muestra un ejemplo de imagen de inmunofluorescencia de una sección tumoral manchada con F4/80, que detecta un antígeno en macrófagos y otras células mieloides. La sección se montó con medios de montaje que contienen DAPI y los núcleos se muestran en azul.

La función de una proteína en una célula depende en gran medida de su correcta localización dentro de la célula. La microscopía de inmunofluorescencia es un método mediante el cual una proteína se puede visualizar dentro de las células utilizando tintes fluorescentes. Un tinte fluorescente es un fluoróforo, es decir, una molécula que absorbe la energía de la luz a una longitud de onda específica mediante un proceso llamado excitación, y luego libera inmediatamente la energía en una longitud de onda diferente, conocida como emisión.

Los colorantes fluorescentes se conjugan con un anticuerpo específico del objetivo y se introducen en las células o tejidos cultivados mediante inmunomanchas. Cuando este anticuerpo primario se une a la proteína de interés, la proteína se etiqueta con el tinte fluorescente. Alternativamente, el tinte fluorescente se puede conjugar con un anticuerpo secundario, en lugar del anticuerpo primario, y el anticuerpo secundario se une al complejo de anticuerpos primarios de proteína para etiquetar el objetivo. Después de eso, la muestra se sella en un medio de montaje antidescolorpara para preservar el etiquetado de fluorescencia y luego está lista para la toma de imágenes en un microscopio de fluorescencia.

Un microscopio de fluorescencia está equipado con una potente fuente de luz. El haz de luz pasa primero a través de un filtro de excitación, que permite que sólo la luz en la longitud de onda de excitación pase a través. La luz de excitación llega entonces a un espejo especializado, llamado espejo dicroro o divisor de haz, que está diseñado para reflejar selectivamente la longitud de onda de excitación hacia una lente objetivo. A continuación, la lente enfoca la luz en una pequeña región de la muestra. Al llegar a la muestra, la luz excita a los fluoróforos, que luego emiten la energía de la luz a una longitud de onda diferente. Esta luz se transmite de vuelta a través de la lente objetivo al espejo dicroico. Dado que la longitud de onda de emisión es diferente de la longitud de onda de excitación, el espejo dicroico permite que la luz de emisión pase a través. Luego, pasa a través de un segundo filtro, llamado filtro de emisión, que elimina la luz de cualquier otra longitud de onda que pueda estar presente. Después de eso, los rayos de luz ahora llegan al ocular o a la cámara, donde presentan una imagen magnificada creada a partir de la luz emitida por los fluoróforos específicos. Esta imagen representa la ubicación de la proteína de interés dentro de la célula.

Los colorantes fluorescentes de unión al ADN se utilizan a menudo junto con la inmunomancha para etiquetar los núcleos como un punto de referencia dentro de las células. Múltiples fluoróforos diferentes, con diferentes longitudes de onda de emisión de excitación, se pueden utilizar para diferentes proteínas dentro de la misma muestra para comparar la localización de las proteínas.

Este vídeo muestra el procedimiento para la tinción inmunofluorescente de una proteína de interés en una muestra de tejido seguida de la toma de imágenes de la muestra en un microscopio de fluorescencia.

Antes de comenzar el proceso de tinción, las secciones, que se deshidrataron durante el proceso de incrustación, deben rehidratarse. Para ello, primero, coloque las diapositivas en un portaobjetos y luego sumerja completamente las diapositivas en isómeros 100% xlenos. Deje que las diapositivas se incuban durante tres minutos. A continuación, retire los portaobjetos del recipiente, limpie cualquier exceso de Xileno con una toalla de papel y colóquelos en un nuevo baño de Xileno en un recipiente nuevo, durante otros tres minutos. Repita esta incubación cada vez en un nuevo recipiente con xileno fresco y limpiando los portaobjetos con toallas de papel antes de transferirlo al nuevo recipiente, para un total de tres incubaciones. A continuación, incubar las secciones en una serie de soluciones de etanol calificadas, comenzando con 100% etanol durante dos minutos. Limpie la portaobjetos con una toalla de papel y transfiera las diapositivas a un nuevo recipiente de etanol 100% durante otros dos minutos. Continúe el ciclo de lavado, limpiando el exceso de etanol con una toalla de papel y transfiriendo los portaobjetos a un baño nuevo, siguiendo las concentraciones indicadas de etanol durante el tiempo especificado. Después del lavado final de etanol, sacuda el exceso de solución e incubar los portaobjetos en 1X PBS durante cinco minutos.

Para comenzar el proceso de tinción, primero, circule las secciones con un lápiz PAP para identificar el área mínima que los búferes necesitan cubrir. Una vez que las secciones estén claramente marcadas en la diapositiva, agregue 100 microlitros de amortiguador de bloqueo a cada diapositiva, asegurándose de cubrir toda la superficie de la sección. Después de que los tejidos estén cubiertos con tampón de bloqueo, coloque los portaobjetos en una cámara humidificada. Deje que los toboganes se incuban durante una hora a temperatura ambiente.

Después del tiempo de incubación deseado, retire el tampón de bloqueo drenándolo de la diapositiva. A continuación, diluir el anticuerpo primario en el tampón de bloqueo. Para una dilución de 1:100, agregue 990 microlitros de tampón de bloqueo a un tubo centrífugo de 1,5 mililitros, seguido de 10 microlitros del anticuerpo primario al mismo tubo. Etiquete una diapositiva como un control y, a continuación, agregue 100 microlitros de búfer de bloqueo. Este control ayudará a identificar cualquier unión no específica del anticuerpo secundario. Ahora, agregue 100 microlitros de tampón de anticuerpos primarios a las diapositivas restantes. Incubar las secciones durante la noche en una cámara humidificada a cuatro grados centígrados, en la oscuridad.

Después de la incubación durante la noche, retire las secciones de la cámara y drene el anticuerpo primario de cada diapositiva y el tampón de bloqueo del control. Coloque las diapositivas en una portaobjetos y luego lávelas tres veces en 1X PBS durante diez minutos cada una. Mientras las diapositivas se lavan en 1X PBS, diluya el anticuerpo secundario en el tampón de bloqueo. Para una dilución de 1:200, agregue 995 microlitros de tampón de bloqueo a un tubo de 1,5 mililitros, seguido de cinco microlitros del anticuerpo secundario al mismo tubo. Añadir el anticuerpo secundario a todas las secciones, incluido el control, e incubarlos durante una hora en una cámara humidificada protegida de la luz. Cuando suene el temporizador, retire las diapositivas de la incubadora. Escurra el anticuerpo secundario de las secciones. Una vez que se retire el anticuerpo secundario, coloque los portaobjetos en un portaobjetos y luego sumerja completamente los portaobjetos en 1X PBS durante 10 minutos, protegidos de la luz. Repita este lavado tres veces, usando 1X PBS fresco para cada lavado. Después de los lavados, agregue de dos a tres gotas de soporte de montaje que contengan DAPI a cada diapositiva y coloque una cubierta de vidrio en las muestras. Deje que las diapositivas se sequen durante la noche en un lugar oscuro antes de tomar imágenes de las secciones con un endoscopio fluorescente.

Durante la toma de imágenes, los detalles de la captura de imágenes dependerán del microscopio y el software específicos disponibles. Sin embargo, en este ejemplo en particular, el software Leica Application Suite, Versión 3. 8, se utiliza para realizar el análisis. Con este programa, haga clic en la pestaña Adquirir y en el modo Adquisición de superposición de imágenes, habilite DAPI y RFP. A continuación, ajuste la exposición, la ganancia y la gamma para DAPI y RFP, tomando una inicial utilizando los ajustes predeterminados definidos por el software y, a continuación, optimizando el brillo modificando el tiempo de exposición y la ganancia, teniendo en cuenta que los ajustes óptimos mínimos son para evitar la saturación de la imagen y el fotoblanqueo de las muestras. Gamma se puede modificar para optimizar las áreas más oscuras de una imagen.

Una vez ajustados los ajustes, pulse el botón Adquirir superposición para crear imágenes superpuestas de las exposiciones DAPI y RFP. Esta imagen de ejemplo, capturada con la técnica demostrada, muestra una sección de tumor mamario del ratón, manchada con el anticuerpo F4/80, que detecta un antígeno, representado en rojo, en macrófagos y otras células mieloides. Desde que se utilizó el medio de montaje que contiene DAPI, los núcleos se muestran en azul. Los datos de la imagen proporcionarán información sobre la intensidad y localización de la proteína dentro de la sección de tejido.

Por ejemplo, en la imagen del tumor manchado con F4/80, se observa la tinción de la superficie celular de este antígeno. Estos datos también pueden proporcionar información sobre la frecuencia de poblaciones celulares específicas dentro de la sección de tejido. Esto se puede cuantificar contando el número de celdas manchadas positivamente, aquí se muestraen en rojo, y comparando eso con la población total de celdas, mostrada en azul, y calculando la frecuencia usando la siguiente ecuación.

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